CN117427068A - 阿齐瑞格在治疗奥希替尼耐药的肺腺癌中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了阿齐瑞格在治疗奥希替尼耐药的肺腺癌中的应用。本发明首次发现阿齐瑞格可以抑制PC9/OR细胞的活力，并使其发生G0/G1周期阻滞，同时升高ROS水平促进其死亡，为治疗奥希替尼耐药的非小细胞肺癌提供了新的治疗策略，同时提供了一种阿齐瑞格的新应用。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种阿齐瑞格在治疗奥希替尼耐药的肺腺癌中的应用。
背景技术
肺癌是常见的恶性肿瘤之一，绝大多数起源于支气管黏膜上皮，发病率和致死率均高居首位，严重威胁着国民的健康。其中，非小细胞肺癌(non-samll cell lungcarcinoma,NSCLC)约占肺癌总数的85％，其起病隐匿，六成以上的患者确诊时已进入晚期或发生转移。传统的治疗方法有手术切除，放化疗等，但总体效果仍不佳，患者五年生存率未得到明显的提高，总体上小于5％，最高仅有17％。
随着医学技术的发展，分子靶向治疗给NSCLC患者带来了新的希望。近年来，表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(Epidermal growth factor receptor-tyrosine kinaseinhibitor,EGFR-TKI)等分子靶向药物使得NSCLC的临床治疗获得了突破性进展。奥希替尼(Osimertinib,Osi)是第三代表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂(Epidermal growthfactorreceptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)的代表药物，是晚期NSCLC患者携带EGFR突变的首选药物。鉴于其显著的疗效和安全性，该药被推荐用于EGFR突变的晚期或转移性NSCLC患者的一线治疗。
尽管奥希替尼疗效显著，但在用药一年左右后同样会不可避免地产生耐药性，从而导致治疗失败。奥希替尼耐药机制多种多样，主要可以分为EGFR依赖性机制和EGFR非依赖性机制两种。目前，针对不同的奥希替尼耐药机制的治疗策略已有不少报道，但由于多种耐药机制的共存和耐药机制的不断变化，导致治疗效果不佳，这增加了制定有效治疗策略的难度。奥希替尼耐药的出现限制了成功的长期治疗，并对EGFR突变的NSCLC患者提出了新的巨大的挑战。因此，寻找新的安全有效的药物来克服这一棘手的挑战是非常迫切的。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种用于治疗奥希替尼耐药的非小细胞肺癌的药物。
为了实现上述发明目的，本发明包括如下技术方案。
一方面，本发明提供了阿齐瑞格在制备预防和/或治疗肺癌的药物中的应用。
在其中一些实施例中，所述肺癌为非小细胞肺癌。
在其中一些实施例中，所述肺癌为携带EGFR突变的肺癌。
在其中一些实施例中，所述肺癌为携带EGFR第19外显子缺失突变的肺癌。
在其中一些实施例中，所述肺癌为经过表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂治疗后产生耐药性的肺癌。
在其中一些实施例中，所述表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂为奥希替尼。
在其中一些实施例中，所述肺癌为对奥希替尼耐药的非小细胞肺癌。所述阿齐瑞格可以使PC9/OR细胞发生G0/G1期阻滞，并且可以明显升高PC9/OR细胞内的ROS水平，从而可以抑制PC9/OR细胞的生长和增殖。
另一方面，本发明还提供了一种用于治疗对奥希替尼耐药的非小细胞肺癌的药物，由活性成分和药学上可按受的辅料制备而成，所述活性成分为阿齐瑞格。
阿齐瑞格(Azeliragon)是口服小分子晚期糖基化终产物受体(RAGE)抑制剂，曾被用于治疗阿尔茨海默症的研究，临床前研究结果对改善认知有效，但在临床试验未能成功。目前，对阿齐瑞格的研究主要集中在精神疾病领域。本发明经过实验证明，阿齐瑞格可以使人肺腺癌PC9/OR(Osimertinib resistance)细胞发生G0/G1周期阻滞，同时升高PC9/OR细胞的活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平，促进细胞的死亡，从而可以显著抑制PC9/OR细胞的生长和增殖。
本发明首次发现阿齐瑞格可以抑制PC9/OR细胞的活力，并使其发生G0/G1周期阻滞，同时升高ROS水平促进其死亡，为治疗奥希替尼耐药的非小细胞肺癌提供了新的治疗策略，同时提供了一种阿齐瑞格的新应用。
附图说明
图1为NSCLC奥希替尼获得性耐药细胞模型的验证结果；其中，
A为CCK8实验检测亲本细胞和耐药细胞的奥希替尼IC50值；
B为q-PCR实验检测ABCB1的基因表达情况；
C为WB实验检测ABCB1的蛋白表达情况。
图2为不同浓度阿齐瑞格对PC9/OR细胞活力的影响。
图3为流式细胞术检测阿齐瑞格对PC9/OR细胞周期的影响；其中，A为流式细胞周期检测的结果，B为结果的统计量化图。
图4为流式细胞术检测阿齐瑞格对PC9/OR细胞中ROS水平的影响；其中，A为流式细胞术检测ROS的结果，B为结果的统计量化图。
具体实施方式
下面通过具体实施例来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
为了对奥希替尼耐药的肺腺癌提供新的治疗方法，本发明经过大量的研究探索，发现阿齐瑞格可以抑制PC9/OR细胞的活力，并使其发生G0/G1周期阻滞，同时升高ROS水平促进其死亡，为治疗奥希替尼耐药的非小细胞肺癌提供了新的治疗策略，同时提供了一种阿齐瑞格的新应用。
在本发明的一个实施方案中，本发明提供了阿齐瑞格在制备预防和/或治疗肺癌的药物中的应用。
其中，所述肺癌可以为普通肺癌，特别是可以为携带EGFR突变的肺癌。例如，EGFR突变可以为第19外显子缺失突变。
本发明的阿齐瑞格尤其对经过表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂治疗后产生耐药性的肺癌具有较强的抑制作用；其中，所述表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂例如可以是奥希替尼。
特别优选地，本发明所述肺癌为对奥希替尼耐药的非小细胞肺癌。本发明所述的阿齐瑞格可以使PC9/OR细胞发生G0/G1期阻滞，并且可以明显升高PC9/OR细胞内的ROS水平，从而可以抑制PC9/OR细胞的生长和增殖。
在本发明的另一实施方案中，本发明还提供了一种用于治疗对奥希替尼耐药的非小细胞肺癌的药物，由活性成分和药学上可按受的辅料制备而成，所述活性成分为阿齐瑞格。
所述的药物可以各种给药途径给予患者，包括但不限于口服、透皮、肌肉、皮下和静脉注射。
本发明所述的药物，其剂型不限，只要能够使活性成分有效达到体内的剂型都可以，包括：注射剂、片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、口含剂、颗粒剂、冲剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、丸剂、粉剂、喷雾剂、滴剂、栓剂、霜剂、贴剂等；优选注射剂型，如：液体注射剂、粉针剂、注射用片剂等；注射形式包括但不限于原药形式、载药纳米粒等；注射部位包括但不限于皮内注射、皮下注射、肌肉注射、静脉注射以及脊椎腔注射等。
本发明通过药物大剂量冲击法诱导奥希替尼耐药细胞模型，利用CCK-8检测不同细胞中奥希替尼的IC50值，计算耐药系数，通过实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative polymerase chain reaction,qPCR)实验和蛋白免疫印迹实验(Westernblotting,WB)检测多药耐药基因ABCB1的表达水平，对奥希替尼耐药细胞模型是否构建成功进行了验证。在此基础上，通过CCK-8、流式细胞术等实验，测定了阿齐瑞格的抗肿瘤效果。实验过程中，通过CCK-8实验测定不同浓度阿齐瑞格处理PC9/OR细胞48h的细胞活力。结果显示阿齐瑞格可以有效抑制PC9/OR细胞的活力，且呈明显的剂量依赖性，IC50值为4.298μM。同时，以0、2、4、6μM阿齐瑞格处理PC9/OR细胞24h，再通过流式细胞术对细胞周期进行检测，证实阿齐瑞格可以使PC9/OR细胞发生G0/G1期阻滞。并且用流式细胞术检测了0、2、4、6μM阿齐瑞格处理了12h的PC9/OR细胞中的ROS水平，结果显示阿齐瑞格可明显升高PC9/OR细胞内ROS的水平。这些结果说明，本发明首次发现了阿齐瑞格可以抑制PC9/OR细胞的活力，并使其发生G0/G1周期阻滞，同时升高ROS水平促进其死亡，为治疗奥希替尼耐药的非小细胞肺癌提供了新的治疗策略，同时提供了一种阿齐瑞格的新应用。
以下为实施例中所用材料：
RPMI1640培养基、青霉素-链霉素(100X)购于美国Gibco公司；
胎牛血清购于中国苏州依科赛生物科技股份有限公司；
奥希替尼(T2490)购于中国上海陶术生物科技有限公司；
DCFH-DA(HY-D0940)购于美国MCE公司；
CCK-8试剂盒(FD3788)购于中国杭州弗德生物科技有限公司；
CCK-8试剂盒(C0005)购于美国TargetMol公司；
细胞周期检测试剂盒(KGA511)购于中国凯基公司。
以下为具体实施例。
实施例1NSCLC奥希替尼获得性耐药细胞模型的建立和验证
1、细胞培养
人非小细胞肺癌细胞株PC9(EGFR基因第19外显子缺失突变)购于中国医学科学院基础医学研究所。PC9细胞培养于含10％胎牛血清、1％青霉素和链霉素的RPMI1640培养液中，于37℃、5％CO2培养箱中进行培养。
2、耐药模型建立
利用奥希替尼敏感性PC9细胞，按照药物大剂量冲击法，建立奥希替尼获得性耐药细胞株PC9/OR。用10μM浓度奥希替尼处理对数生长期的PC9细胞48h，撤药后细胞恢复生长至80％左右生长密度，为一个冲击循环，经历多次药物冲击循环直至细胞可在含2μM奥希替尼培养液中稳定生长，即PC9/OR细胞诱导成功。
3、耐药模型验证
(1)采用CCK-8实验检测细胞活力。具体为：
取对数生长期的PC9和PC9/OR细胞，接种于96孔板中(3×103个细胞/孔)，培养24h待细胞贴壁后加入不同浓度的奥希替尼，于37℃、5％CO2条件下处理48h后，加入10％的CCK-8检测试剂继续孵育1h，酶标仪检测450nm吸光度，计算细胞半数抑制浓度(halfmaximal inhibitory concentration,IC50)；细胞存活率(％)＝(实验组吸光度-空白组吸光度)/(对照组吸光度-空白组吸光度)。
结果如图1中的A所示：奥希替尼在PC9与PC9/OR中的IC50值分别为0.159μM与9.493μM。
(2)采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative polymerase chainreaction,qPCR)、蛋白免疫印迹实验(Westernblotting,WB)检测细胞中多药耐药基因ABCB1的表达变化。具体为：
取对数生长期的PC9和PC9/OR细胞，接种于6孔板中(2×105个细胞/孔)，于37℃、5％CO2条件下培养48h后提取细胞RNA和总蛋白，分别进行qPCR、WB实验。
结果如图1中的B(q-PCR实验检测ABCB1的基因表达情况)和C(WB实验检测ABCB1的蛋白表达情况)所示：PC9/OR细胞中的ABCB1表达升高。
以上结果表明：成功建立并获得了奥希替尼获得性耐药细胞株PC9/OR。
实施例2阿齐瑞格对PC9/OR细胞活力的影响
阿齐瑞格(Azeliragon)是口服小分子晚期糖基化终产物受体(RAGE)抑制剂，曾被用于治疗阿尔茨海默症的研究，临床前研究结果对改善认知有效，但在临床试验未能成功。目前，对阿齐瑞格的研究主要集中在精神疾病领域。其结构式如下：
本实施例采用CCK-8法检测了阿齐瑞格对PC9/OR细胞活力的影响。
具体为：
取对数生长期的PC9/OR细胞，接种于96孔板中(5×103个细胞/孔)，24h后加入不同浓度的阿齐瑞格(0.625、1.25、2.5、5、10、20μM)，于37℃、5％CO2条件下处理48h后，加入10％的CCK-8溶液继续孵育1h，酶标仪检测450nm吸光度后，计算细胞半数抑制浓度(halfmaximal inhibitory concentration,IC50)；细胞存活率(％)＝(实验组吸光度-空白组吸光度)/(对照组吸光度-空白组吸光度)。
结果如图2所示：CCK-8检测结果经分析可知，阿齐瑞格对PC9/OR细胞的IC50值为4.298μM，且呈明显的剂量依赖性。
实施例3阿齐瑞格对PC9/OR细胞周期的影响
本实施例采用流式细胞术检测阿齐瑞格对PC9/OR细胞周期的影响，具体为：
取对数生长期PC9/OR细胞接种于6孔板(2×105个细胞/孔)，24h后加入0、2、4、6μM阿齐瑞格，于37℃、5％CO2条件下处理24h后收集贴壁的所有细胞。按照商品化周期试剂盒(细胞周期检测试剂盒(KGA511))对细胞进行洗涤、固定和染色，最后利用流式细胞仪记录激发波488nm处的红色荧光，以分析细胞的周期情况。
结果如图3所示：流式细胞周期检测结果显示，随着阿齐瑞格浓度的升高，G0/G1期占比也不断增大，表明阿齐瑞格可以使PC9/OR细胞发生G0/G1期阻滞，进而影响PC9/OR细胞的正常增殖分裂。
实施例4阿齐瑞格对PC9/OR细胞中ROS水平的影响
本实施例采用流式细胞术检测PC9/OR细胞的ROS水平。具体为：
取对数生长期PC9/OR细胞接种于12孔板(8×104个细胞/孔)，24h后加入0、2、4、6μM阿齐瑞格处理，于37℃、5％CO2条件下处理12h后，弃去原来的培养基，加入DCFH-DA：1640培养基为1：1000的混合培养液(500μl/孔)于37℃下避光孵育30min。PBS清洗两次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA，收集细胞进行流式细胞术检测，记录绿色荧光强度，以分析细胞内的ROS水平。
结果如图4所示：流式细胞检测ROS水平的结果显示，阿齐瑞格可明显升高PC9/OR细胞内的ROS水平。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.阿齐瑞格在制备预防和/或治疗肺癌的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肺癌为非小细胞肺癌。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肺癌为携带EGFR突变的肺癌。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肺癌为携带EGFR第19外显子缺失突变的肺癌。
5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述肺癌为经过表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂治疗后产生耐药性的肺癌。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂为奥希替尼。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肺癌为对奥希替尼耐药的非小细胞肺癌。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述阿齐瑞格可以使PC9/OR细胞发生G0/G1期阻滞。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述阿齐瑞格可以升高PC9/OR细胞内的ROS水平。
10.一种用于治疗对奥希替尼耐药的非小细胞肺癌的药物，其特征在于，由活性成分和药学上可按受的辅料制备而成，所述活性成分为阿齐瑞格。
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