CN117425675A - Tnfr2抗体及其用途 - Google Patents

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CN117425675A CN202180094789.XA CN202180094789A CN117425675A CN 117425675 A CN117425675 A CN 117425675A CN 202180094789 A CN202180094789 A CN 202180094789A CN 117425675 A CN117425675 A CN 117425675A
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Abstract

本公开提供了与人TNFR2结合的抗体及其抗体片段。所公开的抗体抑制TNF‑TNFR2信号传导轴并增强T效应细胞中的细胞因子分泌，因此可单独或与其他试剂组合用于治疗癌症。

Description

TNFR2抗体及其用途
相关申请的交叉引用
本国际专利申请要求于2020年12月31日提交的美国临时专利申请No.63/132,584的权益，其全部内容通过引用并入本文。
关于序列表的声明
与本申请相关的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并在此通过引用并入说明书。包含序列表的文本文件的名称是127755-5011-US02_Sequence_Listing.txt。该文本文件大约102KB，创建于2018年7月19日，通过EFS-Web以电子方式提交。
技术领域
本公开属于免疫治疗领域，涉及与人TNFR2受体结合的抗体及其片段、编码这些抗体的多核苷酸序列以及产生其的细胞。本公开还涉及包含这些抗体的组合物，以及使用其调节TNF-TNFR2轴以进行癌症免疫治疗的方法。
背景技术
肿瘤坏死因子(TNF)和TNF受体(TNFR)超家族(TNFSF/TNFRSF)在免疫和非免疫细胞的细胞活性调节中发挥重要作用(Dostert等人，Physiol.Rev.,99(1):115-160,2019)。事实上，TNFSF/TNFRSF成员控制先天性免疫细胞和适应性免疫细胞的方式对协调各种细胞和分子机制至关重要，这些机制驱动着免疫反应的共同刺激或共同抑制(Ward-Kavanagh，等人，Immunity,44:1005–1019,2016)。TNF在肿瘤微环境中富集，并在其中促进肿瘤免疫逃逸并促进肿瘤生长。
TNF是一种炎性细胞因子，主要由免疫细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞、T细胞和B细胞)产生，并通过两种结构不同的跨膜受体发挥其生物学作用：I型TNF受体(TNFR1，也称为p55和TNFRSF1A)和II型TNF受体(TNFR2，也称为p75和TNFRSF1B)。TNFR1和TNFR2在表达模式、结构、信号传导机制和功能上有显著差异。TNFR1在几乎所有细胞类型中普遍表达，与之不同，TNFR2在一组有限的细胞上表达，包括小的淋巴细胞、内皮细胞和人间充质干细胞亚组。据推测，TNFR2的有限表达模式可能会导致对患者的毒性较小(Dostert等人，Physiol.Rev.,99(1):115-160,2019)。
重要的是，TNFR2在人CD4+Foxp3+调节性T细胞(Treg)上组成型表达。表达TNFR2受体的Treg在人和小鼠中均具有有效的免疫抑制作用，TNFR2+Treg是在人和鼠肿瘤中发现的主要肿瘤浸润细胞(Torrey等人，Leukemia,33:1206-1218,2018)。在一些人类癌症中，浸润性Treg上的TNFR2表达估计是在对照受试者中循环的Treg上的100倍(Torrey等人，Leukemia,33:1206-1218,2018)。通过TNFR2，TNF优先激活、扩增并促进肿瘤微环境中Treg细胞的表型稳定性、增殖扩增和抑制功能(Shaikh等人，Front.Immunol.,2018年6月18日，和Vanamee等人，Science Signaling,第11卷，第511期，eaao4910,2018)。
据报道，TNFR2参与骨髓源性抑制细胞(MDSC)(另一种免疫抑制细胞)在TME中的积累。骨髓源性抑制细胞(MDSC)上的TNFR2被膜结合的TNF(tmTNF)激活，这进一步有助于肿瘤免疫逃避并促进肿瘤进展(Ba等人，Int.Immunopharm,2017)。
除了Treg和MDSC之外，TNFR2也在一些肿瘤细胞上表达，包括卵巢癌、结肠癌、肾癌、霍奇金淋巴瘤和骨髓瘤(Shaikh等人，Front.Immunol.,2018年6月18日)。TNFR2被认为是一种癌基因，并且最近发表了描述使用拮抗性抗体来靶向TNFR2作为癌症免疫治疗策略的报告(Case等人，Leukoc.Biol.,1-11,2020,Torrey等人，Sci.Signal.,10:462,2017,Torrey等人，Leukemia 33,1206–1218,2019,Yang等人，J.Leukoc.Biol.,1-10,2020,等人，AACR 2020，摘要#725,/>等人AACR年会2020，海报#936)。
尽管TNFR2在初始CD4+和CD8+细胞中表达较低，但据报道TNFR2是一种在肿瘤微环境中在激活的CD8和CD4 T细胞的表面表达的有效的共刺激分子。TNFR2的参与促进CD8和CD4 T细胞的激活、增殖和细胞因子的产生(Kim.E等人，J Immunol，2004年10月1日,173(7)4500-4509；和Ye LL,等人Front Immunol,9:583,2018)。因此，针对TNFR2的激动性抗体有可能进一步增强效应T细胞功能及其抗肿瘤反应(Tam等人，Sci.Transl.Med.,11:512,eaax0720,2019等人AACR Annual Meeting 2020，海报#936,Wei等人，AACRAnnual Meeting2020，海报#2282)。
在肿瘤微环境中TNF与TNFR2结合，诱导Treg和骨髓源性抑制细胞(MDSC)的扩增和激活，从而抑制效应T细胞(Teff)的免疫反应。因此，使用拮抗性或激动性抗TNFR2抗体下调在TME中的抑制性细胞活性、或上调效应细胞活性，为癌症治疗提供了新策略。
尽管美国食品和药物管理局(FDA)已经批准了几种抗癌免疫治疗，但迄今为止还没有FDA批准的抗TNFR2治疗剂。因此，提供可以单独或与其他试剂联合用于调节TNF-TNFR2轴以用于癌症免疫治疗的安全和有效的抗TNFR2抗体的需求尚未得到满足。
发明内容
本公开通过提供抗肿瘤坏死因子受体2抗体(抗TNFR2抗体)及其片段来解决上述需求。这些抗体及其片段的特征在于独特的CDR序列组、对TNFR2(而不是TNFR1)的特异性以及与食蟹猴TNFR2的交叉反应性。更具体地，本公开内容涉及结合人TNFR2的抗体，以及其在调节TNF-TNFR2轴以用于癌症免疫治疗中的用途。所公开的抗体可能特别有益于肿瘤微环境，所述肿瘤微环境富含耗竭的T细胞、抑制性骨髓细胞或有助于抗PD-1/PD-L1抗性的调节性T细胞。
根据一些实施方案，抗体或抗体片段包含一组六个互补决定区(CDR)序列，其选自重链(HC)可变区的三个CDR(选自SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11和48)和轻链(LC)可变区的三个轻链CDR(选自SEQ ID NO:2、4、6、8、10和12)，或是与所鉴定的抗体或片段序列具有至少90％序列同一性的其类似物或衍生物。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体或其抗体片段包含重链可变区，其含有CDR1:SEQID NO:13、CDR2:SEQ ID NO:14和CDR3:SEQ ID NO:15；和/或轻链可变区，其含有CDR1:SEQID NO:16、CDR2:SEQ ID NO:17和CDR3:SEQ ID NO:18。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体或其抗体片段包含重链可变区，其含有CDR1:SEQID NO:19、CDR2:SEQ ID NO:20、和CDR3:SEQ ID NO:21；和/或轻链可变区，其含有CDR1:SEQID NO:22、CDR2:SEQ ID NO:23和CDR3:SEQ ID NO:24。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体或其抗体片段包含重链可变区，其含有CDR1:SEQID NO:25、CDR2:SEQ ID NO:26和CDR3:SEQ ID NO:27；和/或轻链可变区，其含有CDR1:SEQID NO:28、CDR2:SEQ ID NO:29和CDR3:SEQ ID NO:30。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体或其抗体片段包含重链可变区，其含有CDR1:SEQID NO:31、CDR2:SEQ ID NO:32和CDR3:SEQ ID NO:33；和/或轻链可变区，其含有CDR1:SEQID NO:34、CDR2:SEQ ID NO:35和CDR3:SEQ ID NO:36。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体或其抗体片段包含重链可变区，其含有CDR1:SEQID NO:37、CDR2:SEQ ID NO:38和CDR3:SEQ ID NO:39；和/或轻链可变区，其含有CDR1:SEQID NO:34、CDR2:SEQ ID NO:40和CDR3:SEQ ID NO:41。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体或其抗体片段包含重链可变区，其含有CDR1:SEQID NO:37、CDR2:SEQ ID NO:49和CDR3:SEQ ID NO:39；和/或轻链可变区，其含有CDR1:SEQID NO:34、CDR2:SEQ ID NO:40和CDR3:SEQ ID NO:41。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体或其抗体片段包含重链可变区，其含有CDR1:SEQID NO:42、CDR2:SEQ ID NO:43和CDR3:SEQ ID NO:44；和/或轻链可变区，其含有CDR1:SEQID NO:45、CDR2:SEQ ID NO:46和CDR3:SEQ ID NO:47。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体或其抗体片段包含选自SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11和48的可变重链序列。
在其他实施方案中，抗TNFR2抗体或其抗体片段包含选自SEQ ID NO:2、4、6、8、10和12的可变轻链序列。
在其他实施方案中，抗TNFR2抗体或其抗体片段包含选自SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11和48的可变重链序列，以及选自SEQ ID NO:2、4、6、8、10和12的可变轻链序列。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体或抗体片段包含可变重链序列和可变轻链序列，其选自以下组合：
(a)包含SEQ ID NO:1的可变重链序列和包含SEQ ID NO:2的可变轻链序列；
(b)包含SEQ ID NO:3的可变重链序列和包含SEQ ID NO:4的可变轻链序列；
(c)包含SEQ ID NO:5的可变重链序列和包含SEQ ID NO:6的可变轻链序列；
(d)包含SEQ ID NO:7的可变重链序列和包含SEQ ID NO:8的可变轻链序列；
(e)包含SEQ ID NO:9的可变重链序列和包含SEQ ID NO:10的可变轻链序列；
(f)包含SEQ ID NO:48的可变重链序列和包含SEQ ID NO:10的可变轻链序列；和
(g)包含SEQ ID NO:11的可变重链序列和包含SEQ ID NO:12的可变轻链序列。
在一些实施方案中，提供抗TNFR2抗体，其中该抗体包含
(a)包含CDR1:SEQ ID NO:13、CDR2:SEQ ID NO:14和CDR3:SEQ ID NO:15的重链可变区；和/或包含CDR1:SEQ ID NO:16、CDR2:SEQ ID NO:17和CDR3:SEQ ID NO:18的轻链可变区；(b)包含CDR1:SEQ ID NO:19、CDR2:SEQ ID NO:20和CDR3:SEQ ID NO:21的重链可变区；和/或包含CDR1:SEQ ID NO:22、CDR2:SEQ ID NO:23和CDR3:SEQ ID NO:24的轻链可变区；(c)包含CDR1:SEQ ID NO:25、CDR2:SEQ ID NO:26和CDR3:SEQ ID NO:27的重链可变区；和/或包含CDR1:SEQ ID NO:28、CDR2:SEQ ID NO:29和CDR3:SEQ ID NO:30的轻链可变区；(d)包含CDR1:SEQ ID NO:31、CDR2:SEQ ID NO:32和CDR3:SEQ ID NO:33的重链可变区；和/或包含CDR1:SEQ ID NO:34、CDR2:SEQ ID NO:35和CDR3:SEQ ID NO:36的轻链可变区；(e)包含CDR1:SEQ ID NO:37、CDR2:SEQ ID NO:38和CDR3:SEQ ID NO:39的重链可变区；和/或包含CDR1:SEQ ID NO:34、CDR2:SEQ ID NO:40和CDR3:SEQ ID NO:41的轻链可变区；(f)包含CDR1:SEQ ID NO:37、CDR2:SEQ ID NO:49和CDR3:SEQ ID NO:39的重链可变区；和/或包含CDR1:SEQ ID NO:34、CDR2:SEQ ID NO:40和CDR3:SEQ ID NO:41的轻链可变区；或(g)包含CDR1:SEQ ID NO:42、CDR2:SEQ ID NO:43和CDR3:SEQ ID NO:44的重链可变区；和/或包含CDR1:SEQ ID NO:45、CDR2:SEQ ID NO:46和CDR3:SEQ ID NO:47的轻链可变区。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体及其抗体片段包含表1中公开的一种或多种重链可变区CDR和/或表2中公开的一种或多种轻链可变区CDR。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体或其抗体片段单独或组合地表现出一种或多种以下结构和功能特征：(a)特异于人TNFR2，(b)不与人TNFR1结合，(c)与TNFR2的N末端的富含半胱氨酸结构域的CRD3或CRD4区中的表位结合，(d)与食蟹猴TNFR2交叉反应，(e)破坏人TNF的结合相互作用，(f)在不与Fc受体结合的情况下，抑制可溶性TNFα刺激的T细胞激活，(g)在不与Fc受体结合的情况下，抑制跨膜TNF刺激的T细胞激活，(h)在与Fc受体结合时,增强慢性刺激的人效应T细胞的激动活性，(i)在人TNFR2敲入MC38同基因肿瘤模型中，表现出抗肿瘤疗效，(j)在人TNFR2敲入MC38肿瘤模型中，增强了抗PD-L1治疗的肿瘤生长抑制，(k)增强抗PD-L1治疗在人TNFR2敲入的PD1抗性的B16F10黑素瘤模型中的疗效，或表现出有助于抗肿瘤活性的ADCC活性，或(m)增加肿瘤内的CD8与Treg的比率。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体特异性地结合表达内源水平的TNFR2的人细胞和经工程化以过表达TNFR2的宿主细胞，而不表现出对表达人TNFR1的细胞的结合。本文公开的抗TNFR2抗体或抗体片段与过表达人或食蟹猴TNFR2的细胞以亚纳摩尔的EC50值相结合。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体或抗体片段结合TNFR2的N末端的富含半胱氨酸结构域的CRD3或CRD4区中的表位。在可替选的实施方案中，抗TNFR2抗体及其抗体片段结合CRD1或CRD2区中的表位。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体或抗体片段与食蟹猴TNFR2(cynoTNFR2)交叉反应。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体及其抗体片段阻断了人TNF/TNFR2结合的相互作用。在可替选的实施方案中，抗TNFR2抗体及其抗体片段不阻断人TNF/TNFR2的结合相互作用，而是拮抗可溶性TNF和膜TNF的活性。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体及其抗体片段抑制了表达TNFR2的人细胞对可溶性TNFα刺激的反应和对膜TNFα刺激的反应。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体及其抗体片段包含经工程化以增加与FcγR的多价交联活性的Fc区，这将增强T细胞的Fc依赖性激动剂活性。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体通过耗竭的人效应T细胞增强细胞因子分泌。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体在人TNFR2敲入的MC38同基因鼠肿瘤模型中表现出抗肿瘤疗效。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体增强了在人TNFR2敲入的MC38肿瘤模型中的抗PD-L1治疗对肿瘤生长的抑制。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体增强了在人TNFR2敲入的PD1抗性B16F10黑素瘤模型中的抗PD-L1治疗的疗效。
在一些实施方案中，所公开的抗TNFR2抗体的抗肿瘤疗效可以通过ADCC介导的肿瘤微环境中的T调节细胞的消耗(depletion)来实现。
在一些实施方案中，所公开的抗TNFR2抗体的抗肿瘤疗效可以通过增加在肿瘤微环境中的CD8与Treg的比率来实现。
本公开还提供了编码至少一种上述抗体分子的分离的核苷酸序列。
本发明还提供了包含至少一种上述核苷酸序列的质粒。
本公开还提供了包含上述核苷酸序列之一、或上述质粒之一的细胞。
本公开还提供了药物组合物，其包含或由以下组成：至少一种本文公开的抗体或其片段以及任选的药学上可接受的稀释剂、载体、载剂和/或赋形剂。这样的药物组合物可以用于基于抗体的癌症免疫治疗。
本公开还涉及用于治疗患者中的癌症的方法，所述方法包括向患者单独或与另一种治疗剂联合施用治疗有效量的至少一种公开的抗TNFR2抗体或其片段。
附图说明
当结合附图阅读时，将更好地理解前述发明内容以及以下本公开的具体实施方式。出于阐明本公开的目的，图中所示的是目前优选的实施方案。然而，应当理解本公开不限于所示的精确安排、实施例和手段。
图1提供了人抗TNFR2抗体的VH和VL结构域的氨基酸序列及其各自的CDR序列(Kabat编号)。提供了序列标识符，在可变结构域序列中对CDR加上下划线。
图2A-图2B显示通过流式细胞术(A)和图像结合测定法(B)的TNFR2抗体在表达人TNFR2的HEK293T中的结合活性。
图3A和图3B显示抗TNFR2抗体的表位分级和分级簇。图3A显示了TNFR2抗体的六个代表性克隆的交叉阻断活性，图3B显示交叉阻断结果的分级簇。
图4显示生物素化的TNF与表达人TNFR2的HEK293T结合的抑制百分比。
图5显示在表达NFκB荧光素酶报告子的THP1细胞中，TNFR2抗体对可溶性TNF刺激的NFκB信号传导的抑制百分比。
图6A-图6B显示，在表达重组的TNFR2和NFκB荧光素酶报告子的Jurkat细胞中分别以15nM(A)和8nM(B)测试的TNFR2抗体对膜TNF刺激的NFκB信号传导的抑制百分比。
图7A-图7C显示抗TNFR2抗体的交联对Jurkat T细胞信号传导的作用。图7A显示了Jukat-TNFR2报告子测定法的示意图，图7B显示了与THP-1细胞共培养时对Jurkat NFκB激活的作用。图7C显示了在用TNFR2抗体或对照处理后，与T调节细胞共培养的CD8 T细胞分泌的IFNγ的水平。图例表示测试抗体的浓度，μg/mL。
图8A-图8D显示在用TNFR2抗体或对照处理后，在体外产生的耗竭的CD8 T细胞中的细胞增殖(A)、IFNγ(B)、TNF(C)和颗粒酶(D)。如图所示，处理包括可溶性的F(ab')2交联剂和抗体。
图9A和图9B显示用TNFR2抗体或同种型对照抗体处理后，在携带MC38肿瘤的hTNFR2敲入小鼠中的肿瘤生长。图9(A)显示肿瘤生长曲线。图9(B)提供了不同处理组的肿瘤尺寸的单向ANOVA分析。
图10A和图10B显示在用作为单个试剂或联合的抗mPD-L1和/或抗TNFR2抗体、或载剂对照处理后，在hTNFR2敲入模型中携带MC38肿瘤的小鼠的存活率。图10(A)显示肿瘤生长曲线。图10(B)显示了存活率收益。
图11显示在用作为单个试剂或联合的抗mPD-L1和/或抗TNFR2抗体、或载剂对照处理后，在hTNFR2敲入中携带B16-F10肿瘤的小鼠的肿瘤生长抑制。
图12A和图12B显示用两种不同同种型的TNFR2抗体、或载剂对照处理后，携带MC38肿瘤的hTNFR2敲入小鼠中的肿瘤生长。图12(A)显示肿瘤生长曲线。图12(B)提供了不同处理组的肿瘤尺寸的单向ANOVA分析。
图13A和图13B显示用两种不同的小鼠IgG变体的TNFR2抗体处理后，携带MC38肿瘤的hTNFR2敲入小鼠中的肿瘤生长。图13(A)显示肿瘤生长曲线，以及图13(B)表示单向ANOVA分析结果。
具体实施方式
为了可以更容易地理解本公开，以下特别定义某些技术和科学术语。除非在本文其他地方特别定义，否则本文使用的所有其他技术和科学术语具有本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义。
在整个本公开中，将使用以下缩写：
mAb或Mab或MAb—单克隆抗体。
CDR—免疫球蛋白可变区中的互补决定区。
VH或VH—免疫球蛋白重链可变区。
VL或VL—免疫球蛋白轻链可变区。
FR—抗体框架区，不包含CDR区的免疫球蛋白可变区。
术语“肿瘤坏死因子受体超家族”(TNFR)是指一组具有羧基末端的胞内结构域和氨基末端的胞外结构域的I型跨膜蛋白，其特征在于共同的富含半胱氨酸的结构域(CRD)。TNFR超家族包括与TNF超家族中的一种或多种配体结合而导致的介导细胞信号传导的受体。TNFR超家族可分为三个亚组：(i)死亡受体(DR)，其在细胞内的部分含有死亡结构域(DD)，通过DD结合配偶体(例如，Fas相关死亡结构域(FADD)或TNFR1相关的死亡结构域(TRADD))激活细胞凋亡；(ii)TNFR相关因子(TRAF)相互作用受体，其与TRAF家族成员相互作用；和(iii)缺少胞质结构域的诱饵受体(DcR)。
术语“TNFR2”、“TNFR2受体”、“TNFR2蛋白”包括人TNFR2，特别是人TNFR2的天然序列多肽、同种型、嵌合多肽、所有同源物、片段和前体。在NCBI参考序列中提供了人、食蟹猴和鼠TNFR2的氨基酸序列：NP_001057.1(人)(SEQ ID NO:52)；XP_005544817.1(食蟹猴)(SEQ ID NO:53)；NP_035740.2(小鼠)(SEQ ID NO:54)。食蟹猴和小鼠中的TNFR2的直系同源物分别与人蛋白具有95％和77％的序列同一性。
术语“TNFR1”、“TNFR1受体”、“TNFR1蛋白”包括人TNFR1，特别是人TNFR1的天然序列多肽、同种型、嵌合多肽、所有同源物、片段和前体。在NCBI参考序列中提供了人TNFR1的氨基酸序列：NP_001056.1(人)(SEQ ID NO:55)。人TNFR1和TNFR2具有18％的序列同一性。
术语“TNF”和“TNF-α”指天然TNF多肽，以NCBI参考序列NP_000585.2(人)(SEQ IDNO：56)提供。肿瘤坏死因子-α以两种生物活性形式存在，膜结合TNF(tmTNF-α)(SEQ ID NO：57)和可溶性TNF-α(sTNF-α)。跨膜TNF(tmTNF-α)是TNFR2的主要配体。
如本文所用，术语“肿瘤坏死因子受体2信号传导”、“TNFR2信号传导”、“TNFR2信号转导”等可互换使用，是指在TNFR2+细胞(如T-reg细胞、MDSC或TNFR2+癌细胞)表面上的TNFR2被内源的TNFR2配体(如TNFα)激活后，通常发生的细胞事件。TNFR2信号传导可以通过以下发现来证明：选自NFκB、STAT5、CHUK、NKFBIE、NKFBIA、MAP3K111、TRAF2、TRAF3、RelB、cIAP2的一种或多种基因的表达增加(Torrey等人Sci.Signal.,10:462,2017,Yang等人，Front Immunol,9,2018)。或者，TNFR信号传导可以通过发现细胞因子(如TNF、IL-1β、IL-2、IL-6和IFNγ)的表达来证明(Holbrook等人，F1000Res，Jan 28:8，2019)。
本文所用的术语“抗体”以最广义使用，包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体和多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。
如本文所用，术语“拮抗性抗TNFR2抗体”和“拮抗性TNFR2抗体”指TNFR2特异性的抗体，其能够在不与Fc受体结合的情况下抑制或减少TNFR2激活，减弱TNFR2介导的一种或多种信号转导通路、和/或减少或抑制由TNFR2的激活介导的至少一种活性。例如，拮抗性TNFR2抗体可以抑制或减少调节性T细胞的生长和增殖。拮抗性TNFR2抗体可以通过阻断TNFR2与TNFα的结合来抑制或减少TNFR2的激活。
术语“激动性抗TNFR2抗体”和“激动性TNFR2抗体”是指特异于TNFR2的抗体，其能够在不与Fc受体结合的情况下激活由TNFR2介导的一种或多种信号转导通路。例如，激动剂TNFR2抗体可以激活AKT或NFKB信号传导通路，导致靶细胞的促增殖或促存活。激动性抗TNR2抗体还可以增强T效应细胞的功能，如增加IFNγ、颗粒酶B、TNF或IL-2的释放。
如本文所用，术语“阻断”是指抗TNFR2抗体能阻断与可溶形式的TNF或膜形式的TNF结合的能力。
本文所用的术语“抗肿瘤坏死因子受体2抗体”、“抗TNFR2抗体”、“抗TNFR2抗体部分”和/或“抗TNFR2抗体片段”等包括任何能够特异性结合TNFR2的含有蛋白质或肽的分子，其包括免疫球蛋白分子的至少一部分，如，但不限于重链、或轻链或其配体结合部分的至少一个互补决定区(CDR)、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、或其任何部分。
本文所用的术语“单克隆抗体”或“mAb”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，例如，构成群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了可能的变体抗体，例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产和/或储存过程中产生的。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因此，修饰词“单克隆”表示从基本上同质的抗体群体中获得的抗体的特性，不应被解释为需要通过任何方法产生抗体。例如，根据本公开使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体展示法和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，在本文中描述这些方法和制备单克隆抗体的其他示例性方法。
术语“嵌合”抗体是指重组的抗体，其中重链和/或轻链的部分与源自特定物种的、或属于特定抗体类别或亚类的抗体中相应序列相同或同源，而链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段(只要其表现出期望的生物活性)。此外，可以进行互补决定区(CDR)接枝以改变抗体分子的某些特性，包括亲和力或特异性。通常，可变结构域是从实验动物(如啮齿动物)的抗体(“亲本抗体”)中获得的，而恒定结构域序列是从人抗体中获得的，因此所得的嵌合抗体可以指导在人受试者中效应功能，并且与嵌合抗体所源自的亲本(例如，小鼠)抗体相比，较少可能地引起不利的免疫反应。
术语“人源化抗体”是指经工程化以在重链和/或轻链的可变区中包含一个或多个人框架区以及非人(例如，小鼠、大鼠或仓鼠)互补决定区(CDR)的抗体。在某些实施方案中，除CDR区外，人源化抗体包含完全为人的序列。与非人源化抗体相比，人源化抗体对人的免疫原性通常较低，因此在某些情况下可提供治疗益处。本领域技术人员将了解人源化抗体，也将了解用于其产生的合适技术。参见例如，Hwang,W.Y.K.，等人，Methods 36:35,2005；Queen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:10029-10033,1989；Jones等人，Nature,321:522-25,1986；Riechmann等人，Nature,332:323-27,1988；Verhoeyen等人，Science,239:1534-36,1988；Orlandi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:3833-37,1989；美国专利第5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,762；6,180,370号；以及Selick等人，WO90/07861，其各自的全部内容通过引用并入本文。
“人抗体”是具有与人产生的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列的抗体，和/或已经使用本领域技术人员已知的制备人抗体的任何技术制备的抗体。人抗体的该定义特异性地排除了包含非人抗原结合的残基的人源化抗体。可以使用本领域已知的各种技术产生人抗体，包括在Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss,第77页(1985)；Boerner等人，J.Immunol，147(I)：86-95(1991)中描述的方法。还参见vanDijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol,5:368-74(2001)。可以通过将靶抗原施用至转基因动物以制备人抗体，所述转基因动物已被修饰以响应抗原挑战而产生此类抗体，但该转基因动物的内源性基因座已失效，例如，免疫的HuMab小鼠(参见，例如，关于HuMab小鼠的Nils Lonber等人，1994,Nature 368:856-859、WO 98/24884、WO 94/25585、WO 93/1227、WO 92/22645、WO 92/03918和WO 01/09187)、xenomice(参见，例如，关于XENOMOUSETM技术的美国专利第6,075,181和6,150,584号)或Trianni小鼠(参见，例如WO 2013/063391、WO2017/035252和WO 2017/136734)。
抗体的“类别(class)”是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。抗体主要有五类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中若干可进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
术语抗体的“抗原结合结构域”(或简称为“抗体的结合结构域”)或类似术语指保留特异性结合抗原复合物的能力的抗体的一个或多个片段。包含在术语抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的示例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)；(vi)分离的互补决定区(CDR)和(vii)两个或更多个分离的CDR的组合，其可以任选地通过合成接头连接。
抗体的“可变结构域”(V结构域)介导结合并赋予特定抗体的抗原特异性。然而，可变性并未均匀分布在可变结构域的110个氨基酸跨度中。实际上，V区由称为框架区(FR)的15-30个氨基酸的相对不变的延伸、以及隔开所述框架区的本文称为“高变区”或CDR的每个长度为9-12个氨基酸的极端可变的较短区组成。如本领域技术人员将理解的，CDR的准确编号和放置在不同编号系统中可以不同。然而，应当理解可变重链序列和/或可变轻链序列的公开包括相关CDR的公开。因此，每个可变重链区的公开是vhCDR(例如vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3)的公开，每个可变轻链区的公开是vlCDR(例如，vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3)的公开。
本文所用术语“互补决定区”或“CDR”是指主要负责介导特异性抗原识别的重链和轻链多肽的可变区内的短多肽序列。每个VL和每个VH中各有三个CDR(称为CDR1、CDR2和CDR3)。除非本文另有说明，否则CDR和框架区根据Kabat编号方案注释(Kabat E.A.，等人，1991，Sequences of proteins of Immunological interest，In：NIH出版物第91-3242号，USDepartment of Health and Human Services,Bethesda,Md)。
在其他实施方案中，抗体的CDR可根据MacCallum RM等人，(1996)J Mol Biol262：732-745确定，通过引用将其全文并入本文，或根据如Lefranc M-P，(1999)TheImmunologist 7:132-136和Lefranc M-P等人，(1999)Nucleic Acids Res 27：209-212中所述的IMGT编号系统，其各自的全部内容通过引用并入本文。参见，例如，Martin A“Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains,"，Antibody Engineering,Kontermann和Diibel编，第31章，第422-439页，Springer-Verlag,Berlin(2001)，其通过引用全文并入本文。在其他实施方案中，抗体的CDR可根据AbM编号方案确定，其是指AbM高变区，代表Kabat CDR和Chothia结构环之间的折中(compromise)，并由Oxford Molecular的AbM抗体建模软件(Oxford Molecular Group，Inc.)使用，其通过引用全文纳入本文。
“框架”或“框架区”或“FR”是指除高变区(HVR)残基以外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。
“人共有框架”是表示人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最常见的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自可变结构域序列的亚组。通常，序列亚组是如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，NIHPublication 91-3242,Bethesda Md.(1991)，第1-3卷中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是如上文Kabat等人所述的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，亚组是如上文Kabat等人所述的亚组Ill。
“铰链区”通常定义为从人IgG1的216-238(EU编号)或226-251(Kabat编号)的延伸。铰链可以进一步分成三个不同的区，上铰链、中铰链(例如，核心)和下铰链。
本文中的术语“Fc区”和“恒定区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，其包含至少一部分恒定区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。但是，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可存在或不存在。除非本文另有说明，Fc区或恒定区的氨基酸残基编号按照EU编号系统，也称为EU指数，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)。
如本文所用，术语“非天然恒定区”是指源自与抗体可变区不同来源的抗体恒定区，或者是具有与天然抗体恒定区序列不同的氨基酸序列的人产生的合成多肽。例如，含有非天然恒定区的抗体可以具有源自非人类来源(例如，小鼠、大鼠或兔)的可变区和源自人来源的恒定区(例如，人抗体恒定区)，或源自另一种灵长类动物(例如，猪、山羊、兔、仓鼠、猫、狗、豚鼠、牛科成员(如牛、野牛、水牛、麋鹿、和牦牛等)、牛、羊、马或野牛等)的恒定区。
术语“内源性”描述天然存在于特定生物体(例如，人)中、或在生物体内特定位置(例如，组织、器官或细胞)的分子(例如，多肽、核酸或辅因子)，如由人细胞表达的TNFR超家族成员。
术语“效应功能”源自抗体Fc区与某些Fc受体的相互作用，包括但不一定限于C1q结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、FcyR介导的效应功能(如ADCC)和抗体依赖性的细胞介导的吞噬作用(ADCP)以及下调细胞表面受体。此类效应功能通常需要Fc区与抗原结合结构域(例如，抗体可变结构域)组合。
术语“Fc受体”或“FcR”描述结合免疫球蛋白的Fc区的抗体受体，其参与位于某些免疫细胞(包括B淋巴细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和肥大细胞)的膜中的抗原识别。识别IgG的Fc部分的Fc受体称为Fcγ受体(FcγR)。FcγR家族包括这些受体的等位基因变体和选择性剪接形式。根据结构、功能和IgG结合亲和力的差异，FcγR可分为三大类：FcγRI、FcγRII(FcγRIIa和FcγRIIb)和FcγRIII(FcγRIIIa和FcγRIIIb)。其中，FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32a)和FcγRIIIa(CD16a)是激活受体，其在FcγRI和FcγRIIIa的γ亚基中、或在FcγRIIa的胞质尾部中含有信号转导基序、基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。抗原-抗体复合物结合后，激活的Fcγ受体(人：FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIC、FcγRIIIA、FcγRIIIB和鼠：FcγRI、FcγRIII、FcγRIV)触发免疫效应功能。相反，FcγRIIb(CD32b)是一种抑制性受体。FcγRIIb的交联导致基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)的磷酸化和抑制信号传导的转导(Patel等人，Front Immunol.2019；10:223.)。
如本文所用，术语“T调节细胞”或“Treg”是指免疫系统的细胞，其通过阻遏/抑制(suppressing/inhibiting)其他免疫细胞(如CD8阳性(CD8+)效应T细胞)的增殖、激活和细胞毒性能力而具有调节作用。调节性T细胞(Treg)的特征在于表达主转录因子forkhead盒P3(Foxp3)。Treg细胞有两个主要亚组：在胸腺中发育的“天然”Treg(nTreg)细胞，以及在外周由CD4+Foxp3-常规T细胞产生的“诱导的”Treg(iTreg)细胞。天然Treg的特征在于表达CD4 T细胞辅助受体和CD25，其是IL-2受体的组成部分。因此，Treg是CD4+CD25+。核转录因子Forkhead盒P3(FoxP3)的表达是决定天然Treg发育和功能的决定性特性。Treg细胞通过多种作用模式发挥其抑制作用，包括通过以下方式抑制：抑制性细胞因子(例如，IL-10、TGFβ、IL-35)的分泌、树突状细胞功能/成熟的调节、免疫调节性表面分子(例如，CTLA-4、LAG-3)的表达或细胞溶解(例如，颗粒酶A和/或B介导的)。
如本文所用，术语“骨髓源性的抑制细胞”或“MDSC”是指调节多种效应细胞和抗原呈递细胞(如T细胞、NK细胞、树突状细胞和巨噬细胞等)的活性的免疫系统的细胞。MDSC是未成熟骨髓细胞的异质群体，包括巨噬细胞、粒细胞和树突状细胞的未成熟前体。该群体被广泛认为是小鼠中的Gr1+CD11b+细胞和人中的HLA-DR-CD11b+CD33+细胞。其具有显著的抑制体外和体内先天性和适应性免疫反应的能力。
如本文所用，在细胞群体(如TNFR2+细胞群体(例如，T-reg、MDSC或TNFR2+癌细胞))的上下文中，术语“增殖”是指细胞的有丝分裂和细胞分裂从而产生多个细胞。细胞增殖可以，例如，通过发现细胞样品中的细胞(例如，TNFR+细胞)的数量在给定时间段内(例如，在一天或多天的过程中)的增加来证明。在本公开中，当细胞的群体(如，与本文所述的拮抗性抗TNFR2抗体接触的TNFR2+细胞的群体)相对于对照细胞群体(如，不与拮抗性抗TNFR2抗体接触的TNFR2+细胞群体)的增殖的比率降低时，则认为细胞增殖被“抑制”。
与参考抗体“结合相同表位的抗体”是指与参考抗体相比接触一组重叠的抗原氨基酸残基的抗体，或在竞争测定法中以50％或更多地阻断参考抗体与其抗原结合的抗体。可以例如通过测定与抗原复合的抗体的晶体结构或通过进行氢/氘交换来测定与抗原接触的抗体的氨基酸残基。在一些实施方案中，位于抗原以内的抗体残基视为与抗原接触。在一些实施方案中，与参考抗体结合相同表位的抗体在竞争测定法中将参考抗体与其抗原的结合阻断50％或更多，并且相反地，参考抗体在竞争测定法中将抗体与其抗原的结合阻断50％或更多。
术语“抗体片段”是指除完整抗体之外的分子，其包含与抗原(所述抗原为完整抗体结合的抗原)结合的完整抗体的一部分。抗体片段的示例包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv)。木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段)和残留的“Fc”片段，这一名称反映了易于结晶的能力。Fab片段由完整的轻(L)链以及重(H)链的可变区结构域(VH)和一条重链的第一恒定结构域(CH1)组成。胃蛋白酶处理抗体产生单个大F(ab)2片段，其大致对应于两个二硫键连接的Fab片段，其具有二价抗原结合活性并且仍能够交联抗原。Fab片段与Fab’片段的不同之处在于，在CH1结构域的羧基末端有额外的几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH在本文指Fab’，其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离巯基。F(ab’)2抗体片段最初是作为其间有铰链半胱氨酸的Fab’片段对产生的。还已知抗体片段的其他化学偶联。
“Fv”由紧密的非共价结合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠产生六个高变环(H链和L链各有3个环)，其为抗原结合提供氨基酸残基并赋予抗体抗原结合特异性。
“单链Fv”也缩写为“sFv”或“scFv”，是包含连接成单个多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地，sFv多肽还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，其使sFv能够形成抗原结合所需的结构。有关sFv的综述，参见Plückthun，The Pharmacology of MonoclonalAntibodies，113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，269-315页(1994)。
术语抗体的“抗原结合结构域”(或简称为“抗体的结合结构域”)或类似术语指保留特异性结合抗原复合物的能力的抗体的一个或多个片段。包含在术语抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的示例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人，Nature 341：544-546，1989)；(vi)分离的互补决定区(CDR)和(vii)两个或更多个分离的CDR的组合，其可以任选地通过合成接头连接。
术语“多特异性抗体”在最广泛的意义上使用，并特异性地覆盖包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的抗体，其中VH-VL单元具有多表位特异性(即，能够结合一个生物分子上的两个不同表位、或不同生物分子上的每个表位)。这种多特异性抗体包括但不限于全长抗体、具有两个或更多个VL和VH结构域的抗体、双特异性双抗体和三抗体。“多表位特异性”是指特异性结合相同或不同靶标上两个或更多个不同表位的能力。
“双重特异性(dual specificity)”是指特异性结合相同或不同靶标上的两个不同表位的能力。然而，与双特异性抗体相反，双重特异性抗体具有氨基酸序列相同的两个抗原结合臂，并且每个Fab臂能够识别两个抗原。双重特异性允许抗体作为单个Fab或IgG分子与两种不同抗原以高亲和力相互作用。根据一个实施方案，IgG1形式的多特异性抗体以5μM至0.001pM、3μM至0.001pM、1μM至0.001pM、0.5μM至0.001pM或0.1μM至0.001pM的亲和力结合每个表位。“单特异性”是指仅结合一个表位的能力。多特异性抗体可以具有与完整免疫球蛋白分子相似的结构，并包括Fc区，例如IgG的Fc区。此类结构包括，但不限于IgG-Fv、IgG-(scFv)2、DVD-Ig、(scFv)2-(scFv)2-Fc和(scFv)2-Fc-(scFv)2。在IgG-(scFv)2的情况下，scFv可以连接到重链或轻链的N-端或C-端。
如本文所用，术语“双特异性抗体”是指对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体，通常是人或人源化抗体。在本公开中，结合特异性中的一种可以针对TNFR2，另一种可以针对任何其他抗原，例如针对细胞表面蛋白、受体、受体亚基、组织特异性抗原、病毒衍生蛋白、病毒编码的包膜蛋白、细菌衍生蛋白或细菌表面蛋白等。
如本文所用，术语“双抗体”指包含两条多肽链的二价抗体，其中每条多肽链包含通过接头连接的VH和VL结构域，所述接头太短(例如，由五个氨基酸组成的接头)以至于不允许同一肽链上的VH和VL结构域在分子内结合。这种构型迫使每个结构域与另一条多肽链上的互补结构域配对，从而形成同二聚体结构。因此，术语“三抗体”是指包含三条肽链的三价抗体，每条肽链包含通过接头连接的一个VH结构域和一个VL结构域，所述接头过分短(例如，由1-2个氨基酸组成的接头)以至于不允许同一肽链内的VH和VL结构域的分子内结合。
当用于描述本文公开的各种抗体时，术语“分离的抗体”是指已经从表达它的细胞或细胞培养物中鉴定和分离和/或回收的抗体。其天然环境中的污染物成分是通常会干扰多肽诊断或治疗用途的物质，可以包括酶、激素和其他蛋白质溶质或非蛋白质溶质。在一些实施方案中，将抗体纯化至大于95％或99％的纯度，通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)方法测定。关于抗体纯度评估方法的综述，参见例如Flatman等人，J.Chromatogr.B 848:79-87,2007。在优选的实施方案中，将抗体纯化至：(1)足以通过使用转杯测序仪获得至少15个残基的N末端或内部氨基酸序列的程度，或(2)在使用考马斯蓝或优选银染色的非还原或还原条件下通过SDS-PAGE达到均质。
关于抗体与靶标分子的结合，术语“特异性结合(specific binding)”或“特异性结合至(specifically binds to)”或“特异于(specific for)”特定多肽或特定多肽靶标上的表位是指可测量地与非特异性相互作用不同的结合。例如，可以通过测定与对照分子的结合相比的分子的结合，来测量特异性结合。例如，可以通过与类似于靶标的对照分子(例如过量的未标记靶标)竞争来测定特异性结合。在这种情况下，如果标记靶标与探针的结合被过量的未标记靶标竞争性抑制，则指示特异性结合。如本文所用，术语“特异性结合(specific binding)”或“特异性地结合至(specifically binds to)”或“特异于(specific for)”特定多肽或特定多肽靶标上的表位，可以表现为，例如，分子对靶标的Kd为10-4M或更低、或者10-5M或更低、或者10-6M或更低、或者10-7M或更低、或者10-8M或更低、或者10-9M或更低、或者10-10M或更低、或者10-11M或更低或者10-12M或更低，或Kd在10-4M至10- 6M、或10-6M至10-10M或10-7M至10-9M的范围内。本领域技术人员将理解，亲和力和KD值是负相关。通过低KD值测量对抗原的高亲和力。在一个实施方案中，术语“特异性结合”是指其中分子结合至TNFR2或TNFR2表位，而基本上不结合任何其他多肽或多肽表位。
如本文所用，术语“特异性结合TNFR2”是指抗体、或抗原结合片段识别和结合出现在正常或恶性细胞的表面上的内源性人TNFR2、或经工程化以稳定或瞬时过表达人TNFR2的重组细胞的能力。
本文所用的术语“亲和力”是指抗体与表位的结合强度。抗体的亲和力由解离常数Kd给出，定义为[Ab]×[Ag]/[Ab-Ag]，其中[Ab-Ag]是抗体-抗原复合物的摩尔浓度，[Ab]是未结合的抗体的摩尔浓度，以及[Ag]是未结合的抗原的摩尔浓度。亲和力常数Ka由1/Kd定义。确定mAb亲和力的方法可以见于Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1988),Coligan等人，编，Current Protocols in Immunology,Greene Publishing Assoc.和Wiley Interscience,N.Y.,(1992,1993)和Muller,Meth.Enzymol.92:589-601(1983)，其参考文献通过引用全部并入本文。本领域熟知的一种测定mAb亲和力的标准方法是使用表面等离子体共振(SPR)筛选(例如，通过使用BIAcoreTM SPR分析设备进行分析)。
“表位”是本领域术语，其指抗体与其抗原之间相互作用的一个或多个位点。描述见于(Janeway,C,Jr.,P.Travers,等人(2001).Immunobiology:the immune system inhealth and disease.第II部分，第3-8节。New York,Garland Publishing,Inc.):“抗体通常只能识别大分子(如蛋白质)表面的一小部分区......[某些表位]可能由来自通过蛋白质折叠聚集在一起的[抗原]多肽链不同部分的氨基酸组成。这类抗原决定簇被称为构象表位或不连续表位，因为所识别的结构由在抗原氨基酸序列中不连续、但在三维结构中聚集在一起的蛋白质的区段组成。相反，由多肽链的单个区段组成的表位被称为连续表位或线性表位”(Janeway,C.Jr.,P.Travers等人(2001).Immunobiology:the immune systeminhealth and disease.第II部分,第3-8节.New York,Garland Publishing,Inc.)。
如本文所用，术语“Kd”是指平衡解离常数，其由kd与ka的比率(即，kd/ka)获得，表示为摩尔浓度(M)。抗体的Kd值可以使用本领域公知的方法来确定。确定抗体Kd的优选方法包括生物层干涉法(BLI)分析(优选使用Fortebio Octet RED装置)、表面等离子共振(优选使用生物传感器系统(如表面等离子共振系统))、或流式细胞术和Scatchard分析。
关于试剂和特定活性(例如，结合细胞、抑制酶活性、激活或抑制免疫细胞)的“EC50”，是指试剂产生其关于这种活性的最大反应或效应的50％的有效浓度。关于试剂和特定活性的“EC100”是指试剂产生其关于这种活性的实质上最大反应的有效浓度。
术语“肿瘤微环境”是指形成肿瘤的癌细胞以及肿瘤内或与癌细胞相邻或围绕的非癌细胞、分子和/或血管的群体。
如本文所用，术语“基于抗体的免疫治疗”和“免疫治疗”用于泛指任何形式的疗法，其依赖于抗TNFR2抗体、包含抗TNFR2抗体或其抗体片段或CDR的双特异性分子、抗原结合结构域或融合蛋白的靶向特异性，以介导对表达TNFR2的细胞进行直接或间接作用。该术语意指包括使用裸抗体、双特异性抗体(包括T细胞接合，NK细胞接合和其他免疫细胞/效应细胞接合形式)、抗体药物偶联物的治疗方法，使用经工程化以包含TNFR2特异性嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T)或NK细胞(CAR-NK)的细胞疗法，和包含TNFR2特异性结合剂的溶瘤病毒，以及通过递送抗TNFR2抗体的抗原结合序列并在体内表达相应抗体片段的基因疗法。
TNF/TNFR超家族
人肿瘤坏死因子(TNF)和TNF受体(TNFR)超家族(TNFSF/TNFRSF)目前由19种细胞因子样配体分子和29种相关受体组成(Dostert等人，Physiol.Rev.,99(1):115-160,2019,Vanamee等人，Science Signaling,第11卷，第511期，eaao4910,2018)。
肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族(TNFRSF)的受体天然地被TNF超家族的配体激活。配体和受体之间的相互作用通常是非常特异的并具有高亲和力(Zhang,G.,CurrentOpinion in Structural Biology,14(2):154-16,2004)。一些TNFSF配体具有多个受体，一些受体也结合多个配体。
肿瘤坏死因子-α以两种生物活性形式存在，跨膜TNF-α(tmTNF-α)和可溶性TNF-α(sTNF-α)。可溶性TNF-α以高亲和力与TNFR1和TNFR2结合，但几乎完全通过TNFR1发出信号。跨膜TNF(tmTNF-α)是TNFR2的主要配体，也是有效激活TNFR2的唯一形式(Grell等人，Cell,83:793–8021995)。
基于称为TNF同源结构域(THD)的保守羧基末端同源结构域，细胞因子被归入TNF超家族(TNFSF)(Wajant H.,Cell Death Differ.,22(11):1727-1741,2015)。THD负责TNF配体的三聚化及其与三聚化受体复合物的结合。THD与TNFR的NH2末端中的富含半胱氨酸的结构域(CRD)结合。TNF配体通常以膜结合形式合成，可以通过蛋白水解作用切割以产生可溶性配体。
TNFSF配体的所有已知结构均以三聚体形式存在(Zhang,G.,Current Opinion inStructural Biology,14(2):154-16,2004)，来自结构和生化研究的数据表明，TNF家族配体的更高阶聚类(higher order clustering)在信号转导的启动中发挥重要作用。膜结合的或可溶性的TNFSF配体三聚体与其在细胞表面的相应受体结合，触发了受体蛋白的三聚化，激活其下游信号传导通路(Dostert等人，Physiol.Rev.,99(1):115-160,2019)。
TNF配体主要由免疫系统的专职抗原呈递细胞(APC)表达，例如树突状细胞(DC)、巨噬细胞和B细胞，但也由T细胞、NK细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、内皮细胞、胸腺上皮细胞和平滑肌细胞产生(Dostert等人，Physiol.Rev.,99(1):115-160,2019)。
TNFRSF的成员是跨膜蛋白，由胞外结构域、跨膜结构域和在细胞内招募信号转导蛋白的胞内结构域组成。TNFRSF的胞外结构域的特征是富含半胱氨酸的标识，其包含四个重复的富含半胱氨酸的结构域(CRD)(CRD1、CRD2、CRD3和CRD4)，但细胞内结构域不同。
TNFR根据其胞质信号传导结构域通常可以分为三组：(i)死亡受体(DR)(例如，DR3、DR6、TNFRI)，其在细胞内部分含有死亡结构域(DD)，通过DD结合配偶体(例如，Fas相关死亡结构域(FADD)或TNFR1相关的死亡结构域(TRADD))激活细胞凋亡；(ii)与TRAF家族成员相互作用的TNFR相关因子(TRAF)—相互作用受体(例如，TNFRII、GITR、OX40、41BB、CD30、LTbR、CD40)；和(iii)缺少胞质结构域的诱饵受体(DcR)(例如，TRAILR3、TRAILR4)(Vanamee等人，Science Signaling,第11卷，(511),eaao4910,2018)。
TNFR天然地被TNF超家族的配体激活，如上所述，TNF超家族的配体以可溶性的且跨膜的三聚体的形式存在。TNFR与特定TNFSF配体的高亲和力结合诱导同源靶细胞中表达的受体簇集，进而启动信号转导通路，最终导致细胞反应(Ward-Kavanagh等人，Immunity,44:1005–1019,2016)。TNFR的完全的和稳健激活需要两个步骤。最初，三个TNFR分子与TNFSF配体(TNFL)三聚体相互作用。在第二步中，这些最初形成的三聚体配体受体复合物中的两个或更多个组装成超分子信号传导簇。据报道，有效的TNFR2信号传导需要多个受体亚基的成簇/寡聚化(Vanamee等人Science Signaling，第11(511)卷,eaao4910,2018)。
根据TNFR对可溶性TNFL三聚体的反应，可以限定两类的TNFR。I类TNFR与可溶性TNFL三聚体结合，然后聚集，并以这种方式被充分而强烈地激活。相比之下，II类TNFR(例如，TNFR2、41BB、CD27、CD40、CD95、OX40和Fn14)也与可溶性TNFL三聚体以高亲和力相互作用；但之后无法进行成簇(cluster)和传导信号。然而，可溶性TNFL三聚体的寡聚化和/或细胞附着使得可溶性TNFL三聚体能够强烈地刺激II类TNFR(Wajant H.,Cell DeathDiffer.,22(11):1727-1741,2015)。
典型的TNF/TNFR信号传导复合物的结构由三聚配体与三个受体结合组成(Vanamee等人，Science Signaling,第11卷，第511期，eaao4910,2018和Wajant H.,CellDeath Differ.,22(11):1727-1741,2015)。几种TNFSF/TNFRSF配体-受体晶体结构已被解析，包括CD40-CD40L、OX40-OX40L和TNF-TNFR2，并且它们都在配体-受体对中表现出三聚化(Dostert等人，Physiol.Rev.,99(1):115-160,2019)。这些观察结果证实3:3的比率是TNFSF/TNFRSF信号传导的共同基础。
先天性和适应性免疫细胞均由TNFSF/TNFRSF成员控制，其方式对于协调驱动免疫反应的共刺激或共抑制的各种细胞和分子机制至关重要。TNFR引发的细胞和分子结局取决于配体-受体特异性的模式、细胞TNFR的表达谱以及参与相互作用的免疫细胞类型的识别(identity)和FcγR表达谱。
TNFR2
肿瘤坏死因子受体2(TNFR2或TNFRII)，也称为TNFRSF1B和CDl20b，是肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)的共刺激成员，该超家族包括蛋白质，如GITR、0X40、CD27、CD40和4-1BB(CD137)。TNFR2是在T细胞上表达的细胞表面受体，已被证明增强效应T(Teff)细胞的激活以及减少Treg介导的抑制。
TNFR2表达主要限于免疫细胞(例如，CD4+、CD8+、MDSC、肿瘤浸润性Treg细胞和人PBMC中的NK细胞)和一些肿瘤细胞，而TNFR1则表现出普遍表达。TNFR2结合同源配体tmTNF-α(一种II型跨膜蛋白)和分泌的配体淋巴毒素(Lymphotoxin)-α(LTα)，两者都还结合TNFR1(Ward-Kavanagh等人，Immunity,44:1005–1019,2016)。
TNFR2代表与TRAF相互作用的TNFRSF的成员。在存在TCR刺激的情况下，与TRAF相互作用的受体(如TNFR2、41BB和OX40)可充当有效的T细胞共刺激分子。与TRAF相互作用的受体在激活的T细胞和记忆T细胞上表达，但不在静息T细胞上表达，其同源配体主要在激活的抗原呈递细胞上表达，如树突状细胞、巨噬细胞、先天性淋巴细胞和许多其他炎症细胞类型(Dostert等人，Physiol.Rev.,99(1):115-160,2019和Williams等人，Oncotarget,7(42):68278-68291,2016)。可以靶向它们的免疫增强共刺激特性，以通过促进多种癌症类型中T细胞的增殖、存活和效应功能来增强抗肿瘤免疫力。通常的靶向策略包括使用特异于受体的激动性抗体或重组的可溶性配体。
TNFR2的激活主要被认为通过TRAF2和TRAF3 E3连接酶触发促存活的NF-κB通路，而TNFR1的激活则将TRADD招募到细胞质中的死亡结构域，激活caspase依赖性通路(Brenner等人，Nat.Rev.Immunol.,15:362–374,2015)。通过TRAF2/3和NF-kB信号传导的调节，TNFR2可以介导促进细胞存活和增殖的基因的转录。因此，TNF通过与TNFR1结合促进细胞凋亡，但通过TNFR2发挥促存活的作用。
一些出版物报道，TNFR2在免疫细胞(包括CD4+调节性T细胞(Treg)(Govindaraj等人，Front.Immunol.,4:233,2013)、CD4+效应T细胞(Teff)(Chen等人，Sci.Rep.,6:32834,2016)、CD8+Treg(Ablamunits等人，Eur.J.Immunol.,40(10):2891–901,2010)、CD8+Teff(Krummey等人，J.Immunol.,197(5):2009–15,2016)和MDSC(Hu等人，J.Immunol.,192(3):1320-1331,2014))上表达并在其中发挥关键作用。这些发现表明，TNFR2参与多种免疫反应，有助于肿瘤免疫逃避。抑制TNFR2可能有助于通过降低Treg活性来打破与肿瘤相关的免疫耐受。或者，TNFR2的激动作用可能会增强CD8+效应细胞的活性。
TNFR2优先在人和鼠Treg的最大免疫抑制亚群上表达。有明确证据表明，TNFR2介导TNF对CD4+FoxP3+Treg的刺激活性，导致Treg的增殖扩增、激活和表型稳定性(Chen和Oppenheim,Sci.Signal.,10(462),eaal2328,2017)。
此外，TNFR2在多种类型的肿瘤细胞上异常表达，通过多种信号转导级联诱导肿瘤进展。TNFR2直接促进某些种类肿瘤细胞的增殖(Sheng等人，Front.Immunol.,9:11702018，和Chen和Oppenheim,Sci.Signal.,10(462),eaal2328,2017,Torrey等人，Sci.Signal(2017),Yang等人，J.Leukocyte Biol.,107:6,2020)。
靶向TNF/TNFR2用于免疫治疗
通常，TNFRSF受体特异性抗体旨在用于激活肿瘤细胞上的TNFRSF受体以触发细胞死亡(TRAILR1、TRAILR2)、或激活免疫细胞上的共刺激受体以促进抗肿瘤免疫(4-1BB、GITR、CD27、OX40 CD40)(Wajant H.Cell.Death.Differ.,22(11):1727-1741,2015)。在某些情况下(TNFR2、CD30、Fn14)，某些TNFRSF受体的肿瘤相关表达模式被用来利用ADCC诱导的抗体或抗体免疫毒素以靶向肿瘤细胞。
TNFR2优先在激活的T调节细胞上高表达，在促进Treg增殖扩增、表型稳定性和体内免疫抑制功能方面具有至关重要的作用(Chen和Oppenheim,Sci.Signal.,10(462),eaal2328,2017)。此外，TNFR2的配体促进一些表达TNFR2的肿瘤细胞的存活和生长。此外，Torrey等人创建的TNFR2拮抗剂具有诱导OVCAR3(一种表面表达TNFR2的卵巢癌细胞系)死亡的能力(Torrey等人，Sci.Signal.,10:462,2017)。因此，在肿瘤治疗中靶向TNFR2有两方面的理由：TNFR2的抑制剂通过抑制表达TNFR2的Treg的活性或消除表达TNFR2的Treg来增强抗肿瘤反应，以及有可能直接杀死表达TNFR2的肿瘤细胞。
肿瘤浸润性的Treg细胞是强效的免疫抑制细胞，代表肿瘤免疫逃避的主要细胞机制，在抑制自然发生的和治疗诱导的抗肿瘤免疫反应中发挥着重要作用。肿瘤组织内Treg细胞的积累以及由此产生的Treg细胞与效应T(Teff)细胞的高比率与癌症患者，包括肺癌(4)、乳腺癌(5)、结直肠癌(6)、胰腺癌(7)和其他恶性肿瘤患者的不良预后相关。通过减少Treg数量或使用检查点抑制剂下调其免疫抑制功能来消除Treg活性，已成为增强癌症治疗疗效的有效策略。
除了Treg之外，CD11b+Gr1+MDSC也有助于荷瘤小鼠的肿瘤免疫逃避。最近的研究表明，MDSC的产生、积累和功能依赖于TNF/TNFR2信号传导。MDSC在小鼠和人的炎症和肿瘤进展过程中广泛扩增，可以通过抑制T细胞介导的抗肿瘤反应来增强肿瘤生长。TNFR2(而非TNFR1)的信号传导已被证明对MDSC的积累是至关重要的(Zhao等人，J.Clin.Invest.,122(11):4094-4104,2012)。在荷瘤小鼠中，MDSC在中枢(骨髓)和外周(脾、血液、引流淋巴结)器官以及在肿瘤部位积累(Zhao等人，同上)。
抗TNFR2抗体
所公开的抗TNFR2抗体(R2_mAb-1至R2_mAb-6在本文中可替选地指图中的R2-1至R2-6)对人TNFR2具有特异性(例如，特异性结合)。这些抗体及其片段的特征在于独特的CDR序列组、对TNFR2的特异性，可作为单药治疗或与其他抗癌剂联合用于癌症免疫治疗。更具体地，本公开涉及与人TNFR2结合的抗体，以及其用于调节TNF/TNFR2介导的位于肿瘤微环境中的细胞的活性的用途。
人们认识到，抑制TNFR活性和刺激TNFR都可以引发有价值的治疗活性。例如，TNFR2刺激可能提供一种扩增和激活T效应细胞并增强其抗肿瘤活性的方法。相反，TNFR2介导的对表达TNFR2的细胞(Treg、MDSC和肿瘤细胞)的抑制或消耗可以建立并维持肿瘤抑制微环境。针对免疫刺激性受体(属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族)的拮抗性和激动性抗体正在成为有前途的癌症免疫治疗。然而，迄今为止，还没有批准的针对TNFR2的治疗性抗体。
我们试图发现独特的TNFR2抗体，以证明克服免疫抑制环境和T细胞耗竭的新机制，从而实现更好的免疫治疗。所公开的抗TNFR2抗体可以特别有益于富含耗竭的T细胞、抑制性骨髓细胞或有助于抗PD-1/PD-L1抗性的调节性T细胞的肿瘤微环境。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体或其抗体片段单独或组合地表现出一种或多种以下结构和功能特征：(a)特异于人TNFR2，(b)不与人TNFR1结合，(c)与TNFR2的N末端的富含半胱氨酸结构域的CRD3或CRD4区中的表位结合，(d)与食蟹猴TNFR2交叉反应，(e)破坏人TNF结合相互作用，(f)在不存在与Fc受体结合的情况下，抑制可溶性TNFα刺激的T细胞激活，(g)在不存在与Fc受体结合的情况下，抑制跨膜TNF刺激的T细胞激活，(h)在与Fc受体结合时，增强慢性刺激的人效应T细胞的激动活性，(i)在人TNFR2敲入的MC38同基因肿瘤模型中表现出抗肿瘤疗效，(j)在人TNFR2敲入的MC38肿瘤模型中，增强了抗PD-L1处理对肿瘤生长的抑制，(k)增强了在人TNFR2敲入的PD1抗性的B16F10黑素瘤模型中的抗PD-L1处理的疗效，或(l)表现出有助于抗肿瘤活性的ADCC活性，或(m)增加肿瘤内的CD8与Treg的比率。
在一个实施方案中，公开的抗体通过Fc受体相互作用抑制单核THP1细胞中的TNFR2信号传导。在可替选的实施方案中，Fc受体通过THP1细胞交联，导致了抗体激活了Jurkat T细胞TNFR2的信号传导。此外，在原代CD8 T细胞中，它们以交联依赖性方式增强了抗CD3/CD28刺激的IFNγ的释放。更具体地，交联的TNFR2抗体以这样的方式促进CD8 T效应细胞的功能，使得其可以克服在共培养环境中对T调节细胞的抑制作用。
在另一个可替选的实施方案中，用一种或多种公开的抗TNFR2抗体处理具有耗竭表型(例如，通过重复的CD3/CD28刺激诱导的)的CD8 T效应细胞恢复了CD8 T细胞功能，其特征在于增加的细胞增殖、提高的IFN-γ和颗粒酶的释放以及释放的可溶性TNFα的水平增加。相比之下，使用抗PD1处理并不能恢复耗竭的CD8 T细胞的功能。使用人TNFR2敲入的MC38小鼠肿瘤模型，公开的两种抗体已表现出强大的抗肿瘤疗效。
在一些实施方案中，有利的是公开的抗TNFR2抗体既结合hTNFR2又结合食蟹猴TNFR2(cynoTNFR2)。与食蟹猴(例如，食蟹猴(Macaca fascicularis))细胞上表达的TNFR2具有交叉反应性是有利的，因为这使得能够在无需使用替代抗体的情况下对抗体分子进行动物测试。本公开的抗TNFR2抗体(R2_mAb1至R2_mAb6)都以显著的亲和力结合来自食蟹猴的TNFR2。
示例性抗体如IgG包含两条重链和两条轻链。每条重链包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。VH和VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布有更保守的区，称为框架区(FR)。每个VH和VL由3个CDR和4个FR组成，按以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
高变区通常包含以下氨基酸残基：轻链可变区中的约氨基酸残基24-34(LCDR1；“L”表示轻链)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)以及在重链可变区中的约31-35B(HCDR1；“H”表示重链)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；Kabat等人，SEQUENCES OF PROTEINS OFIMMUNOLOGICAL INTEREST,第五版Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991)和/或这些残基形成高变环(例如，轻链可变区中的残基26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)以及重链可变区中的26-32(HCDR1)、53-55(HCDR2)和96-101(HCDR3)；Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917。
在一个实施方案中，抗TNFR2抗体或其抗体片段包含具有表1中公开的一组CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)的VH。例如，抗TNFR2抗体或其抗体片段可以包含与表1中公开的一个或多个抗TNFR2抗体中的那些CDR对应的一组CDR(例如，R2_mAb1的CDR)。
在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体包含具有表2中公开的一组CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)的VL。例如，抗TNFR2抗体或其抗体片段可以包含与表2中公开的一个或多个抗TNFR2抗体中的那些CDR对应的一组CDR(例如，R2_mAb 2的CDR)。
表1：抗TNFR2抗体可变重链的CDR序列
抗TNFR2抗体 CDR1 CDR2 CDR3
R2_mAb-1 SEQ ID NO:13 SEQ ID NO:14 SEQ ID NO:15
R2_mAb-2 SEQ ID NO:19 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:21
R2_mAb-3 SEQ ID NO:25 SEQ ID NO:26 SEQ ID NO:27
R2_mAb-4 SEQ ID NO:31 SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:33
R2_mAb-5 SEQ ID NO:37 SEQ ID NO:38 SEQ ID NO:39
R2_mAb-5.1 SEQ ID NO:37 SEQ ID NO:49 SEQ ID NO:39
R2_mAb-6 SEQ ID NO:42 SEQ ID NO:43 SEQ ID NO:44
表2：抗TNFR2可变轻链的CDR序列
抗TNFR2抗体 CDR1 CDR2 CDR3
R2_mAb-1 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:18
R2_mAb-2 SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:24
R2_mAb-3 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:29 SEQ ID NO:30
R2_mAb-4 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:36
R2_mAb-5 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:40 SEQ ID NO:41
R2_mAb-6 SEQ ID NO:45 SEQ ID NO:46 SEQ ID NO:47
在一个可替选的实施方案中，抗TNFR2抗体或其抗体片段包含具有表1公开的一组CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)的VH以及具有表2公开的一组CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)的VL。
在一个实施方案中，抗体可以是特异性结合人TNFR2的单克隆抗体、人抗体、人源化的或嵌合抗体或其抗原结合部分。在一个实施方案中，抗TNFR2抗体或其抗体片段包含形成为人抗体的R2_mAb 1、R2_mAb 2、R2_mAb 3、R2_mAb 4、R2_mAb 5或R2_mAb 6抗体的全部六个CDR区。在一个可替选的实施方案中，抗TNFR2抗体或抗体片段包含R2_mAb 5.1可变重链的CDR区和R2_mAb 5可变轻链的CDR区。
在一个实施方案中，抗TNFR2抗体或其抗体片段包含VH，其具有选自以下的一组互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)：
(i)CDR1:SEQ ID NO:13、CDR2:SEQ ID NO:14、CDR3:SEQ ID NO:15；
(ii)CDR1:SEQ ID NO:19、CDR2:SEQ ID NO:20、CDR3:SEQ ID NO:21；
(iii)CDR1:SEQ ID NO:25、CDR2:SEQ ID NO:26、CDR3:SEQ ID NO:27；
(iv)CDR1:SEQ ID NO:31、CDR2:SEQ ID NO:32、CDR3:SEQ ID NO:33；
(v)CDR1:SEQ ID NO:37、CDR2:SEQ ID NO:38、CDR3:SEQ ID NO:39；
(vi)CDR1:SEQ ID NO:37、CDR2:SEQ ID NO:49、CDR3:SEQ ID NO:39；和
(vii)CDR1:SEQ ID NO:42、CDR2:SEQ ID NO:43、CDR3:SEQ ID NO:44。
在一个实施方案中，抗TNFR2抗体或其抗体片段包含VL，其具有选自以下的一组互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)：
(i)CDR1:SEQ ID NO:16、CDR2:SEQ ID NO:171CDR3:SEQ ID NO:18；
(ii)CDR1:SEQ ID NO:22、CDR2:SEQ ID NO:23、CDR3:SEQ ID NO:24；
(iii)CDR1:SEQ ID NO:28、CDR2:SEQ ID NO:29、CDR3:SEQ ID NO:30；
(iv)CDR1:SEQ ID NO:34、CDR2:SEQ ID NO:35、CDR3:SEQ ID NO:36；
(v)CDR1:SEQ ID NO:34、CDR2:SEQ ID NO:40、CDR3:SEQ ID NO:41；和
(vi)CDR1:SEQ ID NO:45、CDR2:SEQ ID NO:46、CDR3:SEQ ID NO:47。
在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体或其抗体片段包含：
(a)具有选自以下的一组互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)的VH：
(i)CDR1:SEQ ID NO:13、CDR2:SEQ ID NO:14、CDR3:SEQ ID NO:15；
(ii)CDR1:SEQ ID NO:19、CDR2:SEQ ID NO:20、CDR3:SEQ ID NO:21；
(iii)CDR1:SEQ ID NO:25、CDR2:SEQ ID NO:26、CDR3:SEQ ID NO:27；
(iv)CDR1:SEQ ID NO:31、CDR2:SEQ ID NO:32、CDR3:SEQ ID NO:33；
(v)CDR1:SEQ ID NO:37、CDR2:SEQ ID NO:38、CDR3:SEQ ID NO:39；
(vi)CDR1:SEQ ID NO:37、CDR2:SEQ ID NO:49、CDR3:SEQ ID NO:39；和
(vii)CDR1:SEQ ID NO:42、CDR2:SEQ ID NO:43、CDR3:SEQ ID NO:44,以及
(b)具有选自以下的一组互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)的VL：
(i)CDR1:SEQ ID NO:16、CDR2:SEQ ID NO:17、CDR3:SEQ ID NO:18；
(ii)CDR1:SEQ ID NO:22、CDR2:SEQ ID NO:23、CDR3:SEQ ID NO:24；
(iii)CDR1:SEQ ID NO:28、CDR2:SEQ ID NO:29、CDR3:SEQ ID NO:30；
(iv)CDR1:SEQ ID NO:34、CDR2:SEQ ID NO:35、CDR3:SEQ ID NO:36；
(v)CDR1:SEQ ID NO:34、CDR2:SEQ ID NO:40、CDR3:SEQ ID NO:41；和
(vi)CDR1:SEQ ID NO:45、CDR2:SEQ ID NO:46、CDR3:SEQ ID NO:47。
在一个实施方案中，抗体包含VH和VL的组合，其具有选自以下的一组互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)：
(i)VH:CDR1:SEQ ID NO:13、CDR2:SEQ ID NO:14、CDR3:SEQ ID NO:15，VL:CDR1:SEQ ID NO:16、CDR2:SEQ ID NO:17、CDR3:SEQ ID NO:18；
ii)VH:CDR1:SEQ ID NO:19、CDR2:SEQ ID NO:20、CDR3:SEQ ID NO:21，VL:CDR1:SEQ ID NO:22、CDR2:SEQ ID NO:23、CDR3:SEQ ID NO:24；
(iii)VH:CDR1:SEQ ID NO:25、CDR2:SEQ ID NO:26、CDR3:SEQ ID NO:27，VL:CDR1:SEQ ID NO:28、CDR2:SEQ ID NO:29、CDR3:SEQ ID NO:30；
(iv)VH:CDR1:SEQ ID NO:31CDR2:SEQ ID NO:32、CDR3:SEQ ID NO:33，VL:CDR1:SEQ ID NO:34、CDR2:SEQ ID NO:35、CDR3:SEQ ID NO:36；
(v)VH:CDR1:SEQ ID NO:37、CDR2:SEQ ID NO:38、CDR3:SEQ ID NO:39，VL:CDR1:SEQ ID NO:34、CDR2:SEQ ID NO:40、CDR3:SEQ ID NO:41；
(vi)VH:CDR1:SEQ ID NO:37、CDR2:SEQ ID NO:49、CDR3:SEQ ID NO:39，VL:CDR1:SEQ ID NO:34、CDR2:SEQ ID NO:40、CDR3:SEQ ID NO:41；和
(vii)VH:CDR1:SEQ ID NO:42、CDR2:SEQ ID NO:43、CDR3:SEQ ID NO:44，VL:CDR1:SEQ ID NO:45、CDR2:SEQ ID NO:46、CDR3:SEQ ID NO:47。
在一个实施方案中，抗TNFR2抗体或其抗体片段包含选自SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11和48的可变重链序列；和/或选自SEQ ID NO：2、4、6、8、10和12的可变轻链序列。
在一个实施方案中，抗TNFR2抗体或其抗体片段包含一对可变重链和可变轻链序列，其选自以下组合：包含SEQ ID NO:1的可变重链序列和包含SEQ ID NO:2的可变轻链序列；包含SEQ ID NO:3的可变重链序列和包含SEQ ID NO：4的可变轻链序列；包含SEQ IDNO：5的可变重链序列和包含SEQ ID NO：6的可变轻链序列；包含SEQ ID NO：7的可变重链序列和包含SEQ ID NO:8的可变轻链序列；包含SEQ ID NO：9的可变重链序列和包含SEQ IDNO:10的可变轻链序列；包含SEQ ID NO：48的可变重链序列和包含SEQ ID NO:10的可变轻链序列；包含SEQ ID NO：11的可变重链序列和包含SEQ ID NO:12的可变轻链序列。本领域技术人员将进一步理解，可变轻链和可变重链可以独立选择或混合以及匹配，以制备抗TNFR2抗体，其包含不同于以上鉴定的成对的可变重链和可变轻链的组合。
在一个可替选的实施方案中，抗TNFR2抗体或其抗体片段包含一对可变重链和可变轻链序列，其选自以下组合：与SEQ ID NO:1具有90％、95％或99％同一性的可变重链序列和与SEQ ID NO:2具有90％、95％或99％同一性的可变轻链序列；与SEQ ID NO:3具有90％、95％或99％同一性的可变重链序列和与SEQ ID NO:4具有90％、95％或99％同一性的可变轻链序列；与SEQ ID NO:5具有90％、95％或99％同一性的可变重链序列和与SEQ IDNO:6具有90％、95％或99％同一性的可变轻链序列；与SEQ ID NO:7具有90％、95％或99％同一性的可变重链序列和与SEQ ID NO:8具有90％、95％或99％同一性的可变轻链序列；与SEQ ID NO:9具有90％、95％或99％同一性的可变重链序列和与SEQ ID NO:10具有90％、95％或99％同一性的可变轻链序列；与SEQ ID NO:11具有90％、95％或99％同一性的可变重链序列和与SEQ ID NO:12具有90％、95％或99％同一性的可变轻链序列。技术人员将进一步理解，可变轻链和可变重链可以独立选择或混合以及匹配，以制备抗TNFR2抗体，其包含不同于以上鉴定的成对的可变重链和可变轻链的组合。因此，在一个实施方案中，抗体片段包含至少一个如本文所述的CDR。如本文所述，抗体片段可以包含至少两个、三个、四个、五个或六个CDR。抗体片段进一步可以包含本文所述抗体的至少一个可变区结构域。可变区结构域可以是任何尺寸或氨基酸组成，并且通常将包含至少一个负责与人抗TNFR2结合的CDR序列，例如本文描述的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3，并且其与一个或多个框架序列相邻或在框架内。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体或其抗体片段包含一个或多个保守的氨基酸取代。本领域技术人员将认识到保守的氨基酸取代是一个氨基酸被具有相似结构或化学性质的另一个氨基酸(如，例如相似的侧链)取代。本领域中描述了示例性的保守取代，例如，Watson等人，Molecular Biology of the Gene，The Benjamin/Cummings PublicationCompany，第4版(1987)。
“保守修饰”是指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。保守取代是指氨基酸被具有相似侧链的氨基酸残基替换。具有相似侧链的氨基酸残基家族定义明确，包括具有以下侧链的氨基酸：酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸)、芳香族侧链(例如，苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸)、脂肪族侧链(例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸)、酰胺(例如，天冬酰胺、谷氨酰胺)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和含硫侧链(半胱氨酸、蛋氨酸)。此外，多肽中的任何天然残基也可以被丙氨酸取代，如前面所述的丙氨酸扫描诱变(MacLennan等人，Acta PhysiolScand Suppl 643:55-67,1998,Sasaki等人，Adv Biophys 35:1-24,1998)。本公开的抗体的氨基酸取代可以通过已知方法进行，例如通过PCR诱变(美国专利第4,683,195号)。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体或其抗体片段包含可变重链序列，其包含与SEQID NO:1、3、5、7、9、48或11中所示氨基酸序列具有至少约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的序列同一性的氨基酸序列。在其他实施方案中，抗TNFR2抗体或其抗体片段保留了包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9、48或11的可变重链序列的抗TNFR2抗体或其抗体片段的结合(例如，在BIACORE测定法中)和/或功能活性。在其他进一步的实施方案中，抗TNFR2抗体或其抗体片段包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9、48或11的可变重链序列以及具有一个或多个保守氨基酸取代，例如在重链可变序列中的1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5个保守氨基酸取代。在又进一步的实施方案中，一个或多个保守氨基酸取代落在SEQ ID NO:1、3、5、7、9、48或11中的一个或多个框架区(基于Kabat的编号系统)。在其他实施方案中，抗TNFR2抗体或其抗体片段包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9、48或11的可变重链序列，并且相应地缺少SEQ ID NO:1、3、5、7、9、48或11的一个或多个C端氨基酸残基。
在具体实施方案中，抗TNFR2抗体或其抗体片段包含与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、48或11中所示的抗TNFR2重链可变区序列具有至少约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的序列同一性的可变重链序列，包含在框架区中的一个或多个保守氨基酸取代(基于Kabat的编号系统)，以及保留了包含如SEQ ID NO:1、3、5、7、9、48或11所示的可变重链序列和如SEQ ID NO:2、4、6、8、10或12所示的可变轻链序列的抗TNFR2抗体或其抗体片段的结合和/或功能活性。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体或其抗体片段包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10或12中所示氨基酸序列具有至少约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的序列同一性的氨基酸序列的可变轻链序列。在其他实施方案中，抗TNFR2抗体或其抗体片段保留了包含SEQID NO:2、4、6、8、10或12的可变轻链序列的抗TNFR2抗体或其抗体片段的结合(例如，在BIACORE测定法中)和/或功能活性。在又进一步的实施方案中，抗TNFR2抗体或其抗体片段包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10或12的可变轻链序列以及具有一个或多个保守氨基酸取代，例如在轻链可变序列中的1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5个保守氨基酸取代。在又进一步的实施方案中，一个或多个保守氨基酸取代落在SEQ ID NO:2、4、6、8、10或12中的一个或多个框架区(基于Kabat的编号系统)。
在具体实施方案中，抗TNFR2抗体或其抗体片段包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10或12所示的抗TNFR2轻链可变区序列具有至少约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的序列同一性的可变轻链序列，包含在框架区中的一个或多个保守氨基酸取代(基于Kabat的编号系统)，以及保留了包含如SEQ ID NO:1、3、5、7、9、48或11所示的可变重链序列和如SEQID NO:2、4、6、8、10或12所示的可变轻链序列的抗TNFR2抗体或其抗体片段的结合和/或功能活性。
在一些实施方案中，抗体是全长抗体。在其他实施方案中，抗体是抗体片段，包括例如选自以下的抗体片段：Fab、Fab'、F(ab)2、Fv、结构域抗体(dAbs)和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、嵌合抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微型抗体和含有足以使TNFR2与多肽特异性结合的至少一部分的免疫球蛋白的多肽。
在一些实施方案中，本文公开的抗TNFR2抗体的可变区结构域可以在C末端氨基酸共价连接到至少一个其他抗体结构域或其片段。因此，例如，可变区结构域中存在的VH结构域可以与免疫球蛋白CH1结构域或其片段连接。类似地，VL结构域可以连接到CK结构域或其片段。以这种方式，例如，抗体可以是Fab片段，其中抗原结合结构域包含相关的VH和VL结构域，其C末端分别共价连接到CH1和CK结构域。CH1结构域可以具有其他的氨基酸延伸，例如，以提供铰链区或如Fab片段中存在的铰链区结构域的一部分，或提供其他的结构域，例如抗体CH2和CH3结构域。
在一些实施方案中，本文公开的抗TNFR2抗体还可以包含SEQ ID NO:50和51公开的抗体恒定区之一、或两者、或其变体。SEQ ID NO:50和51中提供的序列是人源的，分别代表人IgG1重链恒定区和人κ轻链恒定区。本领域技术人员还将认识到，为了评价抗TNFR2抗体在鼠肿瘤模型中的抗肿瘤疗效，可能需要制备包含非天然恒定区的重组抗TNFR2抗体。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体或其抗体片段可以包含SEQ ID NO:50或51，以及具有C-或N-末端截短(例如，C-末端赖氨酸截短)。
然而，目前尚不清楚特定mAb是否具有激动性或拮抗性特性。更具体地，抗TNFR2抗体的表位位置、同种型和生物活性之间的关系尚未完全了解。例如，Torrey等人公开了能够拮抗TNFR2的抗体，并根据抗体在TNF-α激动作用存在下的生物活性，将拮抗性抗体描述为显性或隐性拮抗剂(Torrey等人，Sci.Signal.,10:462,2017)。Torrey等人证明，TNFR2拮抗性抗体A和B(两者均被选择用于阻止TNF-α配体结合和TNFR2激活)在存在外源TNF时，在Treg测定中不能发挥拮抗作用。然而，抗TNFR2抗体1和2能够以剂量依赖性方式克服TNF激动作用，并在存在高浓度TNF的情况下减少Treg扩增。这导致抗体A和B被分类为隐性TNFR2拮抗剂，而抗体1和2被分类为显性TNFR2拮抗剂。基于表位的图位研究，Torrey等人得出结论，显性和隐性抗TNFR2抗体分别与位于CRD3/4和CRD2区的不同表位结合(Torrey等人，Sci.Signal.,10:462,2017)。
WO 2016/187068公开了Torrey等人描述的显性拮抗性抗TNFR2抗体，其识别含有KCRPG基序(人TNFR2内的残基142-146(在WO 2016/187068中的SEQ ID NO：7))的一个或多个残基的表位。WO 2019/094559公开了其他的显性拮抗性TNFR2抗体，其结合TNFR2的CRD3或CD4内的一个或多个表位，而不需要结合KCRPG基序内的表位。Torrey等人(WO 2016/187068和WO 2019/094559)中公开的拮抗性抗TNFR2抗体表现出一种或多种有益的生物学特性，如杀死和/或抑制T-reg细胞的增殖、杀死和/或抑制TNFR2+癌细胞的增殖、杀死和/或抑制骨髓源性抑制细胞(MDSC)的增殖和/或诱导效应T细胞增殖的能力。Torrey等人报告两种显性抗TNFR2拮抗剂抗体的功能活性不依赖于使用外源IgG方法的Fcγ受体参与和受体交联(Torrey，等人，Sci.Signal.,10:462,2017)。
Bioinvent有一种临床前的抗TNFR2抗体(称为BI-1808)，其正在开发用于癌症免疫治疗(Targeting TNFR2 for cancer immunotherapy:Ligand blocking depletorsversus receptor agonists,Martensson等人AACR 2020，摘要#936，Martensson等人,AACR2020，摘要#725)。BI-1808阻断TNF-α与TNFR2的结合，抑制TNF-α诱导的TNR2信号传导，并且需要FcγR参与才能发挥生物活性。体内作用模式的研究表明，BI-1808的显性作用机制是肿瘤内Treg消耗和CD8/Treg比率改善(Martensson等人)。鼠BI-1808替代抗体(鼠IgG2a形式的3F10)的体内治疗活性的特点是完全依赖于FcγR与激活性Fc受体的相互作用。Bioinvent提交的WO 2020/089474描述了拮抗性抗TNFR2抗体，表明拮抗性抗体的表位位于结构域3的中心(包括氨基酸134至160)，在一定程度上依赖于CRD4。
WO 2017/040312公开了激动性抗TNFR2抗体，其起到促进TNFR2信号传导和Treg的扩增/增殖的作用。激动性抗体的进一步特征在于与包含序列KCSPG的表位特异性结合。HiFiBio、BioInvent和Merrimack Pharmaceuticals最近发布的海报描述了正在开发的激动性抗TNFR2抗体，用于调节肿瘤微环境中的T细胞活性。
HiFiBio候选物HFB200301是一种人源化抗TNFR2抗体，其不与TNF竞争TNFR2的结合，刺激激活的CD4和CD8 T细胞并增强其体外增殖，并在人TNFR2敲入小鼠的同基因MC38肿瘤模型中显示出不依赖于Fc受体的抗肿瘤活性(Wei等人，AACR 2020，海报#2282)。
Bioinvent候选物BI-1910也不会阻止TNF-α与TNFR2的结合，其特点是强烈激活TNFR2信号传导，不需要Fc参与来发挥生物活性，但作为涉及用于改善抑制性结合的IgG同种型或变体Fc区，则显示出增强的活性，这与激活FcγR不同。Bioinvent提交的WO 2020/089473描述了激动性抗TNFR2抗体，表明激动性抗体似乎与CRD3的远端C末端部分结合，并且与在相同表位图位实验中评估的拮抗性抗TNFR2抗体相比，该结合可能在更大程度上依赖于CRD4。使用BI-1910鼠替代物(即鼠IgG1形式的抗体5A05)处理导致CT26同基因模型中瘤内CD8 T细胞早期增加，从而增加CD8/Treg比率(Martensson等人，AACR 2020，摘要#936)。
Merrimack的抗TNFR2候选抗体MM-401与鼠抗体Y9结合相同的表位(描述在Tam等人，Sci.Transl.Med.,11(512),2019与CRD1中的表位结合)，并且依赖于T细胞的共刺激活性以实现其主要作用机制。更具体地说，它在体外和体内刺激CD4和CD8 T细胞，介导T细胞上的免疫抑制标记物和TNFR2的下调，增加肿瘤浸润CD8 T细胞的数量和效应功能。小鼠同基因肿瘤模型中的抗肿瘤疗效是FcγR依赖性的，并且通过抑制性FcγR的参与而增强(Richards等人，MM-401,a novel anti-TNFR2 antibody that induces T cell co-stimulation.AACR 2019，摘要#4848)。
为了理解抗体的同种型对其体内治疗活性的作用，本领域技术人员将容易理解，需要工程化具有相同可变区(VH和VL)与不同(more than)重链恒定区组合的重组抗体，所述重链恒定区的特征在于不同的同种型以及对于激活性和抑制性Fcγ受体(FcγR)具有固有的不同的结合亲和力。例如，本领域技术人员将知道，鼠IgG2A在功能上类似于人IgG1，并且更有可能结合激活性FcγR，而小鼠IgG1被认为是与人IgG4最接近的功能等同物，更有可能减少与FcγR的结合。
除了结合TNFR2之外，包含本文公开的VH和VL序列的抗体分子的全长形式也将结合Fcγ受体。越来越多的证据表明，免疫调节性抗体接合不同类型的Fcγ受体发挥其调节活性和效应功能。更具体地说，已知抗体免疫复合物如何调节免疫细胞激活是由它们与激活性和抑制性Fcγ受体的相对接合决定的。不同的抗体同种型以不同的亲和力与激活性和抑制性Fcγ受体结合，导致不同的激活性：抑制性比率(A:I比率)(Nimmerjahn等人，Science,310(5753):1510-2,2005,Teige等人，Front Immunol,10,2019)。
过去十年的体内研究表明，抗肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族(TNFRSF)受体抗体与细胞表达的Fcγ受体(FcγR)的锚定对其受体刺激活性具有至关重要的相关性。特别是，FcγRIIB受体已被证明可以正向调节免疫调节激动性抗体的活性(Liu等人，Antibodies,9:64,2020)。Li和Ravetch报道，激动性CD40抗体的抗肿瘤活性需要抑制性Fcγ受体的参与(Li和Ravetch,Proc.Nat’l Acad.Sci.(USA),109:10966–71,2012,Li和Ravetch,333(6045):1030–1034,2011)。报道TNFSF的其他II类共刺激成员(例如4-1BB和OX40)的抗肿瘤数据的出版物已证实，FcγRIIB/抗体相互作用能够正向调节靶向TNFSF受体的免疫调节激动性抗体的活性(Zhang等人，J Biol Chem.,291(53):27134-27146,2016，White等人，J.Immunol.,187,1754-1763,2011，White等人，J.Immunol.,193,1828-1835，2014和Yu等人，Cancer Cell,33,664–675,2018)。
关于抗体开发的文献可能会、也可能不会得出一些关于FcγR相互作用在确定抗TNFR2抗体的生物活性中的重要性的规则。对其他抗TNFR II类特异性抗体(例如抗CD40、抗OX40、抗CD95、抗Fn14)的生物活性的研究表明，抗TNFR IgG抗体的独特型并不是赋予激动活性的决定性因素。靶向TNFR II类受体的抗体的强激动作用所需的主导因素是Fcγ受体(FcγR)结合(Medler等人，Cell Death and Disease,10:224,2019,Li和Ravetch,PNAS(USA),109:10966–71,2012和White等人，J.Immunol.,187,1754-1763,2011)。
本领域技术人员将认识到，Fc工程化可以用于修饰所公开的抗TNFR2抗体的抗肿瘤活性(例如，效应功能)，以增强其激动活性和/或效应功能。文献描述了几种替代性Fc工程化策略，所有这些策略均适合于设计包含本文公开的抗体之一的可变区的工程化抗TNFR2抗体，以FcγR依赖性或FcγR非依赖性方式调节TNF/TNFR2轴。例如，为了产生针对免疫刺激优化的抗体，本文公开的抗TNFR2抗体的可变区结构域可以在C末端氨基酸处共价连接至免疫球蛋白Fc结构域(经工程化以赋予低A:I比率)。因此，在一些实施方案中，本文公开的抗TNFR2抗体可以经工程化以具有与抑制性FcγR(例如，CD32b)增强的结合，以便通过TNFR2三聚体配体受体复合物的超交联形成超分子信号传导簇，从而刺激效应T细胞激活。
例如，通过将两个突变S267E和L328F(即，“SELF”)(第267位的丝氨酸被谷氨酸取代，第328位的亮氨酸被苯丙氨酸取代)引入至人IgGl恒定区，可以将增加的CD32b(FcγRIIB)结合亲和力工程化至人IgGl的恒定区中(Chu等人，Mol.Immunol.45(15):3926-3933,2008)。据报道，与WT hIgG1相比，这两个Fc突变将与CD32b的结合亲和力增加约430倍，对FcRI和FcRIIA-H131的结合变化最小，并消除了与FcRIIIA-V158的结合(Liu等人，Antibodies,9:64,2020)。在体内，与WT hIgG1或hIgG2变体相比，S267E/L328F修饰的抗CD40 hIgG2抗体在hFcR/hCD40转基因小鼠中具有增强的激活T细胞的能力(Liu等人，Antibodies,9:64,2020和Dahan等人，Cancer Cell,29,820-831,2016)。据报道，携带单个S267E(“SE”)突变的抗DR5抗体可以将人IgG1对FcγRIIB的亲和力增加数百倍，在FcγRIIB人源化的小鼠模型中改善肿瘤消退(Li和Ravetch,Proc.Nat’l Acad.Sci.,(USA),109:10966–71,2012)。
可替选地，本文公开的抗TNFR2抗体的可变区结构域可以在C末端氨基酸共价连接至免疫球蛋白的Fc结构域，所述Fc结构域经工程化以包含V12突变(E233D/G237D/P238D/H268D/P271G/A330R)或V11突变(G237D/H268D/P271G/A330R)(由Mimoto等人定义)。V12和V11突变是基于进行的以下研究而阐明的，即，观察到与WT hIgG1相比，突变P238D增强了与FcγRIIB的结合，同时完全消除或严重减少了与激活性FcR(FcRI、FcRIIA-H131、FcRIIIA-V131)的结合(Mimoto等人，Protein Eng.Des.Sel.,26:589–598,2013)。据报道，与野生型人IgG1相比，V12和V11突变分别将FcγRIIB结合增强约217倍和40倍(Mimoto等人)。
Zhang等人对于不同的Fc工程化方法在增强抗OX40抗体SF2的激动和效应功能上进行了系统评价。该研究比较了“SELF”突变、V12突变和Fc突变，这些突变在与细胞表面抗原结合时促进IgG1抗体的六聚化，作为增强抗体的激动和效应功能的替代策略(Zhang等人，J.Bio.Chem.,291(53):27134-27146,2016)。评价的六聚化突变包括单个E345R和E430G突变、E345R/E430G双突变和E345R/E430G/S440Y三突变(Diebolder等人，Science 343,1260–1263,2014)。这些突变预计会通过促进OX40受体的簇集来增强SF2的激动/效应功能，而不依赖于FcγRIIB交联。据报道，单个E345R突变对SF2的激动作用最大，不依赖于FcγRIIB交联。Zhang等人的结论是，E345R六聚体化突变可促进更高的激动作用，而不依赖于FcγRIIB交联，这一特征可赋予效应功能，而与局部微环境中的FcγR表达水平无关。然而，虽然对于表达FcγR的细胞浸润水平较低的肿瘤微环境来说，不依赖于FcγR被认为是一种优势，但其可能会非特异性地刺激激动作用，导致不期望的脱靶效应(Zhang等人，J.Biol.Chem.,291(53):27134-27146,2016)。
Medler和Wajant最近描述了TNFRSF受体特异性的抗体融合蛋白，其具有不依赖于靶向控制的FcγR的激动活性，是通过TNFR2特异性IgG1抗体C4-IgG1(N297A)(选择了干扰与FcγR2A、FcγR2B和FcγR3A结合的点突变)与异源细胞表面锚定结构域的基因融合形成的(Medler等人，Cell Death and Disease,10:224,2019)。细胞表面锚定结构域包含细胞因子(鼠IL-2、鼠GITRL、人GITRL或鼠4-1BBL)，其允许与相应的表达细胞因子受体的细胞结合；以及scFv特异性的肿瘤相关抗原CD19、CD20和CD70。研究的所有四种C4-IgG1(N297A)细胞因子融合蛋白在锚定到相应的细胞表面暴露的细胞因子受体后，以不依赖于FcγR的方式激活TNFR2。类似地，在与表达相应肿瘤抗原的Jurkat细胞共培养的HeLa-TNFR2细胞中，所有的抗TNFR2 scFv特异性融合蛋白均激活TNFR2信号传导。
Medler和Wajant推测，使用肿瘤抗原特异性scFv作为锚定结构域不仅可以消除TME中对FcγR结合的需要，而且有望减少全身副作用(Medler等人，Cell Death andDisease,10:224,2019)。此外，由于与FcγR相比，肿瘤相关抗原可以达到更高的表达水平，因此他们进一步推测细胞表面锚定的抗TNFRSF受体抗体融合蛋白甚至可以获得比FcγR结合的常规抗TNFRSF受体抗体更高的总活性(Medler等人)。使用公开的抗TNFR2抗体的可变区结构域作为融合蛋白，工程化以包含对TME中存在的细胞表面靶标特异性的锚定结构域，可以促进本文公开的抗体用于基于抗体的癌症免疫治疗的用途。
产生抗体的方法
可以通过本领域已知的任何方法制备抗TNFR2抗体或其抗体片段。例如，可以用以下来免疫接受者：编码人TNFR2或其片段的DNA、包含TNFR2的全长胞外结构域的融合蛋白、或四个重复的富含半胱氨酸的结构域(CRD1、CRD2、CRD3和CRD4)的一个或多个的任何组合与Ig Fc结构域组合、或编码来自任何CRD的目标表位的多肽序列，或经工程化以过表达人TNFR2的重组细胞。可以使用任何合适的免疫方法。此类方法可以包括佐剂、其他免疫刺激剂、重复加强免疫以及使用一种或多种免疫途径。
可以使用不同形式的TNFR2抗原以引发免疫反应，用于识别有生物活性的抗TNFR2抗体。因此，引发性(eliciting)TNFR2抗原可以是单个表位、多个表位、或整个蛋白单独或与一种或多种免疫原性增强剂组合。在一些方面，引发性的抗原是分离的可溶性全长蛋白质，或包含少于全长序列的可溶性蛋白质(例如，使用包含人TNFR2的单个CRD结构域的肽、或来源于TNFR2胞外结构域的特定子结构域的肽进行免疫)。如本文所用，术语“部分”指适于构成目的抗原的免疫原性表位的最少数量的氨基酸或核酸。可以使用适于转化目的细胞的任何遗传载体，包括但不限于腺病毒载体、质粒和非病毒载体，例如阳离子脂质。
需要从各种哺乳动物宿主(如小鼠、啮齿动物、灵长类、人等)制备单克隆抗体(mAb)。制备此类单克隆抗体的技术描述于，参见，例如Sties等人(编)BASIC AND CLINICALIMMUNOLOGY(第四版)Lance Medical Publication,Los Altos,CA以及其中引用的参考；Harlow和Lane(1988)ANTIBODIES:ALABORATORY MANUAL CSH Press；Goding(1986)MONOCLONAL ANTIBODIES:PRINCIPLES AND PRACTICE(第二版)Academic Press,New York,NY。通常，来自使用期望抗原免疫的动物的脾细胞是永生化的，通常与骨髓瘤细胞融合(and Milstein,Eur.J.Immunol.,6(7):511-9,1976)。永生化的替代方法包括用EB病毒、癌基因或逆转录病毒转化，或本领域已知的其他方法。参见，例如，Doyle等人(编辑1994和定期增刊)CELL AND TISSUE CULTURE:LABORATORY PROEDURES,John Wiley and Sons,New York,NY。筛选由单个永生化细胞产生的克隆以产生对抗原具有期望的特异性和亲和力的抗体，且可以通过各种技术(包括注射到脊椎动物宿主的腹膜腔中)提高由这种细胞产生的单克隆抗体的产量。可替选地，例如，根据Huse等人(1989)Science 246:1275-1281概述的一般操作方案，可以通过从人B细胞筛选DNA文库来分离编码单克隆抗体或其抗原结合片段的DNA序列。因此，抗体可以通过本领域技术人员熟悉的多种技术获得。
其他合适的技术包括选择噬菌体、酵母、病毒或相似载体中的抗体文库。参见例如上述Huse等人；和Ward等人(1989)Nature 341:544-546。本文公开的多肽和抗体可以在修饰或不修饰的情况下使用，包括嵌合的或人源化抗体。通常，多肽和抗体将通过共价或非共价地连接至提供可检测信号的物质进行标记。已知有多种标记和偶联技术，在科学和专利文献中均有广泛报道。合适的标记包括放射性核素、酶、底物、辅因子、抑制剂、荧光部分、化学发光部分、磁性颗粒等。教导使用此类标记的专利包括美国专利号3,817,837；3,850,752；3,9396,345；4,277,437；4,275,149；和4,366,241。此外，可以产生重组免疫球蛋白，参见Cabilly美国专利号4,816,567；和Queen等人(1989)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10023；或在转基因小鼠中制造，参见Nils Lonberg等人(1994)，Nature368:856-859；和Mendez等人(1997)Nature Genetics 15:146-156；TRANSGENIC ANIMALS ANDMETHODS OF USE(WO 2012/62118)，Medarex,Trianni,Abgenix,Ablexis,OminiAb,Harbour以及其他技术。
在一些实施方案中，产生的抗体与TNFR2和/或其他TNFR超家族相关成员结合的能力可以使用标准结合测定法进行评估，如表面等离子共振(SPR)、FoteBio(BLI)、ELISA、蛋白质印迹、免疫荧光、流式细胞术分析、趋化性测定法和细胞迁移测定法。在一些方面，还可以评估产生的抗体在阻断/抑制在溶液中或细胞表面上的TNFα/TNFR结合相互作用中的能力。
从杂交瘤或宿主细胞中制备的抗体组合物可以使用，例如羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析以及亲和色谱进行纯化，其中亲和色谱是通常的纯化技术。蛋白A作为亲和配体的适用性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可以用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(参见，例如Lindmark等人，1983J.Immunol.Meth.62:1-13)。建议将蛋白G用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等人，EMBO J.5:1567-1575,1986)。与亲和配体附着的基质通常是琼脂糖，但也可使用其他基质。机械性稳定的基质，如可控孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯，可实现比琼脂糖能够实现的更快的流速和更短的加工时间。当抗体包含CH3结构域时，Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.)用于纯化。根据要回收的抗体，也可使用其他蛋白质纯化技术，如离子交换柱分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶色谱法、肝素SEPHAROSETM色谱、阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上的色谱法、色谱聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。
在任何初步纯化步骤之后，可使用pH在约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液对包含目的抗体和污染物的混合物进行低pH的疏水相互作用色谱法，通常在低盐浓度(例如约0-0.25M盐)下进行。
还包括核酸，其在本文定义的低、中和高严谨条件下，与由编码本公开的抗体或抗体片段的分离的多核苷酸序列所表示的核苷酸序列的全部或部分(例如，编码可变区的部分)杂交。杂交核酸的杂交部分的长度通常为至少15(例如20、25、30或50)个核苷酸。杂交核酸的杂交部分与编码抗TNFR2多肽(例如，重链或轻链可变区)的核酸的一部分或全部序列或其互补序列具有至少80％，例如至少90％，至少95％，或至少98％的同一性。本文所述类型的杂交核酸可用作，例如克隆探针、引物(例如，PCR引物)或诊断探针。
多核苷酸、载体和宿主细胞
其他实施方案包括包含编码抗TNFR2抗体或其抗体片段的序列的分离的多核苷酸，包含所述多核苷酸的载体和宿主细胞，以及用于产生抗体的重组技术。分离的多核苷酸可编码任何所需形式的抗TNFR2抗体，包括例如全长单克隆抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段、双抗体、线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。
一些实施方案包括分离的多核苷酸，其包含编码具有SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11和48的氨基酸序列的抗体或抗体片段的重链可变区的序列。一些实施方案包括分离的多核苷酸，其包含编码具有SEQ ID NO：2、4、6、8、10和12中的任一个的氨基酸序列的抗体或抗体片段的轻链可变区的序列。
在一个实施方案中，分离的多核苷酸序列编码具有轻链和重链可变区的抗体或抗体片段，所述轻链和重链可变区包含氨基酸序列：
(a)包含SEQ ID NO:1的可变重链序列和包含SEQ ID NO:2的可变轻链序列；
(b)包含SEQ ID NO:3的可变重链序列和包含SEQ ID NO:4的可变轻链序列；
(c)包含SEQ ID NO:5的可变重链序列和包含SEQ ID NO:6的可变轻链序列；
(d)包含SEQ ID NO:7的可变重链序列和包含SEQ ID NO:8的可变轻链序列；
(e)包含SEQ ID NO:9的可变重链序列和包含SEQ ID NO:10的可变轻链序列；
(f)包含SEQ ID NO:48的可变重链序列和包含SEQ ID NO:10的可变轻链序列；和
(f)包含SEQ ID NO:11的可变重链序列和包含SEQ ID NO:12的可变轻链序列。
在另一个实施方案中，分离的多核苷酸序列编码具有轻链和重链可变区的抗体或抗体片段，所述轻链和重链可变区包含氨基酸序列：
(a)与SEQ ID NO:1具有90％、95％或99％同一性的可变重链序列和与SEQ ID NO:2具有90％、95％或99％同一性的可变轻链序列；
(b)与SEQ ID NO:3具有90％、95％或99％同一性的可变重链序列和与SEQ ID NO:4具有90％、95％或99％同一性的可变轻链序列；
(c)与SEQ ID NO:5具有90％、95％或99％同一性的可变重链序列和与SEQ ID NO:6具有90％、95％或99％同一性的可变轻链序列；
(d)与SEQ ID NO:7具有90％、95％或99％同一性的可变重链序列和与SEQ ID NO:8具有90％、95％或99％同一性的可变轻链序列；
(e)与SEQ ID NO:9具有90％、95％或99％同一性的可变重链序列和与SEQ ID NO:10具有90％、95％或99％同一性的可变轻链序列；和
(f)与SEQ ID NO:11具有90％、95％或99％同一性的可变重链序列和与SEQ IDNO:12具有90％、95％或99％同一性的可变轻链序列。
包含编码抗TNFR2抗体或其抗体片段的序列的多核苷酸可以与本领域已知的一个或多个调节或控制序列融合，可以包含在本领域已知的合适的表达载体或宿主细胞中。编码重链或轻链可变结构域的每个多核苷酸分子可以独立地与编码恒定结构域(如人恒定结构域)的多核苷酸序列融合，从而能够产生完整的抗体。可选择地，可将多核苷酸或其部分融合在一起从而提供生产单链抗体的模板。
为了重组生产，将编码抗体的多核苷酸插入可复制的载体中用于克隆(DNA的扩增)或表达。可获得许多用于表达重组抗体的合适载体。载体组分通常包括，但不限于以下的一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标记物基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
抗TNFR2抗体或其抗体片段也可以作为融合多肽产生，其中抗体或片段与异源多肽(如信号序列、或在成熟蛋白或多肽的氨基末端具有特异性切割位点的其他多肽)融合。所选择的异源信号序列通常是被宿主细胞识别和加工(即，被信号肽酶切割)的序列。对于不识别和处理抗TNFR2抗体信号序列的原核宿主细胞，信号序列可被原核信号序列替换。信号序列可以是，例如碱性磷酸酶、青霉素酶、脂蛋白、热稳定肠毒素II前导序列等。对于酵母分泌，天然信号序列可以被以下取代：例如，从酵母转化酶α-因子(包括酵母属(Saccharomyces)和克鲁维酵母属(Kluyveromyces)α因子前导序列)、酸性磷酸酶、白色念珠菌(C.albicans)糖淀粉酶获得的前导序列或WO90/13646中描述的信号。在哺乳动物细胞中，可以使用哺乳动物信号序列以及病毒分泌的前导序列，例如单纯疱疹gD信号。这种前体区的DNA在阅读框中与编码抗TNFR2抗体的DNA连接。
表达和克隆载体含有使载体在一种或多种选择的宿主细胞中复制的核酸序列。通常，在克隆载体中，该序列是使载体独立于宿主染色体DNA复制的序列，包括复制起点或自主复制序列。多种细菌、酵母和病毒的此类序列是公知的。来自质粒pBR322的复制起点适用于大多数革兰氏阴性菌，2-υ.质粒起点适用于酵母，各种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV和BPV)可以用于在哺乳动物细胞中克隆载体。一般而言，哺乳动物表达载体不需要复制起点组件(通常可以使用SV40起点，只是因为其含有早期启动子)。
表达和克隆载体可以含有编码选择性标记物的基因，以促进表达的识别。典型的选择性标记物基因编码赋予对抗生素或其他毒素(例如，氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素)抗性的蛋白质，或者可选择地，编码与营养缺陷型互补的蛋白，或者另外可选择地，编码提供在复合介质中不存在的特定营养物质的蛋白，例如为杆菌(Bacilli)编码D-丙氨酸消旋酶的基因。
组合物和治疗方法
本公开还提供了组合物，包括，例如包含抗TNFR2抗体或其抗体片段的药物组合物，用作治疗患有源自上皮细胞的原发性或转移性癌症的患者的治疗药物。在一个具体的实施方案中，将治疗有效量的本文所述的组合物施用至癌症患者以杀死肿瘤细胞。例如，本文所述的组合物可用于治疗患有以存在表达或过表达TNFR2的癌细胞为特征的肿瘤的患者。在一些方面，所公开的组合物可用于治疗患有不表达TNFR2的肿瘤的患者，但抗TNFR2将刺激免疫应答并引起肿瘤浸润的免疫细胞中TNFR2的升高。
肿瘤可以是实体瘤或液体肿瘤。在某些实施方案中，肿瘤是免疫原性肿瘤。在某些实施方案中，肿瘤是非免疫原性的。用于治疗的癌症的非限制性示例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、胃癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、结肠直肠癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺癌、神经母细胞瘤、胰腺癌、乳腺癌、头颈癌、黑素瘤、骨癌、子宫癌和衍生自两种主要血细胞系(如骨髓细胞系或淋巴细胞系)中任一种的其他血液恶性肿瘤。
在某些方面，癌症的治疗表示尤其需要联合策略的领域，因为两种、三种、四种甚至更多种癌症药物/疗法的联合作用经常产生协同效应，比单一治疗方法的影响强得多。本文提供的试剂和组合物(例如，药物组合物)可以单独使用，也可以与常规的治疗方案(如手术、放疗、化疗和/或骨髓移植(自体、同基因、同种异体或无关的))联合使用。也可以将试剂和组合物与以下的一种或多种联合使用：抗肿瘤剂、化疗剂、生长抑制剂、细胞毒性剂、免疫检查点抑制剂、共刺激分子、激酶抑制剂、血管生成抑制剂、小分子靶向治疗药物和多表位策略。因此，在本公开的另一个实施方案中，癌症治疗可以有效地与其他各种药物联合。
本公开的抗TNFR2抗体可以单独施用、或与其他用于治疗癌症的组合物联合施用。在一个实施方案中，本公开的抗体可以单独施用或与其他免疫治疗剂(包括其他用于治疗癌症的抗体)联合施用。例如，在一个实施方案中，其他免疫治疗剂是针对选自以下的免疫检查点分子的抗体：人程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)，PD-L1和PD-L2，淋巴细胞激活基因3(LAG3)，NKG2A，B7-H3，B7-H4，CTLA-4，GITR，VISTA，CD137，TIGIT及其任何组合。在可替选的实施方案中，第二免疫治疗剂是针对肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)的抗体。每种组合代表本公开的单独实施方案。
抗TNFR2抗体能够与免疫原性试剂(肿瘤疫苗)，如癌细胞、纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和碳水化合物分子)组合。通过TNFR2激活降低T细胞激活阈值，可以激活宿主中的肿瘤反应，从而可以治疗免疫原性有限的非免疫原性肿瘤。
抗TNFR2抗体可与检查点抑制剂(如PD1/PDL1阻断剂)以及其他可以克服肿瘤免疫逃逸的疗法(如PDL1/TGFb陷阱)联合使用。在动物模型中，靶向TNFR2与抗PD-1具有协同作用(Wei等人，AACR 2020，海报#2282)，表明TNFR2共刺激和PD1阻断可以比PD1单药治疗具有增强的抗肿瘤免疫反应。
抗TNFR2抗体可以与标准癌症治疗(例如，手术、放疗和化疗)结合使用。在这些情况下，有可能减少化疗的剂量，提高癌症患者的化疗和放疗的疗效，延长他们的存活。
本文讨论的治疗剂的组合可以作为双特异性或多特异性结合剂或融合蛋白的组分，或者可以作为药学上可接受的载体中的单个组分同时施用。可替选地，可以将治疗剂的组合作为分开的组合物同时施用，各组合物含有药学上可接受的载体中的每种试剂。在另一个实施方案中，可以顺序施用治疗剂的组合。
药物组合物可以与药学上可接受的载体或稀释剂以及任何其他已知的佐剂和赋形剂按照常规技术进行配制，例如，那些公开于Remington：The Science and Practice ofPharmacy，第19版，Gennaro编，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.,1995中的技术。在一些方面，将药物组合物施用至受试者以治疗癌症。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，载体适于静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(例如，通过注射或输注)。根据施用途径，活性化合物(即，抗体、双特异性和多特异性分子)可以包被在材料中以保护化合物免受酸和其他可能使化合物失活的自然条件的作用。
本公开的组合物可以通过本领域已知的多种方法施用。如本领域技术人员将理解的，施用途径和/或模式将根据所需结果而变化。活性化合物可以与将保护化合物避免快速释放的载体(如控制释放制剂，包括植入物、透皮贴剂和微囊化递送系统)一起制备。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。此类制剂的制备方法通常是本领域技术人员已知的。参见，例如Sustainedand Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson编，Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
药物组合物中活性成分的剂量水平可以变化，以获得针对特定受试者、组合物和施用方式有效实现所需的治疗响应而对受试者无毒性的活性成分的量。所选择的剂量水平将取决于各种药代动力学因素，包括采用的本公开的特定组合物的活性，施用途径，施用时间，采用的特定化合物的排泄速率，治疗持续时间，与采用的特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料，待治疗患者的年龄、性别、体重、病状、一般健康状况和既往病史以及医学领域公知的类似因素。
本文所述的药物组合物可以以有效量施用。“有效量”是指单独或与其他剂量一起实现期望反应或期望效果的量。在治疗特定疾病或特定病况的情况下，期望的反应优选涉及对疾病进程的抑制。这包括减缓疾病的进展，特别是中断或逆转疾病的进展。
出于描述和公开的目的，所有标识出的专利和出版物通过引用明确并入本文，例如，在此类出版物中描述的方法学可以与本公开结合使用。提供这些出版物仅是因为其在本申请提交日期之前公开。这方面的任何内容都不应被解释为承认发明人无权凭借之前的公开或出于任何其他原因而先于这些公开。有关于日期的陈述、或对这些文件内容的陈述均基于申请人所掌握的信息，并不构成任何对这些文件日期或内容正确性的承认。
在尚未指出的程度上，本领域普通技术人员将理解，本文描述和示范的各种实施方案中的任一个均可以被进一步修改，以纳入本文公开的任何其他实施方案中显示的特征。
参考以下实施例可以最好地理解本公开的广泛范围，这些实施例并不旨在将本公开限制于特定实施例中。本文描述的特定实施方案仅以实施例的方式提供，并且本公开将限制于所附权利要求的条款以及这些权利要求所赋予的等同物的全部范围内。
实施例
一般方法
表达TNFR2或TNFR1的稳定细胞系使用电穿孔通过用表达以下TNFR2或TNFR1的基于pcDNA的质粒转染选择的宿主细胞(即，CHO-K1或HEK293T细胞，二者均购自ATCC；或来自Kyinno#KC-0149的Jurkat NFкB细胞)来产生，所述TNFR2是来自智人(Homo sapiens)序列(NCBI登录号NP_001057.1，SEQNO：52)或食蟹猴序列(NCBI登录号XP_005544817.1，SEQ NO：53)、或小家鼠(Mus musculus)序列的TNFR2(NCBI登录号NP_035740.2，SEQ NO：54)或TNFR1是来自智人序列的TNFR1(NCBI登录号NP_001056.1，SEQ NO:55)。表达来自人序列的膜结合的不可切割形式的TNF(SEQ ID NO:57)的HEK293T细胞是根据Horiuchi,T.等人描述的信息生成的(Rheumatology,1215–1228,2010)。
转染后24小时和48小时使用合适的抗体，使用流式细胞术测定表面表达来确认表达。使用适合于质粒构建体的抗生素来选择整合的细胞。在选择7-10天后，在96孔板中对存活的细胞进行限制性稀释，同时将转染子保持在选择压力下。
在需要时，在10-14天后，使用流式细胞术使用TNFR2(R&D Systems，#FAB216A)和TNFR1(R&D Systems，FAB225P)特异性抗体挑取单克隆进行筛选。选择前3-5个高表达的克隆用于进行进一步开发。传代几代后，通过流式细胞术和图像分析确证表达水平，确保其稳定。
如下所述，确定杂交瘤克隆的重链和轻链可变区的序列。使用来自Qiagen(Germantown，MD，USA)的RNeasy Plus Mini试剂盒从1-2×106杂交瘤细胞中提取总RNA。通过使用来自Takara(Mountainview，CA，USA)的SMARTer RACE 5’/3’试剂盒进行5’RACE反应生成cDNA。使用Takara Universal Primer Mix组合针对合适的免疫球蛋白的3’小鼠恒定区的基因特异性引物，使用来自NEB(Ipswitch，MA，USA)的Q5高保真(High-Fidelity)DNA聚合酶进行PCR，以扩增重链和轻链的可变区。扩增的重链和轻链可变区在2％琼脂糖凝胶上运行，切下合适的条带，然后使用来自Qiagen的Mini Elute Gel Extraction试剂盒对凝胶进行纯化。使用来自Invitrogen(Carlsbad，CA，USA)的Zero Blunt PCR Cloning试剂盒克隆纯化的PCR产物，并将其转化到来自Takara的Stellar感受态大肠杆菌细胞中，并铺板于LB琼脂+50ug/ml卡那霉素平板上。通过GeneWiz(South Plainfield，NJ，USA)进行直接菌落Sanger测序。使用IMGT V-QUEST分析得到的核苷酸序列，以鉴定生产性重排并分析翻译的蛋白质序列。CDR测定是基于IMGT编号。
可以获得流式细胞术的方法，包括荧光激活的细胞分选检测系统参见，例如，Owens等人(1994)Flow Cytometry Principles for Clinical LaboratoryPractice,John Wiley and Sons,Hoboken,N.J.；Givan(2001)Flow Cytometry,第二版；Wiley-Liss,Hoboken,N.J.；Shapiro(2003)Practical Flow Cytometry,John Wiley andSons,Hoboken,N.J.。可获得适用于修饰核酸的荧光试剂，包括核酸引物和探针、多肽和抗体，用作例如诊断试剂。Molecular Probes(2003)Catalogue,Molecular Probes,Inc.，Eugene,Oreg.；Sigma-Aldrich(2003)Catalogue,St.Louis,Mo。
描述了用于蛋白质纯化的方法，包括免疫沉淀、色谱法和电泳。Coligan等人(2000)Current Protocols in Protein Science,Vol.1,John Wiley and Sons,Inc.,NewYork。描述了化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白的产生以及蛋白质的糖基化。参见，例如，Coligan等人(2000)Current Protocols in Protein Science，第二卷，JohnWiley and Sons,Inc.,New York；Ausubel等人(2001)Current Protocols in MolecularBiology，第3卷，John Wiley and Sons,Inc.,NY,N.Y.,16.0.5-16.22.17页；Sigma-Aldrich,Co.(2001)Products for Life Science Research,St.Louis,Mo.；45-89页；Amersham Pharmacia Biotech(2001)BioDirectory,Piscataway,N.J.,384-391页。描述了多克隆和单克隆抗体的生产、纯化和片段化。Coligan等人(2001)Current Protcols inImmunology，第1卷，John Wiley and Sons,Inc.,New York；Harlow and Lane(1999)UsingAntibodies,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.；Harlowand Lane，同上。
表征配体/受体相互作用的标准技术是可获得的。参见，例如，Coligan等人(2001)Current Protocols in Immunology，第四卷，John Wiley,Inc.,New York。本领域技术人员还熟知适于表征具有特定作用机制的抗体的抗体功能表征的标准方法。
为了能够在小鼠中进行疗效研究，通过使用抗TNFR2特异性的人VL和VL结构域以及小鼠恒定区来产生嵌合的TNFR2特异性抗体。小鼠Fc可以是小鼠IgG2a(序列ID NO：58)(本文中称为Ms IgG2a)(其是ADCC活性的)、小鼠IgGl(序列ID NO:59)(ADCC惰性的)、或小鼠IgGl中第265位处的天冬氨酸被丙氨酸取代(D265A)(序列ID NO:60)，导致该同种型和低亲和力IgG Fc受体之间的相互作用完全消除。Baudino等人(2008)J Immunol.2008年11月1日；181(9):6664-9。
基于WO 2020/089474中公布的公开可获得的信息(其中抗体称为：001-H10VH”，包括：如SEQ ID NO:7所示的VH组；和SEQ ID NO:8所示的VL组)，制备内部的TNFR2特异性抗体，本文称为“阳性对照3”(R2-PC3或PC3)。在用于评价和表征本文公开的抗TNFR2特异性抗体的结合和功能测定法中，PC3抗体用作对照。
可获得用于确定，例如抗原性片段、前导序列、蛋白质折叠、功能结构域、CDR注释、糖基化位点和序列比对的软件包和数据库。
实施例1：产生抗TNFR2抗体
通过对表达人抗体VH和VL基因的人Ig Trianni转基因小鼠进行免疫，产生全长的人抗人TNFR2抗体(参见，例如WO 2013/063391，小鼠)。Trianni转基因小鼠由Trianni公司产生。/>
免疫-用重组人TNFRII/TNFRSF1B Fc嵌合蛋白(R&D Systems，#726-R2)对上述TRIANNI小鼠进行免疫。
通过眼眶后采血对免疫反应进行监测。通过ELISA或成像或FACS筛选血浆(如下所述)。具有足够抗TNFR2滴度的小鼠用于融合。用免疫原对小鼠进行加强免疫，然后处死小鼠并切除脾脏和淋巴结。
选择产生抗TNFR2抗体的小鼠—为了选择产生结合TNFR2的抗体的小鼠，通过ELISA或成像或FACS筛选来自免疫小鼠的血清与重组TNFR2蛋白或表达TNFR2蛋白的细胞(用TNFR2基因转染的CHO-K1，NCBI:NM_001066.3)的结合。
对于ELISA，简单地说，将包被有重组人TNFR2蛋白(Acro Biosystems#TN1-H5222)的ELISA板与来自免疫小鼠的血清稀释液一起孵育，洗涤测定板，用山羊抗小鼠IgG-HRP偶联的二抗(Jackson ImmumoResearch#115-036-071)和ABTS底物(Moss#ABTS-1000)检测特异性抗体结合。然后，使用ELISA酶标仪(Biotek)读取板。
对于成像测定法，简而言之，将稳定过表达人TNFR2的CHO-K1细胞(NCBI：NM_001066.3)接种到384孔板(Corning#3985)中，在37℃下孵育过夜。第二天，将来自免疫小鼠的稀释血清添加到平板中。然后，用2％多聚甲醛(Alfa Aesar#J61899)固定细胞并孵育，然后用PBST[含0.05％ Tween-20的PBS，Technova#1193)]洗涤3次。将山羊抗小鼠IgG AlexaFluor 488(ThermoFisher#A11001)和赫斯特染料33342核染色(ThermoFisher#H3570)添加到细胞中，孵育1小时。用PBST洗涤3次后，将封闭缓冲液[0.5％ BSA(ThermoFisher#37525)的DPBS(ThermoFisher#14040216)溶液]添加到板中。在成像仪(Cytation 5，Biotek)上扫描和分析板。
对于FACS，简而言之，稳定过表达人TNFR2的CHO-K1或300.19细胞(NCBI：NM_001066.3)在FACS缓冲液[PBS(Lonza#17-516Q)加2％ FBS(Gibco#26140-079)]中等分，与免疫小鼠血清的连续稀释液一起孵育。用2％多聚甲醛(Alfa Aesar#J61899)固定细胞，然后用过量的FACS缓冲液[PBS(Lonza,#17-516Q)加2％的FBS(ThermoFisher#26140-079)]洗涤一次。将与Alexa Fluor 647(ThermoFisher#A-21235)偶联的山羊抗小鼠二抗添加到细胞中并孵育1小时，随后通过流式细胞术(IntelliCyt iQue Screener PLUS)分析反应。
产生针对TNFR2的MAb的杂交瘤的生成—为了生成产生本公开的人抗体的杂交瘤，将脾细胞和淋巴结细胞从免疫的小鼠中分离出，与合适的永生化细胞系(如小鼠骨髓瘤细胞系)融合。为了产生抗原特异性抗体，对所得的杂交瘤进行筛选。例如，将来自免疫小鼠的脾细胞和淋巴结细胞的单细胞悬浮液通过电融合与等数量的Sp2/0非分泌的小鼠IgG骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1581)融合。将细胞置于平底96孔组织培养板中，之后在选择培养基(HAT培养基)中孵育约2周，然后切换至杂交瘤培养基。在细胞铺板约10-14天后，通过ELISA、成像或FACS筛选各孔的上清液(如上所述)。
将分泌抗体的杂交瘤转移至24孔板，再次筛选。如果抗TNFR2仍然呈阳性，则通过使用单细胞分选仪进行分选，将阳性杂交瘤进行亚克隆。然后，在体外培养稳定的亚克隆，以产生少量抗体用于纯化和进一步表征。
实施例2：TNFR2抗体的结合特异性
将稳定过表达人TNFR2的HEK293T细胞、或稳定过表达人TNFR1的CHO-K1等分在FACS缓冲液中，与TNFR2抗体的连续稀释液一起孵育。用2％多聚甲醛(Alfa Aesar#J61899)固定细胞，然后用过量的FACS缓冲液[PBS(Lonza,#17-516Q)加2％的FBS(Thermo 26140-079)]洗涤一次。将与Alexa Fluor 647偶联的二抗添加到细胞中。孵育后，随后通过流式细胞术分析反应。可替选地，将HEK293T细胞过夜接种到384孔黑色透明底的聚-D-赖氨酸处理的板(Falcon#356697)中，在组织培养箱中于37℃孵育过夜。将测试抗体在培养基[DMEM(Thermo#11965-084)，补充有10％热灭活胎牛血清(Thermo#16140-071)和1×抗-抗(Thermo#15240-062)]中连续稀释，转移到细胞中进行结合测定。将浓度反应拟合至GraphPad Prism软件中的四参数逻辑非线性回归模型以获得EC50值。
抗人TNFR2抗体表现出与人TNFR2和食蟹猴TNFR2的强结合。图2给出了代表性克隆的数据。代表性克隆与人TNFR2结合的EC50值范围为0.10nM至0.38nM(表3)。抗TNFR2 mAbPC3是内部对照，基于指定为“001-1H10”的抗体的公开序列信息(VH和VL氨基酸序列)而制成。在同一实验中还评价了PC3的结合活性，测得EC50为0.16nM(图2B)。如表3所示，代表性抗体在高达10μg/mL时未表现出与人TNFR1的任何结合。
表3稳定过表达人TNFR1或TNFR2的CHO-K1细胞中的抗人TNFR2抗体的结合活性
TNFR2 TNFR1
mAb EC50(nM) EC50(nM)
R2_mAb-1 0.10 未结合
R2_mAb-2 0.35 未结合
R2_mAb-3 0.38 未结合
R2_mAb-4 0.11 未结合
R2_mAb-5 0.10 未结合
R2_mAb-6 0.14 未结合
实施例3：TNFR2抗体的交叉反应性
将稳定过表达人TNFR2、食蟹猴TNFR2或鼠TNFR2的HEK293T细胞等分在FACS缓冲液中，与TNFR2抗体的连续稀释液一起孵育2小时。用2％多聚甲醛(Alfa Aesar#J61899)固定细胞，然后用过量的FACS缓冲液[PBS(Lonza,#17-516Q)加2％的FBS(Thermo 26140-079)]洗涤一次。将与Alexa Fluor 647偶联的二抗添加到细胞中并孵育1小时，随后通过流式细胞术分析反应。
将浓度反应拟合至GraphPad Prism软件中的四参数逻辑非线性回归模型以获得EC50值。
TNFR2抗体在人和食蟹猴TNFR2之间发生强烈交叉反应(表4)。对于六个代表性克隆中的每一个，比较人和食蟹猴TNFR2的结合EC50值彼此在2倍以内(数据未显示)。相反，TNFR2抗体在高达10μg/mL时不与鼠TNFR2结合。
表4在稳定过表达人TNFR2、食蟹猴TNFR2或鼠TNFR2的HEK293T细胞中的抗人TNFR2抗体的交叉反应性
实施例4：TNFR2抗体的表位分级
使用顺序结合测定形式对TNFR2抗体的结合表位进行分级。
将抗人Fc探针(Probe Life，#PL168-16004)上样到含有测定缓冲液(含有0.02％Tween20和0.05％叠氮化钠的PBS)的96孔板中30秒(基线步骤)，然后上样到含有抗TNFR2抗体的96孔中180秒(结合步骤，以捕获抗体)，然后进行30秒基线步骤，然后将探针上样至含有人TNFR2 His标签蛋白的96孔板中(Acro Biosystems#TN2-H5227，批号：387-8AUF1-M1)180秒，然后是另一个基线步骤，然后与从杂交瘤中纯化的抗TNFR2抗体结合180秒。使用Gator软件处理数据，第二结合步骤期间的曲线与第一结合步骤的曲线不同，表明与参考抗体相比，与未占据的表位结合。缺乏额外的结合表明表位对参考抗体的阻断。
从该连续结合实验中表明，当受体蛋白已被另一种TNFR2抗体结合时，TNFR2抗体显示出与人TNFR2结合的不同能力(图3A)。根据这些结果，抗体可分组为五个不同的分级，表明其结合表位的相似性(图3B)。
实施例5：TNFR2抗体与TNF配体的结合竞争
在高含量(content)成像测定法中评价了针对TNF配体的TNFR2抗体在结合TNFR2中的结合竞争性。
将过表达人TNFR2受体的HEK293T细胞接种于384孔透明底的聚-D-赖氨酸处理的板(Falcon#356697)中，在组织培养箱中于37℃孵育过夜。将测试抗体在培养基[DMEM(Thermo#11965-084)，补充有10％的热灭活胎牛血清(Thermo#16140-071)和1×抗-抗(Thermo#15240-062)]中连续稀释，再转移到细胞中。
孵育1小时后，将生物素标记的TNF(Acro Biosystems，TNA-H8211)添加到结合反应中，再孵育1小时。用4％多聚甲醛溶液固定细胞，然后用含有0.5％牛血清白蛋白的Dulbecco缓冲盐水溶液洗涤两次。随后，将与Alexa488荧光团(Biolegend#405235)偶联的链霉亲和素和赫斯特染料核染色剂(Thermo#62249)添加到细胞板中。孵育一小时后，用含有0.5％牛血清白蛋白的Dulbecco缓冲盐水溶液洗涤细胞两次。
通过测量Celigo细胞计数仪(Nexcelom)上的荧光信号，检测与细胞表面结合的生物素-TNF。确定结合竞争，并通过将100％抑制设置为不存在生物素-TNF的情况下的信号来归一化数据。
如图4所示，TNFR2抗体的主要组在针对TNF配体的竞争能力方面有所不同。此外，如图4所示，代表性克隆R2-mAb1不抑制TNF的结合，而克隆R2_mAb-2、R2_mAb-3、R2_mAb-4、R2_mAb-5和R2_mAb-6完全抑制了TNF与TNFR2的结合。还评价了PC3，其显示出完全的抑制。
实施例6：TNFR2抗体在可溶性TNF刺激的NFκB信号传导中的拮抗活性
已知TNFR2激活会在细胞内向NFκB发出信号(David J.MacEwan(2020)BritishJournal of Pharmacology(2002)135,855)。使用NFκB响应的荧光素酶报告子测定法来评价TNFR2抗体的拮抗活性。
将测试抗体在培养基[RPMI1640(Thermo#11875-085)，补充有10％热灭活胎牛血清(Thermo#16140-071)和1×抗-抗(Thermo#15240-062)]中连续稀释，并转移到384孔的固体底白色板中(Corning#3752)。将TNF(R&D Systems#10291-TA)添加到细胞板中，然后添加用NFκB荧光素酶报告基因(Kyinno#KC-1216)转染的THP1细胞。将反应物在组织培养箱中孵育过夜。第二天，使用ONE-Glo荧光素酶检测试剂(Promega#E6130)测量荧光素酶报告基因的表达。在Bio-Tek Neo2酶标仪中测量发光。确定抗体的活性，通过将100％抑制设置为在不存在TNF的情况下的信号将数据归一化。
THP1细胞中的TNF刺激导致在报告细胞中的NFκB荧光素酶活性增加，而该活性被TNFR2拮抗剂抑制(图5)。如克隆R2_mAb-1、R2_mAb-2、R2_mAb-3、R2_mAb-4、R2_mAb-5和R2_mAb-6所示，TNFR2抗体完全抑制由TNF诱导的NFκB荧光素酶的活性。还测试了PC3，其显示出完整的信号传导抑制。
实施例7：TNFR2抗体在膜TNF刺激的NFκB信号传导中的拮抗活性
将测试抗体在培养基[RPMI1640(Thermo#11875-085)，补充有10％热灭活胎牛血清(Thermo#16140-071)和1×抗-抗(Thermo#15240-062)]中连续稀释，转移到384孔固体底白色板中(Corning#3752)。将过表达膜结合TNF的HEK293T添加到细胞板中，然后添加过表达人TNFR2和NFκB荧光素酶报告基因的Jurkat细胞。将反应物在组织培养箱中孵育过夜。第二天，使用ONE-Glo荧光素酶检测试剂(Promega#E6130)测量荧光素酶报告基因的表达。在Bio-Tek Neo2酶标仪中测量发光。将100％抑制设置为在不存在膜TNF的情况下的信号以将数据归一化。
如图6A所示，TNFR2抗体的主要组在针对膜TNF刺激的TNFR2信号传导的拮抗活性方面有所不同。克隆R2_mAb-1和R2_mAb-6部分抑制信号传导。以R2_mAb-2、R2_mAb-3、R2_mAb-4、R2_mAb-5为代表的克隆显示出将TNFR2信号传导完全阻断。与PC3相比，R2_mAb-4和R2_mAb-5显示出相似的阻断活性(图6B)。
实施例8：TNFR2抗体在不存在或存在交联情况下的活性
为了评价TNFR2抗体在抗体交联时的活性，我们使用表达FcγR的THP1细胞或抗人IgG Fcγ片段特异性的F(ab’)2以交联抗体。
Jurkat NFkB荧光素酶报告细胞单独培养或与THP1细胞共培养。将TNFR2抗体R2_mAb-4以不同浓度应用于细胞。在没有THP1细胞的情况下，TNFR2抗体R2_mAb-4没有显示任何活性(图7B)。如图所示(图7A)，当TNFR2抗体与THP1细胞上的FcγR交联时，R2_mAb-4表现出激动剂活性，荧光素酶报告基因活性增加证明了这一点(图7B)。
还使用抗人IgG Fcγ片段特异性F(ab’)2评价了交联效果。CD8 T效应细胞在RPMI1640(Thermo#11875-085)中培养，其补充有10％的热灭活胎牛血清(Thermo#16140-071)、1×抗-抗(Thermo#15240-062)、10mM HEPES(Thermo,15630-080)、1mM丙酮酸钠(Thermo#11360-070)、0.1mM MEM-NEAA(Thermo#11140-050)和1×抗-抗(Thermo,15240-062)，通过ImmunoCultTM(STEMCELL#10991)和IL-2(Biolegend#589106)处理激活。在存在或不存在抗人IgG Fcγ片段特异性的F(ab')2(Jackson,#109-006-098)的情况下，将测试抗体在测定培养基(补充有10％热灭活胎牛血清和1×抗-抗的RPMI1640)中连续稀释，转移至384孔透明底黑色板(Falcon#353962)中。收获CD8 T细胞，与分离的T调节细胞共培养。取上清液，用于测量释放的IFNγ。使用人IFNγAlphaLISA试剂(PerkinElmer#AL217F)对照使用已知浓度的人IFNγ构建的标准曲线对IFNγ水平进行定量。在Bio-Tek Neo2酶标仪中测量信号。所有的实验一式三份进行。
在当前实验条件下，与CD8 T细胞共培养的T调节细胞的存在导致IFNγ分泌受到抑制(数据未显示)。在单独存在TNFR2抗体的情况下，与对照相比，IFNγ分泌减少(图7C)。此外，如图7C所示，与对照处理组相比，交联TNFR2抗体，导致IFNγ分泌增加。
实施例9：TNFR2抗体对体外产生的耗竭的CD8 T细胞的作用
采用与Balkhi M.等人(iScience(2018)2:105–122)建立和表征的相似的T细胞耗竭的体外模型。在ImmunoCultTM(STEMCELL#10991)的重复刺激下扩增CD8 T细胞，在补充有人重组IL-2(Biolegend#589106)的ImmunoCultTM-XF T细胞扩增培养基(STEMCELL#10981)中培养。通过观察表面标记物的变化和细胞因子分泌的减少，对细胞进行表征以确保耗竭表型的表达。随后，将细胞在补充有ImmunoCultTM的扩增培养基中培养，在存在10μg/ml(66nM)测试抗体或同种型对照的情况下铺板在96孔板中。在某些情况下，将抗人Fcγ片段特异性的F(ab’)2(Jackson，#109-006-098)添加到含有抗体的孔中。在有或没有交联的抗体的存在下培养细胞。所有的实验一式三份进行。
在仅有抗体的条件下未观察到增殖的增加，但交联剂的存在导致与同种型对照抗体相比，细胞增殖增加(图8A)。T细胞耗竭的特点在于IL-2、IFNγ和颗粒酶B水平逐渐丧失(数据未显示)。从测量T细胞增殖的相同孔中收集上清液，使用BD细胞珠测定法(CBA)分析分泌的人IFNγ(BD目录号558269)、人颗粒酶B(BD目录号560304)和人TNF(BD目录号560112)的存在。根据试剂盒中包含的标准曲线计算细胞因子浓度。单独使用单个TNFR2抗体时，细胞因子水平要么降低，要么保持不变(图8)。
在交联剂存在的情况下，抗TNFR2抗体导致IFNγ(图8B)、TNF(图8C)和颗粒酶(图8D)的分泌增加。相比之下，抗PD-1抗体对增加增殖产生作用，但无法促进IFNγ(图8B)、TNF(图8C)和颗粒酶(图8D)的任何增加。
实施例10：在hTNFR2敲入的同基因肿瘤模型中，抗TNFR2抗体的抗肿瘤疗效
向来自Biocytogen(Boston,MA)的6至7周龄雌性纯合B-hTNFR2小鼠(C57BL/6-Tnfrsf1btm1(hTNFRSF1B)/Bcgen)皮下注射包含5×105个活MC38细胞的0.1mL PBS溶液，注射到右侧肋下。7天后，当肿瘤尺寸达到约100mm3时，将小鼠随机分组，开始腹腔注射治疗(第8天)。第1组接受载剂对照；第2组接受200μg的R2_mAb-4 Ms IgG2a；第3组接受200μg的R2_mAb-5 Ms IgG2a。每周施用治疗2次，持续3周。
每周测量两次体重。使用公式V＝1/2*L x W x W确定在不同时间点的肿瘤体积，其中L为异种移植物的长尺寸，W为短尺寸。任何肿瘤超过2500mm3的小鼠均被处死。
如图9A所示，在用R2_mAb-4 Ms IgG2a和R2_mAb-5 Ms IgG2a治疗的小鼠中观察到肿瘤生长的显著抑制。在研究的第29天，通过单向ANOVA分析确定两种治疗的p值均<0.0001(图9B)。此外，用R2_mAb-4 MsIgG2a和R2_mAb-5MsIgG2a治疗对小鼠的体重没有作用(数据未显示)。
实施例11：在MC38结肠癌模型中，与PD-L1抗体联合的抗肿瘤疗效评价向来自Biocytogen(Boston,MA)的6至7周龄雌性纯合B-hTNFR2小鼠(C57BL/6-Tnfrsf1btm1 (hTNFRSF1B)/Bcgen)皮下注射含有5×105个活的MC38细胞的0.1mL PBS溶液，注射到右侧肋下。8天后，当肿瘤尺寸达到约100mm3时，将小鼠随机分组，开始腹腔注射治疗(第8天)。第1组接受载剂对照；第2组接受60μg的抗mPD-L1抗体；组接受100μg的R2_mAb-5 MsIgG2a；第3组接受100μg的R2_mAb-5 MsIgG2a以及60μg的抗mPD-L1抗体。抗mPD-L1抗体由Biocytogen基于阿替珠单抗(atezolizumab)的公开序列信息提供。每周施用治疗2次，持续3周。
每周测量两次体重。使用公式V＝1/2*L x W x W确定在不同时间点的肿瘤体积，其中L为异种移植物的长尺寸，W为短尺寸。任何肿瘤超过2000mm3的小鼠均被处死。在肿瘤植入后长达63天监测小鼠的存活。
如图10A所示，单药R2-mAb5 MsIgG2a在5mpk时在第32天表现出91.7％的肿瘤生长抑制(TGI)。抗mPD-L1以3mpk单独施用时，导致TGI为71.4％。然而，当R2-mAb5 MsIgG2a与PDL1阻断联合施用时，TGI值在第32天变为96％。TNFR2与PDL1阻断联合的益处也显示在图10B的存活率分析中，来自对照的小鼠存活不超过39天。在研究观察结束时，抗mPD-L1抗体治疗使存活率达到14％。相比之下，用R2_mAb-5 MsIgG2a作为单药或与抗mPD-L1联合治疗的小鼠分别得到50％和63％的存活率。
实施例12：在PD1抗性模型B16F10中TNFR2抗体的评价
为了预测TNFR2抗体治疗对PD1抗性患者的治疗潜力，使用PD1抗性肿瘤模型B16F10黑素瘤模型以比较单药抗TNFR2抗体和抗TNFR2治疗联合PDL1阻断的疗效。向来自Biocytogen(Boston,MA)的6至7周龄雌性纯合B-hTNFR2小鼠(C57BL/6-Tnfrsf1btm1 (hTNFRSF1B)/Bcgen)皮下注射含有1×105个活的B16-F10细胞的0.1mL PBS溶液，注射到右侧肋下。8天后，当肿瘤尺寸达到在75至100mm3之间时，将小鼠随机分组，开始腹腔注射治疗(第8天)。第1组接受载剂对照；第2组接受60μg的抗mPD-L1抗体；组接受100μg的R2_mAb-5MsIgG2a；第3组接受100μg的R2_mAb-5 MsIgG2a以及60μg的抗mPD-L1抗体。每周施用治疗2次，持续3周。
每周测量两次体重。使用公式V＝1/2*L x W x W确定在不同时间点的肿瘤体积，其中L为异种移植物的长尺寸，W为短尺寸。任何肿瘤超过2500mm3的小鼠均被处死。在肿瘤植入后长达26天监测小鼠的存活率。
如图11所示，来自5mpk抗mPD-L1抗体治疗组的小鼠在接种后第15天具有19.3％的TGI值，5mpk R2_mAb-5MsIgG2a治疗具有34％的TGI值。当R2_mAb-5MsIgG2a与抗mPD-L1联合时，产生的TGI值为58％，优于PDL1或TNFR2的单药治疗。
实施例13：TNFR2抗体的疗效并不完全取决于ADCC
肿瘤微环境中Treg细胞上TNFR2的高表达水平导致这样的假设：ADCC介导的Treg耗竭解释了抗TNFR2抗体的疗效。我们评价了R2_mAb-5在小鼠IgG2a形式(ADCC活性)和小鼠IgG1形式(ADCC惰性)中的疗效。
向来自Biocytogen(Boston,MA)的6至7周龄雌性纯合B-hTNFR2小鼠(C57BL/6-Tnfrsf1btm1(hTNFRSF1B)/Bcgen)皮下注射含有5×105个活的MC38细胞的0.1mL PBS溶液，注射到右侧肋下。八天后，当肿瘤尺寸达到约100mm3时，将小鼠随机分组，开始腹腔注射治疗(第8天)。第1组接受载剂对照；第2组接受200μg的R2_mAb-5 Ms IgG2a；第3组接受200μg的R2_mAb-5 Ms IgG1。每周施用治疗2次，持续3周。
每周测量两次体重。使用公式V＝1/2*L x W x W确定在不同时间点的肿瘤体积，其中L为异种移植物的长尺寸，W为短尺寸。任何肿瘤超过2500mm3的小鼠均被处死。
如图12A所示，在用R2_mAb-5 Ms IgG2a和R2_mAb-5 Ms IgG1治疗的小鼠中观察到肿瘤生长的显著抑制。在研究的第32天，通过单向ANOVA分析确定两种治疗的p值均<0.0001(图12B)。与R2_mAb-5 Ms IgG1相比，R2-5 R2_mAb-5Ms IgG2a的肿瘤抑制作用稍强，但差异不具有统计学显著性。这一结果表明ADCC有助于R2-mAb5的抗肿瘤疗效，但疗效并不完全依赖于ADCC。
实施例14：TNFR2抗体的抗肿瘤疗效部分取决于Fc受体的交联活性
为了进一步阐明TNFR2拮抗剂抗体的作用机制，在小鼠IgG2a形式(ADCC活性)和小鼠IgG1 D265A形式(ADCC和Fc交联惰性)中评价了R2_mAb-5的疗效，因为在小鼠IgGl中第265位处的天冬氨酸被丙氨酸取代(D265A)导致该同种型和低亲和力IgG Fc受体(FcγRIIB和FcγRIII)之间的相互作用完全消失。
向来自Biocytogen(Boston,MA)的6至7周龄雌性纯合B-hTNFR2小鼠(C57BL/6-Tnfrsf1btm1(hTNFRSF1B)/Bcgen)皮下注射含有5×105个活的MC38细胞的0.1mL PBS溶液，注射到右侧肋下。八天后，当肿瘤尺寸达到约100mm3时，将小鼠随机分组，开始腹腔注射治疗(第8天)。第1组接受载剂对照；第2组接受100μg的R2_mAb-5 Ms IgG2a；第3组接受200μg的R2_mAb-5 Ms IgG2a，以及第4组接受100μg的R2_mAb-5 Ms IgG1D265A。每周施用治疗2次，持续3周。
每周测量两次体重。使用公式V＝1/2*L x W x W在不同时间点测定肿瘤体积，其中L为异种移植物的长尺寸，W为短尺寸。任何肿瘤超过2500mm3的小鼠均被处死。
如图13A所示，在用R2_mAb-5 Ms IgG2a和R2_mAb-5 Ms IgG1 D265A治疗的小鼠中观察到肿瘤生长的显著抑制。R2_mAb-5 Ms IgG2a表现出剂量依赖性，第3组(10mpk)表现出比第2组(5mpk)更强的抗肿瘤作用，TGI 89.9％vs.TGI 71.4％。此外，如果去除使用MsIgG1D265A变体的Fc交联作用，抗肿瘤作用降低至TGI 41.2％，表明Fc功能是TNFR2抗体R2_mAb5充分发挥抗肿瘤作用所必需的。在研究的第25天，通过单向ANOVA分析确定两种治疗的p值均<0.0001(图13B)。这一结果表明Fc交联有助于R2-mAb5的抗肿瘤疗效，但疗效并不完全依赖于Fc交联。
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-1_VH）
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Phe Asp Glu Asp Asn Lys Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Asn Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-1_VL）
<400> 2
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 3
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-2_VH）
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Gly Tyr Gly Ser Gly Thr Tyr His Asn Asp Tyr Tyr
100 105 110
Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser
130
<210> 4
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-2_VL）
<400> 4
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Met Thr Pro Glu
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 5
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-3_VH）
<400> 5
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Asp Gly Ser Ser Asp Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-3_VL）
<400> 6
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp
65 70 75 80
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Asn Tyr Met Tyr Thr Phe
85 90 95
Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 7
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-4_VH）
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ser Val Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Ala Phe Ser Gly Asn Thr His Tyr Ala Gln Asn Leu
50 55 60
Gln Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Glu Gly Ser Gly Ser Tyr Glu Asp Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-4_VL）
<400> 8
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Thr
85 90 95
Thr Gln Phe Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105 110
<210> 9
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-5_VH）
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Ile Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Phe Asn Gly Asn Ala Asn Ser Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Glu Asp Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 10
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-5_VL）
<400> 10
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Thr Gln Ser
85 90 95
Thr Gln Phe Pro Phe Thr Phe Gly Arg Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 11
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-6_VH）
<400> 11
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Leu Ser Tyr
20 25 30
Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Asn Leu
50 55 60
Gln Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Ile Leu Thr Ala Tyr Tyr Ser Ser Asp Ala Phe Asp
100 105 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 12
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-6_VL）
<400> 12
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Thr Gln Thr
85 90 95
Thr Gln Phe Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-1_VH）
<400> 13
Ser Tyr Gly Met His
1 5
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-1_VH）
<400> 14
Val Ile Trp Phe Asp Glu Asp Asn Lys Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 15
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-1_VH）
<400> 15
Asp Asn Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-1_VL）
<400> 16
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-1_VL）
<400> 17
Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser
1 5
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-1_VL）
<400> 18
Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Pro Thr
1 5
<210> 19
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-2_VH）
<400> 19
Asn Tyr Gly Ile Ser
1 5
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-2_VH）
<400> 20
Trp Ile Asn Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 21
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-2_VH）
<400> 21
Asp Gly Gly Tyr Gly Ser Gly Thr Tyr His Asn Asp Tyr Tyr Tyr Tyr
1 5 10 15
Tyr Gly Met Asp Val
20
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-2_VL）
<400> 22
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Asn Leu His
1 5 10
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-2_VL）
<400> 23
Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser
1 5
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-2_VL）
<400> 24
His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Phe Thr
1 5
<210> 25
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-3_VH）
<400> 25
Ser Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210> 26
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-3_VH）
<400> 26
Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 27
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-3_VH）
<400> 27
Asp Asp Gly Ser Ser Asp Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-3_VL）
<400> 28
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala
1 5 10
<210> 29
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-3_VL）
<400> 29
Asp Ala Ser Ser Leu
1 5
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-3_VL）
<400> 30
Gln Gln Phe Asn Asn Tyr Met Tyr Thr
1 5
<210> 31
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-4_VH）
<400> 31
Ser Tyr Ser Val Thr
1 5
<210> 32
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-4_VH）
<400> 32
Trp Ile Asn Ala Phe Ser Gly Asn Thr His Tyr Ala Gln Asn Leu Gln
1 5 10 15
Asp
<210> 33
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-4_VH）
<400> 33
Glu Glu Gly Ser Gly Ser Tyr Glu Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 34
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-4_VL）
<400> 34
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser
1 5 10 15
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-4_VL）
<400> 35
Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-4_VL）
<400> 36
Met Gln Thr Thr Gln Phe Pro Phe Thr
1 5
<210> 37
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-5_VH）
<400> 37
Thr Tyr Gly Ile Ile
1 5
<210> 38
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-5_VH）
<400> 38
Trp Ile Ser Ala Phe Asn Gly Asn Ala Asn Ser Ala Gln Lys Leu Gln
1 5 10 15
Asp
<210> 39
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-5_VH）
<400> 39
Gly Glu Asp Phe Phe Asp Tyr
1 5
<210> 40
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-5_VL）
<400> 40
Lys Val Ser Ser Arg Phe Ser
1 5
<210> 41
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-5_VL）
<400> 41
Thr Gln Ser Thr Gln Phe Pro Phe Thr
1 5
<210> 42
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-6_VH）
<400> 42
Ser Tyr Gly Leu Ser
1 5
<210> 43
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-6_VH）
<400> 43
Trp Ile Asn Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Asn Leu Gln
1 5 10 15
Asp
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-6_VH）
<400> 44
Trp Asp Ile Leu Thr Ala Tyr Tyr Ser Ser Asp Ala Phe Asp Ile
1 5 10 15
<210> 45
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-6_VL）
<400> 45
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 46
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-6_VL）
<400> 46
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-6_VL）
<400> 47
Thr Gln Thr Thr Gln Phe Pro Ile Thr
1 5
<210> 48
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-5.1_VH）
<400> 48
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Ile Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Phe Asn Ser Asn Ala Asn Ser Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Glu Asp Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 49
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列（R2-5.1_VH）
<400> 49
Trp Ile Ser Ala Phe Asn Ser Asn Ala Asn Ser Ala Gln Lys Leu Gln
1 5 10 15
Asp
<210> 50
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<400> 50
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 51
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 51
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 52
<211> 461
<212> PRT
<213> 智人
<400> 52
Met Ala Pro Val Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Glu Leu
1 5 10 15
Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr
20 25 30
Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln
35 40 45
Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys
50 55 60
Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp
65 70 75 80
Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys
85 90 95
Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg
100 105 110
Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu
115 120 125
Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg
130 135 140
Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val
145 150 155 160
Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr
165 170 175
Asp Ile Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly
180 185 190
Asn Ala Ser Met Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser
195 200 205
Met Ala Pro Gly Ala Val His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser
210 215 220
Gln His Thr Gln Pro Thr Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser
225 230 235 240
Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly
245 250 255
Asp Phe Ala Leu Pro Val Gly Leu Ile Val Gly Val Thr Ala Leu Gly
260 265 270
Leu Leu Ile Ile Gly Val Val Asn Cys Val Ile Met Thr Gln Val Lys
275 280 285
Lys Lys Pro Leu Cys Leu Gln Arg Glu Ala Lys Val Pro His Leu Pro
290 295 300
Ala Asp Lys Ala Arg Gly Thr Gln Gly Pro Glu Gln Gln His Leu Leu
305 310 315 320
Ile Thr Ala Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser
325 330 335
Ala Leu Asp Arg Arg Ala Pro Thr Arg Asn Gln Pro Gln Ala Pro Gly
340 345 350
Val Glu Ala Ser Gly Ala Gly Glu Ala Arg Ala Ser Thr Gly Ser Ser
355 360 365
Asp Ser Ser Pro Gly Gly His Gly Thr Gln Val Asn Val Thr Cys Ile
370 375 380
Val Asn Val Cys Ser Ser Ser Asp His Ser Ser Gln Cys Ser Ser Gln
385 390 395 400
Ala Ser Ser Thr Met Gly Asp Thr Asp Ser Ser Pro Ser Glu Ser Pro
405 410 415
Lys Asp Glu Gln Val Pro Phe Ser Lys Glu Glu Cys Ala Phe Arg Ser
420 425 430
Gln Leu Glu Thr Pro Glu Thr Leu Leu Gly Ser Thr Glu Glu Lys Pro
435 440 445
Leu Pro Leu Gly Val Pro Asp Ala Gly Met Lys Pro Ser
450 455 460
<210> 53
<211> 463
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<400> 53
Met Ala Pro Ala Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Glu Leu
1 5 10 15
Trp Ala Ala Gly His Ala Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr
20 25 30
Ala Pro Glu Pro Gly Gly Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln
35 40 45
Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Pro Pro Gly Gln His Ala Lys
50 55 60
Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp
65 70 75 80
Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys
85 90 95
Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg
100 105 110
Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu
115 120 125
Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Gln Leu Arg Lys Cys Arg
130 135 140
Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val
145 150 155 160
Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr
165 170 175
Asp Ile Cys Arg Pro His Gln Ile Cys His Val Val Ala Ile Pro Gly
180 185 190
Asn Ala Ser Met Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser
195 200 205
Met Ala Pro Gly Ala Val His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser
210 215 220
Gln His Thr Gln Pro Thr Pro Ala Pro Ser Thr Ala Pro Gly Thr Ser
225 230 235 240
Phe Leu Leu Pro Val Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly
245 250 255
Asp Ile Val Leu Pro Val Gly Leu Ile Val Gly Val Thr Ala Leu Gly
260 265 270
Leu Leu Ile Ile Gly Val Val Asn Cys Val Ile Met Thr Gln Val Lys
275 280 285
Lys Lys Pro Leu Cys Leu Gln Arg Glu Thr Lys Val Pro His Leu Pro
290 295 300
Ala Asp Lys Ala Arg Gly Ala Gln Gly Pro Glu Gln Gln His Leu Leu
305 310 315 320
Thr Thr Val Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser
325 330 335
Ala Leu Asp Arg Arg Ala Pro Thr Arg Asn Gln Pro Gln Ala Pro Gly
340 345 350
Ala Glu Lys Ala Ser Gly Ala Gly Glu Ala Arg Ala Ser Thr Gly Ser
355 360 365
Ser Ala Asp Ser Ser Pro Gly Gly His Gly Thr Gln Val Asn Val Thr
370 375 380
Cys Ile Val Asn Val Cys Ser Ser Ser Asp His Ser Ser Gln Cys Ser
385 390 395 400
Ser Gln Ala Ser Ser Thr Met Gly Asp Thr Asp Ala Ser Pro Ser Gly
405 410 415
Ser Pro Lys Asp Glu Gln Val Pro Phe Ser Lys Glu Glu Ser Ala Phe
420 425 430
Arg Ser Gln Leu Glu Thr Pro Glu Thr Leu Leu Gly Ser Thr Glu Glu
435 440 445
Lys Pro Leu Pro Leu Gly Val Pro Asp Ala Gly Met Lys Pro Ser
450 455 460
<210> 54
<211> 474
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 54
Met Ala Pro Ala Ala Leu Trp Val Ala Leu Val Phe Glu Leu Gln Leu
1 5 10 15
Trp Ala Thr Gly His Thr Val Pro Ala Gln Val Val Leu Thr Pro Tyr
20 25 30
Lys Pro Glu Pro Gly Tyr Glu Cys Gln Ile Ser Gln Glu Tyr Tyr Asp
35 40 45
Arg Lys Ala Gln Met Cys Cys Ala Lys Cys Pro Pro Gly Gln Tyr Val
50 55 60
Lys His Phe Cys Asn Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Ala Asp Cys Glu
65 70 75 80
Ala Ser Met Tyr Thr Gln Val Trp Asn Gln Phe Arg Thr Cys Leu Ser
85 90 95
Cys Ser Ser Ser Cys Thr Thr Asp Gln Val Glu Ile Arg Ala Cys Thr
100 105 110
Lys Gln Gln Asn Arg Val Cys Ala Cys Glu Ala Gly Arg Tyr Cys Ala
115 120 125
Leu Lys Thr His Ser Gly Ser Cys Arg Gln Cys Met Arg Leu Ser Lys
130 135 140
Cys Gly Pro Gly Phe Gly Val Ala Ser Ser Arg Ala Pro Asn Gly Asn
145 150 155 160
Val Leu Cys Lys Ala Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asp Thr Thr Ser
165 170 175
Ser Thr Asp Val Cys Arg Pro His Arg Ile Cys Ser Ile Leu Ala Ile
180 185 190
Pro Gly Asn Ala Ser Thr Asp Ala Val Cys Ala Pro Glu Ser Pro Thr
195 200 205
Leu Ser Ala Ile Pro Arg Thr Leu Tyr Val Ser Gln Pro Glu Pro Thr
210 215 220
Arg Ser Gln Pro Leu Asp Gln Glu Pro Gly Pro Ser Gln Thr Pro Ser
225 230 235 240
Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Thr Pro Ile Ile Glu Gln Ser Thr Lys
245 250 255
Gly Gly Ile Ser Leu Pro Ile Gly Leu Ile Val Gly Val Thr Ser Leu
260 265 270
Gly Leu Leu Met Leu Gly Leu Val Asn Cys Ile Ile Leu Val Gln Arg
275 280 285
Lys Lys Lys Pro Ser Cys Leu Gln Arg Asp Ala Lys Val Pro His Val
290 295 300
Pro Asp Glu Lys Ser Gln Asp Ala Val Gly Leu Glu Gln Gln His Leu
305 310 315 320
Leu Thr Thr Ala Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Glu Ser Ser Ala
325 330 335
Ser Ala Gly Asp Arg Arg Ala Pro Pro Gly Gly His Pro Gln Ala Arg
340 345 350
Val Met Ala Glu Ala Gln Gly Phe Gln Glu Ala Arg Ala Ser Ser Arg
355 360 365
Ile Ser Asp Ser Ser His Gly Ser His Gly Thr His Val Asn Val Thr
370 375 380
Cys Ile Val Asn Val Cys Ser Ser Ser Asp His Ser Ser Gln Cys Ser
385 390 395 400
Ser Gln Ala Ser Ala Thr Val Gly Asp Pro Asp Ala Lys Pro Ser Ala
405 410 415
Ser Pro Lys Asp Glu Gln Val Pro Phe Ser Gln Glu Glu Cys Pro Ser
420 425 430
Gln Ser Pro Cys Glu Thr Thr Glu Thr Leu Gln Ser His Glu Lys Pro
435 440 445
Leu Pro Leu Gly Val Pro Asp Met Gly Met Lys Pro Ser Gln Ala Gly
450 455 460
Trp Phe Asp Gln Ile Ala Val Lys Val Ala
465 470
<210> 55
<211> 455
<212> PRT
<213> 智人
<400> 55
Met Gly Leu Ser Thr Val Pro Asp Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu Leu
1 5 10 15
Glu Leu Leu Val Gly Ile Tyr Pro Ser Gly Val Ile Gly Leu Val Pro
20 25 30
His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys
35 40 45
Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys
50 55 60
Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp
65 70 75 80
Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu
85 90 95
Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val
100 105 110
Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg
115 120 125
Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe
130 135 140
Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu
145 150 155 160
Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu
165 170 175
Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr
180 185 190
Lys Leu Cys Leu Pro Gln Ile Glu Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser
195 200 205
Gly Thr Thr Val Leu Leu Pro Leu Val Ile Phe Phe Gly Leu Cys Leu
210 215 220
Leu Ser Leu Leu Phe Ile Gly Leu Met Tyr Arg Tyr Gln Arg Trp Lys
225 230 235 240
Ser Lys Leu Tyr Ser Ile Val Cys Gly Lys Ser Thr Pro Glu Lys Glu
245 250 255
Gly Glu Leu Glu Gly Thr Thr Thr Lys Pro Leu Ala Pro Asn Pro Ser
260 265 270
Phe Ser Pro Thr Pro Gly Phe Thr Pro Thr Leu Gly Phe Ser Pro Val
275 280 285
Pro Ser Ser Thr Phe Thr Ser Ser Ser Thr Tyr Thr Pro Gly Asp Cys
290 295 300
Pro Asn Phe Ala Ala Pro Arg Arg Glu Val Ala Pro Pro Tyr Gln Gly
305 310 315 320
Ala Asp Pro Ile Leu Ala Thr Ala Leu Ala Ser Asp Pro Ile Pro Asn
325 330 335
Pro Leu Gln Lys Trp Glu Asp Ser Ala His Lys Pro Gln Ser Leu Asp
340 345 350
Thr Asp Asp Pro Ala Thr Leu Tyr Ala Val Val Glu Asn Val Pro Pro
355 360 365
Leu Arg Trp Lys Glu Phe Val Arg Arg Leu Gly Leu Ser Asp His Glu
370 375 380
Ile Asp Arg Leu Glu Leu Gln Asn Gly Arg Cys Leu Arg Glu Ala Gln
385 390 395 400
Tyr Ser Met Leu Ala Thr Trp Arg Arg Arg Thr Pro Arg Arg Glu Ala
405 410 415
Thr Leu Glu Leu Leu Gly Arg Val Leu Arg Asp Met Asp Leu Leu Gly
420 425 430
Cys Leu Glu Asp Ile Glu Glu Ala Leu Cys Gly Pro Ala Ala Leu Pro
435 440 445
Pro Ala Pro Ser Leu Leu Arg
450 455
<210> 56
<211> 233
<212> PRT
<213> 智人
<400> 56
Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala
1 5 10 15
Leu Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Gln Gly Ser Arg Arg Cys Leu Phe
20 25 30
Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Ile Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe
35 40 45
Cys Leu Leu His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro
50 55 60
Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser
65 70 75 80
Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro
85 90 95
Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu
100 105 110
Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser
115 120 125
Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly
130 135 140
Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala
145 150 155 160
Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro
165 170 175
Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu
180 185 190
Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu
195 200 205
Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly
210 215 220
Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
225 230
<210> 57
<211> 221
<212> PRT
<213> 智人
<400> 57
Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala
1 5 10 15
Leu Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Gln Gly Ser Arg Arg Cys Leu Phe
20 25 30
Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Ile Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe
35 40 45
Cys Leu Leu His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro
50 55 60
Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala Val Ala His Val
65 70 75 80
Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg
85 90 95
Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu
100 105 110
Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe
115 120 125
Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile
130 135 140
Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala
145 150 155 160
Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys
165 170 175
Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys
180 185 190
Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe
195 200 205
Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
210 215 220
<210> 58
<211> 324
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：小鼠IgG1恒定结构域
<400> 58
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala
1 5 10 15
Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro
100 105 110
Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu
115 120 125
Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser
130 135 140
Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu
145 150 155 160
Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
165 170 175
Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn
180 185 190
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro
195 200 205
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln
210 215 220
Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val
225 230 235 240
Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val
245 250 255
Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln
260 265 270
Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn
275 280 285
Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val
290 295 300
Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His
305 310 315 320
Ser Pro Gly Lys
<210> 59
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：小鼠IgG2a恒定结构域
<400> 59
Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp
145 150 155 160
Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg
165 170 175
Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln
180 185 190
His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn
195 200 205
Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly
210 215 220
Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met
245 250 255
Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu
260 265 270
Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe
275 280 285
Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn
290 295 300
Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
305 310 315 320
Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
325 330
<210> 60
<211> 324
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列：小鼠IgG1 D265A恒定结构域
<400> 60
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala
1 5 10 15
Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro
100 105 110
Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu
115 120 125
Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Ala Ile Ser
130 135 140
Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu
145 150 155 160
Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
165 170 175
Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn
180 185 190
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro
195 200 205
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln
210 215 220
Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val
225 230 235 240
Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val
245 250 255
Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln
260 265 270
Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn
275 280 285
Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val
290 295 300
Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His
305 310 315 320
Ser Pro Gly Lys

Claims (19)

1.一种抗TNFR2抗体，其包含：
(a)VH:CDR1:SEQ ID NO:13、CDR2:SEQ ID NO:14、CDR3:SEQ ID NO:15，VL:CDR1:SEQID NO:16、CDR2:SEQ ID NO:17、CDR3:SEQ ID NO:18；
(b)VH:CDR1:SEQ ID NO:19、CDR2:SEQ ID NO:20、CDR3:SEQ ID NO:21，VL:CDR1:SEQID NO:22、CDR2:SEQ ID NO:23、CDR3:SEQ ID NO:24；
(c)VH:CDR1:SEQ ID NO:25、CDR2:SEQ ID NO:26、CDR3:SEQ ID NO:27，VL:CDR1:SEQID NO:28、CDR2:SEQ ID NO:29、CDR3:SEQ ID NO:30；
(d)VH:CDR1:SEQ ID NO:31CDR2:SEQ ID NO:32、CDR3:SEQ ID NO:33，VL:CDR1:SEQ IDNO:34、CDR2:SEQ ID NO:35、CDR3:SEQ ID NO:36；
(e)VH:CDR1:SEQ ID NO:37、CDR2:SEQ ID NO:38、CDR3:SEQ ID NO:39，VL:CDR1:SEQID NO:34、CDR2:SEQ ID NO:40、CDR3:SEQ ID NO:41；
(f)VH:CDR1:SEQ ID NO:37、CDR2:SEQ ID NO:49、CDR3:SEQ ID NO:39，VL:CDR1:SEQID NO:34、CDR2:SEQ ID NO:40、CDR3:SEQ ID NO:41；或者
(g)VH:CDR1:SEQ ID NO:42、CDR2:SEQ ID NO:43、CDR3:SEQ ID NO:44，VL:CDR1:SEQID NO:45、CDR2:SEQ ID NO:46、CDR3:SEQ ID NO:47。
2.根据权利要求1所述的抗TNFR2抗体，其中所述抗体包含：
(a)具有如SEQ ID NO:1所示序列的重链可变区和如SEQ ID NO:2所示序列的轻链可变区；
(b)具有如SEQ ID NO:3所示序列的重链可变区和如SEQ ID NO:4所示序列的轻链可变区；
(c)具有如SEQ ID NO:5所示序列的重链可变区和如SEQ ID NO:6所示序列的轻链可变区；
(d)具有如SEQ ID NO:7所示序列的重链可变区和如SEQ ID NO:8所示序列的轻链可变区；
(e)具有如SEQ ID NO:9所示序列的重链可变区和如SEQ ID NO:10所示序列的轻链可变区；
(f)具有如SEQ ID NO:48所示序列的重链可变区和如SEQ ID NO:10所示序列的轻链可变区；或者
(g)具有如SEQ ID NO:11所示序列的重链可变区和如SEQ ID NO:12所示序列的轻链可变区。
3.根据权利要求2所述的抗TNFR2抗体，其中所述抗体包含如SEQ ID NO:50所示的重链恒定区。
4.根据权利要求2所述的抗TNFR2抗体，其中所述抗体包含如SEQ ID NO:51所示的轻链恒定区。
5.根据权利要求1所述的抗TNFR2抗体，其中所述抗体是全长人抗体。
6.根据权利要求1所述的抗TNFR2抗体，其中所述抗体是嵌合抗体。
7.根据权利要求1所述的抗TNFR2抗体，其中所述抗体是双特异性抗体或多特异性抗体。
8.根据权利要求1所述的抗TNFR2抗体，其中所述抗体是人源化的抗体。
9.根据权利要求1所述的抗TNFR2抗体，其中所述抗体是抗体片段。
10.根据权利要求9所述的抗TNFR2抗体，其中所述抗体片段选自：Fab、Fab、F(ab)2、Fd、Fv、scFv和scFv-Fc片段、单链抗体、微型抗体和双抗体。
11.一种药物组合物，其包含作为活性成分的至少一种权利要求1至10中任一项所述的抗体和药学上可接受的载体。
12.根据权利要求11所述的药物组合物，其用于通过抑制抗TNFR2与TNF-α的结合来调节免疫系统。
13.根据权利要求11或12中任一项所述的药物组合物，其用于治疗癌症。
14.一种治疗癌症的方法，其包括向需要其的受试者施用权利要求11或12所述的药物组合物。
15.一种分离的多核苷酸，其包含编码根据权利要求1所述的抗TNFR2抗体的序列。
16.根据权利要求15所述的分离的多核苷酸，其编码如SEQ ID NO:1至12中任一项所示的序列。
17.一种载体，其包含根据权利要求16所述的多核苷酸。
18.一种宿主细胞，其包含根据权利要求16所述的多核苷酸和/或根据权利要求17所述的载体。
19.一种用于生产根据权利要求1所述的抗TNFR2抗体的方法，所述方法包括培养权利要求18所述的宿主细胞。
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