CN117430699A - 结合至纤维连接蛋白b结构域的蛋白 - Google Patents

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Abstract

一种纤维连接蛋白B(ED‑B)结构域的表位，特异识别并结合纤维连接蛋白ED‑B结构域的抗体或抗体片段，其可以广泛用于ED‑B蛋白结构域的体外检测和体内定位，也可用于肿瘤靶向治疗。

Description

结合至纤维连接蛋白B结构域的蛋白
本申请是2018年9月29日提交的题为“结合至纤维连接蛋白B结构域的蛋白”的中国专利申请201880061805.3的分案申请。
技术领域
本发明涉及新的纤维连接蛋白B结构域的表位，及特异结合其的抗体，特别是单克隆抗体或抗体片段，具有可识别肿瘤或抑制肿瘤生长的生物学活性，或具有杀伤肿瘤细胞的生物学活性。另外，本发明还涉及该抗体的制备方法及含有该抗体的药物组合物。
发明背景
常用的肿瘤治疗方式有化疗与放疗，由于这些治疗方法特异性不高，对正常组织产生显著的毒副作用，在杀死癌细胞的同时，影响正常器官的生理功能，降低患者的免疫能力和生活质量。提高肿瘤治疗药物特异性的一个方法是借助可识别肿瘤细胞标志物的抗体或抗体片段将药物靶向到肿瘤细胞，对肿瘤产生有针对性的杀伤。这首先需要找到能在细胞膜外表面表达的肿瘤标志物，即只在肿瘤细胞表面或细胞外基质中表达但在正常细胞或组织中表达量很少，甚至不表达的蛋白。
纤维连接蛋白或纤连蛋白(FN)是一种多功能的糖蛋白，广泛地存在于细胞外基质、血浆及其他体液中，由上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、肝细胞等表达，参与细胞的粘附、变形与分布，及血管的形成。
FN的基因约有75kb，约含50个外显子，主要由I，II，III型三类同源重复单元构成，B结构域是包含在FN的III型重复序列中，由单个外显子编码的包含91个氨基酸的完整重复。在FN基因表达过程中，有含B结构域的FN(B+)和不含B结构域的FN(B-)两种情况，这两种情况被认为在个体发育过程中发挥着重要作用，FN(B+)在成人正常组织中表达量极少，但在创伤、疾病、伤口愈合特别是肿瘤生长过程中又重新高表达，如胃癌、结直肠癌、肺癌、乳腺癌等细胞中高表达含B结构域的FN(B+)。通过体外免疫组织化学检测和体内靶向定位显示，FN(B+)在成年人的正常组织中不表达，而在多种肿瘤组织血管中高表达，是肿瘤组织的一种标志性蛋白。因此，FN的B结构域也叫额外结构域B(Extra-domain B，ED-B)。
基于ED-B结构域开发出靶向抗体，可用于将候选药物如细胞毒素等靶向至肿瘤部位，可有效抑制或杀伤肿瘤细胞，从而达到治疗目的，并且同时减少对正常组织的伤害，减少毒副作用。
治疗性抗体的发展方向为全人抗体，全人抗体比鼠源性抗体在临床上体现出很大的优势，比如免疫原性低、抗体在体内的半衰期较长并可借助人免疫球蛋白Fc段介导免疫调理、ADCC及CDC效应，进而增强抗体的生物学效应。
由于人与小鼠ED-B的氨基酸序列100％同源，小鼠免疫系统难以对人ED-B结构域发生免疫反应而产生抗ED-B抗体，比如通过杂交瘤技术获得的鼠源单抗BC-1(Carnemolla,Leprini et al.J Biol Chem 1992,24689-24692)，并不能直接识别ED-B结构域，而是通过识别与ED-B相邻结构域的抗原表位来间接特异性结合ED-B阳性的FN的。现在借助基因工程技术，直接利用噬菌体展示技术表达人工合成的抗体基因，通过淘选获得具有特定功能的抗体，而不需要借助高等动物体的免疫系统产生，具备了开发全人源重组抗体技术。目前报导的ED-B人源抗体有CGS-1，CGS-2，L19(Carnemolla,Neri et al.Int J Cancer 1996,397-405,Pini,Viti et al.J Biol Chem 1998,21769-21776)，B5(Ji J,Zhang M,Gao M,et al.HUMAN ANTIBODY AGAINST ED-B DOMAIN OF FIBRONECTIN AND USESTHEREOF.WO2014194784A1)等，这些抗体均具备了高度的特异性，并且经BIAcore检测，CGS-1、CGS-2、L19的亲和力分别达到5.4×10-8M、1.1×10-9M、8.7×10-10M。尤其是抗体L19的临床研究，充分证明了针对抗原ED-B开发特异性抗体药物，具有显著的抑制或杀伤肿瘤的效果。
发明简述
在一个方面，本发明提供了新的ED-B结构域的线性表位，其由选自VDITDS(SEQ IDNO：76)、TGLEPGIDY(SEQ ID NO：88)和NSSTIIGYR(SEQ ID NO：81)的氨基酸序列组成。
在一个方面，本发明提供了一种特异性结合选自VDITDS(SEQ ID NO：76)、TGLEPGIDY(SEQ ID NO：88)和NSSTIIGYR(SEQ ID NO：81)的表位的分离的抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方案中，本发明提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段含有3个重链互补决定区(HCDR)和3个轻链互补决定区(LCDR)，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，以及LCDR1包含选自SEQ ID NO：8、95-118和143所示的氨基酸序列、LCDR2包含选自SEQID NO：9、119-142和144所示的氨基酸序列和LCDR3包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明所述分离的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明所述抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：3或145所示的氨基酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％相同性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明所述抗体包含SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：146、SEQ ID NO：13的第1-241位氨基酸或SEQ ID NO：13的第1-242位氨基酸所示的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供了包含本发明的分离的抗体或其抗原结合片段的药物组合物，所述药物组合物任选进一步包含融合蛋白、放射性同位素、化学药物和/或纳米颗粒。
在一个方面，本发明提供了本发明的分离的抗体或其抗原结合片段或包含其的药物组合物在制备预防、诊断和治疗癌症的药物中的用途。
在一个实施方案中，所述癌症是表达含ED-B结构域的FN(B+)的癌症，例如选自鼻咽癌、头颈癌、食管癌、胃癌、结直肠癌、肺癌、乳腺癌和软组织肉瘤。
在一个方面，本发明提供了包含本发明的分离的抗体或其抗原结合片段的试剂盒，所述试剂盒可用于(i)诊断肿瘤组织的体内分布或病理组织切片，(ii)分析鉴定细胞或蛋白质，或(iii)亲和纯化含有ED-B蛋白结构域的细胞或蛋白质分子。
在一个方面，本发明提供了本发明的分离的抗体或其抗原结合片段在制备用于(i)诊断肿瘤组织的体内分布或病理组织切片，(ii)分析鉴定细胞或蛋白质，或(iii)亲和纯化含有ED-B蛋白结构域的细胞或蛋白质分子的试剂盒中的用途。
在一个方面，本发明提供了编码本发明的分离的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸分子。
附图说明
图1示出DE2抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列，其中划下划线的氨基酸是CDR区，划双下划线的氨基酸在抗体库中是随机序列，划三下划线的氨基酸在A11抗体亚库中是随机序列。
图2示出通过ELISA实验验证DE2抗体特异性识别抗原ED-B结构域。
图3示出通过细胞免疫荧光实验验证DE2抗体特异性识别FN(B+)细胞。图3A为阴性对照，细胞为不表达ED-B的CHO-789细胞，图3B的细胞为表达ED-B的CHO-7B89细胞。抗体为FITC标记的DE2抗体。
图4示出DE2抗体在荷瘤小鼠体内的分布。通过小动物活体荧光成像方法，检测到Cy5.5标记的DE2抗体可特异性分布在ED-B高表达的种植瘤组织，而其他组织很难检测到有抗体分布。
图5示出DE2抗体在实体瘤组织的分布。将Cy5.5标记的DE2抗体通过为静脉注射到小鼠体内16小时后，进行肿瘤组织冰冻切片分析。Cy5.5标记的抗体主要分布在血管上和肿瘤细胞外基质。
图6示出DE2抗体与ED-B结合的抗原表位。合成多肽序列用水平线条表示，线条粗细表示相对亲和力高低。
图7示出DE2抗体与ED-B结合的抗原表位。与DE2抗体结合能力最高的多肽所在区域用浅灰色球形和深灰色球形标识。
发明内容
发明人通过抗体的基因合成及噬菌体展示技术，淘选到特异性的单链抗体，可以直接识别单独的ED-B结构域，或含ED-B结构域的纤连蛋白FN(B+)，也可以识别其他蛋白与ED-B结构域的融合蛋白。经ELISA方法检测，所得候选抗体亲和力为L19抗体的16倍。经BIAcore检测，所得抗体亲和力为L19的9倍。预示所得抗体对ED-B抗原有更高的亲和力，更好的靶向作用。所得抗体轻链具有人的Lambda链氨基酸序列，有别于L19的人Kappa链氨基酸序列，丰富了抗ED-B的抗体类型。
所得抗体可用于抗肿瘤药物开发，如抗体的放射性同位素标记、与细胞毒素融合、与化学药物偶联、与纳米颗粒偶联等，借助所得抗体的靶向作用使药物高度富集在高表达FN(B+)的肿瘤组织中针对性杀伤肿瘤细胞，提高药效同时对正常组织伤害较小。所得的单链抗体结构形式可以使抗体药物小型化，使抗体在人体内的通透性加强，可沿着肿瘤血管到达肿瘤组织内部，产生较好的肿瘤杀伤效果；并且单链抗体可灵活改变为多种形式抗体，如天然抗体结构、迷你抗体(Minibody)、双抗、多抗融合形式等，通过对抗体结构形式的修改，可改变抗体的稳定性、通透性、用途等。另外，所得抗体可以开发为肿瘤诊断试剂用于体内和体外的肿瘤组织检测，或用于其他各类免疫相关试剂开发。
发明人发现纤连蛋白ED-B结构域上有两个区域能与抗体以极高的亲和力结合，这两个区域位于ED-B结构域的无规则卷曲区。进一步分析发现，ED-B高亲和力抗体识别ED-B的抗原表位由选自下述的ED-B多肽片段组成：VDITDS(SEQ ID NO：76)，TGLEPGIDY(SEQ IDNO：88)，NSSTIIGYR(SEQ ID NO：81)。
发明人得到了一种重组抗含人ED-B蛋白结构域的单克隆抗体或抗体片段，其中，所述的抗体片段优选为抗原结合片段，该抗体或抗体片段能与含ED-B结构域的纤连蛋白FN(简写为FN(B+))有效结合，可用于FN(B+)的检测与诊断，也可用于高表达FN(B+)肿瘤的靶向治疗，或与其他抗肿瘤药物进行联合治疗。
因此，本发明提供了一种分离的特异性识别并结合人纤连蛋白(FN)中ED-B结构域的抗体或抗体片段。在一个特定的实施方案中，本发明提供了一种特异性识别和/或结合由选自下述的ED-B多肽片段组成的线性表位的抗体或抗体片段：VDITDS(SEQ ID NO：76)，TGLEPGIDY(SEQ ID NO：88)，NSSTIIGYR(SEQ ID NO：81)。
在一个特定的实施方案中，本发明所述的抗体或抗体片段含有一个重链可变区的CDR3区氨基酸序列，CDR3区含有氨基酸序列RMSYFDY(SEQ ID NO：7)。
在另一个特定的实施方案中，本发明所述的抗体或抗体片段含有一个轻链可变区的CDR3区氨基酸序列，CDR3区含有氨基酸序列QSWDGRQP(SEQ ID NO：10)。
在另一个特定的实施方案中，本发明所述的抗体或抗体片段含有具有氨基酸序列RMSYFDY(SEQ ID NO：7)的重链可变区CDR3和具有氨基酸序列QSWDGRQP(SEQ ID NO：10)的轻链可变区CDR3。
在另一个特定的实施方案中，本发明所述的抗体或抗体片段含有3个重链可变区CDR，所述CDR的氨基酸序列分别为SYAMS(SEQ ID NO：5)，RISPSGSSTYYADSVKG(SEQ ID NO：6)，RMSYFDY(SEQ ID NO：7)。
在一个特定的实施方案中，本发明所述的抗体或抗体片段含有轻链CDR1，其包含选自SEQ ID NO：8、95-118和143所示的氨基酸序列。
在一个特定的实施方案中，本发明所述的抗体或抗体片段含有轻链CDR2，其包含选自SEQ ID NO：9、119-142和144所示的氨基酸序列。
在另一个特定的实施方案中，本发明所述的抗体或抗体片段含有3个轻链可变区CDR，所述CDR的氨基酸序列分别为：
LCDR1：选自SEQ ID NO：8、95-118和143，例如SEQ ID NO：8、95、97、99、100、114或143所示的氨基酸序列，
LCDR2：选自SEQ ID NO：9、119-142和144，例如SEQ ID NO：9、119、121、123、124、138或144所示的氨基酸序列，和
LCDR3：SEQ ID NO：10。
在另一个特定的实施方案中，本发明所述的抗体或抗体片段含有3个重链可变区CDR和3个轻链可变区CDR，其中所述3个重链可变区CDR的氨基酸序列分别为SYAMS(SEQ IDNO：5)，RISPSGSSTYYADSVKG(SEQ ID NO：6)，RMSYFDY(SEQ ID NO：7)，所述3个轻链可变区CDR的氨基酸序列分别为SGDSLGIFRSGMVS(SEQ ID NO：8)，LPTSRPS(SEQ ID NO：9)，QSWDGRQP(SEQ ID NO：10)。
在另一个特定的实施方案中，本发明提供了一种分离的特异性识别并结合人纤连蛋白(FN)中ED-B结构域的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)，
所述重链可变区包含：
VH CDR1，其包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，
VH CDR2，其包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，和
VH CDR3，其包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，
所述轻链可变区包含：
VL CDR1，其包含SEQ ID NO：8或143所示的氨基酸序列，
VL CDR2，其包含SEQ ID NO：9或144所示的氨基酸序列，和
VL CDR3，其包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。
"分离的抗体"指所述抗体(1)不与在其天然状态下伴随其天然相关成分关联，(2)不含来自相同物种的其它蛋白质，(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)不在天然中发生。因此，经化学合成的多肽或在不同于多肽的天然来源细胞的细胞系统中合成的多肽将会与其天然相关成分"分离"。还可通过分离以使蛋白质实质上不含天然相关成分，即使用本领域众所周知的蛋白质纯化技术。
如本文所用，“抗体”指免疫球蛋白和免疫球蛋白片段，无论天然的或者部分或全部合成(例如重组)产生的，包括其至少包含免疫球蛋白分子的部分可变区并保留全长免疫球蛋白的结合特异性能力的任何片段。因此，抗体包括具有与免疫球蛋白抗原结合结构域(抗体结合位点)同源或基本上同源的结合结构域的任何蛋白。抗体包括合成抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人抗体、非人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、胞内抗体以及抗体片段，例如但不限于Fab片段、Fab'片段、F(ab’)2片段、Fv片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fd’片段、单链Fv(scFv)、单链Fab(scFab)、双抗体、或者上述任何抗体的抗原结合片段。本文所提供的抗体包括任何免疫球蛋白类型(例如IgG、IgM、IgD、IgE、IgA和IgY)、任何类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类(例如，IgG2a和IgG2b)的成员。
如本文所用，抗体的“抗体片段”或“抗原结合片段”指全长抗体的任何部分，其少于全长，但是至少包含结合抗原的所述抗体的部分可变区(例如一个或多个CDR和/或一个或多个抗体结合位点)，并且因此保留结合特异性以及所述全长抗体的至少部分特异性结合能力。因此，抗原结合片段包含与衍生抗体片段的抗体结合相同抗原的抗原结合部分。抗体片段包括通过酶促处理全长抗体所产生的抗体衍生物，以及合成产生的衍生物，例如重组产生的衍生物。抗体包括抗体片段，抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab’)2、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双抗体、Fd和Fd’片段和单结构域抗体(dAb)片段，包括修饰的片段(参见例如Methods in Molecular Biology,Vol 207:Recombinant Antibodies forCancer Therapy Methods and Protocols(2003)；Chapter 1；p3-25,Kipriyanov；Ward等人,Nature 341:544-546,1989和Wu,A.M.and P.D.Senter.Nat Biotechnol 23(9):1137-1146(2005))。所述片段可以包括连接在一起的多条链，例如通过二硫键和/或通过肽接头。
如本文所用，全长抗体是具有两条全长重链(例如VH-CH1-CH2-CH3或VH-CH1-CH2-CH3-CH4)和两条全长轻链(VL-CL)和铰链区的抗体，如通过抗体分泌B细胞天然产生的抗体以及合成产生的具有相同结构域的抗体。
如本文所用，dsFv指具有稳定VH-VL对的工程化分子间二硫键的Fv。
如本文所用，Fab片段是用木瓜蛋白酶消化全长免疫球蛋白所获得的抗体片段，或者例如通过重组方法合成产生的具有相同结构的片段。Fab片段包含轻链(包含VL和CL)和另一条链，所述另一条链包含重链的可变结构域(VH)和重链的一个恒定区结构域(CH1)。
如本文所用，F(ab’)2片段是在pH 4.0-4.5下用胃蛋白酶消化免疫球蛋白所导致的抗体片段，或者例如通过重组方法合成产生的具有相同结构的片段。F(ab’)2片段基本上包含两个Fab片段，其中每个重链部分包含额外的几个氨基酸，包括形成连接两个片段的二硫键的半胱氨酸。
如本文所用，Fab’片段是包含F(ab’)2片段的一半(一条重链和一条轻链)的片段。
如本文所用，“Fv”是最小抗体片段，其含有完整的抗原识别和抗原结合位点。这个片段由一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的紧密非共价缔合的二聚体组成。这两个结构域的折叠产生6个超变环(各来自H和L链的3个环)，贡献抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体的抗原结合特异性。单一的可变结构域(或者包含仅三个特异于抗原的CDR的一半Fv)也具有识别和结合抗原的能力。
如本文所用，scFv片段指包含通过多肽接头以任何顺序共价连接的可变轻链(VL)和可变重链(VH)的抗体片段。接头长度使得两个可变结构域基本不干扰地桥接。示例性接头是分散有一些Glu或Lys残基以增加溶解性的(Gly-Ser)n残基。关于sFv的综述，可参见The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)。
术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中可变区序列源自一个物种，恒定区序列源自另一物种，如其中可变区序列源自小鼠抗体及恒定区序列源自人抗体的抗体。
术语“双抗体”是指小抗体片段，通过在VH与VL结构域之间用短接头(大约5-10个残基)构建sFv片段而制备，由此获得V结构域的链间而不是链内配对，产生二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。
双特异性抗体是两个“交叉”sFv片段的异源二聚体，其中两个抗体的VH和VL结构域存在于不同的多肽链上。参见例如EP 404,097、WO 93/11161及Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)。
“人抗体”是指仅包含人类免疫球蛋白序列的抗体。如果人类抗体产生于小鼠中、小鼠细胞中或来源于小鼠细胞的杂交瘤中，则人类抗体可含有鼠碳水化合物链。类似地，“小鼠抗体”或“大鼠抗体”分别是指仅包含小鼠或大鼠免疫球蛋白序列的抗体。
“人源化”抗体是指非人(例如小鼠)抗体形式，其是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或者其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或者抗体的其它抗原结合亚序列)，含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。优选地，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中接受者抗体的互补决定区(CDR)的残基由来自具有希望的特异性、亲和性和能力的非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或者兔的CDR残基置换。
此外，在人源化中，还可能对VH和/或VL的CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基进行突变，由此改善抗体的一或多种结合特性(例如亲和性)。可进行例如PCR介导的突变引入突变，其对抗体结合或其它功能特性的影响可利用本文所述的体外或体内测试评估。通常，引入保守性突变。此类突变可为氨基酸取代、添加或缺失。另外，CDR内的突变通常不超过一个或两个。因此，本发明所述人源化抗体还涵盖CDR内包含1或2两个氨基酸突变的抗体。
通常，免疫球蛋白具有重链和轻链。每条重链和轻链包含恒定区和可变区(这些区也被称为“结构域”)。组合时，重链和轻链可变区特异性结合抗原。轻链和重链可变区含有被三个高变区(也称为“互补决定区”或“CDR”)中断的“框架”区。已经确定了框架区和CDR的范围(参见Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，U.S.Department of Health and Human Services，1991，其在此通过引用并入本文)。不同轻链或重链框架区的序列在一个物种内相对保守。
CDR主要负责与抗原的表位结合。每条链的CDR通常称为CDR1、CDR2和CDR3，从N-端开始顺序编号，并且通常也通过特定CDR所处的链来鉴定。因此，VH CDR3位于其被发现的抗体重链可变结构域中，而VL CDR1是来自其被发现的抗体轻链可变结构域的CDR1。
提及“VH”或“VH”是指免疫球蛋白重链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv或Fab的可变区。提及“VL”或“VL”是指免疫球蛋白轻链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv或Fab的可变区。
如本文中所使用，“单克隆抗体”或“mAb”或“Mab”是指实质上均质抗体的群体，即除了可少量存在的可能的天然存在的突变以外，构成该群体的抗体分子的氨基酸序列相同。相比之下，常规(多克隆)抗体制剂典型地包括在其可变结构域、尤其CDR中具有不同氨基酸序列的许多不同抗体，其通常对不同表位是特异性的。修饰语“单克隆”指示抗体的特征为获得自实质上均质的抗体群体，且不应理解为需要通过任何特定方法产生该抗体。例如，待根据本发明使用的单克隆抗体可通过Kohler等人(1975)Nature 256:495首先描述的杂交瘤方法制得，或可通过重组DNA方法(参见例如美国专利号4,816,567)制得。“单克隆抗体”也可例如使用Clackson等人(1991)Nature 352:624-628和Marks等人(1991)J.Mol.Biol.222:581-597中描述的技术分离自噬菌体抗体文库。还参见Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116:731。
在另一个特定的实施方案中，本发明所述的抗体或抗体片段含有一个重链可变区(VH)，所述重链可变区含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
在另一个特定的实施方案中，本发明所述的抗体或抗体片段含有一个轻链可变区(VL)，所述轻链可变区含有SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：145所示的氨基酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％相同性的氨基酸序列。
术语“％相同性”通过在对比窗比较两个最佳比对的序列而确定，其中与参考序列(其不包含添加或缺失)相比，对比窗中的部分多肽序列可以包含添加或缺失(即缺口)，以最佳比对两个序列。“％相同性”如下计算：在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数除以对比窗中的位置总数，并将结果乘以100。
在另一个特定的实施方案中，本发明所述的抗体或抗体片段含有一个重链可变区(VH)和一个轻链可变区(VL)，其中所述重链可变区含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述轻链可变区含有SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：145所示的氨基酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％相同性的氨基酸序列。
在另一个特定的实施方案中，本发明所述的抗体具有SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：13的第1-241位氨基酸或SEQ ID NO：13的第1-242位氨基酸残基所示的氨基酸序列。
在另一个特定的实施方案中，本发明所述的抗体具有SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列。在另一个特定的实施方案中，本发明所述的抗体或抗体片段是单克隆抗体，平衡结合解离常数(KD)为1×10-8M或更低、1×10-9M或更低、或者1×10-10M或更低。
在另一个特定的实施方案中，本发明所述的抗体或抗体片段是单体或多聚体。
在另一个特定的实施方案中，本发明所述的抗体或抗体片段是源自哺乳动物抗体序列，尤其是源自人的抗体序列。
在另一个特定的实施方案中，所述的抗体或抗体片段直接与ED-B蛋白结构域结合。特别地，其中ED-B蛋白结构域可以为独立的ED-B重组蛋白，或ED-B蛋白与其他蛋白融合形成的重组蛋白，或含有ED-B结构域的天然纤连蛋白。更特别地，其中ED-B蛋白结构域可以来自人、小鼠、大鼠、鸡或其他物种。更特别地，其中ED-B蛋白结构域可以是糖基化蛋白或非糖基化蛋白。
在一个特定的实施方案中，所述的抗体片段可以是单价小分子抗体如单链抗体、单域抗体、超变区多肽等，Fab，或多价小分子抗体，如双链抗体、三链抗体、微型抗体。
在另一个特定的实施方案中，所述抗体是人免疫球蛋白IgG。
另一方面，本发明提供了包含本发明所述抗体或抗体片段的药物组合物。
在一个实施方案中，所述药物组合物进一步包含但不限于融合蛋白、放射性同位素、荧光染料、化学药物、纳米颗粒等。在一个特定的实施方案中，所述药物组合物用于肿瘤或癌症相关疾病的诊断或治疗。
另一方面，本发明提供了本发明所述抗体或抗体片段或药物组合物在预防、诊断和治疗癌症相关疾病中的用途。
另一方面，本发明提供了预防、诊断和治疗对象中癌症相关疾病的方法，包括给予对象治疗有效量或预防有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段或药物组合物。
另一方面，本发明提供了本发明所述抗体或抗体片段或药物组合物在制备预防、诊断和治疗癌症相关疾病的药物中的用途。
特别地，本发明所述癌症相关疾病是表达含ED-B结构域的FN(B+)的癌症。更特别地，所述癌症相关疾病是胃癌、结直肠癌、肺癌或乳腺癌。
如本文所用，“治疗”患有疾病或疾病状况的个体表示所述个体的症状部分或全部缓解，或者在治疗后保持不变。因此，治疗包括预防、治疗和/或治愈。预防指防止潜在疾病和/或防止症状恶化或疾病发展。治疗还包括所提供的任何抗体或其抗原结合片段以及本文所提供的组合物的任何药学用途。
如本文所用，“治疗有效量”或“治疗有效剂量”指施用于对象之后至少足以产生疗效的物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的量。因此，其为防止、治愈、改善、阻滞或部分阻滞疾病或病症的症状所必需的量。
如本文所用，“疗效”表示由个体的治疗所导致的效果，其改变、通常改良或改善疾病或疾病状况的症状，或者治愈疾病或疾病状况。
如本文所用，“预防有效量”或“预防有效剂量”指在施用于对象时会具有预期的预防效果的物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的量，例如，防止或延迟疾病或症状的发生或复发，减少疾病或症状发生或复发的可能性。完全预防有效剂量不必通过施用一个剂量发生，并且可以仅在施用一系列剂量之后发生。因此，预防有效量可以在一次或多次施用中施用。
如本文中所使用的，术语“对象”包括人和非人哺乳动物，例如小鼠、大鼠、羊、牛、狗、猫、兔等。
本发明的抗体或其抗原结合片段或本发明的药物组合物可以利用本领域公知的一种或多种方法通过一种或多种给药途径给药。本领域技术人员应当理解，给药途径和/或方式根据期望的结果而不同。本发明的给药途径包括例如肠胃外给药途径，例如注射或输注。本文使用的短语“肠胃外给药”是指除肠和局部给药以外的给药模式，通常是注射和输注，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、皮内、腹膜内和皮下。或者，本发明的针对肿瘤的抗体或其抗原结合片段或本发明的药物组合物也可以通过非肠胃外途径给药，如局部、表皮或粘膜途径给药，例如鼻内、经口、阴道、直肠、舌下或表面。
另一方面，本发明提供了包含本发明所述抗体或抗体片段的诊断试剂盒，所述试剂盒可用于诊断肿瘤组织的体内分布、病理组织切片等，或用于分析鉴定细胞、蛋白质等，或用于亲和纯化含有ED-B蛋白结构域的细胞或蛋白质分子。本发明进一步提供了本发明所述试剂盒在用于诊断肿瘤组织的体内分布、病理组织切片，分析鉴定细胞、蛋白质，或用于亲和纯化含有ED-B蛋白结构域的细胞或蛋白质分子中的用途。本发明更进一步提供了本发明所述试剂盒在制备用于诊断肿瘤组织的体内分布、病理组织切片，分析鉴定细胞、蛋白质，或用于亲和纯化含有ED-B蛋白结构域的细胞或蛋白质分子的试剂盒中的用途。
所述药物组合物或试剂盒中本发明的抗体或其抗原结合片段还可以与如细胞毒素、放射性同位素或生物活性蛋白质等治疗性部分缀合。可参见例如Remington’sPharmaceutical Sciences，第19版(Mack Publishing Co.1995)；和Goodman和Gilman的The Pharmacological Basis of Therapeutics，第7版(MacMillan PublishingCo.1985)。
另一方面，本发明提供了编码本发明所述抗体或抗体片段的多核苷酸分子。
在一个特定的实施方案中，所述多核苷酸分子含有如SEQ ID NO：2所示的编码抗体的重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列和如SEQ ID NO：4所示的编码抗体的轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列。
本文使用常规符号来描述核苷酸序列：单链核苷酸序列的左侧末端是5'末端；将双链核苷酸序列的左侧方向称为5'-方向。将5'至3'添加核苷酸至新生RNA转录物的方向称为转录方向。具有与mRNA相同序列的DNA链被称为“编码链”，DNA链上与从该DNA转录的mRNA具有相同序列并且位于RNA转录物5'末端5'的序列被称为“上游序列”，DNA链上具有与RNA相同序列并且位于编码RNA转录物的3'末端的3'的序列被称为“下游序列”。
特别地，本发明提供了一种抗人ED-B蛋白结构域的单克隆抗体(简称为DE2)该抗体为全人源抗体，含有人的重链可变区和轻链可变区，且提供了一种可连接重链可变区和轻链可变区的连接子片段，具体的，本文所述DE2抗体可以是DE2单链抗体(scFv)，其含有重链可变区、轻链可变区以及连接子，优先的构成方式为抗体重链可变区-连接子-抗体轻链可变区。其中，重链可变区具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；轻链可变区含有SEQ IDNO：3所示的氨基酸序列。优选地，连接片段含有(G4S)3S(SEQ ID NO：11)或(G4S)3(SEQ IDNO：94)所示的氨基酸序列。在一个特定的实施方案中，所述DE2抗体具有SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列。
另一方面，本发明也提供了编码上述单克隆抗体的DNA分子。
在其中一个实施例中，该DNA分子含有SEQ ID NO：2所示的编码所述单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列和SEQ ID NO：4所示的编码所述单抗轻链可变区的核苷酸序列，以及可选地SEQ ID NO：12所示可用于编码连接单克隆抗体重链和轻链可变区的连接子片段的核苷酸序列。
本发明所述的ED-B结构域的氨基酸序列可参见SEQ ID NO：16。
本文所述的“单克隆抗体”也简称为“单抗”，是指一类高度均质性的特异性抗体，即除少数可能存在的天然发生的突变体外，各抗体氨基酸序列和结构是相同的。单克隆抗体只识别一种抗原表位(抗原决定簇)，具有高度的特异性。“单克隆”仅表示抗体来源或组成的一致性，是对抗体特征的一种描述，非特定的生产方法或技术。单克隆抗体可以通过许多公知的方法来制备(Smith et al.(2004)J.Clin.Pathol.57,912-917；和Nelson etal.,J Clin Pathol(2000),53,111-117)。例如，单克隆抗体可以通过永生化B细胞来制备，例如通过与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤细胞系或者通过用诸如EBV的病毒感染B细胞。重组技术还可以用来在体外通过用携带编码抗体的核苷酸的人工序列的质粒转化宿主细胞来从宿主细胞的克隆群体制备抗体。
本文所使用的术语“抗体”、“单链抗体”、“抗体片段”或“免疫球蛋白”均含有抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)或其部分。重链和轻链之间可以通过一个共价二硫键连接或通过一个人工合成的多肽连接，形成单体或多聚体。各可变区可以与恒定区连接，也可以与其他的蛋白融合。
本文所述的术语“可变区”表示抗体中某些特定的序列在不同种抗体中存在较大差异，可变区的不同形成了各种抗体可特异性识别特定的抗原或抗原表位。可变区集中在重链和轻链的N端，是氨基酸序列变化较大的区域，分子量一般为约25000道尔顿。可变区内含有三个互补决定区(CDR，或称超变区)，不同CDR区之间较保守的部分称为框架区(FR)。CDR区是抗体识别和结合抗原的区域，直接决定抗体的特异性。
本文所述的抗体恒定区含重链恒定区和轻链恒定区，根据氨基酸序列的差异性分类，重链恒定区可分为5类，分别为：IgA，IgD，IgE，IgG，IgM，其中一些可进一步细分亚类；轻链恒定区可分为2类，分别为κ和λ。
本文所述的“融合蛋白”是指利用基因工程技术将两种或两种以上天然蛋白或人工修饰后的蛋白串联成一种蛋白，原蛋白之间可以通过人工设计的多肽片段连接或通过肽键直接连接。本文一般特指抗体与其他蛋白的融合形式，比如与其他抗体融合形成双特异性抗体或多特异性抗体；与细胞因子(例如白细胞介素-2(IL-2)，白细胞介素-15(IL-15)，白细胞介素-12(IL-12)，肿瘤坏死因子α(TNFα))融合形成融合蛋白；与蛋白类毒素和毒素的部分多肽序列或亚基，包括包括植物毒素(例如蓖麻毒素)、细菌毒素(例如霍乱毒素)、动物毒素(例如蜂毒肽)和真菌毒素，形成毒性靶向药物。所采用的技术手段为本领域内的技术人员所熟知。
本文所述抗体与化学药物偶联(Antibody-drug conjugate，ADC)形成新的药物分子是指抗体与化学药物通过共价反应形成的新化合物，所述化学药物包括抗有丝分裂剂、烷基化剂、抗代谢物、抗癌剂、抗血管生成剂、细胞凋亡剂、生物碱、抗生素或其组合。
本文所述“多聚体”指多个蛋白质单体通过共价或非共价形式形成的聚合体。例如人抗体IgG一般会以二硫键共价结合形成四聚体。
本文所述“放射性同位素”指具有放射性的核素，常用的同位素有碘131，碘125，镥177等。利用放射性同位素标记到对抗原具有高特异性、高亲和力的抗体上，制备成具有放射性的免疫治疗药物，注射入体内后可到达靶器官，发挥射线的生物学效应，也可用于诊断。
本文所述“药物组合物”指抗体或抗体片段与其他化学药物或放射性同位素通过化学键交联形成的新药物；也指抗体或抗体片段与其他蛋白质如细胞毒素通过细胞表达出的融合蛋白；也指抗体或抗体片段连接于纳米颗粒表面产生的新靶向制剂；也包括包含上述抗体、抗体片段、新药物、融合蛋白或制剂以及药学上可接受的载体的组合物。
本文所述“试剂盒”主要组成部分是本文所述抗体或抗体融合蛋白，或者在此基础上标记荧光素、放射性同位素、过氧化物酶、碱性磷酸酶等形成的新抗体组合物，试剂盒中可选地包含缓冲液、非本文所述抗体、酶促反应的底物如二氨基联苯胺(DAB)等，以及相应的支撑物如酶标板、磁珠等。试剂盒可用于诊断肿瘤组织的体内分布、病理组织切片等，或用于分析鉴定细胞、蛋白质等，或用于亲和纯化含有ED-B蛋白结构域的细胞或蛋白质分子。
本文所述”诊断”方法是指能对人体体液、血液、组织等反映人体健康状况的物质作出定性、定量的检测，常用的实验技术有免疫组织化学、免疫细胞化学、酶联免疫法等。
本文所述”治疗”方法是指采用抗体或抗体片段及其形成的药物组合体通过静脉注射或病变局部注射等方式进入体内后到达肿瘤组织，发挥药效的过程。
本发明提供了一种可特异性识别ED-B蛋白的抗体，该抗体含有SEQ ID NO：1所示的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：145所示的轻链可变区氨基酸序列。该抗体也可以采用多种形式发挥其生物学功能，但基本的，抗体片段含有重链的CDR3区序列或轻链的CDR3区序列。
本发明还提供了抗体的DNA序列。在一个实例中，所述DNA含有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，其编码抗体重链可变区氨基酸序列，和/或所述DNA含有SEQ ID NO：4或147所示的核苷酸序列，其编码抗体轻链可变区氨基酸序列。
进一步的，本发明还提供了以上单克隆抗体的制备方法。
在获得编码本发明抗体的氨基酸或核苷酸序列后，本领域的技术人员可通过本领域常规的方法来制备本发明的全人源单克隆抗体，例如，可采用本领域技术人员所熟知的杂交瘤技术、基因工程技术制备，可通过杂交瘤细胞株筛选或利用噬菌体抗体库展示技术分离获得。
如本文中所用，术语“杂交瘤”或“杂交瘤细胞”指由融合产抗体的淋巴细胞和不产抗体的癌细胞而产生的细胞或细胞系(通常为骨髓瘤或淋巴瘤细胞)。如本领域普通技术人员所知的，杂交瘤可增殖并持续供应产生特定单克隆抗体。用于产生杂交瘤的方法为本领域已知的(见例如，Harlow&Lane，1988)。当提及术语“杂交瘤”或“杂交瘤细胞”时，其还包括杂交瘤的亚克隆和后代细胞。
将本发明提供的单链抗体核苷酸序列克隆到蛋白表达载体中，或将抗体重链核苷酸序列和轻链核苷酸序列分别克隆到不同的表达载体或同一载体中，均可获得本发明的ED-B单克隆抗体。
本文所述的蛋白表达载体，包括但不限于原核细胞蛋白表达载体、酵母细胞蛋白表达载体、昆虫细胞蛋白表达载体、植物细胞蛋白表达载体和哺乳动物细胞蛋白表达载体，载体中含有用于在相应宿主细胞中表达蛋白所需的作用元件，如启动子、终止子、抗性筛选片段等。
编码本发明单克隆抗体的DNA序列可采用本领域技术人员熟知的手段获得，如根据氨基酸序列推测DNA序列，或通过提取mRNA来反转录获得，或直接采用人工合成的方法获得。然后通过酶切连接等技术手段将这些DNA序列插入到表达载体中，并且抗体的DNA序列处在适当的读码框内，具有必要的起始密码子和终止密码子。本发明所采用的表达载体是本领域技术人员熟知的各种商业化的表达载体。
将构建好的表达载体转化或转染到匹配的宿主细胞中，在适当的培养条件下即可表达出抗体蛋白。
“宿主细胞”包括原核细胞、真核细胞等。在本发明中，优选真核宿主细胞，更优选哺乳动物细胞，这些细胞可通过商业途径或合作单位获得，其中包括但不限于，中华仓鼠卵巢细胞(CHO)，人胚肾细胞(HEK293)、非洲绿猴肾细胞(Vero)、幼仓鼠肾细胞(BHK)，非洲绿猴肾细胞(COS)及其他多种永生化细胞系。本发明一般采用CHO细胞和HEK293细胞作为宿主细胞，这些细胞株在本领域内已被公认为能为蛋白质分子提供正确的翻译和蛋白折叠、二硫键形成、糖基化等修饰，且接近人源蛋白的天然状态。但本领域的技术人员熟知的，上述提到的各种细胞系及其亚型均可表达本发明所述的抗体或融合蛋白。
表达载体转化或转染宿主细胞的方法有电穿孔技术、脂质体介导、磷酸钙沉淀、PEI介导等方法，本领域内的技术人员可根据不同的宿主细胞及目的采用合适的转染方法。如采用PEI介导含抗体核苷酸序列的载体转染HEK293细胞，而采用Invitrogen公司的脂质体来转染CHO细胞用于构建稳定表达抗体的细胞株。
本发明所述抗体的纯化根据蛋白质的特性或采用的蛋白标签决定，如抗体中含有抗体的恒定区片段，可采用Protein A亲和层析方法，若含有6×组氨酸标签，则可采用镍柱亲和层析，或可采用离子交换层析、疏水层析、分子筛层析、透析、凝胶电泳等方法，本领域技术人员采用常规分离纯化方法就可以得到本发明所述的抗体或含有抗体的融合蛋白。
本发明所述的抗体可采用多种方法鉴定，比如酶联免疫吸附法(ELISA)、蛋白质印迹法(Western Blot)鉴定，亲和力检测可采用BIAcore技术或Scatchard分析法(Beatty etal.J Immunol Methods 1987,173-179)来测定。
本发明所述的抗体或抗体片段可用荧光染料或放射性同位素等化学物质标记用于生物体内或体外的示踪。其中一个具体案例是将抗体用Cy5.5荧光染料标记后，可通过荧光成像仪分析所标记抗体在小鼠体内的分布或代谢情况，也可通过本方法检测到小鼠体内ED-B高表达的实体肿瘤位置。
本发明所述的抗体或抗体片段可用荧光染料或具有生物活性的酶类标记，用于体外检测或实验研究。其中一个具体案例是将抗体用FITC荧光染料标记后，用于检测组织或细胞的ED-B的表达情况。特别的，本发明的抗体也可以不用做任何标记，借助带荧光染料或具生物活性酶类标记的二抗实现上述的检测，与此相关的抗体应用方法和实验技术，本领域内的技术人员可以通过常规技术手段实现。
本发明所述的抗体或抗体片段可与多种蛋白融合，或与化学药物、放射性同位素、纳米颗粒等偶联，发挥靶向作用，形成靶向药物。本发明的抗体或抗体片段及相应的靶向药物的药效可通过细胞水平、活体水平验证，本领域技术人员可以通过常规药物实验方法实现。
除非特别指出，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。本文引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、文章、教科书、公开出版物、GenBank序列、网站以及其他公开材料等及其中引用的参考文献均以其全文并入本文参考。如果发生冲突，以本说明书(包括术语解释)为准。在不脱离本发明的设计思路和保护范围的前提下可对本发明上述的具体描述或实施方案进行各种变化和改动，这对于本领域技术人员而言是明显的，所附权利要求覆盖了所有在本发明范围内的变动。
另外除非特别需要，单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。类似地，除非上下文另有明确指示，词语“或”旨在包括“和”。本发明所述技术和方法通常根据本领域熟知的及在本说明书引用的参考文献所述的常规方法进行。还应该理解的是，给出的核酸或多肽的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子质量值是近似的，并且仅供描述。
下面结合实施例进一步描述本发明。然而应当理解，列举这些实施例是为了起说明作用，并不是用来限制本发明。
实施例
本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方案的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。
实施例1：淘选对人FN中ED-B结构域特异的人源单链抗体
1)将ED-B基因(SEQ ID NO：16)利用常规分子克隆方法通过EcoRI和NotI限制性内切酶酶切位点克隆至pET-22b(+)(Novagen)中，用大肠杆菌进行蛋白表达。在ED-B的C端引入6个组氨酸的标签，并可利用这个标签进行亲和层析获得纯品蛋白。通过同样方式表达和纯化FN中其他III型结构域，FN-789(含FN-7、FN-8、FN-9)和FN-7B89(含FN-7、ED-B、FN-8、FN-9)，各序列的获得可参照文献(Leahy,Aukhil et al.Cell 1996,155-164,Schiefner,Gebauer et al.J Biol Chem 2012,17578-17588)。
2)抗体库的构建
设计全人合成抗体库用于淘选针对ED-B抗原的单链抗体。以在人类抗体分子中最为常见的DP47(Tomlinson,I.M.,Walter,G.,Marks,J.D.,Llewelyn,M.B.&Winter,G.(1992).The repertoire of human germline VH segments reveals about fiftygroups of VH segments with different hypervariable loops.J.Mol.Biol.,227,776-798)为重链模板，以DPL11(Williams,S.C.&Winter,G.(1993).Cloning and sequencingof human immunoglobulin V lambda gene segments.Eur.J.Immunol.,23,1456-1461)为轻链模板，用较常用的(G4S)3S(SEQ ID NO：11)肽链对应的DNA将二者先后连接形成单链抗体库模板，其中轻链和重链的CDR区根据经验随机添加形成。具体的，本抗体库DNA模板除重链CDR3区和轻链CDR3区为随机添加外，其他序列参见SEQ ID NO：15所示的A11核苷酸序列。本模板通过化学合成获得。随机抗体库构建的引物序列见下表，以上述合成的抗体库模板，分别用一对引物DP47EcoRback、DP47for和另一对引物DP47FR4back、DPL11for克隆出含随机序列的DP47和DPL11片段，然后以纯化的DP47和DPL11为混合模板，以DP47EcoRback、DPL11NotIfor为引物，进行PCR扩增，得到含随机序列的单链抗体DNA片段。单链抗体DNA片段中的重链和轻链分别由DP47和DPL11组成，重链、轻链随机序列分别由DP47for、DPL11for引物引入。单链抗体DNA片段的5’和3’端分别通过DP47EcoRback、DPL11NotIfor引物引入EcoRI和NotI限制性酶切位点，并通过该酶切位点构建到pCANTAB5E(AmershamBiosciences)质粒载体的多克隆位点中，用于构建产生随机抗体库的质粒，用电穿孔法将质粒转化到大肠杆菌TG1中进行下一步的噬菌体抗体库展示和抗体淘选。
注：N为选自A、C、G或T的任意核苷酸，M为选自A、C的任意核苷酸。
3)噬菌体抗体库展示和抗体淘选
参照Amersham Biosciences公司的重组噬菌体淘选用户手册(Expressionmodule/Recombinant Phage Antibody system product insert,Pharmacia Biotechdocument XY-040-00-08)进行。简略的，将抗体库大肠杆菌TG1菌液50μl加入到50ml新鲜的2×YT培养基中于37℃震荡培养至OD值为0.4-0.5，加入辅助噬菌体于37℃侵染30min，PEG8000(生工生物工程股份有限公司)沉淀后用10000g离心30min，用PBS重悬备用，使制备的抗体融合噬菌体库滴度应在1012CFU/ml以上。
EDB抗原(SEQ ID NO：16)包被于5ml免疫管，用牛奶封闭后加入2ml上述制备的噬菌体抗体库PBS溶液，37℃孵育2小时，倒掉免疫管中的液体，用含0.1％吐温-20的PBS洗涤20次，加入4ml对数期的TG1细菌，37℃静置孵育1小时。将菌液涂布于含氨苄青霉素和葡萄糖的SOB平板上，过夜培养后收集侵染噬菌体的大肠杆菌TG1菌液，完成第一轮淘选。将获得的TG1菌液再次用于制备抗体融合噬菌体库，进入第二轮淘选。
以ED-B为抗原共进行3轮淘选，所得的大肠杆菌TG1通过合适的比例稀释后涂布至琼脂糖平板上获得单克隆菌落，分别用于表达可溶性的抗体进行ELISA检测，选择在包被抗原相同条件下显色最强的噬菌体克隆用于进一步分析。
4)抗体从原核载体向真核载体的克隆
将淘选所得的单链抗体的DNA片段通过EcoR I和Not I酶切后连接至含有人IgG1抗体恒定区Fc片段DNA序列的pCI-neo(Promega)载体中，抗体DNA序列与IgG1Fc的DNA序列在同一个开放阅读框内，使二者能表达出融合蛋白，其中IgG1Fc位于融合蛋白的碳端，可用于单链抗体的纯化及提高抗体蛋白的稳定性。以下实施例3、实施例4、实施例5、实施例8所用抗体DE2-Fc(SEQ ID NO：13)或L19-Fc，均为带有IgG1Fc的单链抗体重组蛋白。
5)抗体蛋白的真核细胞表达
转染前1天接种，初始密度为50万/ml，达到100万/ml后，将细胞离心(100g,5min)。弃上清，用3mL SFM4Transfx293(Hyclone)润洗细胞，弃上清，以等体积的SFM4Transfx293培养基重悬。制备转染复合物：加60μg DNA至1mL预热PBS(Hyclone,SH30256.01B)中，轻柔混匀，室温放置，形成溶液A。加入120μl PEI(1mg/ml)至1mL预热PBS中，涡旋混匀，形成溶液B。将溶液B加入溶液A，枪头轻柔洗打混匀，室温静置15—25min。将上述转染复合物加入到20ml细胞培养体系中，继续培养，次日直接添加等体积蛋白表达培养基SFM4HEK293(Hyclone,SH30521.02)，继续培养。转染4天后，可离心(800rmp，10min)收集培养基用于蛋白纯化。纯化蛋白经直接ELISA(固相载体包被抗原为ED-B蛋白，一抗为待测的含Fc抗体的细胞培养液，二抗为HRP标记的鼠抗人IgG)和SDS-PAGE实验验证，获得了目标抗体蛋白，抗体蛋白产量约为40mg/L。
6)单克隆抗体的纯化
用Ni亲和层析柱(Qiagen)纯化带组氨酸标签的蛋白，Protein A亲和柱(Genscript)纯化带IgG1恒定区Fc的抗体，相应流程按厂商说明书进行。
经哺乳动物细胞表达并纯化的抗体蛋白经直接ELISA(固相载体包被抗原为ED-B蛋白，一抗为纯化获得的含Fc的抗体，二抗为HRP标记的鼠抗人IgG)检测分析，获得了本发明的A11抗体。A11抗体亲和力(选用Scatchard分析方法，见Beatty et al.JImmunolMethods 1987,173-179)显著高于L19，约为L19的3倍，与B5抗体亲和力一致。A11抗体的氨基酸序列见SEQ ID NO：14。
实施例2：抗体亲和力成熟
1)噬菌体A11抗体亚库的构建
为获得更高亲和力的抗体突变体，选择A11为对象，其编码DNA序列为SEQ ID NO：15。对A11抗体的轻链CDR1：SGDSLGIGSNNYVS(SEQ ID NO：143)、CDR2：DDNKRPS(SEQ ID NO：144)区进行随机化突变，突变方法如下：以A11抗体DNA序列为模板，以下表中引物DPL11CDR1back和DPL11CDR2for为引物进行第一轮PCR扩增，所得产物经纯化后以引物DPL11PstIback和DPL11AgeIfor为引物进行第二轮PCR扩增，所得产物通过引物引入的酶切位点PstI和AgeI克隆入噬菌粒载体pCANTAB5E-A11载体(即实施例1中含有A11抗体序列的pCANTAB5E质粒载体)中，形成全合成噬菌体单链抗体亚库。
注：N为选自A、C、G或T的任意核苷酸，M为选自A、C的任意核苷酸，K为选自T、G的任意核苷酸。
2)抗体亚库高亲和力突变体的淘选
利用本实施例中构建的A11抗体亚库，以原核表达的ED-B为抗原，进行四轮固相淘选。对后三轮淘选的产物进行单克隆噬菌体展示，并通过原核可溶性表达的抗体蛋白进行ELISA初步鉴定阳性克隆。通过HEK293T(得自博士德生物工程有限公司)细胞真核表达的抗体蛋白进行进一步的活性鉴定。具体淘选、抗体表达、阳性克隆鉴定方法同实施例1。
3)淘选结果
将淘选获得的显色最强的噬菌体阳性克隆，挑选50个测序，获得47个测序图谱，共24种不同序列。其中32个序列有重复，CB3、DE2、CA5重复数最高，CA12、CD1次之，另有15个序列为单序列。增加测序样本数可提高富集重复序列数。
经HEK293T表达获得抗体后用于ELISA亲和力检测(见Beatty et al.J ImmunolMethods 1987,173-179)，优选亲和力较高的抗体作为候选抗体。ELISA方法测定突变体抗体的相对亲和力，所有获得的新抗体均可与ED-B特异性结合，亲和力与A11相当或显著高于A11，其中DE2抗体亲和力最高且多次重复试验结果稳定，CB3、CA5、CD1、CB2抗体亲和力基本一致且略低于DE2。将DE2抗体列入候选抗体，进行进一步分析。
根据所用引物序列，可知上述抗体的轻链CDR1和CDR2的序列如下表所示。
序列名称 LCDR1 SEQ ID NO： LCDR2 SEQ ID NO：
CB3 SGDSLGIAWSSAVS 95 SASERPS 119
DE2 SGDSLGIFRSGMVS 96 LPTSRPS 120
CA5 SGDSLGIRAFTPVS 97 QSHWRPS 121
CA12 SGDSLGIRLPPGVS 98 SNTTRPS 122
CD1 SGDSLGISRSTYVS 99 SAELRPS 123
CB2 SGDSLGIPGFSPVS 100 SYRSRPS 124
CA1 SGDSLGIHMPPYVS 101 SSQHRPS 125
CD7 SGDSLGILARSPVS 102 SHGRRPS 126
DE1 SGDSLGILWLSPVS 103 WSNDRPS 127
DF3 SGDSLGIAWSSSVS 104 FRVSRPS 128
CB4 SGDSLGICPLVSVS 105 SAYLRPS 129
DF1 SGDSLGIFLPGRVS 106 DLMSRPS 130
DH3 SGDSLGIGWSGSVS 107 LKSQRPS 131
DE10 SGDSLGILGSGPVS 108 LPTFRPS 132
CA2 SGDSLGILRPAPVS 109 ANELRPS 133
CD4 SGDSLGIPARSPVS 110 PRTPRPS 134
DG2 SGDSLGIPSFSPVS 111 PNARRPS 135
CA3 SGDSLGIPWVSGVS 112 PSDHRPS 136
CB7 SGDSLGIRLFLPVS 113 ASQSRPS 137
CC3 SGDSLGISRSRYVS 114 SAELRPS 138
CB1 SGDSLGISRSTYVS 115 SAKLRPS 139
CC2 SGDSLGITQSKYVS 116 SAELRPS 140
DE4 SGDSLGIVRSLGVS 117 LNGRRPS 141
DE6 SGDSLGIWLCGPVS 118 LPRSRPS 142
另外，由上述结果说明，若候选抗体的CDR3区不变，通过对非CDR3区(如轻链CDR1、CDR2区或重链CDR1、CDR2区)修改后，抗体的亲和力会发生改变，并有部分突变体的亲和力会显著提高。对抗体的CDR区进行单点突变一般不会改变抗体的特异性，具体的如A11抗体亲和力成熟后的抗体CD1和CC3轻链CDR1区。同样的，对抗体的CDR区进行多点突变一般不会改变抗体的特异性，具体的如A11抗体亲和力成熟后的抗体CB1和CC3轻链CDR1区。但对候选抗体CDR区的突变可能会改变抗体的亲和力。
实施例3：抗体的免疫荧光标记
1)抗体的FITC标记
抗体溶解在0.1M碳酸盐缓冲液(PH＝9.5)中，终浓度为2mg/ml。在避光条件下新鲜配制FITC的DMSO溶液，终浓度为1mg/ml。按抗体与FITC的质量比为10：1，将FITC间隔、缓慢加入蛋白溶液中，边加边搅动使其与抗体混合均匀；全部加完后，混合1小时，转入黑暗中反应过夜(4℃冰箱内)。加5mol/L NH4Cl至终浓度50mM，4℃混合2小时以终止反应。采用GE公司HiTrap Desalting除盐预装柱，经Sephadex G-25填料快速除盐后按需保存，荧光染料使用过程需避光。
2)抗体的Cy5.5 NHS Ester标记
抗体溶解在0.1M碳酸盐缓冲液(PH＝9.0)中，终浓度为2mg/ml。在避光条件下新鲜配制Cy5.5 NHS Ester(GE Healthcare)的DMSO溶液，终浓度为1mg/ml。按抗体与Cy5.5 NHSEster质量比为10:1，将Cy5.5 NHS Ester间隔、缓慢加入蛋白溶液中，边加边搅动使其与抗体混合均匀；全部加完后，室温避光反应4小时。采用GE公司HiTrap Desalting除盐预装柱，经Sephadex G-25填料快速除盐后按需保存。整个荧光染料使用过程需避光。
实施例4：抗体的特异性检测
1)分子水平特异性检测
将FN-789，FN-7B89和ED-B(同实施例1)三种蛋白作为抗原，用牛奶封闭后以DE2抗体为一抗，辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG抗体为二抗，TMB为底物进行ELISA检测试验，实验结果显示(图2)，DE2抗体可特异性结合ED-B蛋白和含有ED-B结构域的FN-7B89蛋白，但不能与不含ED-B的FN-789蛋白结合。
2)细胞水平特异性检测
构建羧基端含整合蛋白alpha-IIb跨膜区W968-K989(Li,R.,et al.(2004).JBiol Chem 279(25):26666-26673)的FN-7B89于pCI-neo质粒中，瞬时转染CHO-K1细胞(博士德生物工程有限公司)，得到跨膜表达FN-7B89的CHO-K1细胞株，命名为CHO-7B89，其细胞膜表面ED-B表达阳性。构建跨膜表达FN-789的CHO-K1细胞株，命名为CHO-789，其显示ED-B阴性。
CHO-7B89和CHO-789各10mL(200×104/mL)600rpm离心5min；弃上清，37℃PBS(Hyclone,SH30256.01B)洗涤1遍，100目过滤得单细胞悬液。计数，PBS重悬细胞，分别分为8组，每组100万细胞。如实施例3所述标记抗体。
样本1：抗体为FITC标记的L19-Fc，浓度为50ng/μl共100μl。
样本2：抗体为FITC标记的DE2-Fc，浓度为50ng/μl共100μl。
加入标记抗体，室温孵育1小时，800rpm离心5min，用1ml冷的PBS重悬细胞，800rpm离心5min，洗去未结合抗体，重复洗涤一次。加入抗荧光淬灭封片剂(博士德生物工程有限公司)保护细胞形态。荧光显微镜检测。
结果显示(图3)，DE2抗体可特异性与CHO-7B89细胞特异性结合，但与CHO-789细胞的实验结果显示为阴性。现象与L19抗体一致。
实施例5：抗体亲和力测定
1)用ELISA方法测定ED-B抗原抗体的绝对亲和力
亲和力测定选用Scatchard分析方法(Beatty et al.J Immunol Methods 1987,173-179)，0.1μg/μl ED-B抗原按1：1，1：2，1：4，1：8倍4个浓度梯度稀释后包被酶标板，并于4℃过夜后用4％脱脂奶粉封闭。加入3倍梯度稀释的单链抗体，抗体起始浓度10μg/ml，室温反应1小时后加入辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG抗体反应1小时，加入四甲基联苯胺(TMB)显色到适当深度后，用2M H2SO4终止，测定OD450光吸收值。
经计算，结果显示DE2抗体平衡解离常数KD为0.37nM，CC3抗体平衡解离常数KD为1.18nM。L19抗体平衡解离常数KD为6.00nM，即DE2、CC3抗体亲和力高于L19。
2)用Biocore3000测定ED-B抗原抗体的绝对亲和力。
选用单层羧基芯片CM5(GE,BR100012)(与蛋白的氨基偶联)，包被用pH＝4的醋酸缓冲液稀释抗原EDB(浓度10μg/ml)为固定相。用1M pH＝8.5的乙醇胺-HCl缓冲液以封闭芯片。
动力学常数测定时，选择合适的抗体浓度梯度，往下1:2梯度稀释，共八个浓度作为流动相，每个浓度平行进样三次，用BIAcore3000检测二者动态的结合与解离的情况。
经检测，DE2抗体的平衡解离常数Kd为93.6pM；CC3抗体的平衡解离常数Kd为325pM。。
而已报导的L19抗体亲和力经BIAcore检测值为kon为1.1×105，koff为9.6×10-5，Kd＝8.7×10-10M，即L19亲和力为872.7pM(Pini,Viti et al.J Biol Chem 1998,21769-21776)。用本方法检测DE2抗体亲和力也显著高于L19。
实施例6：单克隆抗体的分布
(1)单克隆抗体的生物分布
BALB/c Nude小鼠(6-8周龄，雌性，SPF级)，将体外培养的小鼠畸胎瘤细胞F9(得自上海复祥生物科技有限公司)于皮下注射造模，每个植瘤点给予300万个F9细胞，5天后小鼠出现实体瘤。在造模后第9天通过尾静脉按10μg/只注射抗体DE2-Cy5.5(如实施例3所述标记抗体)，24小时后用小动物活体成像仪(Xenogen)成像观察。
活体成像(图4)显示FN(B+)高表达的F9细胞种植肿瘤组织有很强的近红外荧光，在膀胱位置偶见较强近红外荧光，其他部位荧光强度很弱或难以检测，表明DE2-Cy5.5荧光染料富集于肿瘤组织。
实验也表明DE2抗体在生物体内具有靶向作用，能富集于表达ED-B的肿瘤组织中，携带的指示物质如Cy5.5可用于分析肿瘤位置和大小等信息，即用于肿瘤诊断。
(2)单克隆抗体的组织分布
将Cy5.5标记的DE2抗体(如实施例3所述标记抗体)10μg通过为静脉注射到小鼠体内16小时后，取肿瘤组织进行冰冻切片，用DAPI染细胞核，通过激光共聚焦显微镜分析。Cy5.5标记的抗体主要分布在肿瘤组织血管壁上和肿瘤细胞外间质(图5)，并可见细胞质中有大量分散的Cy5.5荧光颗粒。非肿瘤组织中未见明显的Cy5.5标记抗体。
实施例7：抗体的动物药效
DE2抗体和白介素-2的融合蛋白氨基酸序列见SEQ ID NO：74，经CHO-K1细胞表达并纯化后，用于实验验证DE2抗体对提高白介素-2对肿瘤生长的抑制效果。
约20g/只的健康Bal b/c小鼠，于前肢腋下注射3×106个小鼠畸胎瘤细胞F9，6天后选择肿瘤体积为70-100立方毫米的小鼠用于药效研究。肿瘤体积计算方法为：肿瘤最大直径(毫米)×最小直径(毫米)×最小直径(毫米)×0.5。相对肿瘤体积计算方法为：接种后第15天的肿瘤体积与接种后第6天肿瘤体积的比值。
给药方法：实验组在肿瘤细胞接种后第6天和第10天分别按每只小鼠30μg抗体药物DE2-IL2，经尾静脉注射给药。阳性对照组分别在第6天和第10天通过尾静脉注射10μg/只人白介素-2(hIL-2)。阴性对照组注射等体积生理盐水，即50μl/只小鼠。每组均为7只小鼠。
实验结果：在接种肿瘤细胞15天后，阴性对照组的相对肿瘤体积为22.0±9.5，阳性对照组的相对肿瘤体积为16.6±6.1，实验组的相对肿瘤体积为5.7±4.0。实验组与阴性对照组、阳性对照组的相对肿瘤体积差别均有显著统计意义(p<0.01)。而阴性对照组和阳性对照组的相对肿瘤体积之间的差异无统计意义。
实验表明hIL-2和DE2-IL2均可以抑制小鼠畸胎瘤的生长，DE2-IL2的肿瘤抑制效果比hIL-2显著，能使肿瘤生长速度明显变慢。
实施例8：高亲和力抗体的抗原线性表位分析
根据ED-B序列合成长度不等的多肽，多肽一般由6-10个氨基酸组成。将合成多肽分别用戊二醛偶联至牛血清白蛋白(BSA)，形成多肽-BSA。
取BSA适量以0.1mol/L pH8.5硼酸缓冲液充分溶解，然后按比例加入一定量合成多肽，混合均匀。BSA分子与多肽分子结合比例为1：10。然后边震荡边缓慢加入含0.3％戊二醛的硼酸缓冲液1mL，室温作用2小时。为中和未反应完全的戊二醛，在上述反应液中加入甘氨酸0.25mL，室温继续中和30min。以硼酸缓冲液透析24小时，换液4次。-20℃保存备用。
将不同的多肽-BSA稀释至相同浓度，分别包被于酶标板上，以ED-B为阳性对照，于37℃静置2小时，用PBS(pH＝7.4)洗涤3次后加入5％的脱脂奶粉于37℃封闭1小时。用PBS洗涤3次后加入辣根过氧化物酶标记的DE2-Fc，37℃孵育1小时，用PBS洗涤6次。加入辣根过氧化物酶底物四甲基联苯胺(TMB)，室温避光放置约15min，加入2mol/L的硫酸终止反应。测定OD450光吸收值，并比较不同多肽样本吸光值。吸光值高提示与DE2-Fc抗体结合能力更强。
结果如下表所示：
根据检测结果，绘制抗原表位示意图6和图7。图6是DE2抗体与ED-B结合的抗原表位。合成多肽序列用水平线条表示，线条粗细表示相对亲和力高低。图7也是DE2抗体与ED-B结合的抗原表位，其中与DE2抗体结合能力最高的多肽所在区域用透视球标识。
实验结果表明DE2抗体可以与ED-B抗原的多肽片段结合，即DE2能识别ED-B的线性表位，提示DE2能识别并结合变性ED-B蛋白或片段。编号为EDB112的线性表位VDITDS(SEQID NO：76)是DE2抗体识别的重要区域之一；编号为EDB141的线性表位TGLEPGIDY(SEQ IDNO：88)是DE2抗体识别的重要区域之一；编号为EDB121的线性表位NSSTIIGYR(SEQ ID NO：81)是DE2抗体识别的重要区域之一。
如图7所示，编号为EDB112、EDB141、EDB121均处于ED-B的无规则卷曲区域。多肽EDB112、EDB141空间位置相邻，且与DE2抗体亲和力强。

Claims (21)

1.一种特异性结合选自VDITDS(SEQ ID NO：76)、TGLEPGIDY(SEQ ID NO：88)、NSSTIIGYR(SEQ ID NO：81)和/或EDB(SEQ ID NO：16)的肽的分离的抗体或其抗原结合片段。
2.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3，其中所述重链CDR1由SEQ IDNO：5所示的氨基酸序列组成，所述重链CDR2由SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列组成，所述重链CDR3由SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列组成，所述轻链CDR1由SEQ ID NO：95-118和143任一所示的氨基酸序列组成，所述轻链CDR2由SEQ ID NO：119-142和144任一所示的氨基酸序列组成，所述轻链CDR3由SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列组成。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其所述轻链CDR1和CDR2选自以下任一组合的氨基酸序列组成：
-SEQ ID NO：95和SEQ ID NO：119；
-SEQ ID NO：97和SEQ ID NO：121；
-SEQ ID NO：99和SEQ ID NO：123；
-SEQ ID NO：100和SEQ ID NO：124；
-SEQ ID NO：114和SEQ ID NO：138；
-SEQ ID NO：143和SEQ ID NO：144。
4.权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3，其中所述重链CDR1由SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成，所述重链CDR2由SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列组成，所述重链CDR3由SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列组成，所述轻链CDR1由SEQ ID NO：114所示的氨基酸序列组成，所述轻链CDR2由SEQ ID NO：138所示的氨基酸序列组成，所述轻链CDR3由SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列组成。
5.权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3，其中所述重链CDR1由SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成，所述重链CDR2由SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列组成，所述重链CDR3由SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列组成，所述轻链CDR1由SEQ ID NO：143所示的氨基酸序列组成，所述轻链CDR2由SEQ ID NO：144所示的氨基酸序列组成，所述轻链CDR3由SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列组成。
6.权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其重链可变区包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，和/或其轻链可变区包含SEQ ID NO：14所示的Gln133至Gly242氨基酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％相同性的氨基酸序列。
7.权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段具有的平衡结合解离常数(KD)为1×10-8M或更低、1×10-9M或更低、或者1×10-10M或更低。
8.权利要求1-7任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段选自三链抗体、合成抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体、人抗体、非人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、胞内抗体、Fab片段、Fab'片段、F(ab’)2片段、Fv片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fd’片段、单链抗体(scFv)和单链Fab(scFab)。
9.权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是双特异性抗体。
10.权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是人免疫球蛋白IgG。
11.权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其是单链Fv(scFv)，其中VH包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，并且VL包含SEQ ID NO：14所示的Gln133至Leu241氨基酸序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％相同性的氨基酸序列。
12.权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述scFv包含SEQ ID NO：14或SEQID NO：146所示的氨基酸序列。
13.包含权利要求1-12任一项的分离的抗体或其抗原结合片段的药物组合物。
14.权利要求13所述的药物组合物，其中所述药物组合物任选进一步包含融合蛋白、放射性同位素、荧光染料、化学药物和/或纳米颗粒。
15.权利要求13或14所述的药物组合物，其中所述药物组合物用于诊断或治疗肿瘤或癌症。
16.权利要求1-12任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段或权利要求13-15任一项所述的药物组合物在制备预防、诊断和治疗肿瘤或癌症相关疾病的药物中的用途，其中所述肿瘤或癌症是表达含ED-B结构域的FN(B+)的肿瘤或癌症。
17.权利要求13-15任一项所述的药物组合物或权利要求16所述的用途，其中所述肿瘤或癌症选自鼻咽癌、头颈癌、食管癌、胃癌、结直肠癌、肺癌、乳腺癌和软组织肉瘤。
18.包含权利要求1-12任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段的试剂盒，所述试剂盒可用于：(i)诊断表达含ED-B结构域的FN(B+)的肿瘤组织的体内分布或病理组织切片，(ii)分析鉴定含有ED-B蛋白结构域的细胞或蛋白质，或(iii)亲和纯化含有ED-B蛋白结构域的细胞或蛋白质分子。
19.权利要求1-12任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段在制备用于(i)诊断表达含ED-B结构域的FN(B+)的肿瘤组织的体内分布或病理组织切片，(ii)分析鉴定含有ED-B蛋白结构域的细胞或蛋白质，或(iii)亲和纯化含有ED-B蛋白结构域的细胞或蛋白质分子的试剂盒中的用途。
20.编码权利要求1-12任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段的核酸分子。
21.权利要求20的核酸分子，其包含：
(a)SEQ ID NO：15的核苷酸序列，和/或
(b)SEQ ID NO：147的核苷酸序列，和/或
(c)与(a)或(b)简并的核苷酸序列。
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