KR20240073008A - Cd137 및 종양 연관 항원에 결합하는 이중특이적 결합 단백질 - Google Patents

Cd137 및 종양 연관 항원에 결합하는 이중특이적 결합 단백질 Download PDF

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Abstract

본 개시는 인간 CD137 및 종양 연관 항원(예를 들어, 클라우딘-6, 클라우딘 18.2, 또는 넥틴-4)에 결합하는 이중특이체 결합 단백질 및 이의 단편, 이들 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 이를 생산하는 세포를 제공한다. 본 개시는 또한 이들 항체를 포함하는 치료적 조성물, 및 암 검출, 예후 및 항체 기반 면역요법에 대한 이들의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

CD137 및 종양 연관 항원에 결합하는 이중특이적 결합 단백질
관련 출원에 대한 상호 참조
본 국제 특허 출원은 2021년 9월 3일에 출원된 미국 특허 가출원 제63/240,402호 및 2022년 4월 5일에 출원된 미국 특허 가출원 제63/327,700호의 이익을 주장하며, 그 전체 내용은 본원에 참조로서 통합된다.
서열 목록에 관한 진술
본 출원과 연관된 서열 목록은 종이 사본을 대신하여 XML 포맷으로 제공되며, 이는 본 명세서에 참조로서 통합된다. 서열 목록이 포함된 XLM 파일의 명칭은 122863-5007_Sequence_Listing_ST.26.xml이다. 텍스트 파일은 약 111,345 바이트이고, 2022년 8월 28일 또는 그 무렵에 생성되었으며, EFS-Web을 통해 전자적으로 제출된다.
기술분야
본 개시는 면역요법 분야와 관련되며, 인간 CD137 및 종양 연관 항원(예를 들어, 클라우딘(Claudin)-6, 클라우딘 18.2, 또는 넥틴(Nectin)-4)에 결합하는 이중특이체 결합 단백질 및 이의 단편, 이들 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 이를 생산하는 세포에 관한 것이다. 본 개시는 또한 이들 이중특이체 결합 단백질을 포함하는 치료 조성물, 및 암 검출, 예후 및 항체 기반 면역요법을 위한 이의 사용 방법에 관한 것이다.
T 세포의 활성화는 항종양 면역에서 중심적인 역할을 한다. 미처리 T 세포를 활성화하려면 2개의 주요 신호가 필요하다. 신호 1은 T 세포 수용체(TCR)를 통해 제공되는 반면, 신호 2는 공자극의 신호이다. CD28:B7 분자는 일차 T 세포 자극이 발생하는 주요 메커니즘으로 여겨지는, 가장 잘 연구된 공자극 경로 중 일부이다. 그러나, 초기 T 세포 활성화 후 T 세포 반응을 증폭시키고 다양화하는 역할을 하는 다수의 다른 분자가 식별되었다. 이들은 4-1BB:4-1BB 리간드(4-1BBL)로도 알려진 CD137/CD137 리간드(CD137L) 분자를 포함한다.　
CD137(4-1BB, 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 9)은 TNF-수용체 수퍼패밀리(TNFRSF)의 구성원이며, 선천 및 적응 면역 세포 둘 다의 면역 세포의 활성화 후에 발현되는 공자극 분자이다. CD137은 다양한 면역 세포의 활성을 조절하는 데 필수적인 역할을 한다. CD137/CD137L 신호 전달 경로를 표적화하는 요법은 다수의 모델 시스템에서 항종양 효과를 갖는 것으로 나타났으며, 작용성 항-CD137 항체 또한 임상 개발에 진입하였다(Yonezawa 등의 문헌[Clin. Cancer Res. 2015 7월 15일; 21(14):3113-20]; Tolcher 등의 문헌[Clin Cancer Res. 2017 9월 15일; 23(18):5349-5357]). CD137 작용제는 면역 세포 증식, 생존, 사이토카인의 분비 및 세포용해 활성 CD8 T 세포를 향상시킨다. 많은 다른 연구는 CD137의 활성화가 마우스에서 종양을 제거하기 위해 면역 반응을 향상시킨다는 것을 보여주었다. 임상에서, CD137 단클론 항체 요법은 유망한 항종양 효과를 나타냈지만, 전신 면역 자극은 용량 제한 간 독성을 유도하였다(Chester, C. 등의 문헌[Cancer Immunol Immunother 65, 1243-1248 (2016)]; Segal, N.H 등의 문헌[Clin. Cancer Res. 2017, 23, 1929-1936]).
새로운 CD137 작용제 모이어티가 개발되고 있으며, 이는 간 염증의 부작용을 피하고 치료 윈도우를 확장하기 위해 종양 미세환경(TME)을 표적화하는 강력한 공동 자극을 목표로 한다. 상이한 접근법이 적용된다. 임상 개발 중인 작제물 중 가장 발전된 것들은 종양 항원(예를 들어, TAA 또는 TSA) 및 CD137을 표적화하는 이중특이체 Ab와 같은 CD137 공자극을 TME에 특이적으로 가져오도록 설계된 CD137 기반 이중특이체 작제물이다. 항종양 활성은 숙주 면역계를 종양 연관 항원으로 유도함으로써 달성될 수 있다. 세포 세포독성을 증가시키도록 종양 세포를 CD137 발현 T 세포와 연결하는 것은 암 요법에서 유망한 전략을 나타낸다.
CD137-Her2 이중특이체 항체는 해당 작제물의 양호한 내약성을 나타냈으며, 임상 활성의 증거를 나타냈으며(Hinner MJ 등의 문헌[Clin Cancer Res. 2019년 10월 1일; 25(19):5878-5889]; Piha-Paul S 등의 문헌[Phase 1 dose escalation study of PRS-343, a HER2/4-1BB bispecific molecule, in patients with HER2+ malignancies, 34th Annual Meeting & Pre-Conference Programs of the Society for Immunotherapy of Cancer, National Harbor, MD, 2019]), 종양 항원 5T4 및 CD137을 표적화하는 이중특이체 Ab 또한 양호한 전임상 활성을 나타냈다(Nelson M 등의 문헌[Potent tumor-directed T cell activation and tumor inhibition induced by ALG.APV-527, a 4-1BB x 5T4 ADAPTIRTM bispecific antibody, 34th Annual Meeting & Pre-Conference Programs of the Society for Immunotherapy of Cancer, National Harbor, MD, 2019]).
클라우딘 수퍼패밀리 구성원은 밀착 접합부의 주요 구성요소이며, 이는 세포 극성을 유지하고 인접한 세포 사이의 공간을 밀봉한다. 클라우딘 6(CLDN6)은 초기 발달 동안 발현되지만 건강한 성인 인간 조직에서는 침묵하는 암배아 단백질이다. CLDN6 발현은 소아 뇌 종양, 위 선암종 및 생식 세포 종양, 및 난소암 및 고환암과 같은 광범위한 비혈액암에서 보고되었다. 이의 발현은 종종 불량한 예후와 상관된다. 클라우딘 18.2는 위암, 식도암, 췌장암, 폐암 및 난소암을 포함하는 광범위한 인간 악성 종양에서 광범위하게 발현된다. 클라우딘 18.2는 우수한 표적 안전성 프로파일을 갖는다. 정상 조직에서, 클라우딘 18.2 발현은 위장 및 단수명 분화 세포에서만 발현되는 것으로 제한된다. 넥틴 계열 단백질은 동종성 및 이종성 트랜스-상호작용을 통해 세포-세포 부착을 매개하며, 여기에서 이종성 트랜스-상호작용은 동종성 트랜스-상호작용보다 훨씬 더 강하다. 넥틴 단백질 계열 구성원으로서, 넥틴-4는 종양 형성 및 전이의 중요한 동인이다. 암 조직에서 넥틴-4의 과발현은 암 진행 및 불량한 예후와 관련이 있다.
상피 기원의 암은 환자, 그 가족 및 의료 시스템에 영향을 미치는 중요한 글로벌 의학적 과제라고 할 수 있다. 종양을 가진 환자의 충족되지 않은 의학적 요구를 위해, CLDN6, CLDN18.2, 또는 넥틴-4와 같은 상피 종양 항원을 과발현하며, 단독으로 또는 다른 제제와 조합하여 CD137 및 이들 종양 항원에 결합하는 특이적 결합 단백질이 항체 기반 면역요법에 사용될 수 있으며, 이는 잠재적으로 효과적이고 안전한 치료 해결책을 제공한다.
본 개시는 CD137 및 종양 연관 항원(TAA)에 결합하는 이중특이체 결합 단백질을 제공함으로써 전술한 요구를 해결한다. 특정 구현예에서, 본 개시는 종양 특이적 항원 CLDN18.2, CLDN6 또는 넥틴-4, 및 공자극 CD137 수용체에 결합하는 이중특이체 항체를 제공한다. 이러한 이중특이체 결합 단백질은 암과 같은 질환 또는 장애의 치료에 유용할 수 있다.
또한, 종양 연관 항원 및 CD137에 결합하는 이중특이체 결합 단백질이 본원에 제공되며, 이는: (a) 종양 연관 항원에 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 종양 연관 항원에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 항체 스캐폴드 모듈; 및 (b) CD137에 결합하는 제3 항원 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 제1 결합 모듈을 포함한다.
일부 구현예에서, 종양 연관 항원은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 클라우딘 6, 클라우딘 18.2, 및 넥틴-4.
일부 구현예에서, 종양 연관 항원은 클라우딘 6이다.
일부 구현예에서, 종양 연관 항원은 클라우딘 18.2이다.
일부 구현예에서, 종양 연관 항원은 넥틴-4이다.
일부 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은 IgG이다.
일부 구현예에서, 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위 둘 모두는 클라우딘 6에 결합하고: (i) CDR1: 서열번호 45, CDR2: 서열번호 46, 및 CDR3: 서열번호 47을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 CDR1: 서열번호 48, CDR2: 서열번호 49, 및 CDR3: 서열번호 50을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열; 또는 (ii) CDR1: 서열번호 51, CDR2: 서열번호 52, 및 CDR3: 서열번호 53을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 CDR1: 서열번호 54, CDR2: 서열번호 55, 및 CDR3: 서열번호 56을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위 둘 모두는 클라우딘 6에 결합하고, 서열번호 25 또는 서열번호 27에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 26 또는 서열번호 28에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위 둘 모두는 클라우딘 6에 결합하고, (i) 서열번호 25에 제시된 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 26에 제시된 경쇄 가변 영역 서열; 또는 (ii) 서열번호 27에 제시된 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 28에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위 둘 모두는 클라우딘 18.2에 결합하고: CDR1: 서열번호 33, CDR2: 서열번호 34, 및 CDR3: 서열번호 35를 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 CDR1: 서열번호 36, CDR2: 서열번호 37, 및 CDR3: 서열번호 38을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위 둘 모두는 클라우딘 18.2에 결합하고, 서열번호 21에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 22에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위 둘 모두는 넥틴-4에 결합하고: CDR1: 서열번호 57, CDR2: 서열번호 58, 및 CDR3: 서열번호 59를 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 CDR1: 서열번호 60, CDR2: 서열번호 61, 및 CDR3: 서열번호 62를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위 둘 모두는 넥틴-4에 결합하고, 서열번호 29 또는 서열번호 31에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 30 또는 서열번호 32에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위 둘 모두는 넥틴-4에 결합하고, (i) 서열번호 29에 제시된 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 30에 제시된 경쇄 가변 영역 서열; 또는 (ii) 서열번호 31에 제시된 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 32에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 이중특이체 결합 단백질은 하나의 제1 결합 모듈을 포함한다.
일부 구현예에서, 결합 단백질은 2개의 제1 결합 모듈을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 결합 모듈은 항체 단편이다.
일부 구현예에서, 항체 단편은 scFv이다.
일부 구현예에서, 제1 결합 모듈은 CD137에 결합한다.
일부 구현예에서, 제1 결합 모듈은 CD137에 결합하는 scFV이다.
일부 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은 둘 모두 C-말단 및 N-말단을 갖는 2개의 중쇄 서열을 포함하고, 항체 스캐폴드 모듈은 둘 모두 C-말단 및 N-말단을 갖는 2개의 경쇄 서열을 포함한다. 제1 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 하나 또는 둘 모두의 C-말단, 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 하나 또는 둘 모두의 C-말단, 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 하나 또는 둘 모두의 N-말단, 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 하나 또는 둘 모두의 N-말단, 또는 이들의 조합에 공유 부착되고, 여기에서 제1 결합 모듈 및 항체 스캐폴드 모듈은 직접적으로 또는 인터링커를 통해 서로 공유 부착된다.
일부 구현예에서, 제1 결합 모듈 및 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 64 또는 서열번호 65에 제시된 서열을 갖는 인터링커를 통해 서로 공유 부착된다.
일부 구현예에서, 제1 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 둘 모두의 C-말단에 공유 부착된다.
일부 구현예에서, 제1 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 둘 모두의 C-말단에 공유 부착된다.
일부 구현예에서, 제1 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 둘 모두의 N-말단에 공유 부착된다.
일부 구현예에서, 제1 결합 모듈은 CD137에 결합하고: CDR1: 서열번호 39, CDR2: 서열번호 40, 및 CDR3: 서열번호 41을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 CDR1: 서열번호 42, CDR2: 서열번호 43, 및 CDR3: 서열번호 44를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 결합 모듈은 CD137에 결합하고: 서열번호 23에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 24에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 이중특이체 결합 단백질은 CD137에 결합하는 2개의 제1결합 모듈을 포함하고, 여기에서: 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위 둘 모두는 클라우딘 18.2에 결합하고, 서열번호 21에 제시된 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 22에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하고; 제1 결합 모듈은 각각 서열번호 23에 제시된 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 24에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하되, 제1 결합 모듈은 글리신-세린 링커에 의해 항체 스캐폴드 모듈의 각각의 중쇄의 C-말단에 별도로 부착된다.
일부 구현예에서, 글리신-세린 링커는 3xG4S 링커(서열번호 64)이다.
일부 구현예에서, 제1 결합 모듈의 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열은 글리신-세린 링커에 의해 부착된다.
일부 구현예에서, 글리신-세린 링커는 4xG4S 링커(서열번호 65)이다.
일부 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈, 글리신-세린 링커, 및 제1 결합 모듈의 중쇄는 서열번호 3에 제시된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 이중특이체 결합 단백질은 CD137에 결합하는 2개의 제1결합 모듈을 포함하고, 여기에서: 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위 둘 모두는 클라우딘 18.2에 결합하고, 서열번호 21에 제시된 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 22에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하고; 제1 결합 모듈은 각각 서열번호 23에 제시된 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 24에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하되, 제1 결합 모듈은 글리신-세린 링커에 의해 항체 스캐폴드 모듈의 각각의 경쇄의 C-말단에 별도로 부착된다.
일부 구현예에서, 글리신-세린 링커는 3xG4S 링커(서열번호 64)이다.
일부 구현예에서, 제1 결합 모듈의 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열은 글리신-세린 링커에 의해 부착된다.
일부 구현예에서, 글리신-세린 링커는 4xG4S 링커(서열번호 65)이다.
일부 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈, 글리신-세린 링커, 및 제1 결합 모듈의 경쇄는 서열번호 5에 제시된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 이중특이체 결합 단백질은 CD137에 결합하는 2개의 제1결합 모듈을 포함하고, 여기에서: 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위 둘 모두는 클라우딘 6에 결합하고, 서열번호 25 또는 27에 제시된 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 26 또는 28에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하고; 제1 결합 모듈은 각각 서열번호 23에 제시된 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 24에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하되, 제1 결합 모듈은 글리신-세린 링커에 의해 항체 스캐폴드 모듈의 각각의 중쇄의 C-말단에 별도로 부착된다.
일부 구현예에서, 글리신-세린 링커는 3xG4S 링커(서열번호 64)이다.
일부 구현예에서, 제1 결합 모듈의 중쇄 가변 영역 서열 및 중쇄 가변 영역 서열은 글리신-세린 링커에 의해 부착된다.
일부 구현예에서, 글리신-세린 링커는 3xG4S 링커(서열번호 64)이다.
일부 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈, 글리신-세린 링커, 및 제1 결합 모듈의 중쇄는 서열번호 12, 13, 또는 72에 제시된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 이중특이체 결합 단백질은 CD137에 결합하는 2개의 제1결합 모듈을 포함하고, 여기에서: 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위 둘 모두는 넥틴-4에 결합하고, 서열번호 29 또는 31에 제시된 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 30 또는 32에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하고; 제1 결합 모듈은 각각 서열번호 23에 제시된 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 24에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하되, 제1 결합 모듈은 글리신-세린 링커에 의해 항체 스캐폴드 모듈의 각각의 경쇄의 C-말단에 별도로 부착된다.
일부 구현예에서, 글리신-세린 링커는 3xG4S 링커(서열번호 64)이다.
일부 구현예에서, 제1 결합 모듈의 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열은 글리신-세린 링커에 의해 부착된다.
일부 구현예에서, 글리신-세린 링커는 4xG4S 링커(서열번호 65)이다.
일부 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈, 글리신-세린 링커, 및 제1 결합 모듈의 경쇄는 서열번호 17에 제시된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 이중특이체 결합 단백질은 CD137에 결합하는 2개의 제1결합 모듈을 포함하고, 여기에서: 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위 둘 모두는 넥틴-4에 결합하고, 서열번호 29 또는 31에 제시된 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 30 또는 32에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하고; 제1 결합 모듈은 각각 서열번호 23에 제시된 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 24에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하되, 제1 결합 모듈은 글리신-세린 링커에 의해 항체 스캐폴드 모듈의 각각의 중쇄의 N-말단에 별도로 부착된다.
일부 구현예에서, 글리신-세린 링커는 4xG4S 링커(서열번호 65)이다.
일부 구현예에서, 제1 결합 모듈의 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열은 글리신-세린 링커에 의해 부착된다.
일부 구현예에서, 글리신-세린 링커는 4xG4S 링커(서열번호 65)이다.
일부 구현예에서, 제1 결합 모듈, 글리신-세린 링커, 및 항체 스캐폴드 모듈의 중쇄는 서열번호 18에 제시된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 이중특이체 결합 단백질은 CD137에 결합하는 2개의 제1결합 모듈을 포함하고, 여기에서: 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위 둘 모두는 넥틴-4에 결합하고, 서열번호 29 또는 31에 제시된 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 30 또는 32에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하고; 제1 결합 모듈은 각각 서열번호 23에 제시된 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 24에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하되, 제1 결합 모듈은 글리신-세린 링커에 의해 항체 스캐폴드 모듈의 각각의 중쇄의 C-말단에 별도로 부착된다.
일부 구현예에서, 글리신-세린 링커는 3xG4S 링커(서열번호 64)이다.
일부 구현예에서, 제1 결합 모듈의 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열은 글리신-세린 링커에 의해 부착된다.
일부 구현예에서, 글리신-세린 링커는 4xG4S 링커(서열번호 65)이다.
일부 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈의 중쇄, 글리신-세린 링커, 및 제1 결합 모듈은 서열번호 14에 제시된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은 불변 영역을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 불변 영역은 하나 이상의 Fc 침묵 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, Fc 침묵 돌연변이는 L234A/L235A(LALA) 단독 또는 P329A 돌연변이(LALAP) 또는 N297A와의 조합일 수 있다.
일부 구현예에서, 불변 영역은 서열번호 66, 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69, 또는 서열번호 73을 포함한다.
또한, 종양 연관 항원 및 CD137에 결합하는 이중특이체 결합 단백질이 본원에 제공되며, 이는: (a) 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위를 통해 종양 연관 항원에 결합하기 위한 수단을 포함하는 항체 스캐폴드 모듈; 및 (b) 제3 항원 결합 부위를 통해 CD137 에 결합하기 위한 수단을 포함하는 적어도 하나의 제1결합 모듈을 포함한다.
본 개시는 또한 본원에 개시된 이중특이체 결합 단백질 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 개시는 또한 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 방법은 본원에 개시된 바와 같은 이중특이체 결합 단백질을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
또한, 본원에 개시된 이중특이체 결합 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드가 본원에 제공된다. 본 개시는 또한 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 세포를 제공한다. 또한, 본원에 개시된 바와 같은 이중특이체 결합 단백질의 생산 방법이 본원에 제공되며, 방법은 본원에 개시된 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
본 개시의 전술한 요약뿐만 아니라 다음의 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 판독될 때 더 잘 이해될 것이다. 본 개시를 예시하기 위한 목적으로, 본 개시의 바람직한 구현예가 도면에 도시된다. 그러나, 본 개시는 도시된 배열, 실시예 및 기구에 정확히 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다.
도 1 도 1a-1c는 CLDN18.2/CD137, CLDN6/CD137, 및 넥틴-4/CD137 이중특이체의 중쇄 및 경쇄 서열의 아미노산 서열을 제공한다. 도 1d는 CD137, CLDN6, CLDN18.2, 또는 넥틴-4에 결합하는 결합 단백질의 VH 및 VL 도메인의 아미노산 서열을 제공한다. TAA/CD137 이중특이체 단백질의 다른 성분의 서열 또한 제공된다. 각각의 가변 도메인 서열에서의 VH 및 VL 도메인의 CDR 서열(Kabat 넘버링)에는 밑줄이 그어져 있다. 서열 식별자가 제공된다.
도 2는 3개의 예시적인 이중특이체 결합 단백질 포맷을 도시하며, 이는, i) 종양 연관 항원에 결합하는 2개의 항원 결합 부위, 및 각각 항체 스캐폴드 모듈의 중쇄 불변 영역의 C-말단에 별도로 부착된, CD137에 결합하는 2개의 제1 결합 모듈(예를 들어, scFv)를 포함하는 항체 스캐폴드 모듈을 갖는 제1 이중특이체 결합 단백질 포맷(BsAb_A); ii) 종양 연관 항원에 결합하는 2개의 항원 결합 부위, 및 각각 항체 스캐폴드 모듈의 경쇄 불변 영역의 C-말단에 별도로 부착된, CD137에 결합하는 2개의 제1 결합 모듈(예를 들어, scFv)를 포함하는 항체 스캐폴드 모듈을 갖는 제2 이중특이체 결합 단백질 포맷(BsAb_B); 및 iii) 종양 연관 항원에 결합하는 2개의 항원 결합 부위, 및 각각 항체 스캐폴드 모듈의 중쇄 가변 영역의 N-말단에 별도로 부착된, CD137에 결합하는 2개의 제1 결합 모듈(예를 들어, scFv)를 포함하는 항체 스캐폴드 모듈을 갖는 제3 이중특이체 결합 단백질 포맷(BsAb_C)를 포함한다.
도 3은 1901Ab1, 1901Ab2, 1901Ab3, 1923Ab4, 1912Ab1, 1912Ab2, 1912Ab3, 1912Ab4, 1912Ab5, 1925Ab1, 1925Ab2, 1925Ab3, 및 1925Ab4를 포함하는, 여러 결합 단백질의 중쇄 및 경쇄 성분을 도시한다.
도 4는 1901Ab1, 1901Ab2, 1901Ab3, 1923Ab4, 1912Ab1, 1912Ab2, 1912Ab3, 1912Ab4, 1912Ab5, 1925Ab1, 1925Ab2, 1925Ab3, 및 1925Ab4를 포함하는, 여러 결합 단백질의 항체 스캐폴드 모듈 및 결합 모듈(존재하는 경우)의 성분을 도시한다.
도 5는 1901Ab1, 1901Ab2, 1901Ab3, 1923Ab4, 1912Ab1, 1912Ab2, 1912Ab3, 1912Ab4, 1912Ab5, 1925Ab1, 1925Ab2, 1925Ab3, 및 1925Ab4를 포함하는, 여러 결합 단백질의 서열에 대한 서열 식별자를 도시한다. 1901Ab2, 1912Ab3, 1912Ab4, 1912Ab5, 1925Ab1, 및 1925Ab3의 경우, 중쇄 서열은 항체 스캐폴드 모듈의 중쇄, 글리신-세린 링커, 및 제1 결합 모듈의 아미노산 서열을 포함한다. 1901Ab3 및 1925Ab2의 경우, 경쇄 서열은 항체 스캐폴드 모듈의 경쇄, 글리신-세린 링커, 및 제1 결합 모듈의 아미노산 서열을 포함한다.
도 6a-b는 종양 항원 클라우딘 6에 대한 결합 활성을 나타낸다. 도 6a는, NEC8 야생형 세포 표면 상에서의 인간 클라우딘 6에 대한 단일특이체 항체(1912Ab1 및 1912Ab2) 및 이중특이체 항체 CLDN6/CD137(1912Ab3 및 1912Ab4) BsAb를 NEC8 CLDN6 녹아웃 세포와 비교하여 도시한다. 도 6b는 bsAb 1912Ab5가 NEC8 야생형 세포에 결합한다는 것을 나타낸다. 도 6c는 1912Ab5가 클라우딘 9가 아닌 클라우딘 6에 선택적으로 결합한다는 것을 나타낸다.
도 7a-b는 CD137 결합 활성을 나타낸다. 도 7a는 CD137에 결합하는 1912Ab5의 표면 플라스몬 공명(SPR) 결합 분석을 나타낸다. 도 7b는 HEK-CD137 세포 기반 결합 검정에서의 1912Ab3, 1912Ab4 및 1923Ab4의 인간 CD137 결합을 나타낸다. 도 7c는 인간 CD137에 결합하는 1912Ab5 및 우렐루맙-NR(Urelumab-NR)의 투여량 반응 결합 곡선을 나타낸다. 우렐루맙-NR은 미국 특허 제7,288,638호에 공개된 공개적으로 사용 가능한 정보를 기반으로 하는 자체 생산 대조군 항-CD137 항체이다.
도 8a-d는 Jurkat T 세포 CD137 NFKB 리포터 세포를 사용한, CLDN6/CD137 BsAb에 의한 CD137 신호전달의 클라우딘-6 의존성 활성화를 나타낸다. 도 8a는 NEC8 야생형 세포 또는 클라우딘 6 녹아웃 NEC8 세포의 존재 하 공동 배양 분석에서의 1912Ab3, 1912Ab4 또는 벤치마크 대조군 우렐루맙-NR로부터의 활성을 나타낸다. 도 8b는 NEC8 야생형 세포의 존재 하 신호전달 검정에서의 CLDN6/CD137 BsAb 1912Ab3, 1912Ab4 또는 벤치마크 대조군 우렐루맙-NR의 투여량 의존적 활성을 나타낸다. 도 8c는 NEC8 표적 세포를 사용하는 공동 배양 신호전달 분석에서의 1912Ab5 또는 우렐루맙-NR에 의한 NFKB 활성화를 나타낸다. 도 8d는 OV90 표적 세포를 사용하는 공동 배양 신호전달 분석에서의 1912Ab5 또는 우렐루맙-NR에 의한 NFKB 활성화를 나타낸다.
도 9는 CLDN6/CD137 BsAb에 의한 IFNγ 분비를 유도하는 CD8 T 세포의 클라우딘 6 의존성 활성화를 나타낸다. 도 9a는 NEC8 야생형 세포 또는 클라우딘 6 녹아웃 NEC8 세포의 존재 하 공동 배양 분석에서의 1912Ab3, 1912Ab4 또는 벤치마크 대조군 우렐루맙-NR로부터의 활성을 나타낸다. 도 9b는 NEC8 야생형 세포의 존재 하에서의 CLDN6/CD137 BsAb 1912Ab3, 1912Ab4 및 벤치마크 대조군 우렐루맙-NR의 투여량 의존적 활성을 나타낸다. 도 9c는 NEC8 야생형 세포를 사용하는 공동 배양 신호 전달 검정에서의 1912Ab5 또는 우렐루맙-NR에 의한 IFNγ 분비를 나타낸다. 도 9d는 클라우딘 6 녹아웃 NEC8 세포를 사용하는 공동 배양 신호전달 분석에서의 1912Ab5 또는 우렐루맙-NR에 의한 NFKB 활성화를 나타낸다.
도 10a-b는 표적 세포 사멸에서의 T 세포 유래 사멸을 나타낸다. 도 10a는 CLDN6/CD137 이중특이체 항체 1912Ab3 및 1912Ab4에 의한 NEC8 세포 사멸을 나타낸다. 도 10b는 CLDN6/CD137 이중특이체 항체 1912Ab5에 의한 T 세포 유래 OV90 세포 사멸을 나타낸다.
도 11a-c는 쥣과 MC38 종양 모델을 사용한 생체 내 효능 및 안전성 데이터를 나타낸다. 도 11a는 CLDN6/CD137 BsAb 1912Ab3 및 1912Ab4에 의한 생체 내 MC38-클라우딘 6 종양 성장의 클라우딘 6 억제를 나타내다. 21일차 혈청을 사용하여 마우스 생효소 활성을 측정하였다. ALT 활성은 도 11b에 도시되어 있으며, AST 활성은 도 11c에 도시되어 있다. 도 11d는 이전에 1912Ab3 또는 1912Ab4로 치료받았고 완전한 종양 관해를 보인 마우스를 사용한 재투여 연구의 결과를 나타낸다.
도 12는 0.3 mpk, 1 mpk, 및 3 mpk에서의 1912Ab5의 항종양 성장 효과를 나타낸다.
도 13은 0.1 mpk에서의 1912Ab5 및 0.1 mpk에서의 벤치마킹 항체 우렐루맙-NR의 항종양 성장 효과를 나타낸다.
도 14는 이미 성장한 대형 종양을 치료하는 1912Ab5의 항종양 효과를 나타낸다.
도 15는 대조군(도 15a) 또는 1912Ab5(도 15b) 치료 종양의 형광 면역조직화학(IHC) 데이터를 나타낸다.
도 16a-f는 대조군 또는 1912Ab5 치료 종양의 종양 침윤 림프구 결과를 나타낸다. 데이터는 CD4(도 16a), CD8(도 16b), T cem(도 16c), Trm(도 16d), 고갈된 T 세포(도 16e), 및 M2-유사 대식세포 세포(도 16f)에서의 대조군 및 1912Ab5 치료 세포의 데이터를 비교하는 면역 세포 프로파일링을 나타낸다.
도 17은 B16-F10 종양 치료에서의 1912Ab5의 항종양 성장 효과를 나타낸다.
도 18은 NUGC4 세포 상에서의 인간 클라우딘 18.2에 대한 단일특이체 1901Ab1 및 CLDN18.2/CD137 BsAb 1901Ab2 및 1901Ab3의 결합 활성을 나타낸다.
도 19는 세포 표면 상에서의 인간 CD137에 대한 CLDN18.2/CD137 BsAb 1901Ab2 및 1901Ab3, 및 단일특이체 항-CD137 항체 1923Ab4의 결합 활성을 나타낸다.
도 20a-b는 Jurkat T 세포 CD137 리포터 세포를 사용한, CLDN18.2/CD137 BsAb에 의한 CD137 신호전달의 클라우딘 18.2 의존성 활성화를 나타낸다. 도 20a는 막대 그래프로 이를 도시하며, 도 20b는 클라우딘 18.2-CD137 이중특이체 항체의 투여량 의존성 활성을 나타낸다.
도 21은 NUGC4 세포의 존재 하에서 CD8 T 세포 활성화를 유도하는 CLDN18.2/CD137 BsAb의 투여량-반응 곡선을 도시한다.
도 22는 CLDN18.2/CD137 BsAb 1901Ab2 및 1901Ab3에 의한 T 세포 유래 표적 세포 사멸을 나타낸다.
도 23은 CLDN18.2/CD137 BsAb 1901Ab2에 의한 생체 내 MC38-클라우딘 18.2 종양 성장의 억제를 나타내다.
도 24는 CHO 세포 상에서의 인간 넥틴4에 대한 넥틴4/CD137 BsAb 1925Ab1, 1925Ab2, 및 1925Ab3의 결합 활성을 부모 쥣과 단클론 항체 1925Ab4의 결합 활성과 비교하여 도시한다.
도 25는 세포 표면 상에서의 인간 CD137에 대한 넥틴4/CD137 BsAb 1925Ab1, 1925Ab2, 및 1925Ab3의 결합 활성을 부모 쥣과 단클론 항체 1925Ab4의 결합 활성과 비교하여 도시한다.
도 26a-b는 넥틴-4/CD137 BsAb가 Jurkat T 세포 CD137 리포터 세포를 사용하여 표적 세포 의존성 CD137 작용을 유도한다는 것을 나타낸다. 도 26a는 막대 그래프로 이를 도시하며, 도 26b는 넥틴4/CD137 이중특이체 항체의 투여량 의존성 활성을 나타낸다.
도 27a-c는 대조군 항체, 우렐루맙-NR 또는 1912Ab5 치료에 의해 유도된 면역 세포 침윤을 나타낸다. T 세포 침윤 및 대식세포 침윤을 나타내기 위해, CD4(a), CD8(b), 및 F4/80(c)에 의해 염색된 마우스 간 IHC 섹션을 사용하였다.
본 개시는 CD137 및 종양 연관 항원(TAA)에 결합하는 이중특이체 결합 단백질을 제공한다. 예시적인 TAA는 클라우딘 6, 클라우딘 18.2, 및 넥틴 4를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 유리하게는, 본원에 개시된 이중특이체 결합 단백질은 표적 내 독성을 극복할 수 있다. 예를 들어, 종양 연관 항원이 발현되거나 접근이 불가능한 간과 같은 조직에서, 본 개시의 분자는 CD137-매개 세포독성을 활성화시킬 수 없기 때문에 안전할 것이다. 대조적으로, 종양 연관 항원이 과발현되거나 접근 가능한 종양 조직에서, 항체는 종양 연관 항원 결합 의존성 CD137 신호전달 활성화를 거쳐, CD137-매개 면역 세포 활성화를 초래함으로써 종양을 치료한다. 이중특이체 결합 단백질은 암의 치료에 사용될 수 있다. 또한, 본원에 개시된 이중특이체 결합 단백질은 투여량 제형을 보다 적게 하고, 투여의 빈도를 낮추고/낮추거나 이의 효과를 높이며, 비용 감소 및 효율 증가를 가져온다.
종양 미세환경에서, 전체 T 세포 활성화는 두 가지 신호에 의존한다: 하나는 TCR/CD3 활성화를 통해 매개되고, 다른 하나는 공자극 경로에 의해 매개된다. T 세포 공자극을 제공하는 표면 수용체 중, CD137은 중요한 조절제이다. 종양-표적화 CD137 작용제 항체는 T 세포 증식, 생존, 기억 형성, 및 종양-사멸 기능을 촉진하기 위해 단독으로 또는 종양-표적화 CD3 불문(agnostic) 항체와 조합하여 사용될 수 있다.
CD137 공자극(즉, 작용)은 연장된 T 세포 증식, 항응혈 T 세포 재활성화, 기억 T 세포 형성 촉진 및 유지를 야기하는 것으로 보고되었다(Hashimoto K.의 문헌[Cancers (Basel). 2021 5월 11일;13(10):2288]; Chester C 등의 문헌[Blood 2018 1월 4일;131(1):49-57)]). 작용성 항체를 사용하는 CD137의 활성화은 면역 관문 억제제(ICI)의 치료 효능을 개선하거나 ICI에 대한 내성을 극복할 기회를 제공한다. 또한, TAA의 존재 하에서만 CD137 신호전달을 활성화시키는 이중특이체 항체는 간 상주 쿠퍼(Kupffer) 세포에서의 CD137 신호전달의 활성화에 대해 단클론 항-CD137 작용 항체를 사용한 임상시험에서 관찰된 투여량 의존적 간독성을 감소시키는 데 도움이 될 수 있다. 따라서, 본 개시는 CD137의 TAA 매개 클러스터링을 통해 종양 미세환경에서 CD137 공자극 경로를 활성화하도록 고유하게 설계된 신규 4가 TAA/CD137 결합 단백질(즉, 이중특이체 항체)을 제공한다.
본 개시가 보다 용이하게 이해될 수 있도록, 특정 기술적 및 과학적 용어가 아래에 구체적으로 정의된다. 본 문서의 다른 곳에서 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 다른 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시가 속하는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 갖는다.
본 개시 전체에 걸쳐, 다음의 약어가 사용된다.
BsAb - 이중특이체 항체.
mAb 또는 Mab 또는 MAb - 단클론 항체.
CDR - 면역글로불린 가변 영역 내의 상보성 결정 영역.
VH 또는 VH - 면역글로불린 중쇄 가변 영역.
VL 또는 VL - 면역글로불린 경쇄 가변 영역.
FR - 항체 프레임워크 영역, CDR 영역을 제외한 면역글로불린 가변 영역.
용어 "CD137"은 4-1BB, 또는 TNF-수용체 수퍼패밀리(TNFRSF)의 구성원인 TNFRSF9(TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원 9)를 지칭하며, 이는 면역 세포(선천성 및 적응성 면역 세포 둘 모두)의 활성화 후에 발현되는 공자극 분자이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 4-1BB는 포유동물, 예를 들어 호모 사피엔스(인간)(NCBI 수탁 번호 NP_001552)로부터 유래될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 용어 CD137은 변이체, 이소형, 상동체, 이종상동체, 및 파라로그를 포함한다. 예를 들어, 인간 CD137 단백질에 특이적인 항체는, 특정 경우, 인간 이외의 종으로부터의 CD137 단백질과 교차 반응할 수 있다. 다른 구현예에서, 인간 CD137 단백질에 특이적인 항체는 인간 CD-137 단백질에 대해 완전히 특이적일 수 있으며, 교차 반응의 종 또는 다른 유형을 나타낼 수 있거나, 특정 다른 종으로부터의 CD137과 교차 반응할 수 있지만 다른 모든 종과는 교차 반응하지 않을 수 있다(예를 들어, 원숭이 CD137과 교차 반응하지만 마우스 4-1BB와는 교차 반응하지 않음). 용어 "cyno CD137"은 시노몰구스 원숭이 CD137, 예컨대 NCBI 수탁 번호 XP_005544945.1을 갖는 완전한 아미노산 서열을 지칭한다. 용어 "마우스 CD137"은 마우스 서열 4-1BB, 예컨대 NCBI 수탁 번호 NP_035742.1을 갖는 마우스 4-1BB의 완전한 아미노산 서열을 지칭한다. 본 개시의 인간 CD137 서열은, 예를 들어, 보존된 돌연변이 또는 보존되지 않은 영역에서의 돌연변이를 가짐으로써 NCBI 수탁 번호 NP_001552의 인간 CD137과 상이할 수 있으며, 본 개시의 CD137은 NCBI 수탁 번호 NP_001552의 인간 CD137과 실질적으로 동일한 생물학적 기능을 갖는다.
용어 "종양 연관 항원" 또는 "TAA"는 정상 세포(즉, 비-종양 세포)에서 관찰된 것보다 더 많은 양(예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 그 이상)으로 종양 세포의 표면 상에서 발현되는 항원을 지칭한다. 용어 "종양 특이적 항원" 또는 "TSA"는 종양에 특별한 항원을 지칭한다. TAA 및 TSA의 비제한적인 예는 AFP, BAGE, BCMA, 클라우딘 6, 클라우딘 18.2, CAMEL, CEA, CD19, CD20, CD22, CD30, CD38, CD71, CD123, CD133, DAM-6, GPRC5D, PCMA, EGFR, cMET, HER2, HER3, TROP2, ROR1, ROR2, MSLN, B7H3, B7H4, PD-L1, MAGE, MUC1, MUC16, NY-ESO-1, PSM, TRP-2, Wt-1, PSA 및 SART-1을 포함한다.
용어 "클라우딘 6" 또는 "CLDN6"(본원에서 상호교환적으로 사용됨)은 바람직하게는 인간 CLDN6에 관련되며, 특히 서열 목록의 서열번호 75에 따른 아미노산 서열 또는 전술한 아미노산 서열의 변이체를 포함하는 단백질에 관련된다. 용어 "CLDN6"은 번역 후 변형된 변이체 및 형태 변이체와 같은 임의의 CLDN6 변이체를 포함한다. 인간, 시노몰구스, 및 쥣과 CLDN6에 대한 아미노산 서열은 NCBI 참조 서열: NP_067018.2(인간)(서열번호 75), XP_005591080.1(시노몰구스 원숭이(서열번호 76), 및 NP_061247.1(마우스)(서열번호 77)으로 제공된다. CLDN6의 이종상동체는 시노몰구스 원숭이 및 마우스에서 인간 단백질에 대해 각각 > 99% 및 약 88%의 동일성을 공유한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "클라우딘 18 이소형 2"(CLDN18.2와 상호 교환적으로 사용됨)는 NCBI 등록 NP_001002026.1에 제공된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 펩티드를 지칭하며, 클라우딘-18 이소형 2는 정상 또는 형질전환된 암 세포의 표면 상에 존재하거나, CLDN18.2 유전자로 형질감염된 세포 상에서 발현되는 번역 후 변형된 변이체 및 종 상동체를 포함한다. 클라우딘 18.2는 바람직하게는 서열번호 72에 따른 아미노산 서열을 갖는다.
용어 "넥틴-4"(N4), 또는 "넥틴-4 단백질"은 인간 넥틴-4, 특히 천연-서열 폴리펩티드, 이소형, 키메라 폴리펩티드, 모든 상동체, 단편, 및 넥틴-4의 전구체를 포함한다. 인간, 시노몰구스, 랫트 및 쥣과 넥틴-4에 대한 아미노산 서열은 NCBI 참조 서열: NP_112178.2(인간)(서열번호 78), XP_005541277.1(시노몰구스 원숭이)(서열번호 79), NP_001102546.1(랫트)(서열번호 80), 및 NP_082169.2(마우스)(서열번호 81)에 제공된다. 넥틴-4의 이종상동체는 시노몰구스 원숭이, 랫트 및 마우스에서 인간 단백질과 각각 >99%, 약 94% 및 약 92%의 상동성을 공유한다.
용어 "백분율 동일성"은, 최상의 정렬 후에 수득되는, 비교되는 2개의 서열 사이에서의 동일한 아미노산 잔기의 백분율을 나타내는 것으로 의도되며, 해당 백분율은 순수하게 통계적이며, 2개의 서열 간의 차이는 무작위로 그리고 이들의 전체 길이에 걸쳐 분포된다. 2개의 아미노산 서열 간의 서열 비교는, 통상적으로 이들 서열을 최적으로 정렬한 후 이들 서열을 비교함으로써 수행되며, 해당 비교는 서열 유사성의 국소 영역을 식별하고 비교하기 위해 분절에 의해 또는 "비교 윈도우"에 의해 수행된다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 수작업 이외에, Smith 및 Waterman의 문헌[1981, Ads App. Math. 2, 482]의 국소 상동성 알고리즘의 의해, Neddiernan 및 Wunsch의 문헌[1970, J. Mol. Biol. 48, 443]의 국소 상동성 알고리즘의 의해, Pearson 및 Lipman의 문헌[1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444]의 유사성 검색 방법에 의해, 또는 이러한 알고리즘을 사용하는 컴퓨터 프로그램(GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N 및 TFASTA(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.))에 의해 수행될 수 있다.
본원에서의 용어 "항체"는 최대한 광범위한 의미로 사용되며, 단클론 항체, 다클론 항체, 및 다중특이체 항체(예를 들어, 이중특이체 항체)를 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 항체 구조를 포함한다.
본원에서의 용어 "항체 스캐폴드 모듈"은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 갖는 Y-형상 항체를 지칭한다. 2개의 중쇄는 이황화 결합에 의해 서로 연결되고, 각각의 중쇄는 이황화 결합에 의해 경쇄에 연결된다. 항체 스캐폴드는 이의 중쇄 및/또는 경쇄 중 하나 이상에 부착된 하나 이상의 결합 모듈을 가질 수 있다. 항체 결합 스캐폴드는 2개의 Fab 및 2개의 불변 영역 서열을 갖는 Fc 부분을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "교차 반응"은 상이한 종으로부터 CD137 또는 TAA에 각각 결합하는, 본원에 기술된 항-인간 CD137 또는 TAA 항체의 능력을 지칭한다. 예를 들어, 본원에 기술된 항체는 또한 다른 종(예를 들어, 랫트 또는 마우스 CD137 또는 TAA)으로부터의 CD137 또는 TAA에 결합할 수 있다.
IgG와 같은 예시적인 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역(CDR)으로 지칭되는 초가변성 영역, 프레임워크 영역(FR)으로 지칭되는 보다 보존된 영역으로 산재된 영역으로 추가로 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노 종결부로부터 카르복시 종결부까지 다음의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
초가변 영역은 대체적으로 경쇄 가변 영역의 대략 아미노산 잔기 24-34(LCDR1; "L"은 경쇄를 지칭함), 50-56(LCDR2) 및 89-97(LCDR3) 및 중쇄 가변 영역의 대략 31-35B(HCDR1; "H"는 중쇄를 지칭함), 50-65(HCDR2), 및 95-102(HCDR3)로부터의 아미노산 잔기(Kabat 등의 문헌[SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 제5판, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]) 및/또는 초가변 루프를 형성하는 잔기로부터의 아미노산 잔기(예를 들어, 경쇄 가변 영역의 잔기 26-32(LCDR1), 50-52(LCDR2), 및 91-96(LCDR3) 및 중쇄 가변 영역의 잔기 26-32(HCDR1), 53-55(HCDR2), 및 96-101(HCDR3)(Chothia 및 Lesk의 문헌[(1987) J. Mol. Biol. 196:901-917])를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "단클론 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 여기에서, 예를 들어, 집단을 포함하는 개별 항체는, 예를 들어 자연 발생 돌연변이를 함유하거나 단클론 항체 제제의 생산 중에 발생하는 가능한 변이체 항체, 예컨대 일반적으로 소량으로 존재하는 변이체를 제외하고는, 동일하고/하거나, 동일한 에피토프에 결합한다. 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 유도된 상이한 항체를 통상적으로 포함하는 다클론 항체 제제와 대조적으로, 단클론 항체 제제의 각각의 단클론 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 유도된다. 따라서, 조절제 "단클론"은 해당 항체의 특성이 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된다는 것을 나타내며, 임의의 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 한다는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 본 개시에 따라 사용되는 단클론 항체는, 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지 디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유하는 유전자이식 동물을 이용하는 방법, 이러한 방법들 및 본원에서 기술되는 단클론 항체를 제조하기 위한 및 다른 예시적인 방법을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일 부분이 특정 종으로부터 유래된 항체, 또는 특정 항체 부류 또는 하위 부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 이에 상동성인 한편, 사슬(들)의 나머지는 상이한 종으로부터 유래된 항체, 또는 상이한 항체 부류 또는 하위 부류에 속하는 항체뿐만 아니라 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 이러한 항체의 단편의 상응하는 서열과 동일하거나 이에 상동성인 재조합 항체를 지칭한다. 또한, 친화도 또는 특이성을 포함하는 항체 분자의 특정 특성을 변경하기 위해 상보성 결정 영역(CDR) 이식이 수행될 수 있다. 일반적으로, 생성된 키메라 항체가 인간 대상체에서 효과기 기능을 유도할 수 있고, 유래된 부모(예를 들어, 마우스) 항체 대비 부정적인 면역 반응을 유도할 가능성이 적도록, 가변 도메인은 설치류와 같은 실험 동물의 항체("부모 항체")로부터 수득되고, 불변 도메인 서열은 인간 항체로부터 수득된다.
용어 "인간화 항체"는 중쇄 및/또는 경쇄의 비-인간(예를 들어, 마우스, 랫트, 또는 햄스터) 상보성 결정 영역(CDR)과 함께 가변 영역에서 하나 이상의 인간 프레임워크 영역을 포함하도록 조작된 항체를 지칭한다. 특정 구현예에서, 인간화 항체는 CDR 영역을 제외하고는 전체적으로 인간 서열을 포함한다. 인간화 항체는 비-인간화 항체에 비해 인간에게 일반적으로 덜 면역원성이며, 따라서 특정 상황에서 치료적 이점을 제공한다. 당업자는 인간화 항체를 인지하고 있을 것이며, 또한 이들의 생성을 위한 적절한 기술을 인지하고 있을 것이다. 예를 들어, Hwang, W. Y. K. 등의 문헌[Methods 36:35, 2005]; Queen 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10033, 1989]; Jones 등의 문헌[Nature, 321:522-25, 1986]; Riechmann 등의 문헌[Nature, 332:323-27, 1988]; Verhoeyen 등의 문헌[Science, 239:1534-36, 1988]; Orlandi 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:3833-37, 1989]; 미국 특허 제5,225,539호; 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,761호; 제5,693,762호; 제6,180,370호; 및 Selick 등의 WO 90/07861를 참조하며, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참조로서 통합된다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖고/갖거나 당업자에게 공지된 인간 항체를 제조하기 위한 기술 중 어느 하나를 사용하여 제조된 항체이다. 인간 항체의 이러한 정의는 비-인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 특이적으로 배제한다. 인간 항체는 Cole 등의 문헌[Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)]; Boerner 등의 문헌[J. Immunol, 147(I):86-95 (1991)]에 기술된 방법을 포함하는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 또한, van Dijk 및 van de Winkel의 문헌[Curr. Opin. Pharmacol, 5: 368-74 (2001)]을 참조한다. 인간 항체는 항원 공격에 반응하여 해당 항체를 생성하도록 변형되었지만 이의 내인성 유전자좌는 비활성화된 형질전환 동물, 예를 들어 면역화된 HuMab 마우스(HuMab 마우스와 관련하여, 예를 들어, Nils Lonberg 등의 문헌[1994, Nature 368:856-859], WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 및 WO 01/09187 참조), Xenomice(XENOMOUSETM 기술에 관련하여, 예를 들어, 미국 특허 제6,075,181호 및 제6,150,584호 참조)또는 Trianni 마우스(예를 들어, WO 2013/063391, WO 2017/035252 및 WO 2017/136734 참조)에 항원을 투여함으로써 제조될 수 있다.
항체의 "부류(class)"는 이의 중쇄가 보유한 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체에는 5가지의 주요 부류가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 그리고 이들 중 일부는 하위 부류(이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 추가로 나뉠 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 지칭된다.
항체 또는 유사한 용어에서의 항체의 용어 "항원 결합 도메인"(또는 단순히 "결합 도메인")은 항원 복합체에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 용어, 항체의 "항원 결합 부분" 내에 포함되는 결합 단편의 예는 다름을 포함한다: (i) VL, VH, CL 및 CH 도메인으로 이루어진 1가 단편인, Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인, F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(Ward 등의 문헌[(1989) Nature 341: 544-546]); (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR); 및 (vii) 합성 링커에 의해 선택적으로 연결될 수 있는 2개 이상의 단리된 CDR의 조합.
항체의 "가변 도메인"(V 도메인)은 결합을 매개하고 특정 항체의 항원 특이성을 부여한다. 그러나, 가변성은 가변 도메인의 110개-아미노산 범위에 걸쳐 균일하게 분포되지 않는다. 대신, V 영역은 본원에서 "초가변 영역"으로 지칭되는 극단적인 가변성의 더 짧은 영역에 의해 분리된 15-30개 아미노산의 프레임워크 영역(FR)으로 불리는 비교적 불변인 신축부 또는 각각 9-12개 아미노산 길이의 CDR로 이루어진다. 당업자가 이해하는 바와 같이, CDR의 정확한 넘버링 및 배치는 상이한 넘버링 시스템 사이에서 서로 상이할 수 있다. 그러나, 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 서열에 대한 내용은 연관된 CDR의 내용을 포함한다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 각각의 가변 중쇄 영역의 내용은 vhCDR(예를 들어, vhCDR1, vhCDR2 및 vhCDR3)의 개시이고, 각각의 가변 경쇄 영역의 개시는 vlCDR(예를 들어, vlCDR1, vlCDR2 및 vlCDR3)의 내용이다.
본원에서 사용되는 용어 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 특이적 항원 인식의 매개를 주로 담당하는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 둘 모두의 가변 영역 내의 짧은 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 각각의 VL 및 각각의 VH 내에는 3개의 CDR(CDR1, CDR2, 및 CDR3으로 지칭됨)이 있다. 본원에서 달리 언급되지 않는 한, CDR 및 프레임워크 영역은 Kabat 넘버링 체계(Kabat E. A. 등의 문헌[1991, Sequences of Proteins of Immunological interest, In: NIH Publication No. 91-3242, US Department of Health and Human Services, Bethesda, Md])에 따라 주석이 달린다.
다른 구현예에서, 항체의 CDR은, 그 전체 내용이 본원에 참조로서 통합되는 MacCallum RM 등의 문헌[(1996) J Mol Biol 262: 732-745]에 따라 결정될 수 있다. 다른 구현예에서, 항체의 CDR은, Kabat CDR과 Chothia 구조적 루프 사이의 절충을 나타내고, 그 전체가 본원에 참조로서 통합되는 Oxford Molecular의 AbM 항체 모델링 소프트웨어(Oxford Molecular Group, Inc.)에서 사용되는, AbM 초가변 영역을 의미하는 AbM 넘버링 체계에 따라 결정될 수 있다. CDR은 또한, Kabat 등의 문헌[1991, In: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.]의 서열 비교에 의해 정의될 수 있는 한편, HVL은 Chothia 및 Lesk의 문헌[1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917]에 기술된 바와 같은 가변 도메인의 3-차원 구조에 따라 구조적으로 정의된다. 이들 2개의 방법이 CDR에 다소 상이한 식별을 나타내는 경우, 구조적 정의가 바람직하다. Kabat에 의해 정의된 바와 같이, 경쇄 가변 도메인에서, CDR-L1은 대략 잔기 24-34, CDR-L2는 대략 잔기 50-56, 그리고 CDR-L3는 대략 잔기 89-97에 위치되고; 중쇄 가변 도메인에, CDR-H1은 대략 잔기 31-35, CDR-H2는 대략 잔기 50-65, 그리고 CDR-H3은 대략 잔기 95-102에 위치된다. IMGT 및 NORTH는 CDR의 대안적인 정의를 제공한다(Lefranc MP.의 문헌[Unique database numbering system for immunogenetic analysis. Immunol Today (1997) 18:509]; 및 North B, Lehmann A, Dunbrack RLJ.의 문헌[A new clustering of antibody CDR loop conformations. J Mol Biol. (2011) 406:228-56]). 또한, CDR은 Chemical Computing Group(CCG) 넘버링에 따라 정의될 수 있다(Almagro 등의 문헌[Proteins 2011; 79:3050-3066] 및 Maier 등의 문헌[Proteins 2014; 82:1599-1610]). 따라서, 중쇄 및 경쇄의 CDR1, CDR2, CDR3은 주어진 항체에 특이적인, 고유한 기능적 특성을 정의한다.
"프레임워크" 또는 "프레임워크 영역" 또는 "FR"은 초가변 영역(HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 대체적으로 다음과 같은 4개의 FR 도메인으로 이루어진다: FR1, FR2, FR3, 및 FR4.
"인간 컨센서스 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에서 가장 흔히 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위그룹으로부터 유래한다. 일반적으로, 이러한 서열의 하위그룹은 Kabat 등의 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md. (1991), Vols. 1-3]에 기술된 바와 같은 하위그룹이다. 일 구현예에서, VL의 경우, 하위그룹은 Kabat 등(전술함)에 기술된 바와 같은 하위그룹 카파 I이다. 일 구현예에서, VH의 경우, 하위그룹은 Kabat 등(전술함)에 기술된 바와 같은 하위그룹 III이다.
"힌지 영역"은 대체적으로 인간 IgG1의 216-238(EU 넘버링) 또는 226-251(Kabat 넘버링)로부터의 신장으로서 정의된다. 힌지는 3개의 별개의 영역, 즉 상부, 중간부(예를 들어, 코어), 및 하부 힌지로 추가로 분할될 수 있다.
본원에서의 용어 "Fc 영역"은 해당 불변 영역의 적어도 일 부분을 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 해당 용어는 고유 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226으로부터, 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카르복실 말단까지 연장된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 리신(Lys447)은 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있다. 본원에서 달리 명시되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역의 아미노산 잔기의 넘버링은 Kabat 등의 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]에 기술된 바와 같은, EU 넘버링 시스템(EU 인덱스로도 지칭됨)에 따른다.
용어 "항체 단편"은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일 부분을 포함하는, 해당 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab)2; 디아바디; 선형 항체; 단쇄 항체 분자(예를 들어, scFv)를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 항체의 파파인 분해는 "Fab" 단편으로 지칭되는 2개의 동일한 항원 결합 단편, 및 용이하게 결정화할 수 있는 능력을 반영하는 명칭인 잔류 "Fc" 단편을 생성한다. Fab 단편은 중쇄(H) 사슬(VH)의 가변 영역 도메인 및 하나의 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)과 함께 전체 경쇄(L)로 이루어진다. 항체의 펩신 처리는 단일의 큰 F(ab)2 단편을 제공하며, 이는 2가 항원 결합 활성을 가지며 여전히 항원을 가교 결합할 수 있는 2개의 이황화-결합된 Fab 단편에 대략적으로 상응한다. Fab 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 CH1 도메인의 카르복시 말단에서 추가의 적은 잔기를 가짐으로써 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올기를 갖는 Fab'에 대한 본원에서의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 원래 이들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생산되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링 또한 공지되어 있다.
"Fv"는 단단히 비공유 결합된 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 영역 도메인의 이량체로 이루어진다. 이들 2개의 도메인의 접힘으로부터, 항원 결합을 위한 아미노산 잔기에 기여하고 항체에 대한 항원 결합 특이성을 부여하는 6개의 초가변 루프(H 및 L 사슬로부터 각각 3개의 루프)가 생성된다.
"단쇄 가변 단편" 또는 "scFv"는 면역글로불린의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역의 융합 단백질을 지칭한다. sFv의 검토에 대해, Plueckthun의 문헌[The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg 및 Moore 편집, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다. 일부 양태에서, 영역은 10개 내지 약 25개의 아미노산으로 이루어진 짧은 링커 펩티드와 연결된다. 링커는 가요성을 위한 글리신뿐만 아니라 용해도를 위한 세린 또는 트레오닌이 풍부할 수 있고, VH의 N-말단을 VL의 C-말단과 연결하거나, 그 반대일 수 있다. 이러한 단백질은 불변 영역의 제거 및 링커의 도입에도 불구하고 원래의 면역글로불린의 특이성을 유지한다. 이황화 안정화된 scFv는 쌍을 이룬 시스테인 돌연변이 특이적 VH 또는 VL 잔기를 도입함으로써 조작될 수 있다. 이들 잔기는 VH 및 VL의 인터페이스에 있다. 참조 문헌인 Weatherill, E. E. 등의 문헌 [Towards a universal disulphide stabilized single chain Fv format: importance of interchain disulphide bond location and VL-VH orientation. Protein Eng Des Sel 25, 321-329]을 참조하며, 여기에서 NovaRock은 VH44-VL100을 사용하였다.
용어 "다중특이체 항체"는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 특히 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항체를 특이적으로 포함하며, 여기에서 VH-VL 유닛은 폴리에피토프 특이성을 갖는다(예를 들어, 하나의 생물학적 분자 상의 2개의 상이한 에피토프 또는 상이한 생물학적 분자 상의 각각의 에피토프에 결합할 수 있음). 이러한 다중특이체 항체는 전장 항체, 2개 이상의 VL 및 VH 도메인을 갖는 항체, 이중특이체 디아바디 및 트리아바디를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. "폴리에피토프 특이성"은 동일하거나 상이한 표적(들) 상의 2개 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 지칭한다.
"이중 특이성" 또는 "이중특이성"은 동일하거나 상이한 표적(들) 상의 2개의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 지칭한다. 그러나, 이중특이체 항체와 대조적으로, 이중 특이성 항체는 아미노산 서열이 동일한 2개의 항원 결합 아암을 가지며, 각각의 Fab 아암은 2개의 항원을 인식할 수 있다. 이중 특이성은 항체가 단일 Fab 또는 IgG 분자로서 2개의 상이한 항원과 높은 친화도로 상호작용할 수 있게 한다. 일 구현예에 따르면, IgG1 형태의 다중특이체 항체는 5 μM 내지 0.001 pM, 3 μM 내지 0.001 pM, 1 μM 내지 0.001 pM, 0.5 μM 내지 0.001 pM 또는 0.1 μM 내지 0.001 pM의 친화도로 각각의 에피토프에 결합한다. "단일특이체"은 하나의 에피토프에만 결합하는 능력을 지칭한다. 다중특이체 항체는 전체 면역글로불린 분자와 유사한 구조를 가질 수 있으며 Fc 영역, 예를 들어 IgG Fc 영역을 포함할 수 있다. 이러한 구조는 IgG-Fv, IgG-(scFv)2, DVD-Ig, (scFv)2-(scFv)2-Fc 및 (scFv)2-Fc-(scFv)2를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. IgG-(scFv)2의 경우, scFv는 중쇄 또는 경쇄 중 어느 하나의 N-말단 또는 C-말단 단부에 부착될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "이중특이체 항체"(BsAb)는 종종 적어도 2개의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 인간 또는 인간화 항체를 지칭한다. 본 개시에서, 결합 특이성 중 하나는 CD137에 대해 유도될 수 있고, 다른 하나는 CLDN6, CLDN18.2, 또는 넥틴-4에 대해 유도될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "디아바디"는 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 2가 항체를 지칭하며, 여기에서 각각의 폴리펩티드 사슬은 동일한 펩티드 사슬 상의 VH 및 VL 도메인의 분자내 결합을 가능하게 하기에는 너무 짧은 링커(예를 들어, 5개의 아미노산으로 이루어진 링커)에 의해 연결된 VH 및 VL 도메인을 포함한다. 이러한 구성은 각각의 도메인이 다른 폴리펩티드 사슬 상의 상보성 도메인과 페어링되어 동종이량체 구조를 형성하게 한다. 따라서, 용어 "트리아바디"는 3개의 펩티드 사슬을 포함하는 3가 항체를 지칭하며, 이들 각각은 동일한 펩티드 사슬 내에서 VH 및 VL 도메인의 분자내 결합을 허용하기 위해 매우 짧은 링커(예를 들어, 1-2개의 아미노산으로 이루어진 링커)에 의해 연결된 하나의 VH 도메인 및 하나의 VL 도메인을 함유한다.
용어 "단리된 항체"는, 본원에 개시된 다양한 항체를 설명하는 데 사용될 경우, 해당 항체가 발현된 세포 또는 세포 배양물로부터 식별되고 분리되고/되거나 회수된 항체를 의미한다. 단리된 항체 또는 항체 단편은 항체 또는 항체 단편의 생산, 정제 및/또는 보관 중에 발생하는 하나 이상의 번역 후 변형을 갖는 항체 또는 항체 단편의 변이체를 포함할 수 있다. 자연 환경의 오염 성분은 대체적으로 폴리펩티드에 대한 진단적 또는 치료적 용도를 방해하는 물질이다. 이들은 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 항체는, 예를 들어 전기영동(예를 들어, SDS-PAGE, 등전점 전기영동(IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC) 접근법에 의해 측정 시 95% 또는 99%를 초과하는 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가를 위한 방법의 검토는, 예를 들어, Flatman 등의 문헌[J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)]을 참조한다. 바람직한 구현예에서, 항체는 (1) 스피닝 컵 시퀀터를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 수득하기에 충분한 정도로, 또는 (2) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하는 비환원 또는 환원 조건 하에서 SDS-PAGE를 사용하여 균질성으로 정제될 것이다.
표적 분자에 대한 항체의 결합과 관련하여, 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 표적 상의 에피토프에 대한 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적인"은 비특이적 상호작용과 측정 가능하게 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은, 예를 들어 대조군 분자의 결합과 비교하여 분자의 결합을 결정함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합은 표적과 유사한 대조군 분자, 예컨대 표지되지 않은 표적의 과량과의 경쟁에 의해 결정될 수 있다. 이러한 경우, 프로브에 대한 표지된 표적의 결합이 표지되지 않은 과량의 표적에 의해 경쟁적으로 억제되는 경우, 특이적 결합으로 표시된다. 본원에서 사용되는 바와 같은 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 표적 상의 에피토프에 대한 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적인"은, 예를 들어, 10-4 M 이하, 대안적으로 10-5 M 이하, 대안적으로 10-6 M 이하, 대안적으로 10-7 M 이하, 대안적으로 10-8 M 이하, 대안적으로 10-9 M 이하, 대안적으로 10-10 M 이하, 대안적으로 10-11 M 이하, 대안적으로, 10-12 M 이하의 표적에 대한 Kd, 또는 10-4 M 내지 10-6 M 또는 10-6 M 내지 10-10 M 또는 10-7 M 내지 10-9 M 범위의 Kd를 갖는 분자에 의해 나타날 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 친화도와 KD 값은 반비례 관계이다. 항원에 대한 높은 친화도는 낮은 KD 값으로 측정된다. 일 구현예에서, 용어 "특이적 결합"은 분자가 임의의 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프에 실질적으로 결합하지 않고 CD137, CLDN6, CLDN18.2, 또는 넥틴-4(또는 CD137, CLDN6, CLDN18.2, 또는 넥틴-4 에피토프)에 결합하는 결합을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "CD137에 결합한다", "CLDN6에 결합한다", "CLDN18.2에 결합한다", "넥틴-4에 결합한다"는, 각각 CD137, CLDN6, CLDN18.2, 또는 넥틴-4를 과발현하도록 조작된 재조합 숙주 세포의 표면 또는 정상 또는 악성 세포의 표면 상에서 발생하는 바와 같이, 내인성 인간 CD137, CLDN6, CLDN18.2, 또는 넥틴-4를 각각 인식하고 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편의 능력을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "친화도"는 에피토프에 대한 항체의 결합 강도를 의미한다. 항체의 친화도는 [Ab] Х [Ag]/[Ab - Ag]로서 정의된 해리 상수 Kd로 주어지며, 여기에서 [Ab - Ag]는 항체 - 항원 복합체의 몰 농도이고, [Ab]는 미결합 항체의 몰 농도이며, [Ag]는 미결합 항원의 몰 농도이다. 친화도 상수 Ka는 1/Kd로 정의된다. mAb의 친화도를 결정하기 위한 방법은 Harlow 등의 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988], Coligan 등의 문헌(편집)[Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993)], 및 Muller의 문헌[Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983)]에서 찾을 수 있으며, 이들 문헌은 그 전체 내용이 본원에 참조로서 포함된다. mAb의 친화도를 결정하기 위한 당업계에 공지된 하나의 표준 방법은 표면 플라스몬 공명(SPR) 스크리닝(예컨대, BIAcoreTM SPR 분석 장치를 사용하는 분석에 의함)을 사용하는 것이다.
"에피토프"는 항체와 이의 항원(들) 사이의 상호작용의 부위 또는 부위들을 나타내는 당업계의 용어이다. Janeway, C, Jr., P. Travers 등의 문헌[(2001). Immunobiology: the immune system in health and disease. Part II, Section 3- 8. New York, Garland Publishing, Inc.]에 기술된 바와 같이: "항체는 대체적으로 단백질과 같은 큰 분자 표면 상의 작은 영역만은 인식한다. ?? [특정 에피토프]는 단백질 폴딩에 의해 합쳐진 [항원] 폴리펩티드 사슬의 상이한 부분으로부터의 아미노산으로 구성될 가능성이 있다. 이러한 종류의 항원 결정인자는, 인식된 구조가 항원의 아미노산 서열에서 불연속적이지만 3차원 구조에서 함께 모이는 단백질의 분절로 구성되기 때문에, 형태적 또는 불연속적 에피토프로 알려져 있다. 대조적으로, 폴리펩티드 사슬의 단일 분절로 이루어진 에피토프는 연속 또는 선형 에피토프"로 지칭된다"("An antibody generally recognizes only a small region on the surface of a large molecule such as a protein... [Certain epitopes] are likely to be composed of amino acids from different parts of the [antigen] polypeptide chain that have been brought together by protein folding. Antigenic determinants of this kind are known as conformational or discontinuous epitopes because the structure recognized is composed of segments of the protein that are discontinuous in the amino acid sequence of the antigen but are brought together in the three-dimensional structure. In contrast, an epitope composed of a single segment of the polypeptide chain is termed a continuous or linear epitope")(Janeway, C. Jr., P. Travers 등의 문헌[(2001). Immunobiology: the immune system in health and disease. Part II, Section 3-8. New York, Garland Publishing, Inc.]).
본원에서 사용되는 용어 "KD"는 평형 해리 상수를 지칭하며, 이는 ka에 대한 kd의 비(예를 들어, kd/ka)로부터 수득되고 몰 농도(M)로서 표현된다. 항체에 대한 KD 값은 당업계에 잘 확립된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 항체의 KD를 결정하기 위한 바람직한 방법은, 바람직하게는 Fortebio Octet RED 장치를 사용하는 바이오층 간섭계(BLI) 분석, 바람직하게는 BIACORE® 표면 플라스몬 공명 시스템과 같은 바이오센서 시스템을 사용하는 표면 플라스몬 공명, 또는 유세포 계측법 및 Scatchard 분석을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "KD"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 지칭하는 것으로 의도된다. 이는 다음의 식으로 계산된다: Koff/Kon = KD. 결합 동역학은 항체가 이의 표적에 얼마나 신속히 결합하는지(Kon), 그리고 얼마나 신속히 해리되는지(Koff)를 기술한다. 항체의 표적, 예를 들어, CD137에 대한 항체 체류 시간은 이러한 동역학 특징에 의해 결정된다(Schuetz, DA 등의 문헌[(2017) Kinetics for Drug Discovery: an industry-driven effort to target drug residence time. Drug Discov Today 22: 896-911]).
본원에서 사용되는 용어 "IC50"은 결합하는 항원의 생물활성의 50%를 중화시키는 데 필요한 본원에 개시된 이중특이체 결합 단백질의 유효 농도를 지칭하는 것으로 의도된다.
제제 및 특정 활성(예를 들어, 세포에 대한 결합, 효소 활성의 억제, 면역 세포의 활성화 또는 억제)에 관한 "EC50"은 이러한 활성에 대한 최대 반응 또는 효과의 50%를 생성하는 해당 제제의 효율적인 농도를 지칭한다. 제제 및 특정 활성에 관한 "EC100"은 이러한 활성에 대한 실질적으로 최대 반응을 생성하는 제제의 효율적인 농도를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "항체-약물 접합체"(ADC)는 합성 링커를 통해 세포독성제에 공유 연결된 재조합 단클론 항체(페이로드로 알려짐)로 이루어진 면역접합체를 지칭한다. 면역접합체(항체-약물 접합체, ADC)는 매우 강력한 항체 기반 암 치료제의 부류이다. ADC는 합성 링커를 통해 세포독성제에 공유 결합된 재조합 단클론 항체(페이로드로 알려짐)로 구성된다. ADC는 단클론 항체의 특이성과 소분자 화학요법 약물의 효능을 조합하고, 종양 세포에 대한 고도의 세포독성 소분자 약물 모이어티의 직접적인 표적화된 전달을 촉진시킨다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "세포내이입(endocytosis)"는 진핵 세포가 형질막의 분절, 세포 표면 수용체, 및 세포외 유체로부터의 성분을 내재화하는 과정을 지칭한다. 세포내이입 메커니즘은 수용체 매개 세포내이입을 포함한다. 용어 "수용체 매개 세포내이입"은, 리간드가 이의 표적에 결합할 때 막 침윤 및 핀칭을 유발하고, 내재화되어, 세포액 내로 전달되거나 적절한 세포내 구획으로 이송되는 생물학적 메커니즘을 지칭한다.
용어 "방관자(bystander) 효과"는 항체 약물 접합체에 의해 표적화된 종양 세포에 인접한 건강한 세포의 표적 세포 매개 사멸을 지칭한다. 방관자 효과는 일반적으로 소수성 세포독성 약물의 세포 유출에 의해 야기되며, 이는 항원 양성 표적 세포로부터 인접한 항원 음성 건강 세포 내로 확산될 수 있다. 방관자 효과의 존재 또는 부재는 면역접합체를 생산하는 데 사용되는 링커 및 접합 화학물질의 양태에 기인할 수 있다.
항체 Fc 영역과 특정 Fc 수용체의 상호작용으로부터 유래되는 용어 "효과기 기능"은, Clq 결합, 보체 의존성 세포독성(CDC), Fc 수용체 결합, ADCC와 같은 FcyR-매개 효과기 기능, 항체 의존성 세포 매개 식균작용(ADCP), T 세포 의존성 세포 세포독성(TCDD), 및 세포 표면 수용체의 하향조절을 포함하나, 반드시 이에 한정되지는 않는다. 이러한 효과기 기능은 일반적으로 Fc 영역이 항원 결합 도메인(예를 들어, 항체 가변 도메인)과 조합되는 것을 필요로 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체 기반 면역요법" 및 "면역요법"은, CD137 및 CLDN6, CD137 및 CLDN18.2, 또는 CD137 및 넥틴-4에 결합하는 결합 단백질의 표적화 특이성에 의존하여 CD137, CLDN6, CLDN18.2, 및/또는 넥틴-4 발현 세포에 대한 직접 또는 간접 효과를 매개하는 임의의 형태의 요법을 광범위하게 지칭하는 데 사용된다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 면역글로불린의 Fc 영역에 결합하는 항체 수용체를 기술하며, 이는 B 림프구, 자연 살해 세포, 대식세포, 호중구, 및 비만 세포를 포함하는 특정 면역 세포의 막에 위치한 항원 인식에 관여한다. IgG의 Fc 부분을 인식하는 Fc 수용체는 Fc 감마 수용체(FcγR)로 지칭된다. FcγR 계열은 대립유전자 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태의 이들 수용체를 포함한다. IgG 결합에 대한 구조, 기능 및 친화도의 차이에 기초하여, FcγR은 3개의 주요 군으로 분류된다: FcγRI, FcγRII(FcγRIIa 및 FcγRIIb) 및 FcγRIII(FcγRIIIa 및 FcγRIIIb). 이들 중, FcγRI(CD64), FcγRIIa(CD32a), 및 FcγRIIIa(CD16a)는, FcγRI 및 FcγRIIIa의 γ 서브유닛 내, 또는 FcγRIIa의 세포질 테일 내에 신호 변환 모티프, 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM)를 함유하는 활성화 수용체이다. 항원-항체 복합체의 결합 후, 활성화 Fcγ 수용체(인간: FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIC, FcγRIIIA, FcγRIIIB 및 쥣과: FcγRI, FcγRIII, FcγRIV)는 면역 효과기 기능을 유발한다. 대조적으로, FcγRIIb(CD32b)는 억제 수용체이다. FcγRIIb의 가교결합은 면역수용체 티로신 기반 억제 모티프(ITIM)의 인산화 및 억제 신호전달 변환을 유도한다(Patel 등의 문헌[Front Immunol. 2019; 10: 223]).
용어 "Fc 침묵"은 FcgR 및 보체와의 결합 활성을 최소화/제거하도록 조작된 Fc 영역을 지칭하여, 이는 Fc 매개 효과기 기능을 침묵시키거나 제거한다. Fc를 조작하기 위한 전략은 Fc 당질화의 변형, IgG 하위부류의 혼성체 사용, 또는 힌지 및/또는 CH2 영역에의 하나 이상의 돌연변이 도입을 포함한다. 잔기는 효과기 기능에 중요하며, Fc를 침묵시키는 각각의 돌연변이는 예를 들어, Strohl, WR 및 Strohl LM의 문헌["Antibody Fc engineering for optimal antibody performance" In Therapeutic Antibody Engineering, Cambridge: Woodhead Publishing (2012), pp 242], 국제 특허 공개 번호 WO 2017/008169A1 및 WO 2021/055669와 같이 당업계에 공지되어 있다.
인간 IgG1 Fc를 침묵시키도록 조작될 수 있는 부위에 대한 특이적이고 비제한적인 예는, 모두 EU 넘버링으로, L234, L235, G237, D265, N297, P329, P331을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "이중특이체"는 항체 스캐폴드 모듈 및 제1 결합 모듈을 포함하는 결합 단백질을 지칭하며, 여기에서 모듈은 2개의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 및/또는 수용체 단백질로부터 유래된다. 일 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은 종양 연관 항원(TAA)에 대한 결합 특이성을 가지며, 제1 결합 모듈은 CD137(예를 들어, 인간 CD137)에 대한 결합 특이성을 갖는다.
표적 분자에 대한 이중특이체 결합 단백질의 결합과 관련하여, 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 표적 상의 에피토프에 대한 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적인"은 비특이적 상호작용과 측정 가능하게 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은, 예를 들어 대조군 분자의 결합과 비교하여 분자의 결합을 결정함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합은 표적과 유사한 대조군 분자, 예를 들어 과량의 비표지 표적과의 경쟁에 의해 결정될 수 있다. 이러한 경우, 프로브에 대한 표지된 표적의 결합이 표지되지 않은 과량의 표적에 의해 경쟁적으로 억제되는 경우, 특이적 결합으로 표시된다. 본원에서 사용되는 바와 같은 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 표적 상의 에피토프에 대한 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적인"은, 예를 들어, 10-4 M 이하, 대안적으로 10-5 M 이하, 대안적으로 10-6 M 이하, 대안적으로 10-7 M 이하, 대안적으로 10-8 M 이하, 대안적으로 10-9 M 이하, 대안적으로 10-10 M 이하, 대안적으로 10-11 M 이하, 대안적으로, 10-12 M 이하의 표적에 대한 Kd, 또는 10-4 M 내지 10-6 M 또는 10-6 M 내지 10-10 M 또는 10-7 M 내지 10-9 M 범위의 Kd를 갖는 분자에 의해 나타날 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 친화도와 KD 값은 반비례 관계이다. 항원에 대한 높은 친화도는 낮은 KD 값으로 측정된다. 일 구현예에서, 용어 "특이적 결합"은, 분자가 임의의 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프에 실질적으로 결합하지 않고, 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 상의 에피토프에 결합하는 결합을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "친화도"는 에피토프에 대한 이중특이체 결합 단백질의 결합 강도를 의미한다. 이중특이체 결합 단백질의 친화도는 [이중특이체 결합 단백질] Х [Ag] / [이중특이체 결합 단백질 - Ag]로서 정의된 해리 상수 Kd에 의해 주어지며, 여기에서 [이중특이체 결합 단백질 - Ag]는 이중특이체 결합 단백질-항원 복합체의 몰 농도이고, [이중특이체 결합 단백질]은 미결합 이중특이체 결합 단백질의 몰 농도이고, [Ag]는 미결합 항원의 몰 농도이다. 친화도 상수 Ka는 1/Kd로 정의된다. 결합 단백질의 친화도를 결정하기 위한 방법은, 그 전체가 본원에 참조로서 통합되는, Harlow 등의 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988], Coligan 등의 문헌(편집)[Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993)], 및 Muller의 문헌[Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983)]을 참조한다. 이중특이체 결합 단백질의 친화도를 결정하기 위한 당업계에 공지된 하나의 표준 방법은 표면 플라스몬 공명(SPR) 스크리닝(예컨대, BIAcoreTM SPR 분석 장치를 사용하는 분석에 의함)을 사용하는 것이다.
용어 "링커"는 2개의 화학적 엔티티 사이에 공유 결합을 형성하는 적어도 하나의 원자를 지칭한다. 용어 "링커"는 스캐폴드 모듈과 결합 모듈에 대한 다른 공유 결합 사이에 공유 결합을 형성하는 적어도 하나의 원자를 지칭할 수 있다. 스캐폴드 모듈 및 결합 모듈이 펩티드 결합을 통해서만 연결되는 경우, 링커는 "펩티드 링커"로서 지칭된다. 그렇지 않은 경우, 링커는 "화학적 링커"로서 지칭된다. 또한, "가요성 펩티드 링커"는 대부분 작은, 비극성 또는 극성 아미노산을 포함하는 반면, "강성 펩티드 링커"는 알파-나선 형성 서열을 포함하고/하거나 프롤린 잔기가 풍부하다(Chen 등의 문헌[2013. Adv Drug Deliv Rev. 65(10):1357-1369]).
CD137(4-1BB)
CD137(4-1BB)은 활성화된 T 및 자연 살해(NK) 세포에서 발현되는 유도성 공자극 수용체이다. 4-1BB 단백질은 4개의 세포외 시스테인-풍부 의사 반복(CRD) 도메인, CRD1, CRD2, CRD3 및 CRD4를 갖는다(아래 표의 아미노산 서열 및 CRD 영역 참조). T 세포 상의 4-1BB 리간드(41BBL) 삼량체에 의한 4-1BB 삼량체 클러스터링은 신호전달 캐스케이드를 유발하여 항세포자멸사 분자의 상향 조절, 사이토카인 분비, 및 효과기 기능을 향상시킨다. NK 세포 상에서, 4-1BB 신호전달은 항체 의존성 세포 매개 세포독성을 증가시킬 수 있다.
TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원인 CD137은 처음에는 T 세포에 의해 활성화된 유도성 분자로서 식별되었다(Kwon 및 Weissman의 문헌[1989, Proc Natl Acad Sci USA 86, 1963-1967]). 후속 연구는 NK 세포, B 세포, NKT 세포, 단핵구, 호중구, 비만 세포, 수지상 세포(DC) 및 내피 및 평활근 세포와 같은 비-조혈 기원 세포를 포함하는 많은 다른 면역 세포 또한 4-1BB를 발현한다는 것을 입증하였다(Vinay 및 Kwon의 문헌[2011, Cell Mol Immunol 8, 281-284]). 상이한 세포 유형에서의 4-1BB의 발현은 대부분 유도 가능하고, T 세포 수용체(TCR) 또는 B 세포 수용체 유발과 같은 다양한 자극 신호뿐만 아니라 전염증성 사이토카인의 공자극 분자 또는 수용체를 통해 유도된 신호에 의해 유도된다(Diehl 등의 문헌[2002, J Immunol 168, 3755-3762]; Zhang 등의 문헌[2010, Clin Cancer Res 13, 2758-2767]).
4-1BB 리간드(4-1BBL 또는 CD137L)는 1993년에 식별되었다(Goodwin 등의 문헌[1993, Eur J Immunol 23, 2631-2641]). 4-1BBL의 발현은 B 세포, DC 및 대식세포와 같은 전문 항원 제시 세포(APC)로 제한되는 것으로 나타났다. 4-1BBL의 유도 가능한 발현은 αβ 및 γδ T 세포 서브세트 둘 모두룰 포함하는 T 세포 및 내피 세포의 특징이다(Shao 및 Schwarz의 문헌[2011, J Leukoc Biol 89, 21-29]).
(예를 들어, 4-1BB L 결찰에 의한) 4-1BB수용체를 통한 공자극은 T 세포(CD4+ 및 CD8+ 서브세트 둘 모두) 내에서 다수의 신호전달 캐스케이드를 활성화시켜, T 세포 활성화를 강력하게 증강시킨다(Bartkowiak 및 Curran의 문헌(2015)). TCR 유발과 조합하여, 작용성 4-1BB-특이적 항체는 T 세포의 증식을 향상시키고, 림포카인 분비를 자극하고, 활성화 유도 세포 사멸에 대한 T 림프구의 민감도를 감소시킨다(Snell 등의 문헌[2011, Immunol Rev 244, 197-217]). 이러한 메커니즘은 암 면역요법에서의 제1 개념 증명으로서 더욱 발전되었다. 전임상 모델에서, 종양 보유 마우스에서의 4-1BB에 대한 작용 항체의 투여는 강력한 항종양 효과를 유도하였다(Melero 등의 문헌[1997, Nat Med 3, 682-685]). 이후, 축적된 증거는 4-1BB가 대체적으로 다른 면역조절 화합물, 화학요법 시약, 종양 특이적 백신접종 또는 방사선요법과 병용 투여될 때에만 항종양제로서의 효능을 나타낸다는 것을 밝혔다(Bartkowiak 및 Curran 등의 문헌[2015, Front Oncol 5, 117]).
4-1BB를 표적화하는 작용성 단클론 항체는 암 면역요법에 대해 4-1BB 신호전달을 활용하기 위해 개발되었다. 다양한 유도 및 자발적 종양 모델에서의 전임상 결과는 작용제 항체로 4-1BB를 표적화하는 것이 종양 제거 및 지속적인 항종양 면역을 초래할 수 있음을 시사한다. 또한, 4-1BB 리간드의 하나의 세포외 도메인 및 단쇄 항체 단편으로 구성된 융합 단백질(Homig 등의 문헌[2012, J Immunother 35, 418-429]; Muller 등의 문헌[2008, J Immunother 31, 714-722]) 또는 중쇄의 C-말단에 융합된 단일 4-1BB 리간드로 구성된 융합 단백질(Zhang 등의 문헌[2007, Clin Cancer Res 13, 2758-2767])이 제조되었다. WO 2010/010051은 서로 연결되고 항체 부분에 융합된 3개의 TNF 리간드 세포외 도메인으로 이루어진 융합 단백질의 생성을 개시한다.
우렐루맙 및 우토밀루맙과 같은 면역 작용제 CD137 항체의 1세대는 임상에서 원하는 효능을 달성하지 못했다. T 세포 공자극 작용제가 암 치료제로서 작용하기 위해서는, 표적-결합 친화도, 결합 동역학, 결합 원자가, 클러스터링 형성, Fc 수용체 매개 활성 등과 같은 많은 인자를 고려할 필요가 있다. 목적에 적합한 종양 항원-CD137 구성 설계가 개시된 이중특이체 항체의 효능 및 안전성을 개선하는 데 사용되었다. 구체적으로, 종양 세포 결합을 위해 고도로 특이적인 종양 항원 결합 항체를 선택하고, 종양 항원 결합을 위한 이중가(bi-valency)를 사용하여 표적 결합을 최대화하였다. 2) T 세포의 준최적 활성화는 T 세포 고갈이 더 적고 항종양 효과가 오래 지속되는 것으로 간주되었다(Stone JD 등의 문헌[Immunology. 2009;126(2):165-176]). 신속-온(fast-on), 신속-오프(fast-off) 특징부를 갖는 CD137 항체는 T 세포에 대한 일정한 자극 신호를 회피하며, 이에 따라 저속-오프(slow-off) 항체보다 더 잘 작용할 것으로 예상되었다(Garble K의 문헌[Nature Reviews Drug Discovery 19, 3-5 (2020)]). 또한, 클러스터링 의존성을 갖는 CD137 작용은 순환 T 세포의 전신 활성화를 회피할 수 있고, 종양 부위에서 종양 세포 경험 T 세포만을 활성화시킬 수 있다. 이는 종양 항원-클러스터링-의존성 CD137 작용을 사용함으로써 달성되었다. 또한, 효과기 기능 및 Fc 매개 수용체 클러스터링을 제거하기 위해 Fc를 침묵시키는 것은 쿠퍼(Kuffer) 세포 활성화 유래 간 독성을 추가로 감소시킬 수 있다.
클라우딘 단백질 계열
클라우딘(CLDN) 계열은 27개의 구성원으로 구성되며, 세포 유형 및 조직 유형 선택 방식으로 구별되는 발현 패턴을 나타낸다. 클라우딘은 상피 및 내피의 밀착 접합부(TJ) 내에 위치된 일체형 막 단백질이다. CLDN은 동일한 세포(시스-상호작용) 및 인접한 세포(트랜스-상호작용) 둘 모두에서 서로 상호작용하여, 조직 특이적 장벽 기능을 갖는 TJ를 구성한다. 개별 세포 유형은 클라우딘 계열 구성원 중 하나 이상을 발현한다. 일반 생리학에서, 클라우딘은 다수의 단백질과 상호작용하고 밀착 접합부로의 신호전달 및 밀착 접합부로부터의 신호 변환에 밀접하게 관여한다(Lal-Nag, M 및 Morin, P.J.의 문헌[Genome Biol 10: 235, 2009).
CLDN 단백질은 4개의 막관통(TM) 나선(TM1, TM2, TM3, 및 TM4) 및 2개의 세포외 루프(ELI 및 EL2)를 포함한다. 인접한 세포로부터의 클라우딘의 세포외 루프는 서로 상호작용하여 세포 시트를 밀봉하고 내강 및 기저측 공간 사이의 세포주위 수송을 조절한다. 클라우딘 단백질 구조는 상이한 계열 구성원 중 고도로 보존된 것이며, CLDN6은 220개의 아미노산을 포함하고, 크기가 23 kDa이고, 전형적인 클라우딘 단백질 구조를 나타낸다.
1988년, 밀착 접합부의 주요 구조적 및 기능적 성분으로서 단백질의 제1 클라우딘 계열이 최초로 클로닝되었으며 이로서 명명되었다. 계열로서, 클라우딘은 상피 및 내피 세포의 장벽 기능 및 세포골격의 유지에 관여하는 테트라 막관통 단백질의 다중유전자 계열이다(Furuse 등의 문헌[J. Cell. Biol. 141(7): 1539-50, 1998]). 클라우딘은 상피 또는 내피 세포 시트에서 발견되는 것과 같은 극성화된 세포 유형에서 가장 정점에 있는 세포-세포 부착 접합부인 밀착 접합부의 주요 구조적 단백질을 포함하는 일체형 막 단백질이다.
클라우딘 단백질의 제1 세포외 도메인(ECD)은 일반적으로 약 50개의 아미노산으로 이루어지는 한편, 제2 아미노산은 약 22개의 아미노산을 갖는 더 작은 것이다(Hashimoto 등의 문헌[Drug Discovery Today 21(10): 1711-1718, 2016]). N-말단 단부는 일반적으로 매우 짧은(예를 들어, 약 4 내지 10개 아미노산) 한편, C-말단 단부는 21 내지 약 63개 아미노산 범위이고, 밀착 접합부에서의 단백질의 국소화에 필요하다.
밀착 접합 투과성이 종종 정상 조직보다 종양 조직에서 더 높다는 관찰 결과는 종양 세포 상의 클라우딘 단백질이 온전한 밀착 접합을 갖는 정상 조직에서보다 보다 더 접근 가능할 수 있다는 예측으로 이어졌다. 이러한 관찰 결과는 또한 클라우딘 단백질을 치료적 암 개입을 위한 매력적인 표적으로 만든다.
인간에서 클라우딘 계열 단백질은 22-34 kDa 크기 범위의 적어도 27개의 구성원으로 구성된다. 모든 클라우딘은 테트라스패닌 형상을 가지며, 여기에서 단백질 말단 둘 모두는 막의 세포내 면 상에 위치하여, 2개의 세포외(EC) 루프인 EC1 및 EC2를 형성한다. 통상적으로, EC1은 약 50-60개 아미노산 크기이고, EC2는 EC1보다 작으며, 대체적으로 약 25개의 아미노산을 포함한다. EC 루프는 헤드-투-헤드 동종친화성을 매개하며, 클라우딘의 특정 조합의 경우, 밀착 접합부의 형성을 유도하는 이종친화성 상호작용을 매개한다.
클라우딘-6
광범위하게 발현되는 대부분의 클라우딘 단백질과 달리, CLDN6은 선택적 발현을 특징으로 한다(Hewitt 등의 문헌[BMC Cancer, 6:186, 2006]). CLDN6은 여러 유형의 배아 상피 세포에서 발현되는 종양 태아 밀착 접합 분자이다.
밀착 접합부의 장애 및 밀착 접합부 분자의 조절 장애는 암 세포의 빈번한 특징이며, 종종 악성 형질전환과 연관된다. CLDN6 발현은 위, 폐 및 난소 선암종, 자궁내막 및 배아 암종, 뇌의 소아 종양(예를 들어, 비정형 기형/횡문근 종양) 및 생식 세포 종양을 포함하는 다양한 암 유형에서 비정상적으로 활성화된다(Hassimoto 등의 문헌[J Pharmacol Exp Ther 368:179-186, 2019]; Kojima 등의 문헌[Cancers 2020, 12, 2748]). 여러 인간 악성 종양에서의 CLDN6의 발현 증가는 난소암 및 위암과 같은 불량한 예후와 연관된다(Zavala-Zendejas VE 등의 문헌[Cancer Invest. 29:1-11. 2011]; Wang L, 등의 문헌[Diagn Pathol. 8:1902013]). 따라서, CLDN6은 CART 및 T 세포 결합 이중특이체 항체와 같은 종양-표적화 치료제를 위한 유망한 종양-연관 항원(TAA)이다.
종양-연관 항원으로서, 이는 표피 분화 및 장벽 형성에 중요한 표피 형성의 초기 단계 동안의 이의 발현으로 인해, 분화 항원으로서 분류될 수 있다. 암에서는 CLDN6의 뚜렷한 발현 패턴이 있지만 정상적인 성인 조직에서는 발현되지 않는다는 점과 항체에 대한 이의 세포 표면 접근성이 결합되어, CLDN6은 다양한 암 유형에서의 진단 및 면역치료 접근법을 위한 유망한 표적이 될 수 있다.
CLDN6과 다른 클라우딘 단백질 사이에는 높은 수준의 서열 보존이 존재한다. CLDN6과 다른 클라우딘 단백질(예를 들어, CLDN9, CLDN4 및 CLDN3)의 높은 상동성은 특이성, 친화도 및 안전성과 같은 치료적 용도에 적합한 특성을 갖는 CLDN6 항체를 제공하는 것을 어렵게 한다.
CLDN6은 대체적으로 인간에서 220-아미노산 전구체 단백질로서 발현되며, 이의 첫 21개 아미노산은 신호 펩티드를 구성한다. CLDN6 전구체 단백질의 아미노산 서열은 국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI) 웹사이트에서 NCBI 참조 서열 NP 067018.2로서 공개적으로 이용 가능하며, 본원에서는 서열번호 75로 제공된다.
발현 CLDN6은, 정반종, 배아 암종 및 난황낭 종양을 포함하는 생식 세포 종양뿐만 아니라, 일부 경우 위 선암종, 폐 선암종, 난소 선암종, 및 자궁내막 암종에서 고도로 발현된다(Ushiku T 등의 문헌[Histopathology 61(6):1043-1056, 2012], Hewitt KJ, Agarwal R, Morin PJ의 문헌[The claudin gene family: expression in normal and neoplastic tissues. BMC Cancer 2006; 6; 186]; Micke, P. 등의 문헌[(2014) Aberrantly activated Claudin-6 and 18.2 as potential therapeutic targets in non-small-cell lung cancer. Int. J. Cancer 135, 2206-2214]; Lal-Nag, M. 등의 문헌[(2012) Claudin-6: a novel receptor for CPE-mediated cytotoxicity in ovarian cancer. Oncogenesis 1, e33]; Ben-David, U. 등의 문헌[(2013) Immunologic and chemical targeting of the tight junction protein Claudin-6 eliminates tumorigenic human pluripotent stem cells. Nat. Commun. 4, 1992]).
인간 CLDN6 단백질은 세포외 도메인(ECD)에서 인간 CLDN9 단백질 서열과 매우 밀접하게 관련되며, ECD1에서는 >98% 동일성 및 ECD2에서는 >91% 동일성을 갖는다. 인간 CLDN4는 또한 ECD 서열에서 인간 CLDN6과 밀접하게 관련되며, ECD1에서는 >84% 동일성 및 ECD2에서는 >78% 동일성을 갖는다. CLDN6에 대한 단클론 항체(MAb)의 발견은 내인성으로 발현되는 클라우딘-9(CLDN9)의 높은 상동성, 즉 CLDN6의 세포외 도메인에서 단지 3개의 아미노산(ECD1에서 2개, ECD2에서 1개)만이 상이한 상동성에 의해 어려움을 겪고 있다. CLDN4, CLDN6, 및 CLDN9 단백질에 대한 추론된 시노몰구스 원숭이 단백질 ECD 서열은 각각의 인간 ECD 서열과 100% 동일하다. 또한, 클라우딘-6 유전자는 상이한 종 사이에서 고도로 보존되며, 예를 들어, 인간 및 쥣과 유전자는 DNA 및 단백질 수준에서 88% 상동성을 나타낸다.
클라우딘 18.2
단백질 클라우딘 계열의 또 다른 구성원인 밀착 접합부 분자 클라우딘-18은 일반적으로 위 점막 및 장 상피의 세포 밀착 접합부에서 발견된다. 프로모터 의존적 방식으로, 폐 제한(CLDN18.1) 및 위 제한(CLDN18.2) 발현을 나타내는 구분되는 이소형을 암호화하는, 2개의 대안적으로 스플라이싱된 인간 클라우딘 18 전사 변이체(Niimi 등의 문헌[Mol. Cell. Biol. 21:7380-90, 2001])가 이전에 기술되었다. 스플라이스 변이체의 일차 단백질 서열은 N-말단 세포내 영역, 제1 막관통 영역(TMD1), 및 세포외 루프 1(ECL1)을 포함하는 N-말단 부분에서 상이하다. CLDN18.2는 하나의 세포 계통에 대한 엄격한 제약을 갖는 인간 클라우딘 계열의 몇몇 구성원 중 하나이다(Tureci 등의 문헌). 보다 구체적으로, 이는 수명이 짧은 분화된 상피 세포로 제한되고 위샘의 줄기 세포 구역으로부터 부재하는 발현 패턴을 갖는 매우 선택적인 위 계통(예를 들어, 위세포 특이적) 마커를 제공한다(Sahin 등의 문헌[Clin. Cancer Res. 14 (23) 7624-7634, 2008]).
CLDN18.2는 악성 형질전환에서 유지되고, 원발성 종양 및 이들의 전이부의 상당한 부분에서 발현된다. Sahin 등은 또한 CLDN18.1이 아닌 CLDN18.2가 췌장암, 위암, 식도암, 폐암 및 난소암을 포함하는 여러 상이한 유형의 암에서 빈번하게 과발현된다고 보고하였다. 따라서, 암의 맥락에서, CLDN18.2는 위 세포 계통으로 제한되지 않는다(Sahin 등의 문헌). 종합하면, 공개된 보고의 결과는 CLDN18.2가 상피 세포 유래 종양과 연관된 질환의 암 면역요법의 발생을 위한 진단 도구 및 약물화 가능한 표적 둘 모두를 제공한다는 것을 입증한다.
밀착 접합 투과성이 종종 정상 조직보다 종양 조직에서 더 높다는 것으로 보고되었으며, 이는 종양 세포 상의 클라우딘 단백질이 온전한 밀착 접합을 갖는 정상 조직에서보다 보다 더 접근 가능할 수 있다는 예측으로 이어졌다. 이러한 가능성은 클라우딘 단백질을 치료적 암 개입을 위한 매력적인 표적으로 만든다. 또한, 공개된 발현 프로파일링 결과는 CLDN18.2를 표적화하는 암 요법이 양호한 전신 독성 프로파일을 가질 것임을 나타내며, 이는 정상적인 전환 및 항상성 과정이 2일 내지 7일마다 위장관 상피 세포를 보충하기 때문이다(Sahin 등의 문헌). 제한된 기간의 일시적인 위장관 독성은 암 면역요법제에 있어서 통상적으로 발생하고 관리 가능한 이상반응이다.
췌장 및 위식도암은 충족되지 않은 의학적 요구가 가장 높은 악성 종양 중 하나이다(Sahin 등의 문헌). 위암 및 췌장암이 유의한 암 관련 이환율 및 사망률에 기여한다는 사실에도 불구하고, 치료 옵션은 제한적이다. 따라서, 상피 세포 유래 원발성 및 전이성 고형 종양과 연관된 암의 면역요법에 사용하기 위한 항-CLDN18.2 특이적 항체 및 결합제에 대한 필요성이 존재한다.
CLDN18.2는 2개의 작은 세포외 루프(소수성 영역 1 및 소수성 영역 2에 의해 포함된 루프 1; 소수성 영역 3 및 4에 의해 포함된 루프 2)를 갖는 4개의 막 스패닝 도메인을 포함한다. CLDN18.2는 막관통 단백질이므로, 이의 세포외 루프 내에 존재하거나 이에 의해 형성된 에피토프는 항체 기반 암 면역요법에 대한 바람직한 표적이 된다. 그러나, CLDN18.1이 독성과 매우 관련이 있는 조직인 정상 폐 조직에서 폐포 상피 세포에 의해 발현된다는 점을 고려할 때, 배타적인 스플라이스 변이체 특이성이 항체 기반 암 면역요법을 위한 CLDN18.2 특이적 항체의 사용을 위한 전제 조건으로 인식된다. Sahin 등은 CLDN18.2에 배타적으로 결합하고 CLDN18.1에 결합하지 않는 항체(다클론 및 단클론)의 단리에 기초하여 CLDN18.2를 암 면역요법에 대한 약물화 가능한 표적으로서 검증하는 개념 증명 결과를 처음으로 보고하였다(Sahin 등의 문헌[Clin. Cancer Res. 14 (23) 7624-7634, 2008]).
CLDN18.2는 위암, 식도암, 췌장암, 폐암, 예컨대 비소세포 폐암, 난소암, 결장암, 간암, 두경부암, 및 담낭암을 포함하는 다수의 원발성 종양 및 이들의 전이부에서 발현된다. 클라우딘의 조절이상 발현은 많은 암에서 검출되며, 이는 종양형성 및 암 침습성에 기여할 수 있다(Singh 등의 문헌[J Oncology 2010; 2010: 541957]). CLDN18.2의 발현은 췌장관 선암종(PDAC)(Tanaka 등의 문헌[J Histochem Cytochem. 2011; 59:942-952]), 식도 종양, 비소세포 폐암(NSCLC), 난소암(Sahin 등의 문헌[Hu Cancer Biol. 2008; 14:7624-7634]), 및 담관 선암종(Keira 등의 문헌[Virchows Arch. 2015; 466:265-277])에서 현저하게 상승한다.
위암이 유의한 암 관련 이환율 및 사망률에 기여한다는 사실에도 불구하고, 위암에 대한 치료 옵션은 제한적이다. 클라우딘은 정상 조직, 양성 신생물, 증식성 병태 및 암에 존재한다(Ding 등의 문헌[Cancer Manag. Res. 5:367-375 (2013)]). 클라우딘의 발현 패턴은 매우 조직 특이적이며, 대부분의 조직은 다수의 클라우딘을 발현한다. 클라우딘 단백질은 동형 또는 이형 방식으로 인접한 세포로부터의 클라우딘과 상호작용하여 밀착 접합부를 형성할 수 있다(Ding 등의 문헌). 클라우딘 발현 및 신호전달 경로의 변화는 암 발생과 연관되는 것으로 알려져 있으며, 손상된 밀착 접합부의 기능과 종양 진행 간의 연관성이 광범위하게 보고되었다.
넥틴 단백질 계열
넥틴(라틴어 "넥토(necto)"는 "연결"을 의미함)은 이의 ECD의 Ig-유사 V-도메인을 통해 다른 세포 표면 분자 상의 넥틴과 상호작용한다. 넥틴은 먼저 동일한 세포 상에 시스-이량체를 형성하도록 결합한 다음, 인접한 세포 상에 넥틴 또는 면역글로불린 수퍼패밀리(IgSF)의 다른 구성원과 함께 동종성 또는 이종성 트랜스-이량체를 형성함으로써 세포-세포 접착을 촉진하도록 기능한다(Miyoshi 등의 문헌[Am J Nephrol , 27:590, 2007]). 이종성 트랜스-이량체는 동종성 트랜스-이량체보다 더 강한 세포-세포 상호작용을 형성하는 것으로 보고되었다. 결합 특이성은 각각의 넥틴에 대해 상이하다(예를 들어, 넥틴-4는 그 자체 및 넥틴-1에 결합함).
인간 넥틴 계열은 9개의 상동체(넥틴-1 내지 넥틴-4 및 넥틴-유사-1 내지 -5)를 포함한다(Duraivelan 등의 문헌[Sci Rep , 10:9434, 2020]). 넥틴 단백질(넥틴-1, 넥틴-2, 넥틴-3, 및 넥틴-4)은 상피 세포의 유착 접합부에서 세포-세포 유착을 매개하기 위해 동종친매성 또는 이종친매성으로 트랜스-작용하는 칼슘-독립 면역글로불린 수퍼패밀리(IgSF) 세포 유착 분자이다. 정상 상피에서, 유착 접합부는 종양 형성 동안 종종 손실되는 특징인 세포 극성을 정의한다.
넥틴-1, -2, -3, 및 -4는 단일 통과 I형 당단백질로서 발현되고, N-말단 Ig-유사 가변 도메인(D1)으로서 배열된 3개의 직렬 면역글로불린-유사 도메인/루프를 갖는 세포외 도메인(ECD)에 이어서 2개의 Ig-유사 불변 도메인(D2 및 D3)으로 이루어진 공통 도메인 조직을 특징으로 한다. 넥틴은 V-도메인 결합 상호작용을 위해 V-도메인을 통해 서로 상호작용함으로써 세포-세포 부착을 지원하는 트랜스-헤테로-상호작용 네트워크를 생성한다. 넥틴-3/넥틴-1, 넥틴-3/넥틴-2, 넥틴-1/넥틴-4 간의 이종친매성 상호작용이 보고되었다(Harrison 등의 문헌[Nat Struct Mol Biol, 19(9):906-915, 2012]). 넥틴은 세포-세포 부착에서의 이의 역할 외에도, 다양한 생리학적 세포 활성, 바이러스 진입 및 면역 조절을 조절하는 데 중요한 역할을 한다.
넥틴 계열의 구성원은 단일 통과 I형 당단백질로서 발현되고, 세포외도메인의 3개의 Ig-유사 도메인(막 원위 IgV 도메인에 이어서 2개의 IgC 도메인이 있음), 막관통 영역, 및 어댑터 단백질 아파딘을 통해 액틴 세포골격에 결합하는 세포질 도메인(Samanta 등의 문헌[Cell Mol Life Sci, 72(4):645-658, 2015])으로 구성된 공통 도메인 조직을 특징으로 한다.
많은 바이러스는 IgSF 구성원 단백질을 이용하여 바이러스 향성, 부착 및 숙주 세포 내로의 후속 진입을 촉진한다. 넥틴 계열의 여러 구성원을 바이러스 수용체로서 식별한 후, 세포 부착 분자로서의 이들의 생리학적 기능을 조사하였다. 초기에, 넥틴 계열의 구성원은 다수의 군에 의해 바이러스 진입 수용체로서 독립적으로 식별되었으며, 관찰된 기능에 기초하여 명칭이 할당되었다. 넥틴-1, -2 및 -3은 폴리오바이러스 수용체(PVR, necl-5, CD155)와 상동인 분자로서 처음으로 기술되었고, 이에 따라 폴리오바이러스 수용체 관련(PRR) 단백질(넥틴1/PRR1/CD111, 넥틴2/PRR2/CD112 및 넥틴3/PRR3)(Reymond 등의 문헌[J Biol Chem , 276(46):43205-15, 2001])이라는 명칭으로 기술되었으며, 이어서 각각 CD111, CD112 및 CD113이라는 명칭이 할당되었다. 이어서, 넥틴-4는 홍역 바이러스 헤마글루티닌(MV-H)을 인식하며, 홍역 바이러스 진입을 위한 상피 세포 수용체로서 기능하는 것으로 입증되었다(Samanta 등의 문헌[Cell Mol Life Sci , 72(4):645-658, 2015]).
넥틴은 먼저 세포 표면 상에 동종 시스-이량체를 형성한 다음, 동종친매성 및 이종친매성 방식 둘 모두로 인접 세포 상에 트랜스-이량체를 형성함으로써, 세포 부착 분자로서 기능한다. 결합 특이성은 각각의 넥틴에 대해 상이하다. 넥틴-4는 그 자체 및 넥틴-1에 결합한다(Reymond 등의 문헌[J Biol Chem , 276(46):43205-15, 2001], Fabre 등의 문헌[J Biol Chem , 277(30):27006-27013, 2002]). 세포-세포 접촉은 인접한 세포 상에서의 넥틴 간의 상호작용에 의해 개시되는 것으로 여겨진다. 후속하여, 카데린-카테닌 복합체가 넥틴 기반 세포간 부착 부위에 동원되고, 인접한 세포 상에서 카데린의 트랜스-상호작용이 일어남으로써, 유착 접합부가 형성된다(Boylan 등의 문헌[Oncotarget , 8(6):9717-9738, 2017]).
넥틴 단백질의 세포외 도메인은 30 내지 55%의 아미노산 서열 동일성을 공유한다. 넥틴은 세포질 도메인에서 결합 모티프를 통해 액틴 세포골격 아파딘(F-액틴 결합 단백질)에 연결되고, 상피 및 내피 접합부의 조직화에 참여한다. 다른 세포 부착 분자(CAM) 및 신호 변환 분자와의 복잡한 상호작용에서, 바이러스의 이동, 증식, 생존, 분화, 분극화, 및 진입과 같은 여러 다양한 생리학적 세포 활성이 조절된다.
포유동물에서 추가 세포 표면 분자와 상호작용하는 넥틴 계열 구성원의 능력은 이들의 상호작용 네트워크를 유의미하게 확장시킨다. 넥틴은 혈소판 유래 성장 인자 수용체, 섬유아세포 성장 인자 수용체, 혈관 내피 성장 인자 수용체, 프로락틴 수용체, ErbB2, ErbB3, 및 ErbB4, 및 인테그린, 예컨대 인테그린 αvβ3 및 인테그린 α6β4와 같은 다른 세포 표면 막 수용체와 시스-상호 작용하고, 세포-세포 부착뿐만 아니라 세포 이동, 증식, 분화, 및 생존을 조절하는 것으로 알려져 있다(Kedashiro 등의 문헌[Sci Rep, 9:18997, 2019]).
넥틴 계열의 여러 구성원은 면역글로불린 수퍼패밀리의 다른 구성원과의 이종친매성 트랜스-상호작용의 결과로서 면역조절 기능을 발휘할 수 있다. 이러한 상호작용은 자연 살해(NK) 세포, 단핵구, 수지상 세포(DC), 및 T 림프구를 포함하는 다양한 면역 세포 유형의 기능에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 알려진 넥틴 계열 상호작용자 IgSF 구성원 중 여러 구성원뿐만 아니라, 일부 넥틴은 공통 결합 파트너를 인식하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 넥틴-2 및 PVR 둘 모두는 CD226, TIGIT, 및 넥틴-3을 인식한다(Duraivelan 등의 문헌[Sci Rep, 10:9434, 2020]).
단백질을 기능적으로 관련된 군으로 분류하기 위한 알고리즘을 사용하는 생물정보학 분석은 5개의 추가 IgSF 구성원, CD96(TACTILE), CD226(DNAM-1), TIGIT(WUCAM, VSTM3), CRTAM, 및 CD200이 넥틴 및 넥틴-유사 단백질과 기능적으로 그리고 진화적으로 관련이 있으며, 넥틴 계열의 구성원에 대한 결합 파트너를 나타낼 수 있음을 예측하였다(Rubinstein 등의 문헌[Structure , 21(5):766-776, 2013]). 현재까지, CD200을 제외하고, 이들 단백질 모두는 넥틴-/넥틴-유사 계열의 구성원에 결합하는 것으로 보고되었다(Rubenstein 등의 문헌).
추가 세포 표면 분자와 상호작용하는 넥틴 계열 구성원의 능력은 이들의 상호작용 네트워크를 유의미하게 확장시킨다. 넥틴 계열의 여러 구성원은 IgSF의 다른 구성원과의 이종친매성 트랜스-상호작용의 결과로서 면역조절 기능을 발휘할 수 있다. 이러한 상호작용은 자연 살해(NK) 세포, 단핵구, 수지상 세포(DC), 및 T 림프구를 포함하는 다양한 면역 세포 유형의 기능에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 알려진 넥틴 계열 파트너 IgSF 구성원 중 여러 구성원뿐만 아니라, 일부 넥틴은 공통 결합 파트너를 인식하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 넥틴-2 및 PVR 둘 모두는 CD226, TIGIT, 및 넥틴-3을 인식한다(Duraivelan 등의 문헌[Sci Rep, 10:9434, 2020]).
넥틴-4
넥틴-4(폴리오바이러스-수용체-유사 4, PVRL4로도 알려짐)는 관련 서열을 식별하기 위해 알려진 넥틴 단백질 세포외도메인의 서열을 사용하는 생물정보학 검색을 통해 처음으로 식별되었다(Reymond 등의 문헌[J Biol Chem , 276(46):43205-15, 2001]). 인간 넥틴-4는 인간 기관으로부터 클로닝되었으며 정상 인간 조직에서 제한된 발현 패턴을 갖는 항원으로서 기술되었다. 보다 구체적으로, 이는 V-도메인 상호작용을 통해 넥틴-1과는 트랜스-상호작용하지만 넥틴-2, 넥틴-3, 또는 PVR과는 트랜스-상호작용하지 않는 넥틴 계열의 아파딘-연관 구성원으로서 기술되었다(Reymond 등의 문헌[J Biol Chem , 276(46):43205-15, 2001]).
Reymond 및 연구진은 다음의 발견에 기초하여 넥틴-4를 넥틴-1에 대한 신규 리간드로 식별하였다(Reymond 등의 문헌[J Biol Chem , 276(46):43205-15, 2001)]: i) 가용성 키메라 재조합 넥틴-4 세포외도메인(넥틴-4-Fc)은 넥틴-1을 발현하는 세포와 상호작용하지만 PVR/CD155, 넥틴-2 또는 넥틴-3을 발현하는 세포와는 상호작용하지 않으며, 대조적으로 넥틴-1Fc는 넥틴-4를 발현하는 세포에 결합함; ii) 넥틴-1-Fc는 COS 세포에서 발현된 넥틴-4를 침전시킴; 및 iii) 넥틴-4-Fc와 넥틴-1-Fc 가용성 재조합 단백질 간 상호적인 시험관 내 물리적 상호작용이 관찰됨(Reymond, N 등의 문헌). 넥틴-4-Fc/넥틴-4-Fc 상호작용 또한 검출되었으며, 이는 넥틴-4가 동종친매성 및 이종친매성 특성 둘 모두를 가진다는 것을 나타낸다.
인간 넥틴-4 유전자는 510개 아미노산을 함유하는 55.5 kDa 단백질인 넥틴-4 부착 수용체를 암호화하는 9개의 엑손을 함유한다. 단백질 정보 데이터베이스 UniProtKb에 따르면, 넥틴-4(Q96NY8)는 N-말단 신호 펩티드(1-31개 아미노산), 3개의 면역글로불린 유사 하위 도메인(V-형1 32-144개 아미노산, C2-형1 148-237개 아미노산, C2-형2 248-331개 아미노산)을 갖는 세포외 도메인(32-349개 아미노산), 막관통 도메인(350-370개 아미노산), 및 세포질 도메인(371-510개 아미노산)을 함유한다.
넥틴-4의 V-유사 도메인은 넥틴-1과의 트랜스-상호작용을 매개하기에 충분하고, 막 근위 넥틴-4 C-유사 도메인은 트랜스-상호작용의 친화도를 증가시키는 데 기여하는 것으로 보고되었다(Fabre 등의 문헌[J Biol Chem , 277(30):27006-27013, 2002]). 넥틴-4 및 넥틴-3은 넥틴-1 V-유사 도메인에서 공통 결합 영역을 공유한다(Harrison 등의 문헌[Nat Struct Mol Biol, 19(9):906-915, 2012]).
또한, 넥틴-4/넥틴-1 트랜스-상호작용은 에피토프가 넥틴-1의 V-유사 도메인에 국소화된 항-넥틴-1 단클론 항체(R1.302)에 의해 차단되는 것으로 보고되었다(Reymond 등의 문헌[J Biol Chem , 276(46):43205-15, 2001]). 후속 문헌은 넥틴-4의 Ig-유사 V 도메인에 특이적인 단클론 항체가 넥틴-1에 대해 인간 넥틴-4(NIH:OVCAR5)를 과발현하도록 조작된 난소암 세포주의 부착을 차단한다는 것을 입증한다(Boylan 등의 문헌[Oncotarget , 8(6):9717-9738, 2017]).
넥틴-4는 유방암(Fabre-Lafay 등의 문헌[BMC Cancer, 7:73, 2007]), 폐암(Takano 등의 문헌[Cancer Res, 69(16):6694-03, 2009]), 난소암(Derycke 등의 문헌[Am J Clin Pathol, 5:835-845, 2010]), 췌장암(Nishiwada 등의 문헌[J Exp Clin Cancer Res, 34(1):30, 2015]), 담낭암(Zhang 등의 문헌[Cancer Lett, 375:179-189, 2016]), 및 위암(Zhang 등의 문헌[Hum Pathol, 72:107-116, 2018])과 같은 다양한 상피 세포암에서 상향조절되는 것으로 보고되었다. 이들 암은 종종 넥틴-4 유전자좌의 복제수 증가 또는 국소 증폭을 갖는다(Pavlova 등의 문헌[Elife, 2:e00358, 2013]).
최근, 넥틴이 종양형성에 기여하고 전이를 촉진하는 기능을 한다는 것을 나타내는 증거가 축적되었다. 특히, 넥틴-4는 암 세포 부착, 이동, 증식 및 상피-중간엽 전이에 관여하는 것으로 나타났다. 유방암, 췌장암 및 폐암에서, 넥틴-4의 과발현, 또는 검출 또는 환자 혈청 중 가용성 넥틴-4는 종양 진행 및/또는 불량한 생존에 관련되는 것으로 보고되었다(Fabre-Lafay 등의 문헌[BMC Cancer, 7:73, 2007], Takano 등의 문헌[Cancer Res, 69(16):6694-03, 2009], Derycke 등의 문헌[Am J Clin Pathol, 5:835-845, 2010], Nishiwada 등의 문헌[J Exp Clin Cancer Res, 34(1):30, 2015] 및 Lattanzio 등의 문헌[Oncogenesis, 3:e118, 2014]).
암 면역요법을 위한 종양 연관 항원 표적화
지난 몇 년 동안, 밀착 접합부가 암 세포 증식, 형질전환 및 전이에 역할을 한다는 보다 많은 증거가 밝혀졌다. 클라우딘의 조절 장애는 상피 세포에서 밀착 접합부의 파괴를 초래하며, 이는 결국 세포 극성의 손실 및 상피 무결성의 손상을 야기한다. 종양 세포에 의한 클라우딘 6 및/또는 클라우딘 18.2의 과발현은 종양 세포의 탈분화의 결과로서의 클라우딘의 조절이상 국소화, 또는 비정상적인 혈관화를 갖는 종양 덩어리 내에서 영양소를 효율적으로 흡수하기 위해 급속히 성장하는 암성 조직의 요구와 연관될 수 있다(Morin PJ.의 문헌[Cancer Res. 1;65(21):9603-6, 2005]). 세포-세포 부착 감소 및 암 세포의 이동성 증가는 암 진행 및 전이에 있어서 중요한 단계인 상피에서 중간엽으로의 전이(EMT)의 주요 이벤트인 것으로 제시된다.
넥틴-4는 방광암에서 높은 수준의 mRNA 발현에 기인하는 억제 감산 혼성화를 사용하여 잠재적 표적으로 식별되었다(Challita-Eid 등의 문헌[Cancer Res , 76(10):3003-13, 2016]). 넥틴-4는 인간 태반의 내피 세포에 의한 넥틴-4의 제한된 발현(Reymond 등의 문헌[J Biol Chem, 276(46):43205-15, 2001]), 정상 성인 조직에서의 발현 부족, 및 유방암, 난소암, 췌장암 및 폐암을 포함하는 다양한 암 조직에서의 재발현(Fabre-Lafay 등의 문헌[BMC Cancer, 7:73, 2007], Takano 등의 문헌[Cancer Res, 69(16):6694-03, 2009], Derycke 등의 문헌[Am J Clin Pathol, 5:835-845, 2010], Pavlova 등의 문헌[Elife, 2:e00358, 2013], Nishiwada 등의 문헌[J Exp Clin Cancer Res, 34(1):30, 2015], Challita-Eid 등의 문헌[Cancer Res, 76(10):3003-13, 2016])을 보고한 초기 문헌으로 인해, 당초 종양 특이 항원(TSA)으로 기술되었다.
인간 넥틴-4의 세포외 도메인에 대해 유도된 쥣과 항체(M22-244b3) 및 정상 인간 조직 시편의 패널(36개의 인간 기관을 나타냄)을 사용한 면역조직화학(IHC) 연구 결과는 이전에 보고된 것(Challita-Eid 등의 문헌)보다 낮은 수준에서 중간 수준으로 정상 조직에서 더 광범위한 발현을 나타냈으며, 표적 항-넥틴-4 독성에 대해 유도될 위험이 증가할 수 있는 정상 조직을 식별하였다. 인간 피부 각질세포, 피부 부착물(땀샘 및 모낭, 및 방광, 위, 유방, 식도, 및 타액선(관)의 상피)에서 낮은 수준의 약하거나 중간인 균질한 염색이 보고되었으며(Challita-Eid 등의 문헌, Reymond 등의 문헌[J Biol Chem, 276(46):43205-15, 2001], Brancati 등의 문헌[Am J Hum Gen , 87:265-273, 2010]), 이는 넥틴-4가 TSA보다 종양 연관 항원(TAA)에 더 많다는 것을 시사한다.
넥틴-4는 다수의 암, 특히 요로상피암, 폐암, 췌장암, 유방암 및 난소암에서 과발현된다(Challita-Eid 등의 문헌[Cancer Res, 76(10):3003-13, 2016], Fabre-Lafay 등의 문헌[BMC Cancer, 7:73, 2007], Takano 등의 문헌[Cancer Res, 69(16):6694-03, 2009], Derycke 등의 문헌[Am J Clin Pathol, 5:835-845, 2010]). 7개의 상이한 적응증(예를 들어, 방광암, 유방암, 췌장암, 폐암, 난소암, 두경부암, 및 식도암)을 나타내는 34개의 종양을 나타내는 인간 암 종양 마이크로어레이(TMA)에서 넥틴-4 발현의 광범위한 면역조직화학은, 평가된 암 적응증 전반에 걸쳐, TMA 시편의 69%가 넥틴-4에 대해 양성이었음을 입증하였다. 방광, 유방 및 췌장 종양에서 넥틴-4의 전체적인 발현에 대한 가장 높은 빈도가 관찰되었다. 난소암, 폐암, 두경부암 및 식도암 샘플에서는, 중간 내지 강한 염색을 갖는 넥틴-4-양성 샘플의 유병률은 대체적으로 더 낮았다(Chalittta-Eid 등의 문헌). 암에서 관찰된 보다 높은 넥틴-4 발현 수준은 이론적으로 항-넥틴-4 표적화 ADC 및 항체 기반 면역요법에 대해 허용가능한 안전성 프로파일을 특징으로 하는 치료 윈도우를 제공한다(Challita-Eid 등의 문헌[Cancer Res, 76(10):3003-13, 2016], 및 Shim 등의 문헌[Biomolecules, 10(3):360, 2020]).
상피암 진행의 초기 단계는 세포외 기질 고정이 없는 상태에서 생존하고 증식하는 능력을 부여하는 유전적 변화를 특징으로 한다. 고정이 없는 상태를 견디는 암 세포의 능력은 암 세포의 생존 및 종양형성의 병리학적 진행(예를 들어, 기저 기질의 침윤, 혈관으로의 혈관 외 유출 및 원위 부위로서의 전이성 증식)에 중요하다(Pavlova 등의 문헌[Elife , 2:e00358, 2013]). 넥틴-4는 TL-HMEC(SV40 거대 T 항원으로 형질도입된 hTERT-불멸화 인간 유방 상피 세포)에서의 기질 고정과 독립적인 세포 증식을 가능하게 하는 유전자에 대한 기능 획득 스크리닝에서 식별되었다(Pavlova 등의 문헌[Elife , 2:e00358, 2013]).
Pavlova 등은 넥틴-4가 현탁액 중 다세포 클러스터 내로의 TL-HMEC의 신속한 연관을 유도하고, 넥틴-4의 세포외 도메인에 유도된 항체를 사용하여 관찰된 클러스터 형성을 파괴할 수 있음을 추가로 보고하였다. 세포 클러스터링은 항-넥틴-4 항체의 존재 하에서 완전히 제거되었다. 유사하게, 넥틴-1의 세포외 영역을 표적화하는 항체는 또한 넥틴-4-유도 세포 클러스터링을 억제하였다.
Pavlova 등은, 넥틴-4가 인접 세포 상에 넥틴-1 수용체를 결합시킴으로써 서로에 대해 종양 세포의 클러스터링을 촉진한다는 것과, 기질 부착 독립적인 방식으로 인테그린 β4/SHP-2/c-Src 활성화를 유발하는 상호작용을 추가로 입증하였다. Pavlova 등은, 넥틴-4/넥틴-1 상호작용을 통한 종양 특이적 세포 접촉 및 신호 전달이 세포 기질 신호 전달을 위한 대리물을 제공하고, 아노이키스(anoikis)(즉, 세포외 기질(ECM) 및 이웃하는 세포에 대한 부착 상실 시 세포의 사멸 유도) 회피를 가능하게 하는 생존 이점을 제공하는 모델을 제안하였다.
난소암 진행(즉, 세포 부착, 구상체 형성, 이동 및 증식)의 기저 세포 기능에서의 넥틴-4의 생물학적 유의성을 결정하기 위해 수행된 연구의 결과는, 넥틴-4의 IgV-유사 도메인에 대한 mAb가 넥틴-1에 대한 난소암 세포 부착을 거의 완전히 차단하였음을 입증하는 시험관 내 데이터를 보고한다(Boylan 등의 문헌[Oncotarget, 8(6):9717-9738, 2017]). Boylan 등은, Pavlova가 유방암의 마우스 이종이식 모델에서 동일한 항-넥틴-4 항체를 사용하여, 대조군 IgG로 치료한 종양과 비교하여 생체 내에서의 종양 세포 부착의 파괴 및 종양 성장 감소를 관찰하였다는 점에 주목하였으며, 이러한 조합된 결과에 기초하여, 넥틴-4 세포 부착을 차단하는 것이 암 면역요법에 사용되는 항-넥틴-4 항체의 치료 효능의 중요한 구성요소일 수 있다는 것을 제안하였다(Boylan 등의 문헌).
넥틴-4 발현 종양 치료를 위한 단독요법으로서의 항-넥틴-4 ADC의 용도를 평가하는 전임상 연구의 결과를 보고하는 문헌은 항-넥틴-4 항체 기반 면역치료제의 임상 개발을 검증하였다. 예를 들어, AGS-22M6E ADC 단독요법은 인간 방광암, 췌장암, 유방암 및 폐암 4개의 마우스 이종이식 모델에서 종양의 성장을 억제하는 것으로 보고되었다. 이후 M-Rabet 등의 후속 문헌에서는 서로 다른 항-넥틴-4 항체를 사용하여 제조한 ADC(N41 mAb-vcMMAE)(WO 2017/042210)가, 원발성 종양, 전이성 병변 및 국소 재발에 대해 면역 저하된 NSG 마우스에서 개발된 TNBC의 세 가지 모델의 시험관 내 및 생체 내에서 완전하고 지속적인 반응을 유도했다는 관찰을 바탕으로 넥틴-4가 원발성 및 전이성 삼중음성 유방암(TNBC)의 치료 표적임을 확인하였다(M-Rabet 등의 문헌[Annals of Oncology, 28(4):769-776, 2017]).
CD137 및 종양 연관 항원에 결합하는 이중특이체 결합 단백질
본 개시는 CD137 및 종양 연관 항원(TAA) 또는 종양 특이적 항원 및 이의 단편에 결합하는 이중특이체 결합 단백질을 제공한다. 예를 들어, 종양 특이적 항원은 종양이 아닌 세포 상에서보다 더 많은 양으로 종양 세포의 표면 상에서 발현되는 임의의 항원일 수 있다. 일부 구현예에서, 종양 연관 항원은 클라우딘 6, 클라우딘 18.2, 또는 넥틴-4이다.
TAA 및 CD137에 결합하는 이중특이체 결합 단백질은, (a) TAA에 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 TAA에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 항체 스캐폴드 모듈; 및 (b) CD137에 결합하는 제3 항원 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 제1 결합 모듈을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 종양 연관 항원 및 CD137에 결합하는 이중특이체 결합 단백질은: (a) 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위를 통해 종양 연관 항원에 결합하기 위한 수단을 포함하는 항체 스캐폴드 모듈; 및 (b) 제3 항원 결합 부위를 통해 CD137 에 결합하기 위한 수단을 포함하는 적어도 하나의 제1결합 모듈을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 갖는 Y-형상 항체이다. 추가의 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4를 포함하는 IgG이다. 일부 구현예에서, 제1 결합 모듈은 scFv와 같은 항체 단편이다. 추가의 구현예에서, scFv는 이황화 결합의 도입에 의해 안정화된다.
일부 구현예에서, 제1 결합 모듈은 CD137에 결합하고 작용 활성을 갖는다.
일부 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은 2가 단클론 항체이다. 일부 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은 전장 항체이다. 일부 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은 쥣과 항체 또는 인간 항체이다. 다른 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은 키메라, 이중특이체, 또는 인간화 항체이다. 일부 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은 대칭(예를 들어, 동종이량체) 또는 비대칭(예를 들어, 이종이량체)이다.
다른 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은, 예를 들어, Fab, Fab', F(ab)2, Fv, 도메인 항체(dAb), 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디, 및 단쇄 항체(scFv)로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 단편을 포함하는 항체 단편이다. 항체 스캐폴드 모듈은 키메라 항체 또는 이중특이체 항체일 수 있다. 대안적인 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은 폴리펩티드에 대한 TAA 선택적 결합을 부여하기에 충분한 항체의 적어도 일 부분을 함유하는 폴리펩티드(들)일 수 있다. 인간 항체이다.
일부 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은 둘 모두 C-말단 및 N-말단을 갖는 2개의 중쇄 서열 및 둘 모두 C-말단 및 N-말단을 갖는 2개의 경쇄 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 하나 또는 둘 모두의 C-말단, 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 하나 또는 둘 모두의 C-말단, 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 하나 또는 둘 모두의 N-말단, 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 하나 또는 둘 모두의 N-말단, 또는 이들의 조합에 공유 부착된다. 추가의 구현예에서, CD137에 결합하는 제1결합 모듈 및 TAA에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈은 직접적으로 또는 인터링커를 통해 서로 공유 부착된다. 일 구현예에서, 제1 결합 모듈은 인간 또는 인간화된 것일 수 있다.
항체 스캐폴드 모듈 및 제1 결합 모듈은 직접적으로 접합되거나(예를 들어, 융합되거나) 링커에 의해 간접적으로 접합될 수 있다. 예시적인 링커는, 예를 들어 3xG4S 링커(예를 들어, GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 64)) 및 4xG4S 링커(예를 들어, GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 65))를 포함하는 글리신-세린 링커를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본원에 제공된 이중특이체 결합 단백질은, 제한 없이, 아미노산 잔기 치환, 돌연변이 및/또는 변형을 포함하는, 불변 영역(즉, Fc 영역)의 치환 또는 변형을 갖는 항체 스캐폴드 모듈을 포함할 수 있으며, 이는: 변경된 약동학, 증가된 혈청 반감기, 결합 친화도 증가, 감소된 면역원성, 증가된 생산량, Fc 수용체(FcR)에 대한 변경된 Fc 리간드 결합, ADCC의 강화 또는 감소된 ADCC, CDC, ADCP, TDCC, 변경된 당질화 및/또는 이황화 결합 및 변형된 결합 특이성을 포함하나 이에 한정되지 않는 바람직한 특성을 초래할 수 있다.
몇몇 문헌은 최적화된 FcgR 결합 프로파일 및 세포 매개 효과기 기능을 최적화하기에 적합한 활성화/억제화(A:I) 비를 갖는 변이체 인간 IgG1 Fc 도메인(CH 영역)을 설계하기 위한 단백질 조작 전략의 성공적인 용도를 보고한다. 이는 특히, 저 친화도 수용체 FcγIIIa에 대한 Fc 도메인의 친화도를 증가시키는 데 중점을 둔다. Fc 수용체의 결합을 직접 또는 간접적으로 향상시키고 결과적으로 세포 세포독성을 유의하게 향상시키는 Fc 도메인 내의 다수의 돌연변이가 식별되었다(Lazar, G.A.의 문헌[PNAS 103:4005-4010 (2006)], Shields, R.L. 등의 문헌[J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001)] Stewart, R. 등의 문헌[Protein Engineering Design and Selection 24: 671-678 (2011)])(Richards, J.O. 등의 문헌[Mol. Cancer Ther. 7:2517-2575 (2008)]).
항체 스캐폴드 모듈은 Fc 영역(예를 들어, 2개의 항체 중쇄 불변 영역)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, Fc 영역은, 예를 들어 L234A L235A 또는 N297A를 포함하는 적어도 하나의 Fc 침묵 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 중쇄의 이량체화를 촉진하기 위한 노브-인-홀(KiH) 돌연변이를 갖는 하나의 중쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 본원에 개시된 항체 스캐폴드 모듈에 사용하기 위한 예시적인 Fc 불변 영역은 서열번호 66, 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69, 및 서열번호 73에 제시되어 있다. 본원에 개시된 항체 스캐폴드 모듈의 경쇄에 대한 예시적인 불변 영역은 서열번호 70 및 서열번호 71에 제시되어 있다.
일 구현예에서, CD137에 결합하는 제1 결합 모듈은 항-CD137 항체 또는 이의 단편으로부터 유래된 CDR을 포함한다. 예를 들어, 제1 결합 모듈은 표 1에 개시된 CDR 세트(HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3)를 갖는 VH를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 제1 결합 모듈은, 예를 들어 서열번호 23에 제시된 바와 같은 가변 중쇄 도메인을 포함하는 항체를 포함하는, CD137에 결합하는 항체의 중쇄 HCDR을 포함한다.
일 구현예에서, CD137에 결합하는 제1 결합 모듈은 항-CD137 항체 또는 이의 단편으로부터 유래된 CDR을 포함한다. 예를 들어, 제1 결합 모듈은 표 1에 개시된 CDR 세트(LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3)를 갖는 VL을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 제1 결합 모듈은, 예를 들어 서열번호 24에 제시된 바와 같은 가변 경쇄 도메인을 포함하는 항체를 포함하는, CD137에 결합하는 항체의 LCDR을 포함한다.
일 구현예에서, 제1 결합 모듈은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 상보성 결정 영역의 세트(CDR1, CDR2 및 CDR3)를 갖는 VH 및 VL의 조합을 포함한다:
(i) VH: CDR1: 서열번호 39, CDR2: 서열번호 40, CDR3: 서열번호 41,
VL: CDR1: 서열번호 42, CDR2: 서열번호 43, CDR3: 서열번호 44.
일 구현예에서, CD137에 결합하는 제1 결합 모듈은 항-CD137 항체 또는 이의 단편으로부터 유래된 CDR을 포함한다. 예를 들어, 제1 결합 모듈은 표 1에 개시된 CDR 세트(HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3)를 갖는 VH 및 표 2에 개시된 CDR 세트(LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3)를 갖는 VL을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 제1 결합 모듈은 서열번호 23에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 VH를 포함한다. 다른 구현예에서, 제1 결합 모듈은 서열번호 24에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 VL를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제1 결합 모듈은 서열번호 23에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 VH; 및 서열번호 24에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 VL을 포함한다.
일부 구현예에서, 이중특이체 결합 단백질은 1-10 nM 이하의 KD를 갖는, CD137에 결합하는 제1 결합 모듈을 포함한다. 결합 연관 상수 ka는 1-10 x 106 (1/Ms)이다. 결합 연관 상수 kd는 1-10 x 10-2 (1/S)이다.
항체 스캐폴드 모듈은 TAA에 특이적인 항체로부터의 CDR 세트를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은 클라우딘 6에 결합하고, 표 3에 개시된 CDR 세트(HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3)를 갖는 VH를 포함한다. 다른 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은 클라우딘 6에 결합하고, 표 4에 개시된 CDR 세트(HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3)를 갖는 VL을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은 표 3에 개시된 CDR 세트(HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3)를 갖는 VH 및 표 4에 개시된 CDR 세트(LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3)를 갖는 VL을 포함한다.
일 구현예에서, 클라우딘 6에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 상보성 결정 영역의 세트(CDR1, CDR2 및 CDR3)를 갖는 VH 및 VL의 조합을 포함한다:
(i) VH: CDR1: 서열번호 45, CDR2: 서열번호 46, CDR3: 서열번호 47,
VL: CDR1: 서열번호 48, CDR2: 서열번호 49, CDR3: 서열번호 50 및;
ii) VH: CDR1: 서열번호 51, CDR2: 서열번호 52, CDR3: 서열번호 53,
VL: CDR1: 서열번호 54, CDR2: 서열번호 55, CDR3: 서열번호 56.
다른 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 25 또는 서열번호 27에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 VH를 포함한다. 다른 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 26 또는 서열번호 28에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 VL를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 25에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 VH; 및 서열번호 26에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 VL을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 27에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 VH; 및 서열번호 28에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 VL을 포함한다.
일 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은 클라우딘 18.2에 결합하고, 표 5에 개시된 CDR 세트(HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3)를 갖는 VH를 포함한다. 다른 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은 클라우딘 18.2에 결합하고, 표 6에 개시된 CDR 세트(HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3)를 갖는 VL을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은 표 5에 개시된 CDR 세트(HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3)를 갖는 VH 및 표 6에 개시된 CDR 세트(LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3)를 갖는 VL을 포함한다.
일 구현예에서, 클라우딘 18.2에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 상보성 결정 영역의 세트(CDR1, CDR2 및 CDR3)를 갖는 VH 및 VL의 조합을 포함한다:
(i) VH: CDR1: 서열번호 33, CDR2: 서열번호 34, CDR3: 서열번호 35,
VL: CDR1: 서열번호 36, CDR2: 서열번호 37, CDR3: 서열번호 38.
다른 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 21에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 VH를 포함한다. 다른 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 22에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 VL을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 21에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 VH; 및 서열번호 22에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 VL을 포함한다.
일 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은 넥틴-4에 결합하고, 표 7에 개시된 CDR 세트(HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3)를 갖는 VH를 포함한다. 다른 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은 넥틴-4에 결합하고, 표 8에 개시된 CDR 세트(HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3)를 갖는 VL을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은 표 7에 개시된 CDR 세트(HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3)를 갖는 VH 및 표 8에 개시된 CDR 세트(LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3)를 갖는 VL을 포함한다.
일 구현예에서, 넥틴-4에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 상보성 결정 영역의 세트(CDR1, CDR2 및 CDR3)를 갖는 VH 및 VL의 조합을 포함한다:
(i) VH: CDR1: 서열번호 57, CDR2: 서열번호 58, CDR3: 서열번호 59,
VL: CDR1: 서열번호 60, CDR2: 서열번호 61, CDR3: 서열번호 62.
다른 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 29 또는 서열번호 31에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 VH를 포함한다. 다른 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 30 또는 서열번호 32에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 VL를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 29에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 VH; 및 서열번호 30에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 VL을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 31에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 VH; 및 서열번호 32에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 VL을 포함한다.
다른 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은 다음의 조합으로부터 선택되는 한 쌍의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열을 포함한다:
i) 서열번호 21과 90%, 95%, 또는 99% 동일한 가변 중쇄 서열 및 서열번호 22와 90%, 95%, 또는 99% 동일한 가변 경쇄 서열; 및
ii) 서열번호 23과 90%, 95%, 또는 99% 동일한 가변 중쇄 서열 및 서열번호 24와 90%, 95%, 또는 99% 동일한 가변 경쇄 서열;
iii) 서열번호 25와 90%, 95%, 또는 99% 동일한 가변 중쇄 서열 및 서열번호 26과 90%, 95%, 또는 99% 동일한 가변 경쇄 서열;
iv) 서열번호 27과 90%, 95%, 또는 99% 동일한 가변 중쇄 서열 및 서열번호 28과 90%, 95%, 또는 99% 동일한 가변 경쇄 서열;
v) 서열번호 29와 90%, 95%, 또는 99% 동일한 가변 중쇄 서열 및 서열번호 30과 90%, 95%, 또는 99% 동일한 가변 경쇄 서열;
vi) 서열번호 31과 90%, 95%, 또는 99% 동일한 가변 중쇄 서열 및 서열번호 32와 90%, 95%, 또는 99% 동일한 가변 경쇄 서열.
당업자는 가변 경쇄 및 가변 중쇄가 독립적으로 선택되거나, 혼합되고 매칭되어, 위에서 식별된 페어링과 구별되는 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 조합을 포함하는 항-CLDN6 항체를 제조할 수 있음을 추가로 이해할 것이다.
일부 구현예에서, 이중특이체 결합 단백질은 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 당업자는 보존적 아미노산 치환이 하나의 아미노산을, 예를 들어 유사한 측쇄와 같은 유사한 구조적 또는 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환하는 것이라는 것을 인식할 것이다. 예시적인 보존적 치환은 당업계에, 예를 들어, Watson 등의 문헌[Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Publication Company, 제4판 (1987)]에 기술되어 있다.
"보존적 변형"은 아미노산 서열을 함유하는 이중특이체 결합 단백질의 결합 특성에 상당한 영향을 미치거나 변경하지 않는 아미노산 변형을 지칭한다. 보존적 변형은 아미노산 치환, 첨가 및 결실을 포함한다. 보존적 치환은 아미노산이 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환되는 것들이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 부류는 양호하게 정의되어 있으며, 이는 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 염기성 측쇄(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신, 트립토판), 방향족 측쇄(예를 들어, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘, 티로신), 지방족 측쇄(예를 들어, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 세린, 트레오닌), 아미드(예를 들어, 아스파라긴, 글루타민), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 황 함유 측쇄(시스테인, 메티오닌)를 포함한다. 또한, 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발에 대해 이전에 기술된 바와 같이, 폴리펩티드의 임의의 고유 잔기는 또한 알라닌으로 치환될 수 있다(MacLennan 등의 문헌[(1998) Acta Physiol Scand Suppl 643: 55-67]; Sasaki 등의 문헌[(1998) Adv Biophys 35: 1-24]). 본 개시의 이중특이체 결합 단백질에 대한 아미노산 치환은 공지된 방법에 의해, 예를 들어 PCR 돌연변이 유발에 의해 이루어질 수 있다(미국 특허 제4,683,195호).
일부 구현예에서, CD137에 결합하는 제1 결합 모듈은 서열번호 23에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, CD137에 결합하는 제1 결합 모듈은 서열번호 23의 가변 중쇄 서열을 포함하는 CD137에 결합하는 결합 모듈의 결합 및/또는 기능적 활성을 보유한다. 또 다른 구현예에서, CD137에 결합하는 제1 결합 모듈은 서열번호 23의 가변 중쇄 서열을 포함하고, 중쇄 가변 서열에서 하나 이상의 보존적 아미노산 치환, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 또는 1-5개의 보존적 아미노산 치환을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환은 (Kabat의 넘버링 시스템에 기초하여) 서열번호 23의 하나 이상의 프레임워크 영역 내에 속한다.
특정 구현예에서, CD137에 결합하는 제1 결합 모듈은 서열번호 23에 제시된 가변 영역과 적어도 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 서열 동일성을 갖는 가변 중쇄 서열을 포함하고, (Kabat의 넘버링 시스템에 기초하여) 프레임워크 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하며, 서열번호 23에 제시된 가변 중쇄 서열 및 서열번호 24에 제시된 가변 경쇄 서열을 포함하는 CD137에 결합하는 제1 결합 모듈의 결합 및/또는 기능적 활성을 보유한다.
일부 구현예에서, CD137에 결합하는 제1 결합 모듈은 서열번호 24에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, CD137에 결합하는 제1 결합 모듈은 서열번호 24의 가변 경쇄 서열을 포함하는 CD137에 결합하는 결합 모듈의 결합 및/또는 기능적 활성을 보유한다. 또 다른 구현예에서, CD137에 결합하는 제1 결합 모듈은 서열번호 24의 가변 경쇄 서열을 포함하고, 경쇄 가변 서열에서 하나 이상의 보존적 아미노산 치환, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 또는 1-5개의 보존적 아미노산 치환을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환은 (Kabat의 넘버링 시스템에 기초하여) 서열번호 24의 하나 이상의 프레임워크 영역 내에 속한다.
특정 구현예에서, CD137에 결합하는 제1 결합 모듈은 서열번호 24에 제시된 가변 영역과 적어도 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 서열 동일성을 갖는 가변 경쇄 서열을 포함하고, (Kabat의 넘버링 시스템에 기초하여) 프레임워크 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하며, 서열번호 23에 제시된 가변 중쇄 서열 및 서열번호 24에 제시된 가변 경쇄 서열을 포함하는 제1 결합 모듈의 결합 및/또는 기능적 활성을 보유한다.
일부 구현예에서, 클라우딘 6에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 25 또는 27에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 클라우딘 6에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 25 또는 27의 가변 중쇄 서열을 포함하는 클라우딘 6에 결합하는 결합 모듈의 결합 및/또는 기능적 활성을 보유한다. 또 다른 구현예에서, 클라우딘 6에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 25 또는 27의 가변 중쇄 서열을 포함하고, 중쇄 가변 서열에서 하나 이상의 보존적 아미노산 치환, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 또는 1-5개의 보존적 아미노산 치환을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환은 (Kabat의 넘버링 시스템에 기초하여) 서열번호 25 또는 27의 하나 이상의 프레임워크 영역 내에 속한다.
특정 구현예에서, 클라우딘 6에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 25 또는 27에 제시된 가변 영역과 적어도 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 서열 동일성을 갖는 가변 중쇄 서열을 포함하고, (Kabat의 넘버링 시스템에 기초하여) 프레임워크 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하며, 서열번호 25 또는 27에 제시된 가변 중쇄 서열 및 서열번호 26 또는 28에 제시된 가변 경쇄 서열을 포함하는 클라우딘 6에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈의 결합 및/또는 기능적 활성을 보유한다.
일부 구현예에서, 클라우딘 6에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 26 또는 28에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 클라우딘 6에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 26 또는 28의 가변 경쇄 서열을 포함하는 클라우딘 6에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈의 결합 및/또는 기능적 활성을 보유한다. 또 다른 구현예에서, 클라우딘 6에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 26 또는 28의 가변 경쇄 서열을 포함하고, 경쇄 가변 서열에서 하나 이상의 보존적 아미노산 치환, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 또는 1-5개의 보존적 아미노산 치환을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환은 (Kabat의 넘버링 시스템에 기초하여) 서열번호 26 또는 28의 하나 이상의 프레임워크 영역 내에 속한다.
특정 구현예에서, 클라우딘 6에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 26 또는 28에 제시된 가변 영역과 적어도 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 서열 동일성을 갖는 가변 경쇄 서열을 포함하고, (Kabat의 넘버링 시스템에 기초하여) 프레임워크 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하며, 서열번호 25 또는 27에 제시된 가변 중쇄 서열 및 서열번호 26 또는 28에 제시된 가변 경쇄 서열을 포함하는 항체 스캐폴드 모듈의 결합 및/또는 기능적 활성을 보유한다.
일부 구현예에서, 클라우딘 18.2에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 21에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 클라우딘 18.2에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 21의 가변 중쇄 서열을 포함하는 클라우딘 18.2에 결합하는 결합 모듈의 결합 및/또는 기능적 활성을 보유한다. 또 다른 구현예에서, 클라우딘 18.2에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 21의 가변 중쇄 서열을 포함하고, 중쇄 가변 서열에서 하나 이상의 보존적 아미노산 치환, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 또는 1-5개의 보존적 아미노산 치환을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환은 (Kabat의 넘버링 시스템에 기초하여) 서열번호 21의 하나 이상의 프레임워크 영역 내에 속한다.
특정 구현예에서, 클라우딘 18.2에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 21에 제시된 가변 영역과 적어도 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 서열 동일성을 갖는 가변 중쇄 서열을 포함하고, (Kabat의 넘버링 시스템에 기초하여) 프레임워크 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하며, 서열번호 21에 제시된 가변 중쇄 서열 및 서열번호 22에 제시된 가변 경쇄 서열을 포함하는 클라우딘 18.2에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈의 결합 및/또는 기능적 활성을 보유한다.
일부 구현예에서, 클라우딘 18.2에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 22에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 클라우딘 18.2에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 22의 가변 경쇄 서열을 포함하는 클라우딘 18.2에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈의 결합 및/또는 기능적 활성을 보유한다. 또 다른 구현예에서, 클라우딘 18.2에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 22의 가변 경쇄 서열을 포함하고, 경쇄 가변 서열에서 하나 이상의 보존적 아미노산 치환, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 또는 1-5개의 보존적 아미노산 치환을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환은 (Kabat의 넘버링 시스템에 기초하여) 서열번호 22의 하나 이상의 프레임워크 영역 내에 속한다.
특정 구현예에서, 클라우딘 18.2에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 22에 제시된 가변 영역과 적어도 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 서열 동일성을 갖는 가변 경쇄 서열을 포함하고, (Kabat의 넘버링 시스템에 기초하여) 프레임워크 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하며, 서열번호 21에 제시된 가변 중쇄 서열 및 서열번호 22에 제시된 가변 경쇄 서열을 포함하는 항체 스캐폴드 모듈의 결합 및/또는 기능적 활성을 보유한다.
일부 구현예에서, 넥틴-4에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 29 또는 31에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 넥틴-4에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 29 또는 31의 가변 중쇄 서열을 포함하는 넥틴-4에 결합하는 결합 모듈의 결합 및/또는 기능적 활성을 보유한다. 또 다른 구현예에서, 넥틴-4에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 29 또는 31의 가변 중쇄 서열을 포함하고, 중쇄 가변 서열에서 하나 이상의 보존적 아미노산 치환, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 또는 1-5개의 보존적 아미노산 치환을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환은 (Kabat의 넘버링 시스템에 기초하여) 서열번호 29 또는 31의 하나 이상의 프레임워크 영역 내에 속한다.
특정 구현예에서, 넥틴-4에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 29 또는 31에 제시된 가변 영역과 적어도 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 서열 동일성을 갖는 가변 중쇄 서열을 포함하고, (Kabat의 넘버링 시스템에 기초하여) 프레임워크 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하며, 서열번호 29 또는 31에 제시된 가변 중쇄 서열 및 서열번호 30 또는 32에 제시된 가변 경쇄 서열을 포함하는 넥틴-4에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈의 결합 및/또는 기능적 활성을 보유한다.
일부 구현예에서, 넥틴-4에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 30 또는 32에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 넥틴-4에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 30 또는 32의 가변 경쇄 서열을 포함하는 넥틴-4에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈의 결합 및/또는 기능적 활성을 보유한다. 또 다른 구현예에서, 넥틴-4에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 30 또는 32의 가변 경쇄 서열을 포함하고, 경쇄 가변 서열에서 하나 이상의 보존적 아미노산 치환, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 또는 1-5개의 보존적 아미노산 치환을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환은 (Kabat의 넘버링 시스템에 기초하여) 서열번호 30 또는 32의 하나 이상의 프레임워크 영역 내에 속한다.
특정 구현예에서, 넥틴-4에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 30 또는 32에 제시된 가변 영역과 적어도 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 서열 동일성을 갖는 가변 경쇄 서열을 포함하고, (Kabat의 넘버링 시스템에 기초하여) 프레임워크 영역 내에 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하며, 서열번호 29 또는 31에 제시된 가변 중쇄 서열 및 서열번호 30 또는 32에 제시된 가변 경쇄 서열을 포함하는 항체 스캐폴드 모듈의 결합 및/또는 기능적 활성을 보유한다.
일부 구현예에서, 이중특이체 결합 단백질은 다음을 포함한다: 서열번호 3 및 서열번호 2(1901 Ab2), 서열번호 4 및 서열번호 5(1901 Ab3), 서열번호 12 및 서열번호 9(1912 Ab3), 서열번호 13 및 서열번호 11(1912 Ab4), 서열번호 72 및 서열번호 9(1912 Ab5), 서열번호 14 및 서열번호 15(1925 Ab1), 서열번호 16 및 서열번호 17(1925 Ab2), 또는 서열번호 18 및 서열번호 15(1925 Ab3).
다른 구현예에서, 이중특이체 결합 단백질은 서열번호 3 및 서열번호 2(1901 Ab2)를 포함하고, CD137 및 클라우딘 18.2에 결합한다. 다른 구현예에서, 이중특이체 결합 단백질은 서열번호 4 및 서열번호 5(1901 Ab3)를 포함하고, CD137 및 클라우딘 18.2에 결합한다. 다른 구현예에서, 이중특이체 결합 단백질은 서열번호 12 및 서열번호 9(1912 Ab3)를 포함하고, CD137 및 클라우딘 6에 결합한다. 다른 구현예에서, 이중특이체 결합 단백질은 서열번호 13 및 서열번호 11(1912 Ab4)을 포함하고, CD137 및 클라우딘 6에 결합한다. 다른 구현예에서, 이중특이체 결합 단백질은 서열번호 72 및 서열번호 9(1912 Ab5)를 포함하고, CD137 및 클라우딘 6에 결합한다. 다른 구현예에서, 이중특이체 결합 단백질은 서열번호 14 및 서열번호 15(1925 Ab1)를 포함하고, CD137 및 넥틴-4에 결합한다. 다른 구현예에서, 이중특이체 결합 단백질은 서열번호 16 및 서열번호 17(1925 Ab2)을 포함하고, CD137 및 넥틴-4에 결합한다. 다른 구현예에서, 이중특이체 결합 단백질은 서열번호 18 및 서열번호 15(1925 Ab3)를 포함하고, CD137 및 넥틴-4에 결합한다.
일 구현예에서, CD137 및 클라우딘 18.2에 결합하는 이중특이체 결합 단백질은 다음을 포함한다:
i) 클라우딘 18.2에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈로서, 항체 스캐폴드 모듈은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 갖는 IgG이고, 여기에서 IgG는 N-말단 및 C-말단을 갖는 2개의 불변 사슬을 포함하는 Fc 영역을 포함하는, 항체 스캐폴드 모듈; 및
ii) CD137에 결합하는 2개의 제1 결합 모듈로서, 제1 결합 모듈은 scFv이고, 여기에서 scFv는 4x(G4S) 링커에 의해 연결된 VH 및 VL을 포함하고, 제1 결합 모듈 각각은 3x(G4S) 링커에 의해 Fc 불변 사슬의 C-말단에 별도로 부착되는, 2개의 제1 결합 모듈.
일부 구현예에서, 3x(G4S) 링커는 N-말단 및 C-말단을 가지며, 여기에서 3x(G4S) 링커의 N-말단은 2개의 Fc 불변 사슬의 C-말단에 부착되고, 3x(G4S) 링커의 C-말단은 제1 결합 모듈에서의 VH의 N-말단에 부착된다. scFv는 안정화될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈의 2개의 중쇄 둘 모두, 3x(G4S) 링커, 및 제1 결합 모듈은 서열번호 3에 제시된 것과 같은, N-말단으로부터 C-말단까지 아미노산 서열을 포함한다. 추가의 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은 각각 서열번호 2에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 2개의 경쇄를 포함한다.
일 구현예에서, CD137 및 클라우딘 18.2에 결합하는 이중특이체 결합 단백질은 다음을 포함한다:
i) 클라우딘 18.2에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈로서, 항체 스캐폴드 모듈은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 갖는 IgG이고, 여기에서 IgG는 N-말단 및 C-말단을 갖는 2개의 불변 사슬을 포함하는 Fc 영역을 포함하는, 항체 스캐폴드 모듈; 및
ii) CD137에 결합하는 2개의 제1 결합 모듈로서, 제1 결합 모듈은 scFv이고, 여기에서 scFv는 4x(G4S) 링커에 의해 연결된 VH 및 VL을 포함하고, 제1 결합 모듈 각각은 3x(G4S) 링커에 의해 경쇄의 C-말단에 별도로 부착되는, 2개의 제1 결합 모듈.
일부 구현예에서, 3x(G4S) 링커는 N-말단 및 C-말단을 가지며, 여기에서 3x(G4S) 링커의 N-말단은 2개의 경쇄의 C-말단에 부착되고, 3x(G4S) 링커의 C-말단은 제1 결합 모듈에서의 VH의 N-말단에 부착된다. scFv는 안정화될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈의 2개의 경쇄, 3x(G4S) 링커, 및 제1 결합 모듈은 서열번호 5에 제시된 것과 같은, N-말단으로부터 C-말단까지 아미노산 서열을 각각 별도로 포함한다. 추가의 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은 각각 서열번호 4에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄를 포함한다.
일 구현예에서, CD137 및 클라우딘 6에 결합하는 이중특이체 결합 단백질은 다음을 포함한다:
i) 클라우딘 6에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈로서, 항체 스캐폴드 모듈은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 갖는 IgG이고, 여기에서 IgG는 N-말단 및 C-말단을 갖는 2개의 불변 사슬을 포함하는 Fc 영역을 포함하는, 항체 스캐폴드 모듈; 및
ii) CD137에 결합하는 2개의 제1 결합 모듈로서, 제1 결합 모듈은 scFv이고, 여기에서 scFv는 4x(G4S) 링커에 의해 연결된 VH 및 VL을 포함하고, 제1 결합 모듈 각각은 3x(G4S) 링커에 의해 Fc 불변 사슬의 C-말단에 별도로 부착되는, 2개의 제1 결합 모듈.
일부 구현예에서, 3x(G4S) 링커는 N-말단 및 C-말단을 가지며, 여기에서 3x(G4S) 링커의 N-말단은 2개의 Fc 불변 사슬의 C-말단에 부착되고, 3x(G4S) 링커의 C-말단은 제1 결합 모듈에서의 VH의 N-말단에 부착된다. scFv는 안정화될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈의 2개의 중쇄, 3x(G4S) 링커, 및 제1 결합 모듈은 서열번호 12 또는 서열번호 72에 제시된 것과 같은, N-말단으로부터 C-말단까지 아미노산 서열을 각각 별도로 포함한다. 추가의 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은 각각 서열번호 9에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 2개의 경쇄를 포함한다.
일 구현예에서, CD137 및 클라우딘 6에 결합하는 이중특이체 결합 단백질은 다음을 포함한다:
i) 클라우딘 6에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈로서, 항체 스캐폴드 모듈은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 갖는 IgG이고, 여기에서 IgG는 N-말단 및 C-말단을 갖는 2개의 불변 사슬을 포함하는 Fc 영역을 포함하는, 항체 스캐폴드 모듈; 및
ii) CD137에 결합하는 2개의 제1 결합 모듈로서, 제1 결합 모듈은 scFv이고, 여기에서 scFv는 4x(G4S) 링커에 의해 연결된 VH 및 VL을 포함하고, 제1 결합 모듈 각각은 3x(G4S) 링커에 의해 경쇄의 C-말단에 별도로 부착되는, 2개의 제1 결합 모듈.
일부 구현예에서, 3x(G4S) 링커는 N-말단 및 C-말단을 가지며, 여기에서 3x(G4S) 링커의 N-말단은 2개의 경쇄의 C-말단에 부착되고, 3x(G4S) 링커의 C-말단은 제1 결합 모듈에서의 VH의 N-말단에 부착된다. scFv는 안정화될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈의 2개의 경쇄, 3x(G4S) 링커, 및 제1 결합 모듈은 서열번호 11에 제시된 것과 같은, N-말단으로부터 C-말단까지 아미노산 서열을 각각 별도로 포함한다. 추가의 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은 각각 서열번호 13에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄를 포함한다.
일 구현예에서, CD137 및 넥틴-4에 결합하는 이중특이체 결합 단백질은 다음을 포함한다:
i) 넥틴-4에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈로서, 항체 스캐폴드 모듈은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 갖는 IgG이고, 여기에서 IgG는 N-말단 및 C-말단을 갖는 2개의 불변 사슬을 포함하는 Fc 영역을 포함하는, 항체 스캐폴드 모듈; 및
ii) CD137에 결합하는 2개의 제1 결합 모듈로서, 제1 결합 모듈은 scFv이고, 여기에서 scFv는 4x(G4S) 링커에 의해 연결된 VH 및 VL을 포함하고, 제1 결합 모듈 각각은 3x(G4S) 링커에 의해 Fc 불변 사슬의 C-말단에 별도로 부착되는, 2개의 제1 결합 모듈.
일부 구현예에서, 3x(G4S) 링커는 N-말단 및 C-말단을 가지며, 여기에서 3x(G4S) 링커의 N-말단은 2개의 Fc 불변 사슬의 C-말단에 부착되고, 3x(G4S) 링커의 C-말단은 제1 결합 모듈에서의 VH의 N-말단에 부착된다. scFv는 안정화될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈의 2개의 중쇄, 3x(G4S) 링커, 및 제1 결합 모듈은 서열번호 14에 제시된 것과 같은, N-말단으로부터 C-말단까지 아미노산 서열을 각각 별도로 포함한다. 다른 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은 각각 서열번호 15에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 2개의 경쇄를 포함한다.
일 구현예에서, CD137 및 넥틴-4에 결합하는 이중특이체 결합 단백질은 다음을 포함한다:
i) 넥틴-4에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈로서, 항체 스캐폴드 모듈은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 갖는 IgG이고, 여기에서 IgG는 N-말단 및 C-말단을 갖는 2개의 불변 사슬을 포함하는 Fc 영역을 포함하는, 항체 스캐폴드 모듈; 및
ii) CD137에 결합하는 2개의 제1 결합 모듈로서, 제1 결합 모듈은 scFv이고, 여기에서 scFv는 4x(G4S) 링커에 의해 연결된 VH 및 VL을 포함하고, 제1 결합 모듈 각각은 3x(G4S) 링커에 의해 경쇄의 C-말단에 별도로 부착되는, 2개의 제1 결합 모듈.
일부 구현예에서, 3x(G4S) 링커는 N-말단 및 C-말단을 가지며, 여기에서 3x(G4S) 링커의 N-말단은 2개의 경쇄의 C-말단에 부착되고, 3x(G4S) 링커의 C-말단은 제1 결합 모듈에서의 VH의 N-말단에 부착된다. scFv는 안정화될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈의 2개의 경쇄, 3x(G4S) 링커, 및 제1 결합 모듈은 서열번호 17에 제시된 것과 같은, N-말단으로부터 C-말단까지 아미노산 서열을 각각 별도로 포함한다. 추가의 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은 각각 서열번호 16에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄를 포함한다.
일 구현예에서, CD137 및 넥틴-4에 결합하는 이중특이체 결합 단백질은 다음을 포함한다:
i) 넥틴-4에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈로서, 항체 스캐폴드 모듈은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 갖는 IgG이고, 여기에서 IgG는 N-말단 및 C-말단을 갖는 2개의 불변 사슬을 포함하는 Fc 영역을 포함하는, 항체 스캐폴드 모듈; 및
ii) CD137에 결합하는 2개의 제1 결합 모듈로서, 제1 결합 모듈은 scFv이고, 여기에서 scFv는 4x(G4S) 링커에 의해 연결된 VH 및 VL을 포함하고, 제1 결합 모듈 각각은 4x(G4S) 링커에 의해 2개의 중쇄의 N-말단에 별도로 부착되는, 2개의 제1 결합 모듈.
일부 구현예에서, 4x(G4S) 링커는 N-말단 및 C-말단을 가지며, 여기에서 4x(G4S) 링커의 C-말단은 2개의 중쇄의 N-말단에 부착되고, 4x(G4S) 링커의 N-말단은 제1 결합 모듈에서의 VL의 C-말단에 부착된다. scFv는 안정화될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈, 4x(G4S) 링커, 및 항체 스캐폴드 모듈의 2개의 중쇄는 서열번호 18에 제시된 것과 같은, N-말단으로부터 C-말단까지 아미노산 서열을 각각 별도로 포함한다. 추가의 구현예에서, 항체 스캐폴드 모듈은 각각 서열번호 15에 제시된 것과 같은, N-말단으로부터 C-말단까지 아미노산 서열을 갖는 2개의 경쇄를 포함한다.
본 개시의 이중특이체 결합 단백질의 치료적 성능은, 예를 들어, 방사성 동위원소, 약물, 또는 세포독소와 같은 세포독성 효과기 제제를 포함하는 세포독성 약물 또는 제제에 대한 접합에 의해 향상될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 이중특이체 결합 단백질은 단독으로 또는 조합되어, 다음의 구조적 및 기능적 특성 중 하나 이상을 나타낸다:
(a) 인간 CD137 및 종양 연관 항원(TAA)에 결합할 수 있음;
(b) 시노몰구스 CD137 및 종양 연관 항원(TAA) 중 하나와 교차 반응함;
(c) CD137에 대한 인간 CD137L의 결합을 파괴함(예를 들어, 감소 또는 방지함);
(d) CD137에 대해 신속 온(fast on) 또는 신속 오프(fast off) 특성을 나타냄;
(e) CD137 신호전달에 대한 TAA 의존성 작용 활성을 보유함;
(f) TAA 의존성 방식으로 T 세포를 활성화시킴; 및
(g) CD8 T 세포를 활성화시킴으로써 TAA 발현 세포를 사멸시킴.
일부 구현예에서, 이중특이체 결합 단백질은 단독으로 또는 조합되어, 다음의 구조적 및 기능적 특성 중 하나 이상을 나타내는 클라우딘-6/CD137 BsAb이다:
(a) 클라우딘 6 결합에 대한 2가성;
(b) 신속-온/신속-오프 CD137 결합 동역학;
(c) 종양에서 림프구 침윤을 향상시킴;
(d) 종양에서 T 세포 증식/활성화를 촉진함;
(e) 종양 중 고갈로부터 T 세포를 보호함;
(f) 종양 경험 T 세포로부터 T 세포 기억 형성을 촉진함;
(g) 종양 미세환경(TME)에서 Treg/CD8 비율을 감소시킴; 및
(h) TME에서 M2-유사 대식세포를 감소시킴.
스캐폴드 또는 결합 모듈로서의 용도를 위한 단클론 항체를 생산하는 방법
CD137 및 TAA에 결합하는 이중특이체 결합 단백질은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 수용자는 가용성 재조합 인간 CD137 단백질, 또는 이의 담체 단백질과 접합된 CD137 펩티드의 단편으로 면역화될 수 있다. 유사하게, 수용자는 가용성 재조합 TAA 단백질, 또는 이의 담체 단백질과 접합된 종양 연관 항원 펩티드의 단편으로 면역화될 수 있다. 임의의 적절한 면역화 방법이 사용될 수 있다. 이러한 방법은 보조제, 다른 면역 자극제, 반복 부스터 면역화, 및 하나 이상의 면역화 경로의 사용을 포함할 수 있다. 항체로부터 수득된 CDR 또는 VH/VL은 항체 스캐폴드 모듈 및/또는 제1 결합 모듈에 사용될 수 있다.
본원에 개시된 조성물 및 방법의 비-인간 또는 인간 항-CD137 및/또는 TAA 항체의 생성을 위한 면역원으로서, 인간 CD137 또는 TAA의 임의의 적절한 공급원이 사용될 수 있다.
생물학적으로 활성인 항-CD137 또는 항-TAA 항체의 식별을 위한 면역 반응을 유도하기 위해 상이한 형태의 CD137 및/또는 TAA가 사용될 수 있다. 따라서, CD137 항원 또는 TAA를 유도하는 것은 단일 에피토프, 다수의 에피토프, 또는 전체 단백질 단독이거나 하나 이상의 면역원성 강화제와의 조합일 수 있다. 일부 양태에서, 유도 항원은 단리된 가용성 전장 단백질, 또는 전장 서열 미만을 포함하는 가용성 단백질이다(예를 들어, CD137 또는 TAA, ECD1 및/또는 ECD2 단독 또는 이의 조합의 세포외 도메인/루프를 포함하는 펩티드로 면역화함). 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "부분"은 관심 항원의 면역원성 에피토프를 구성하기 위한, 적절한, 아미노산 또는 핵산의 최소 수를 지칭한다. 관심 세포의 형질전환에 적합한 임의의 유전자 벡터가 사용될 수 있으며, 이는 아데노바이러스 벡터, 플라스미드, 및 양이온성 지질과 같은 비-바이러스 벡터를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
마우스, 설치류, 영장류, 인간 등과 같은 다양한 포유류 숙주로부터 단클론 항체(mAb)를 제조하는 것이 바람직하다. 이러한 단클론 항체를 제조하기 위한 기술에 대한 설명은, 예를 들어, Sties 등(편집) 문헌[ BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (제4판) Lance Medical Publication, Los Altos, CA], 및 해당 문헌에 인용된 참고 문헌; Harlow 및 Lane 등의 문헌[(1988) ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL CSH Press; Goding (1986) MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (제2판) Academic Press, New York, NY]에서 찾을 수 있다. 일반적으로, 원하는 항원으로 면역화된 동물로부터의 비장 세포는 통상적으로 골수종 세포와의 융합에 의해 불멸화된다. Kohler 및 Milstein의 문헌[(196) Eur. J. Immunol. 6:511-519]을 참조한다. 불멸화의 대안적인 방법은 엡스타인 바 바이러스, 종양유전자, 또는 레트로바이러스, 또는 당업계에 공지된 다른 방법을 이용한 형질전환을 포함한다. 예를 들어, Doyle 등(편집)의 문헌(1994 및 주기적 보완)[CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES, John Wiley and Sons, New York, NY]을 참조한다. 단일 불멸화 세포로부터 발생하는 콜로니는 항원에 대한 원하는 특이성 및 친화도의 항체의 생산에 대해 스크리닝되고, 이러한 세포에 의해 생산된 단클론 항체의 수율은 척추동물 숙주의 복강 내로의 주입을 포함하는 다양한 기술에 의해 향상될 수 있다. 대안적으로, 예를 들어, Huse 등의 문헌[(1989) Science 246: 1275-1281]에 개략적으로 기술된 일반 프로토콜에 따라, 인간 B 세포로부터 DNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 DNA 서열을 단리할 수 있다. 따라서, 항체는 당업자에게 익숙한 다양한 기술에 의해 수득될 수 있다.
다른 적절한 기술은 파지, 효모, 바이러스 또는 유사한 벡터에서의 항체의 라이브러리의 선택을 포함한다. 예를 들어, Huse 등의 문헌(전술함); 및 Ward 등의 문헌[(1989) Nature 341:544-546]을 참조한다. 본원에 개시된 폴리펩티드 및 항체는 키메라 또는 인간화 항체를 포함하여, 변형시키거나 변형시키지 않고 사용될 수 있다. 종종, 폴리펩티드 및 항체는 검출가능한 신호를 제공하는 물질과 공유적으로 또는 비공유적으로 결합함으로써 표지된다. 매우 다양한 표지 및 접합 기술이 공지되어 있으며 과학 및 특허 문헌 모두에서 광범위하게 보고되어 있다. 적절한 표지는 방사성 핵종, 효소, 기질, 보조인자, 억제제, 형광 모이어티, 화학발광 모이어티, 자성 입자 등을 포함한다. 이러한 표지의 사용을 교시하는 특허는 미국 특허 제3,817,837호; 제3,850,752호; 제3,9396,345호; 제4,277,437호; 제4,275,149호; 및 제4,366,241호를 포함한다. 또한, 재조합 면역글로불린은, 유전자 이식 마우스에서 생산되거나(Cabilly의 미국 특허 제4,816,567호; 및 Queen 등의 문헌[(1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86: 10029-10023] 참조), 이로부터 만들어질 수 있다(Nils Lonberg 등의 문헌[(1994), Nature 368:856-859]; 및 Mendez 등의 문헌[(1997) Nature Genetics 15: 146-156]; 유전자이식 동물 및 이의 용도(TRANSGENIC ANIMALS AND METHODS OF USE)(WO 2012/62118), Medarex, Trianni, Abgenix, Ablexis, OminiAb, Harbour 및 다른 기술 참조).
일부 구현예에서, 생산된 항체가 CD137 또는 TAA에 결합하는 능력은 표면 플라스몬 공명(SPR), FoteBio(BLI), Gator(BLI), ELISA, 웨스턴 블롯, 면역형광, 유세포 계측 분석(FACS), 또는 내재화 검정과 같은 표준 결합 검정을 사용하여 평가될 수 있다.
하이브로도마 또는 숙주 세포로부터 제조된 항체 조성물은, 예를 들어 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 및 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있으며, 여기에서 친화도 크로마토그래피는 일반적인 정제 기술이다. 친화도 리간드로서의 단백질 A의 적합성은 항체에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 따라 달라진다. 단백질 A는 인간 감마1, 감마2, 또는 감마4 중쇄에 기초한 항체를 정제하는 데 사용될 수 있다(예를 들어, Lindmark 등의 문헌[1983 J. Immunol. Meth . 62:1-13] 참조). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 감마3에 대해 권장된다(예를 들어, Guss 등의 문헌[1986 EMBO J. 5:1567-1575] 참조). 친화도 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 통상적으로 아가로오스이지만, 다른 매트릭스 또한 이용 가능하다. 제어된 기공 유리 또는 폴리(스티렌디비닐) 벤젠과 같은 기계적으로 안정적인 매트릭스는 아가로오스로 달성될 수 있는 것보다 더 빠른 유량 및 더 짧은 처리 시간을 허용한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABXTM 수지(J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)가 정제에 유용하다. 회수될 항체에 따라, 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예컨대 이온-교환 컬럼 상의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 상의 헤파린 SEPHAROSETM 크로마토그래피 상의 크로마토그래피(예컨대 폴리아스파르트산 컬럼), 크로마토그래피포커싱, SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전이 또한 이용 가능하다.
임의의 예비 정제 단계(들) 후, 관심 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물은 일반적으로 낮은 염 농도(예를 들어, 약 0-0.25 M 염)에서 수행되는, 약 2.5-4.5의 pH에서 용리 완충액을 사용하는 저 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피를 거칠 수 있다.
폴리뉴클레오티드, 벡터, 및 숙주 세포
다른 구현예는, 본원에 개시된 바와 같은 이중특이체 결합 단백질을 암호화하는 서열(들)을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포, 및 이중특이체 결합 단백질의 생산을 위한 재조합 기술을 포함한다. 단리된 폴리뉴클레오티드는 스캐폴드 모듈 및/또는 제1 결합 모듈과 같은 이의 성분을 포함하는, 임의의 원하는 형태의 이중특이체 결합 단백질을 암호화할 수 있다.
일 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 서열은, 다음으로부터 선택되는 상보성 결정 영역의 세트(CDR1, CDR2 및 CDR3)를 갖는 VH 및 VL의 조합을 포함하는 제1 결합 모듈을 암호화한다: VH: CDR1: 서열번호 39, CDR2: 서열번호 40, CDR3: 서열번호 41; 및 VL: CDR1: 서열번호 42, CDR2: 서열번호 43, CDR3: 서열번호 44를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 이중특이체 결합 단백질.
일 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 서열은 클라우딘 6에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈을 암호화하며, 다음으로부터 선택되는 상보성 결정 영역의 세트(CDR1, CDR2 및 CDR3)를 갖는 VH 및 VL의 조합을 포함한다: VH: CDR1: 서열번호 45, CDR2: 서열번호 46, CDR3: 서열번호 47; 및 VL; CDR1: 서열번호 48, CDR2: 서열번호 49, CDR3: 서열번호 50.
일 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 서열은 클라우딘 6에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈을 암호화하며, 다음으로부터 선택되는 상보성 결정 영역의 세트(CDR1, CDR2 및 CDR3)를 갖는 VH 및 VL의 조합을 포함한다: VH: CDR1: 서열번호 51, CDR2: 서열번호 52, CDR3: 서열번호 53; 및 VL: CDR1: 서열번호 54, CDR2: 서열번호 55, CDR3: 서열번호 56.
일 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 서열은 클라우딘 18.2에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈을 암호화하며, 다음으로부터 선택되는 상보성 결정 영역의 세트(CDR1, CDR2 및 CDR3)를 갖는 VH 및 VL의 조합을 포함한다: VH: CDR1: 서열번호 33, CDR2: 서열번호 34, CDR3: 서열번호 35; 및 VL: CDR1: 서열번호 36, CDR2: 서열번호 37, CDR3: 서열번호 38.
일 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 서열은 넥틴-4에 결합하는 항체 스캐폴드 모듈을 암호화하며, 다음으로부터 선택되는 상보성 결정 영역의 세트(CDR1, CDR2 및 CDR3)를 갖는 VH 및 VL의 조합을 포함한다: VH: CDR1: 서열번호 57, CDR2: 서열번호 58, CDR3: 서열번호 59; 및 VL: CDR1: 서열번호 60, CDR2: 서열번호 61, CDR3: 서열번호 62.
다른 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 29 또는 서열번호 31에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 VH를 포함하는 항체 스캐폴드 모듈을 암호화한다. 다른 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 30 또는 서열번호 32에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 VL을 포함하는 항체 스캐폴드 모듈을 암호화한다. 또 다른 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 29에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 VH; 및 서열번호 30에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 VL을 포함하는 항체 스캐폴드 모듈을 암호화한다. 또 다른 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 31에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 VH; 및 서열번호 32에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 VL을 포함하는 항체 스캐폴드 모듈을 암호화한다.
다른 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 서열은 다음의 조합으로부터 선택되는 한 쌍의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열을 포함하는 항체 스캐폴드 모듈을 암호화한다:
i) 서열번호 21과 90%, 95%, 또는 99% 동일한 가변 중쇄 서열 및 서열번호 22와 90%, 95%, 또는 99% 동일한 가변 경쇄 서열; 및
ii) 서열번호 23과 90%, 95%, 또는 99% 동일한 가변 중쇄 서열 및 서열번호 24와 90%, 95%, 또는 99% 동일한 가변 경쇄 서열;
iii) 서열번호 25와 90%, 95%, 또는 99% 동일한 가변 중쇄 서열 및 서열번호 26과 90%, 95%, 또는 99% 동일한 가변 경쇄 서열;
iv) 서열번호 27과 90%, 95%, 또는 99% 동일한 가변 중쇄 서열 및 서열번호 28과 90%, 95%, 또는 99% 동일한 가변 경쇄 서열;
v) 서열번호 29와 90%, 95%, 또는 99% 동일한 가변 중쇄 서열 및 서열번호 30과 90%, 95%, 또는 99% 동일한 가변 경쇄 서열;
vi) 서열번호 31과 90%, 95%, 또는 99% 동일한 가변 중쇄 서열 및 서열번호 32와 90%, 95%, 또는 99% 동일한 가변 경쇄 서열.
일부 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 서열은 다음을 포함하는 이중특이체 결합 단백질을 암호화한다: 서열번호 3 및 서열번호 2(1901 Ab2), 서열번호 4 및 서열번호 5(1901 Ab3), 서열번호 12 및 서열번호 9(1912 Ab3), 서열번호 13 및 서열번호 11(1912 Ab4), 서열번호 72 및 서열번호 9(1912 Ab5), 서열번호 14 및 서열번호 15(1925 Ab1), 서열번호 16 및 서열번호 17(1925 Ab2), 또는 서열번호 18 및 서열번호 15(1925 Ab3).
다른 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 3 및/또는 서열번호 2(1901 Ab2)를 포함하고, CD137 및 클라우딘 18.2에 결합하는 이중특이체 결합 단백질을 암호화한다. 다른 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 4 및/또는 서열번호 5(1901 Ab3)를 포함하고, CD137 및 클라우딘 18.2에 결합하는 이중특이체 결합 단백질을 암호화한다. 다른 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 12 및/또는 서열번호 9(1912 Ab3)를 포함하고, CD137 및 클라우딘 6에 결합하는 이중특이체 결합 단백질을 암호화한다. 다른 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 13 및/또는 서열번호 11(1912 Ab4)를 포함하고, CD137 및 클라우딘 6에 결합하는 이중특이체 결합 단백질을 암호화한다. 다른 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 72 및/또는 서열번호 9(1912 Ab5)를 포함하고, CD137 및 클라우딘 6에 결합하는 이중특이체 결합 단백질을 암호화한다. 다른 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 14 및/또는 서열번호 15(1925 Ab1)를 포함하고, CD137 및 넥틴-4에 결합하는 이중특이체 결합 단백질을 암호화한다. 다른 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 16 및/또는 서열번호 17(1925 Ab2)을 포함하고, CD137 및 넥틴-4에 결합하는 이중특이체 결합 단백질을 암호화한다. 다른 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 18 및/또는 서열번호 15(1925 Ab3)를 포함하고, CD137 및 넥틴-4에 결합하는 이중특이체 결합 단백질을 암호화한다.
또한, 본 개시의 이중특이체 결합 단백질을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열(들)로 제시되는 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일 부분(예를 들어, 가변 영역을 암호화하는 부분)에 대해, 본원에서 정의된 바와 같은, 낮은, 중간, 및 높은 엄격성 조건 하에서 혼성화되는 핵산이 포함된다. 혼성화 핵산의 혼성화 부분은 일반적으로 적어도 15개(예를 들어, 20, 25, 30 또는 50개) 뉴클레오티드 길이이다. 혼성화 핵산의 혼성화 부분은 이중특이체 결합 단백질(예를 들어, 항체 스캐폴드 모듈 및/또는 제1 결합 모듈의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역), 또는 이의 보체를 암호화하는 핵산의 일 부분 또는 전부의 서열과 적어도 80%, 예를 들어, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일하다. 본원에 기술된 유형의 혼성화 핵산은, 예를 들어 클로닝 프로브, 프라이머, 예를 들어 PCR 프라이머, 또는 진단 프로브로서 사용될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 이중특이체 결합 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드(들)는 당업계에 공지된 바와 같은 하나 이상의 조절 또는 조절 서열에 융합될 수 있으며, 당업계에 공지된 바와 같은 적절한 발현 벡터 또는 세포에 함유될 수 있다. 항체 스캐폴드 모듈의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 분자 각각은 인간 불변 도메인과 같은 불변 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 독립적으로 융합되어, 항체 스캐폴드 모듈을 형성할 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드 또는 이의 부분은 함께 융합되어, 제1 결합 모듈의 생산을 위한 템플릿을 제공할 수 있다.
재조합 생산을 위해, 본원에 개시된 이중특이체 결합 단백질(예를 들어, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄를 포함하는 이의 항체 스캐폴드 모듈 및 제1 결합 모듈)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 클로닝(DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제 가능한 벡터 내에 삽입된다. 이중특이체 결합 단백질을 발현시키기 위한 많은 적절한 벡터가 이용 가능하다. 벡터 성분은 일반적으로 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
이중특이체 결합 단백질(예를 들어, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄를 포함하는 이의 항체 스캐폴드 모듈 및 제1 결합 모듈)은 또한 융합 폴리펩티드로서 생산될 수 있으며, 여기에서 이중특이체 결합 단백질은 이종 폴리펩티드, 예컨대 신호 서열 또는 성숙한 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노 종결부에서의 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드와 융합된다. 선택된 이종 신호 서열은 일반적으로 숙주 세포에 의해 인식되고 처리되는(즉, 신호 펩티다아제에 의해 절단되는) 것이다. 이중특이체 결합 단백질 신호서열을 인식하지 않고 처리하지 않는 원핵 숙주 세포의 경우, 신호서열은 원핵 신호 서열로 치환될 수 있다. 신호 서열은, 예를 들어 알칼리 인산분해효소, 페니실리나아제, 지질단백질, 열안정 장독소 II 리더 등일 수 있다. 효모 분비의 경우, 천연 신호 서열은, 예를 들어 효모 인버타아제 알파 인자(사카로마이세스(Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) α 인자 리더 포함), 산성 인산분해효소, C. 알비칸스(C. albicans) 글루코아밀라아제, 또는 WO 90/13646에 기술된 신호로부터 수득된 리더 서열로 치환될 수 있다. 포유류 세포에서, 포유류 신호 서열뿐만 아니라 바이러스 분비 리더, 예를 들어 단순 포진 gD 신호가 사용될 수 있다. 이러한 전구체 영역에 대한 DNA는 판독 프레임에서 이중특이체 결합 단백질(예를 들어, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄를 포함하는 이의 항체 스캐폴드 모듈 및 제1 결합 모듈)을 암호화하는 DNA에 결찰된다.
발현 및 클로닝 벡터는 벡터가 하나 이상의 선택된 숙주 세포에서 복제할 수 있게 하는 핵산 서열을 함유한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서, 이러한 서열은 벡터로 하여금 숙주 염색체 DNA와 독립적으로 복제할 수 있게 하는 서열이며, 복제 기점 또는 자율 복제 서열을 포함한다. 이러한 서열은 다양한 박테리아, 효모 및 바이러스에 대해 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람 음성 박테리아, 즉 2-u에 적합하다. 플라스미드 기점은 효모에 적합하며, 다양한 바이러스 기점(SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV, 및 BPV)은 포유류 세포에서의 클로닝 벡터에 유용하다. 대체적으로, 복제 성분의 기점은 포유류 발현 벡터에 필요하지 않다(일반적으로 SV40 기점은 초기 프로모터를 함유하기 때문에 사용될 수 있음).
발현 및 클로닝 벡터는 발현의 식별을 용이하게 하기 위해 선택성 마커를 암호화하는 유전자를 함유할 수 있다. 일반적인 선별성 표지 유전자는 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하는 단백질을 암호화하거나, 대안적으로, 보체 영양요구성 결핍이거나, 다른 대안에서, 복합체 배지에 존재하지 않는 특정 영양소, 예를 들어, 바실루스(Bacilli)에 대한 D-알라닌 라세미화효소를 암호화하는 유전자를 공급한다.
또한, 이중특이체 결합 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포가 본원에 제공된다. 본원에 개시된 바와 같은 이중특이체 결합 단백질을 생산하는 데 사용되는 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. Ham's F10(Sigma), Minimal Essential Medium((MEM), Sigma), RPMI-1640(Sigma), FreeStyle TM (Gibco) 및 Dulbecco's Modified Eagle's Medium((DMEM), Sigma)과 같은 상업적으로 이용 가능한 배지가 숙주 세포를 배양하는 데 적합하다. 이들 또는 다른 배지 중 어느 하나는 필요에 따라, 호르몬 및/또는 다른 성장 인자(예컨대 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염(예컨대 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 및 인산염), 완충액(예컨대 HEPES), 뉴클레오티드(예컨대 아데노신 및 티미딘), 항생제(예컨대 겐타마이신), 미량 원소(예컨대, 일반적으로 마이크로몰 또는 더 낮은 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물), 및 포도당 또는 동등한 에너지 공급원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충제는 또한 당업자에게 공지된 적절한 농도로 포함될 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현에 대해 선택된 세포에 대해 종래에 사용된 조건들을 포함하며, 이는 당업자에게 명백할 것이다.
비치료적 용도
본원에 기술된 이중특이체 결합 단백질은 친화도 정제제로서 유용하다. 이러한 프로세스에서, 이중특이체 결합 단백질은 당업계에 공지된 방법을 사용하여, 단백질 A 수지와 같은 고상 상에 고정된다. 고정된 이중특이체 결합 단백질은 정제될 CD137 및 TAA 단백질(또는 이의 단편)을 함유하는 샘플과 접촉하고, 그 후 지지체는, 고정된 이중특이체 결합 단백질에 결합된, CD137 및 TAA 단백질을 제외한, 샘플 내의 실질적으로 모든 물질을 제거할 적절한 용매로 세척된다. 마지막으로, 지지체는 이중특이체 결합 단백질로부터 CD137 및/또는 TAA 단백질을 방출할 다른 적절한 용매로 세척된다.
본원에 개시된 이중특이체 결합 단백질은 또한 CD137 및/또는 TAA 단백질을 검출 및/또는 정량화하기 위한 진단 검정에 유용하며, 예를 들어, 특정 세포, 조직, 또는 혈청에서 CD137 및/또는 TAA 발현을 검출하는 데 유용하다. 이중특이체 결합 단백질은, 예를 들어, 주어진 치료 및/또는 예방 요법의 효능을 결정하기 위한 임상 시험 절차의 일부로서 질환의 발생 또는 진행을 모니터링하기 위해 진단적으로 사용될 수 있다. 검출은 이중특이체 결합 단백질을 검출가능한 물질에 커플링시킴으로써 용이해질 수 있다. 검출가능한 물질의 예는 다양한 효소, 인공 기, 형광 물질, 발광 물질, 생물발광 물질, 방사성 물질, 다양한 양전자 방출 단층 촬영을 사용하는 양전자 방출 금속, 및 비방사성 상자성 금속 이온을 포함한다. 예를 들어, 본 개시에 따른, 진단용으로서의 용도를 위해 이중특이체 결합 단백질에 접합될 수 있는 금속 이온에 대해서는 미국 특허 제4,741,900을 참조한다.
이중특이체 결합 단백질은 CD137 및/또는 TAA-연관 장애(예를 들어, CD137 및/또는 TAA의 비정상적인 발현을 특징으로 하는 장애)를 진단하거나, 대상체에서 CD137 및/또는 TAA-연관 장애의 발생 위험이 증가되는지의 여부를 결정하기 위한 방법에 사용될 수 있다. 이러한 방법은 대상체로부터의 생물학적 샘플을 본원에 개시된 이중특이체 결합 단백질과 접촉시키는 단계, 및 CD137 및/또는 TAA에 대한 분자의 결합을 검출하는 단계를 포함한다. "생물학적 샘플"은 CD137 및/또는 TAA를 잠재적으로 발현하는 세포의 개체, 세포주, 조직 배양물, 또는 다른 공급원으로부터 수득된 임의의 생물학적 샘플을 의도한다. 포유동물로부터 조직 생검 및 체액을 수득하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 방법은 환자 샘플 중의 CD137 및/또는 TAA의 수준을, 대조군 샘플(예를 들어, CD137 및/또는 TAA-연관 장애를 갖지 않는 대상체)과 비교하여, 해당 환자가 CD137 및/또는 TAA-연관 장애를 갖거나 CD137 및/또는 TAA-연관 장애가 발생할 위험이 있는지의 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 진단 목적으로 이중특이체 결합 단백질을 검출가능한 모이어티로 표지하는 것이 유리할 것이다. 방사성 동위원소, 형광 표지, 효소 기질 표지 등을 포함하는 다수의 검출가능한 표지가 이용 가능하다. 표지는 다양한 공지된 기술을 사용하여 이중특이체 결합 단백질과 간접적으로 접합될 수 있다. 예를 들어, 이중특이체 결합 단백질은 비오틴과 접합될 수 있으며, 전술한 3개의 넓은 카테고리의 표지 중 어느 하나는 아비딘과 접합될 수 있거나, 그 반대일 수도 있다. 비오틴은 아비딘에 선택적으로 결합하며, 이에 따라 해당 표지는 이러한 간접적인 방식으로 이중특이체 결합 단백질에 접합될 수 있다. 대안적으로, 이중특이체 결합 단백질과 표지의 간접 접합을 이루기 위해, 이중특이체 결합 단백질은 소형 합텐(예컨대, 디곡신)에 접합될 수 있으며, 전술한 상이한 유형의 표지 중 하나는 항-합텐 항체(예를 들어, 항-디곡신 항체)에 접합된다. 이에 따라, 이중특이체 결합 단백질과 표지의 간접 접합이 이루어질 수 있다.
예시적인 방사성 동위원소 표지는 35S, 14C, 125I, 3H, 및 131I를 포함한다. 이중특이체 결합 단백질은, 예를 들어 Coligen 등의 문헌(편집)[Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, 1991, Coligen 등 편집, Wiley-Interscience, New York, N.Y., Pubs]에 기술된 기술을 사용하여, 방사성 동위원소로 표지될 수 있다. 방사성은, 예를 들어 섬광 계수를 통해 측정될 수 있다.
예시적인 형광 표지는 희토류 킬레이트(유로피움 킬레이트) 또는 플루오레세인 및이의 유도체로부터 유래된 표지를 포함하며, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 리사민, 피코에리트린, 및 텍사스 레드가 이용 가능하다. 형광 표지는, 예를 들어, Current Protocols in Immunology에 개시된 것과 같은, 공지된 기술을 통해 이중특이체 결합 단백질에 접합될 수 있다. 형광은 형광계를 사용하여 정량화될 수 있다.
당업계에는 양호하게 특성화된 다양한 효소 기질 표지가 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,275,149호 참조). 효소는 일반적으로 다양한 기술을 사용하여 측정될 수 있는 발색 기질의 화학적 변경을 촉매한다. 예를 들어, 변경은 분광광도계로 측정될 수 있는 기질의 색상 변화일 수 있다. 대안적으로, 효소는 기질의 형광 또는 화학발광을 변경시킬 수 있다. 형광의 변화를 정량화하기 위한 기술은 전술한 바와 같다. 화학발광 기질은 화학 반응에 의해 전자적으로 여기된 다음, 화학발광계를 사용하여 측정될 수 있는 빛을 방출할 수 있거나, 예를 들어, 형광 수용기에 에너지를 제공할 수 있다.
효소 표지의 예는 반딧불 루시페라아제 및 박테리아 루시페라아제와 같은 루시퍼라아제(미국 특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 말레이트 탈수소효소, 우레아제, 퍼옥시다아제, 예컨대 서양고추냉이 퍼옥시다아제(HRPO), 알칼리 인산분해효소, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 리소자임, 당류 산화효소(예컨대, 포도당 산화효소, 갈락토오스 산화효소, 및 포도당-6-인산염 탈수소효소), 헤테로시디드 산화효소(예컨대, 우리카제 및 잔틴 산화효소), 락토퍼옥시다아제, 마이크로퍼옥시다아제 등을 포함한다. 효소를 단백질성 분자에 접합하기 위한 기술은, 예를 들어, O'Sullivan 등의 문헌[1981, Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for the Use in Enzyme Immunoassay, Methods in Enzym.(J. Langone 및 H. Van Vunakis, 편집), Academic Press, N.Y., 73: 147-166]에 기술되어 있다.
효소-기질 조합의 예는, 예를 들어: 기질로서 과산화수소를 갖는 서양고추냉이 퍼옥시다아제(HRPO)(여기에서 과산화수소는 오토페닐렌 디아민(OPD) 또는 3,3,5,5-테트라메틸 벤지딘 염산염(TMB)과 같은 염료 전구체를 산화시킴); 발색 기질로서 파라-니트로페닐 인산염을 갖는 알칼리 인산분해효소(AP); 및 p-니트로페닐-β-D-갈락토시다아제 또는 형광생성 기질 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토시다아제와 같은 발색 기질를 갖는 β-D-갈락토시다아제(β-D-Gal)를 포함한다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 이중특이체 결합 단백질은 표지되지 않은 상태로 사용되고, 이중특이체 결합 단백질에 결합하는 표지된 항체로 검출된다.
본원에 기술된 이중특이체 결합 단백질은 임의의 공지된 검정 방법, 예컨대 경쟁 결합 검정, 직접 및 간접 샌드위치 검정, 및 면역침강 검정에 사용될 수 있다. 예를 들어, Zola의 문헌[Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987)]을 참조한다.
본원에 개시된 이중특이체 결합 단백질은 CD137 및/또는 TAA가 이의 각각의 수용체에 결합하는 것을 억제하는 데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 본원에 개시된 이중특이체 결합 단백질을 세포(예를 들어, 포유류 세포) 또는 세포 환경에 투여하는 단계를 포함하며, 이에 의해 수용체에 의해 매개되는 신호전달은 억제된다. 이러한 방법은 시험관 내 또는 생체 내에서 수행될 수 있다. "세포 환경"은 세포를 둘러싸는 조직, 배지, 또는 세포외 기질을 의미한다.
조성물 및 치료 방법
본 개시는 또한, 예를 들어 본원에 개시된 바와 같은 이중특이체 결합 단백질을 포함하는 약학적 조성물을 포함하는 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 암과 같은 질환 또는 장애의 치료, 예방 또는 완화를 위한 다수의 치료적 용도를 갖는다.
TAA-CD137 항체에 의한 TME에서의 CD137의 활성화는 환자의 암 세포에 대한 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 본 개시된 이중특이체 항체에 의해 성장이 억제될 수 있는 암은 일반적으로 면역요법에 반응하는 암, 및 면역 관문 내성 종양을 포함하는, 일반적으로 면역요법에 반응하지 않는 암을 포함한다. 암은 고형 종양 또는 액체 종양일 수 있다.
치료를 위한 암의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: 골암, 피부암, 자궁암, 편평 세포 암종, 소세포 폐암(SCLC), 비소세포 폐암(NSCLC), 신경교종, 위장관암, 신장암, 난소암, 간암, 대장암, 자궁내막암, 신장암, 전립선암, 갑상선암, 신경아세포종, 췌장암, 자궁경부암, 위암, 방광암, 간종, 유방암, 결장 암종, 및 두경부암, 생식 세포 종양, 흑색종, 고환암, 난관 암종, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 식도암, 소장암, 내분비계 암, 부갑상선 암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 요관암, 신우 암종, 원발성 CNS 림프종, 척추축 종양, 뇌암, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 표피모양암, 모든 유형의 백혈병, 림프종, 및 골수종, 예컨대 급성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 및 만성 골수성 백혈병(CML), 미분화 AML(MO), 골수아세포 백혈병(Ml), 림프종, 예컨대 호지킨 림프종(HL), 비호지킨 림프종(NHL), B 세포 혈액암, 예를 들어, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 림프형질세포성 림프종, 단핵구 B-세포 림프종, 점막 연관 림프 조직(MALT) 림프종, 역형성(예를 들어, Ki 1+) 대세포 림프종, 성인 T-세포 림프종/백혈병, 외투 세포 림프종, 혈관 면역아세포 T-세포 림프종, 혈관중심성 림프종, 장 T-세포 림프종, 원발성 종격동 B-세포 림프종, 전구체 T-림프모구성 림프종, T-림프모구성; 및 림프종/백혈병(T-Lbly/TALL), 말초 T-세포 림프종, 림프모구성 림프종, 이식 후 림프구증식성 장애, 참조직구 림프종, 원발성 중추신경계 림프종, 원발성 삼출액 림프종, B 세포 림프종, 림프모구성 림프종(LBL), 림프 계통의 조혈 종양, 급성 림프구성 백혈병, 미만성 거대 B-세포 림프종, 버킷 림프종, 여포성 림프종, 미만성 조직구 림프종(DHL), 면역아세포성 대세포 림프종, 전구체 B-림프모구성 림프종, 피부 T 세포 림프종(CTLC); 골수종, 예컨대 IgG 골수종, 경쇄 골수종, 비분비성 골수종, 무증상 골수종(무통성 골수종이라고도 함), 고립성 형질세포종, 및 다발성 골수종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 유모 세포 림프종; 및 전술한 암의 임의의 조합.
본원에 기술된 항체는 또한 전이성 암, 절제 불가능 및/또는 불응성 암(예를 들어, 이전 면역요법에 불응성인 암), 및 재발성 암의 치료에 사용될 수 있다. 소정의 구현예에서, TAA-CD137 Ab는 이전 치료, 예를 들어, 면역종양학 약물로 이전 치료에 부적절한 반응을 보인 암을 가진 환자, 또는 내인성 불응성 또는 내성(예를 들어, PD-1 경로 길항제에 불응성)이거나 내성이 있거나 내성 또는 불응성 상태로 판정된 암을 가진 환자에게 투여된다. 예를 들어, 최초 요법에 반응하지 않거나 충분히 반응하지 않거나 치료(예를 들어, 항-PD-1 치료) 후 질환 진행을 보이는 대상체는 TAA-CD137 항체를 단독으로 투여하거나 다른 요법(예를 들어, 항-PD-1 요법)과 병용 투여함으로써 치료될 수 있다. 특정 구현예에서, TAA-CD137 항체는 면역-종양제, 예를 들어 PD-1 경로 길항제를 이전에 투여받지 않은(즉, PD-1 경로 길항제로 치료받은 적이 없는) 환자에게 투여된다. TAA-CD137 항체는 표준 치유 치료제와 함께 투여될 수 있다. TAA-CD137 항체는 유지 요법, 예를 들어, 종양의 발생 또는 재발을 방지하도록 의도된 요법으로서 투여될 수 있다. 항-GITR 항체는 다른 치료, 예를 들어 방사선, 수술, 또는 화학요법과 함께 투여될 수 있다.
인간에서, 일부 종양은 흑색종과 같은 면역원성인 것으로 나타났다. CD137 활성화를 통한 T 세포 활성화의 임계값을 낮춤으로써, 숙주에서의 종양 반응이 활성화될 수 있으며, 이는 비-면역원성 종양 또는 제한된 면역원성을 갖는 종양의 치료를 가능하게 한다.
일부 구현예에서, 암을 앓고 있는 환자의 치료를 위한 치료제로서의 용도를 위한, 예를 들어, CD137 및 종양 연관 항원에 결합하는 이중특이체 결합 단백질을 포함하는 약학적 조성물을 포함하는 조성물이 제공된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 조성물은 종양 세포를 사멸시키기 위해 암 환자에게 투여된다. 예를 들어, 본원에 기술된 조성물은 종양 연관 항원을 발현하거나 과발현하는 암 세포의 존재를 특징으로 하는 고형 종양 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시된 조성물은 유방암, 폐암, 난소암, 고환암, 췌장암, 위암, 담낭암 및 요로상피암을 치료하는 데 사용될 수 있다.
본 개시는 또한 암의 치료 또는 예방을 위한 방법을 제공하며, 방법은 본원에 개시된 이중특이체 결합 단백질, 및 선택적으로 다른 면역 기반 요법을 포함하는 조성물 또는 제형을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 개시된 이중특이체 결합 단백질은 또한 암을 치료하는 방법에서 단독으로(예를 들어, 단일 요법으로서) 또는 다른 면역치료제 및/또는 화학요법과 조합하여 유용하다.
이중특이체 결합 단백질은 단독으로 투여되거나 면역 매개 염증성 장애 또는 자가면역 질환을 치료하는 데 유용한 다른 조성물과 조합하여 투여될 수 있다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 하나 이상의 이중특이체 결합 단백질을 포함하는 조성물, 예를 들어 약학적 조성물이 제공된다. 약학적 조성물은, 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제뿐만 아니라, Remington의 문헌[The Science and Practice of Pharmacy, 제19판, Gennaro 편집, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1995]에 기술된 것과 같은 통상적인 기술에 따른 임의의 다른 공지된 보조제 및 부형제와 함께 제형화될 수 있다.
통상적으로, 주사에 의한 투여를 위한 조성물은 멸균 등장성 수성 완충액 중의 용액이다. 필요한 경우, 약학적 제제는 또한 가용화제 및 주사 부위의 통증을 완화시키기 위한 리그노카인과 같은 국소 마취제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분은, 예를 들어, 활성제의 양을 나타내는 앰플 또는 사셰트와 같은 기밀 밀봉된 용기 중의 건조 동결건조된 분말 또는 물 없는 농축물로서 공급되거나 개별적으로 또는 단위 투여 형태로 함께 혼합된다. 약학적 제제가 주입에 의해 투여되는 경우, 이는 멸균 약학적 등급 물 또는 식염수를 함유하는 주입 병으로 분배될 수 있다. 약학적 제제가 주사에 의해 투여되는 경우, 이는, 해당 성분이 투여 전에 혼합될 수 있도록, 주사용 멸균수 또는 식염수의 앰플이 제공될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "약학적으로 허용가능한 담체"는 생리학적으로 양립 가능한 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등 중 어느 하나 또는 모두를 포함한다. 바람직하게는, 담체는 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의한) 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 표피 투여에 적합하다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉 이중특이체 결합 단백질은 임의의 물질로 코팅되어, 산의 작용 및 화합물을 불활성화시킬 수 있는 다른 자연 조건으로부터 화합물을 보호할 수 있다.
조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 투여 모드는 원하는 결과에 따라 상이할 것이다. 이중특이체 결합 단백질은 급속 방출로부터 화합물을 보호할 담체, 예컨대 이식물, 경피 패치, 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 방출 제어 제형으로 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산과 같은 생분해성, 생체적합성 중합체가 사용될 수 있다. 이러한 제형의 제조 방법은 대체적으로 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson 편집, Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다.
약학적 조성물 중 이중특이체 결합 단백질의 투여량 수준은 대상체에게 독성 없이, 특정 대상체, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 반응을 달성하는 데 효과적인 이중특이체 결합 단백질의 양을 수득하도록 변경될 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용된 특정 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배설 속도, 치료 지속시간, 다른 약물, 사용된 특정 조성물과 조합하여 사용된 화합물 및/또는 물질, 나이, 성별, 중량, 병태, 치료 중인 환자의 전반적인 건강 및 이전 병력, 및 의학 기술분야에 공지된 유사한 인자를 포함하는 다양한 약동학적 인자에 따라 달라질 것이다.
본원에 기술된 약학적 조성물은 유효량으로 투여될 수 있다. "유효량"은 원하는 반응 또는 원하는 효과를 단독으로 또는 추가 투여량과 함께 달성하는 양을 지칭한다. 특정 질환 또는 특정 병태의 치료의 경우, 원하는 반응은 바람직하게는 질환의 과정의 억제에 관련된다. 이는 질환의 진행을 늦추는 것, 특히 질환의 진행을 방해하거나 역전시키는 것을 포함한다.
일부 양태에서, 본원에 기술된 조성물은 본원에 기술된 것과 같은 다양한 장애를 치료 또는 예방하기 위해, 예를 들어 생체 내로 환자에게 투여된다. 환자는, 바람직하게는 본원에 개시된 이중특이체 결합 단백질을 투여함으로써 교정되거나 완화될 수 있는 장애를 갖는 인간 환자를 포함한다.
일부 양태에서, 종래의 바이러스 및 비-바이러스 기반 유전자 전달 방법이 본원에 기술된 바와 같은 이중특이체 결합 단백질을 암호화하는 핵산을 포유류 세포 또는 표적 조직에 도입하는 데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 시험관 내에서 이중특이체 결합 단백질을 암호화하는 핵산을 세포에 투여하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 이중특이체 결합 단백질을 암호화하는 핵산은 생체 내 또는 생체 외 유전자 요법 용도를 위해 투여된다. 다른 구현예에서, 유전자 전달 기술은 세포 기반 또는 동물 모델에서 이중특이체 결합 단백질의 활성을 연구하는 데 사용된다. 비-바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 플라스미드, 네이키드 핵산, 및 리포좀과 같은 전달 비히클과 복합체화된 핵산을 포함한다. 바이러스 벡터 전달 시스템은 세포에 전달된 후 에피솜 또는 통합 게놈을 갖는 DNA 및 RNA 바이러스를 포함한다. 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있다.
본 개시의 이중특이체 결합 단백질을 암호화하는 핵산의 비-바이러스 전달 방법은 리포펙션, 미세주입, 바이오리스틱스, 바이로솜, 리포솜, 면역리포솜, 폴리케이션 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 비리온, 및 DNA의 제제 강화 흡수를 포함한다. 리포펙션 방법 및 리포펙션 시약은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, TransfectamTM 및 LipofectinTM). 폴리뉴클레오티드의 효율적인 수용체 인식 리포펙션에 적합한 양이온성 및 중성 지질은 Felgner의 특허, WO 91/17424, WO 91/16024에 개시된 것들을 포함한다. 전달은 세포(생체 외 투여) 또는 표적 조직(생체 내 투여)에 대한 전달일 수 있다. 면역지질 복합체와 같은 표적화된 리포좀을 포함하는 지질:핵산 복합체의 제조는 당업계에 공지되어 있다.
본원에 기술된 이중특이체 결합 단백질을 암호화하는 핵산의 전달을 위한 RNA 또는 DNA 바이러스 기반 시스템의 사용은 바이러스를 신체의 특정 세포에 표적화하고 바이러스 페이로드를 핵으로 수송하기 위한 고도로 진화된 프로세스를 활용한다. 바이러스 벡터는 환자에게 직접 투여될 수 있거나(생체 내), 시험관 내에서 세포를 치료하고 해당 변형된 세포가 환자에게 투여될 수 있다(생체 외). 본 개시의 이중특이체 결합 단백질의 전달을 위한 종래의 바이러스 기반 시스템은 유전자 전달을 위한 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 및 단순 포진 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 현재, 바이러스 벡터는 표적 세포 및 조직에서 유전자 전달의 가장 효율적이고 다양한 방법이다. 레트로바이러스, 렌티바이러스, 및 아데노-연관 바이러스 유전자 전달 방법을 사용하면 숙주 게놈에서의 통합이 가능하며, 이는 종종 삽입된 이식유전자의 장기적 발현을 초래한다. 또한, 많은 상이한 세포 유형 및 표적 조직에서 높은 형질도입 효율이 관찰되었다.
하나의 치료 방법에서, CD137 및 종양 연관 항원에 결합하는 이중특이체 결합 단백질을 포함하는 약학적 조성물은 CD137 및 종양 연관 항원에 결합하는 이중특이체 결합 단백질에 접합되거나 접합되지 않은 치료제 또는 독성제를 추가로 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, CD137 및 종양 연관 항원에 결합하는 이중특이체 결합 단백질은 종양 연관 항원을 발현 및/또는 과발현하는 종양에 대한 세포독성 페이로드를 갖는 ADC를 표적화하는 데 사용된다.
본 개시의 넓은 범위는, 본 개시를 특정 구현예로 제한하고자 하는 의도를 갖지 않는 다음의 실시예를 참조하여 가장 잘 이해된다. 본원에 기술된 특정 구현예는 단지 예시로서 제공되며, 본 개시는 첨부된 청구범위의 조건 및, 해당 청구범위에 부여되는 등가물의 전체 범위로 제한되어야 한다.
실시예
일반 방법
면역침강, 크로마토그래피, 및 전기영동을 포함하는 단백질 정제 방법이 기술된다. 예를 들어, Coligan 등의 문헌 [(2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York]을 참조한다. 화학적 분석, 화학적 변형, 번역 후 변형, 융합 단백질의 생산, 및 단백질의 당질화가 기술된다. 예를 들어, Coligan 등의 문헌 [(2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., New York]; Ausubel 등의 문헌 [(2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, N.Y., pp. 16.0.5-16.22.17]; Sigma-Aldrich, Co.의 문헌[(2001) Products for Life Science Research, St. Louis, Mo.; pp. 45-89]; Amersham Pharmacia Biotech의 문헌[(2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., pp. 384-391]을 참조한다. 다클론 및 단클론 항체의 생산, 정제 및 단편화가 기술된다. Coligan 등의 문헌 [(2001) Current Protcols in Immunology, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York]; Harlow 및 Lane의 문헌[(1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Harlow 및 Lane의 문헌(전술함)을 참조한다.
제조사의 절차에 따라, 본원에 기술된 바와 같은 항체 단백질을 함유하는 하이브리도마 또는 세포 배양 상청액을 HiTrap 단백질 G 컬럼(GE, cat. 번호 17040401)을 통해 정제하였다. 요약하면, 상청액을 DPBS(Gibco, cat. 번호 14190-136)로 5 CV로 평형화하고, 주변 온도 및 3분 체류 시간에서 주사기/주입 펌프(Legato 200, KDS)를 통해 로딩하였다. 컬럼을 5 CV의 DPBS로 세척하고, 4 CV의 pH 2.8 용리 완충액(Fisher Scientific, cat. 번호 PI21004)으로 용리를 수행하였다. 용리액을 분획하고, 분획을 1 M Tris-HCL, pH 8.5(Fisher Scientific, cat 번호 50-843-270)로 중화시키고, A280(DropSense96, Trinean)으로 분석하였다. 피크 분획을 풀링하고, 완충액을 DPBS로 교환하였다. 원심 필터(EMD Millipore, cat. 번호 UFC803024)를 DPBS에서 4,000 x g로 2분 동안 평형화시켰다. 정제된 샘플을 로딩하고, DPBS를 첨가하고, 총 DPBS 부피가 ≥ 6 DV에 도달할 때까지 샘플을 4,000 x g로 5 내지 10분 동안 회전시켰다. 최종 풀을 A280으로 분석하였다.
분자 생물학의 표준 방법이 기술된다. 예를 들어, Maniatis 등의 문헌 [(1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Sambrook 및 Russell의 문헌[(2001) Molecular Cloning, 제3판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]; Wu의 문헌[(1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, Calif.]을 참조한다. 표준 방법은 또한 Ausbel 등의 문헌 [(2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols. 1-4, John Wiley and Sons, Inc. New York, N.Y.]에서 찾을 수 있으며, 이는 박테리아 세포 및 DNA 돌연변이 유발에서의 클로닝(Vol. 1), 포유류 세포 및 효모에서의 클로닝(Vol. 2), 당접합체 및 단백질 발현(Vol. 3), 및 생물정보학(Vol. 4 참조)을 기술한다.
본원에 기술된 바와 같은, 표적 TSA/TAA를 발현하는 안정적인 세포주는 선택된 숙주 세포(즉, CHO-K1, HEK293T)를 전기천공 기반 형질감염을 사용하여, 본원에 기술된 바와 같은 TSA/TAA 단백질을 발현하는 pcDNA3.1 기반 플라스미드로 형질감염시킴으로써 생성되었다. 게네티신을 사용하여 통합된 세포를 선별하였다. 7-10일의 게네티신 선별 후, FACS로 안정적인 클론을 단리하였다. 증식 후, 유세포 계측법으로 TSA/TAA 표적의 발현에 대해 안정적인 클론을 추가로 확인하였다.
본원에서 "우렐루맙-NR"로 지칭되는 항-CD137 항체 기반 자체개발 대조군 항-CD137 항체(우렐루맙)를 미국 특허 제7,288,638호에 공개된 공개적으로 이용 가능한 정보(VH 서열번호 3 및 VL 서열번호 6)에 기초하여 제조하였다.
하이브리도마 클론에 대한 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 대한 서열을 아래에 기술된 바와 같이 결정하였다. 총 RNA를 Qiagen(Germantown, MD, USA)의 RNeasy Plus Mini Kit를 사용하여 1-2 x 106 하이브리도마 세포로부터 추출하였다. CDNA는 Takara(Mountainview, CA, USA)의 SMARTer RACE 5'/3' 키트를 사용하여 5' RACE 반응을 수행함으로써 생성되었다. 적절한 면역글로불린의 3' 마우스 불변 영역에 대한 유전자 특이적 프라이머와 조합된 Takara Universal Primer Mix를 사용하여 중쇄 및 경쇄로부터 가변 영역을 증폭하기 위해 NEB(Ipswich, MA, USA)의 Q5 High-Fidelity DNA Polymerase를 사용하여 PCR을 수행하였다. 중쇄 및 경쇄에 대한 증폭된 가변 영역을 2% 아가로오스 겔 상에서 실행하고, 적절한 밴드를 절제한 다음, Qiagen의 Mini Elute Gel Extraction Kit를 사용하여 겔 정제하였다. 정제된 PCR 산물을 Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)의 Zero Blunt PCR Cloning Kit를 사용하여 클로닝하고, Takara의 Stellar Competent 대장균 세포로 형질전환시키고, LB Agar + 50 ug/ml 카나마이신 플레이트 상에 도말하였다. GeneWiz(South Plainfield, NJ, USA)로 직접 콜로니 생거(Sanger) 시퀀싱을 수행하였다. 생산적 재배열을 식별하고 번역된 단백질 서열을 분석하기 위해, IMGT V-QUEST를 사용하여 생성된 뉴클레오티드 서열을 분석하였다. Kabat 넘버링에 기초하여 CDR을 결정하였다.
재조합 단클론 또는 이중특이체 결합 단백질을 다음과 같이 발현시키고 정제하였다: 각각의 중쇄 또는 경쇄를 PCR 증폭시키거나 합성하고, 인간 IgG1(Uniprot P01857) 또는 인간 카파 경쇄(UniProt P01834) 또는 인간 람다 경쇄(UniProt P0DOY2)로부터 유래된 불변 영역을 보유하는 pcDNA3.4-기반 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 쌍을 이룬 중쇄 및 경쇄 발현 플라스미드를 공급사의 Expi293 발현 시스템 프로토콜에 따라 Expi293 세포(Thermo Fisher Scientific)에 형질감염시켰다. 형질감염 5일 후, 원심분리로 배양 상청액을 수집하였다. 항체를 단백질 A 컬럼을 사용하는 1-단계 친화도 정제로 정제하고 완충액을 20 mM 아세테이트 나트륨, pH 5.0 또는 PBS pH 7.2.로 교체하였다.
형광 활성화 세포 분류 검출 시스템(FACS®)을 포함하는, 유세포 계측 방법이 이용 가능하다. 예를 들어, Owens 등의 문헌 [(1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, N.J.]; Givan의 문헌[(2001) Flow Cytometry, 제2판; Wiley-Liss, Hoboken, N.J.]; Shapiro의 문헌[(2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, N.J.]을 참조한다. 예를 들어 진단 시약으로서의 용도를 위해, 핵산 프라이머 및 프로브, 폴리펩티드, 및 항체를 포함하는 핵산을 변형시키기에 적합한 형광 시약이 이용 가능하다. Molecular Probes의 문헌[(2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg.; Sigma-Aldrich의 문헌[(2003) Catalogue, St. Louis, Mo.]을 참조한다.
리간드/수용체 상호작용을 특성화하기 위한 표준 기술이 이용 가능하다. 예를 들어, Coligan 등의 문헌 [(2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., New York]을 참조한다. 특정 작용 메커니즘을 갖는 항체의 특성화에 적절한 항체 기능 특성화의 표준 방법 또한 당업자에게 공지되어 있다.
예를 들어, 항원성 단편, 리더 서열, 단백질 폴딩, 기능적 도메인, CDR 주석, 당질화 부위, 및 서열 정렬을 결정하기 위한 소프트웨어 패키지 및 데이터베이스가 이용 가능하다.
표 9는 본원에서 사용되는 참조 서열을 제시한다.
실시예 1: CD137 및 클라우딘 6, 클라우딘 18.2, 또는 넥틴-4에 결합하는 결합 단백질의 생성
인간 항체 VH 및 VL 유전자를 발현하는 인간 Ig 유전자이식 마우스, Trianni 마우스를 면역화하여 완전한 인간 항-인간 CD137, 클라우딘 6, 및 클라우딘 18.2 항체를 생성하였다(예를 들어, WO 2013/063391, TRIANNI® 마우스 참조).
면역화 - 전술한 TRIANNI 마우스를 복강내(IP), 피하(SC), 꼬리 기저부 또는 발바닥 주사를 통해 재조합 인간 단백질, 표적 단백질을 발현하는 안정적인 세포주, 또는 DNA 중 하나로 주사하여 면역화시켰다.
마우스 항-넥틴-4 항체는 복강내(IP) 피하(SC), 또는 꼬리 기저부 또는 발바닥 주사 중 하나를 통해 재조합 인간 넥틴-4 단백질로 Balb/c 마우스를 면역화함으로써 생성되었다.
안와후 출혈로 면역 반응을 모니터링하였다. ELISA, 유세포 계측법(FACS) 또는 이미징(아래에 기술됨)으로 혈장을 스크리닝하였다. 충분한 항-CD137, 클라우딘 6, 클라우딘 18.2, 또는 넥틴-4 역가를 갖는 마우스를 융합에 사용하였다. 마우스를 희생시키고 비장 및 림프절을 제거하기 전, 마우스에게 복강내, 꼬리 기저부, 발바닥 또는 정맥내로 면역원을 추가투여하였다.
CD137, 클라우딘 6, 클라우딘 18.2, 또는 넥틴-4에 결합한 항체를 생산하는 마우스를 선택하기 위해, 인간 CD137, 클라우딘 6, 클라우딘 18.2, 또는 넥틴-4 단백질에 대한 결합에 대해, 면역화된 마우스로부터의 혈청을 ELISA, FACS, 또는 이미징으로 각각 스크리닝하였다.
ELISA의 경우, 요약하면, 재조합 인간 CD137 또는 넥틴-4로 코팅된 ELISA 플레이트를 면역화된 마우스로부터의 혈청 희석액과 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 검정 플레이트를 세척하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 특이적 항체 결합을 HRP-표지된 항-마우스 IgG 항체(Jackson ImmunoResearch, 카탈로그 번호: 115-036-071)로 검출하고, 세척한 다음, ABTS 기질(Moss, 카탈로그 번호: ABTS-1000)로 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. ELISA 플레이트 판독기(Biotek)를 사용하여 플레이트를 판독하였다.
FACS의 경우, 요약하면, CD137, 클라우딘 6, 클라우딘 18.2, 또는 넥틴-4-발현 HEK293T 또는 CHO-K1 세포 또는 부모 HEK293T 또는 CHO-K1 세포를 면역화된 마우스로부터의 혈청 희석액과 함께 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 2% PFA(Alfa Aesar, 카탈로그 번호: J61899)로 4℃에서 15분 동안 고정시킨 다음 세척하였다. 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 특이적 항체 결합을 Alexa 647 표지된 염소 항-마우스 IgG 항체(ThemoFisher Scientific, 카탈로그 번호: A21235)로 검출하였다. 유세포 계측 기기(Intellicyte, IQue plus, Sartorius) 상에서 유세포 계측 분석을 수행하였다.
또한, 이미징으로 마우스 혈청을 시험하였다. 요약하면, CD137, 클라우딘 6, 클라우딘 18.2, 또는 넥틴-4-발현 HEK293T 또는 CHO-K1 세포를 면역화된 마우스의 혈청 희석액과 함께 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고, 파라포름알데히드로 고정시키고, 세척하고, 특이적 항체 결합을 이차 Alexa488 염소 항-마우스 항체 및 Hoechst(Invitrogen)로 검출하였다. 이미징 기기(Cytation 5, Biotek) 상에서 플레이트를 스캔하고 분석하였다.
CD137, 클라우딘 6, 클라우딘 18.2, 또는 넥틴-4에 대한 인간 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하기 위해, 비장세포 및 림프절 세포를 면역화된 마우스로부터 단리하고, 마우스 골수종 세포주와 같은 적절한 불멸화 세포주에 융합하였다. 항원 특이적 항체의 생산에 대해 생성된 하이브리도마를 스크리닝하였다. 예를 들어, 면역화된 마우스로부터의 비장세포, 림프절 세포의 단일 세포 현탁액을 전기 융합으로 이와 동일한 수의 Sp2/0 비분비 마우스 IgG 골수종 세포(ATCC, CRL 1581)에 융합하였다. 세포를 평평한 바닥 96-웰 조직 배양 플레이트에 도말한 다음, 선별 배지(HAT 배지)에서 약 1주일 동안 인큐베이션하고, 이어서 하이브리도마 배양 배지로 전환하였다. 세포 도말 후 약 10-14일차에, 전술한 바와 같이 ELISA, 이미징 또는 FACS로 개별 웰의 상청액을 스크리닝하였다. 항체 분비 하이브리도마를 24-웰 플레이트로 옮기고, 다시 스크리닝하고, 항-CD137, 클라우딘 6, 클라우딘 18.2, 또는 넥틴-4에 대해 여전히 양성인 경우, 양성 하이브리도마를 단일 세포 분류기를 사용하여 분류하여 서브클로닝하였다. 전술한 바와 같이 ELISA, 이미징 또는 FACS로 서브클론을 다시 스크리닝하였다. 그런 다음, 안정적인 서브클론을 시험관 내에서 배양하여 정제 및 특성화를 위한 소량의 항체를 생성하였다.
쥣과 항-넥틴-4 항체를 CDR 접목으로 인간화시켰다. 요약하면, 1925Ab4의 VH 및 VL을 각각 쿼리로서 사용하여, 가장 유사한 인간 프레임워크 영역에 대한 인간 항체 생식선 서열에 대해 검색하였다. (Kabat 넘버링에 기초한) 쥣과 CDR을 식별된 인간 항체 프레임워크에 이식하였다. 인간화 VH 및 VL 변이체의 여러 쌍을 발현시키고 정제하고, 인간 넥틴-4에 대해 가장 높은 결합 친화도를 갖는 한 쌍(1925Ab4 VH(Hz) 및 1925Ab4 VL(Hz))을 사용하여 이중특이체 항체를 작제하였다.
실시예 2: TAA/CD137 이중특이체(BsAb_A)의 분자 설계 및 생산
TAA에 결합하는 결합 단백질의 대표적인 예로서, 도 3 및 4에 요약된 서브유닛/성분을 포함하는 도 2 BsAb_A에 도시된 분자 포맷을 특징으로 하는 대칭 이중특이체(클라우딘 6 x CD137)를 제조하였다:
1912Ab3
1.중쇄: 다음 성분을 포함하는 서열번호 12: 항-클라우딘 6 항체의 중쇄, 링커 및 항-CD137 scFv(CC를 갖는 VH-VL)(N → C); 및
2. 경쇄: 항-클라우딘 6 항체 경쇄를 포함하는 서열번호 9.
1912Ab3의 중쇄 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 12)을 갖는 DNA 분절 1을 발현 벡터 내에 삽입하고, 1912Ab3의 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 9)을 갖는 DNA 분절 2를 발현 벡터에 삽입하였다.
1912Ab5
1. 중쇄: 다음 성분을 포함하는 서열번호 72: 항-클라우딘 6 항체의 중쇄, 링커 및 항-CD137 scFv(CC를 갖는 VH-VL)(N → C); 및
2. 경쇄: 항-클라우딘 6 항체 경쇄를 포함하는 서열번호 9.
대안적인 예에서, 1912Ab5의 중쇄 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 72)을 갖는 DNA 분절 1을 발현 벡터 내에 삽입하고, 1912Ab5의 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 9)을 갖는 DNA 분절 2를 발현 벡터에 삽입하였다.
작제된 발현 벡터를 Expi293 세포(ThermoFisher)에서 일시적으로 발현시키고, CO2 인큐베이터에서 37℃의 조건 하 5일 동안 Expi293 발현 배지에서 배양하였다. 이중특이체 항체를 재조합 단백질 A 친화도 크로마토그래피(Hitrap Mabselect SuRe, GE)로 세포 배양 상청액으로부터 정제하고, 필요한 경우 이온 교환 크로마토그래피 또는 겔 여과 크로마토그래피로 이차 단계 정제하였다. 이중특이체 항체의 크기 및 순도를 검출하고 확인하기 위해, SDS-PAGE(BiRad), SE-HPLC 컬럼(TOSO, G3000SWXL) 및 CE-SDS(SCIEX, PA800 Plus)가 구비된 크기 배제 HPLC(Agilent, 1100 시리즈) 분석을 수행하였다. 정제된 단백질을 원하는 완충액으로 완충액 교체하고, Amicon Ultra 15 30K 장치를 사용하여 한외여과로 농축시키고, 드롭센스(Unchained Lab)를 사용하여 단백질 농도를 추정하였다. 일시적 형질감염은 2-벡터 시스템에 사용되거나 중쇄 및 경쇄 성분 둘 모두를 하나의 단일 벡터에 함유하는 1-벡터 시스템에 사용될 수 있다. 대안적으로, 이중특이체 항체는 안정적인 CHO 발현 세포주의 상청액으로부터 정제될 수 있다.
실시예 3: TAA/CD137 이중특이체(BsAb_B)의 분자 설계 및 생산
TAA에 결합하는 결합 단백질의 대표적인 예로서, 도 3 및 4에 요약된 서브유닛/성분을 포함하는 도 2 BsAb_B에 도시된 분자 포맷을 특징으로 하는 대칭 이중특이체(클라우딘 18.2 x CD137)를 제조하였다:
1901Ab3
1.중쇄: 다음의 성분을 포함하는 서열번호 4: 항-클라우딘 18.2 항체의 중쇄; 및
2. 경쇄: 항-클라우딘 18.2 항체 경쇄, 링커 및 항-CD137 scFv(CC를 갖는 VH-VL)(N → C)를 포함하는 서열번호 5.
1901Ab3의 중쇄 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 4)을 갖는 DNA 분절 1을 발현 벡터 내에 삽입하고, 1901Ab3의 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 5)을 갖는 DNA 분절 2를 발현 벡터에 삽입하였다.
작제된 발현 벡터를 Expi293 세포(ThermoFisher)에서 일시적으로 발현시키고, CO2 인큐베이터에서 37℃의 조건 하 5일 동안 Expi293 발현 배지에서 배양하였다. 이중특이체 항체를 재조합 단백질 A 친화도 크로마토그래피(Hitrap Mabselect SuRe, GE)로 세포 배양 상청액으로부터 정제하고, 필요한 경우 이온 교환 크로마토그래피 또는 겔 여과 크로마토그래피로 이차 단계 정제하였다. 이중특이체 항체의 크기 및 순도를 검출하고 확인하기 위해, SDS-PAGE(BiRad), SE-HPLC 컬럼(TOSO, G3000SWXL) 및 CE-SDS(SCIEX, PA800 Plus)가 구비된 크기 배제 HPLC(Agilent, 1100 시리즈) 분석을 수행하였다. 정제된 단백질을 원하는 완충액으로 완충액 교체하고, Amicon Ultra 15 30K 장치를 사용하여 한외여과로 농축시키고, 드롭센스(Unchained Lab)를 사용하여 단백질 농도를 추정하였다. 일시적 형질감염은 2-벡터 시스템에 사용되거나 중쇄 및 경쇄 성분 둘 모두를 하나의 단일 벡터에 함유하는 1-벡터 시스템에 사용될 수 있다. 대안적으로, 이중특이체 항체는 안정적인 CHO 발현 세포주의 상청액으로부터 정제될 수 있다.
실시예 4: TAA/CD137 이중특이체(BsAb_C)의 분자 설계 및 생산
TAA에 결합하는 결합 단백질의 대표적인 예로서, 도 3 및 4에 요약된 서브유닛/성분을 포함하는 도 2 BsAb_C에 도시된 분자 포맷을 특징으로 하는 대칭 이중특이체(넥틴-4 x CD137)를 제조하였다:
1925Ab3
1. 중쇄: 다음 성분을 포함하는 서열번호 18: 항-CD137 scFv(CC를 갖는 VH-VL)(N → C), 링커, 및 인간화 항-넥틴-4 항체의 중쇄; 및
2. 경쇄: 인간화 넥틴-4 항체 경쇄를 포함하는 서열번호 15.
1925Ab3의 중쇄 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 18)을 갖는 DNA 분절 1을 발현 벡터 내에 삽입하고, 1925Ab3의 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 15)을 갖는 DNA 분절 2를 발현 벡터에 삽입하였다.
작제된 발현 벡터를 Expi293 세포(ThermoFisher)에서 일시적으로 발현시키고, CO2 인큐베이터에서 37℃의 조건 하 5일 동안 Expi293 발현 배지에서 배양하였다. 이중특이체 항체를 재조합 단백질 A 친화도 크로마토그래피(Hitrap Mabselect SuRe, GE)로 세포 배양 상청액으로부터 정제하고, 필요한 경우 이온 교환 크로마토그래피 또는 겔 여과 크로마토그래피로 이차 단계 정제하였다. 이중특이체 항체의 크기 및 순도를 검출하고 확인하기 위해, SDS-PAGE(BiRad), SE-HPLC 컬럼(TOSO, G3000SWXL) 및 CE-SDS(SCIEX, PA800 Plus)가 구비된 크기 배제 HPLC(Agilent, 1100 시리즈) 분석을 수행하였다. 정제된 단백질을 원하는 완충액으로 완충액 교체하고, Amicon Ultra 15 30K 장치를 사용하여 한외여과로 농축시키고, 드롭센스(Unchained Lab)를 사용하여 단백질 농도를 추정하였다. 일시적 형질감염은 2-벡터 시스템에 사용되거나 중쇄 및 경쇄 성분 둘 모두를 하나의 단일 벡터에 함유하는 1-벡터 시스템에 사용될 수 있다. 대안적으로, 이중특이체 항체는 안정적인 CHO 발현 세포주의 상청액으로부터 정제될 수 있다.
실시예 5: 세포 표면 상의 클라우딘 6에 대한 CLDN6/CD137 BsAb의 결합
실시예 4에 기술된 바와 같이 이중특이체 CLDN6/CD137 결합 단백질을 생성하고, 생산하고, 정제하였다. 클라우딘 6에 대한 BsAb 1912Ab3 및 1912Ab4의 결합 활성을 조사하기 위해, 세포 표면 상에서 내인성 인간 클라우딘 6을 발현하는 NEC8 WT 세포 또는 NEC8 클라우딘 6 KO 세포를 사용하여 면역형광 결합 검정을 수행하였다. CRISPR 유전자 편집 기술로 NEC8 클라우딘 6 KO 세포를 생성하였다. 이들 세포를 10% FBS와 함께 RPMI에서 배양하였다. 실험 당일, 세포를 수집하고, 세척하고, 4℃에서 2시간 동안 BsAbs 1912Ab3 및 1912Ab4, 그리고 mAbs 1912Ab1 및 1912Ab2로 염색한 다음, 실온에서 15분 동안 세포를 고정시켰다. 고정된 세포를 PBS로 3회 세척한 다음, 검출을 위해 실온에서 Alexa Fluor® 488 염소 항-인간 IgG 항체(Invitrogen, Cat#: A-11013)로 1시간 동안 염색하였다. iQue Screener PLUS(Sartorius, MI)를 사용하여 형광 강도를 정량화함으로써 결합 신호를 평가하였다.
도 6a에 나타낸 바와 같이, 10 μg/ml의 농도에서, 1912Ab3 및 1912Ab4를 포함하는 본 개시된 이중특이체 결합 단백질은 단일특이체 대조군 항체인 1912Ab1 및 1912Ab12와 비교하여, NEC8 세포의 세포 표면 상에서 인간 클라우딘 6에 대해 유사하게 결합하였다. CRISPR 유전자 편집 기술에 의해 클라우딘 6 유전자가 결실되었을 경우, 결합은 검출되지 않았다. 이러한 결과는 NEC8 WT 세포 상에서의 이중특이체 결합 단백질의 결합은 NEC8 세포의 세포 표면 상에서 발현되는 클라우딘 6을 통해 특이적임을 입증한다. 클라우딘 6에 대한 1912Ab5의 농도 의존적 결합 곡선은 도 6b에 도시되어 있다. 1912Ab5는 1.5 nM의 결합 EC50 값으로 NEC8 세포에 결합한다.
클라우딘 6과 클라우딘 9 간의 높은 상동성과 클라우딘 9의 정상 세포 발현 프로파일로 인해, 암의 치료 및 안전성 문제의 최소화를 위해서는 고도로 선택적인 클라우딘 6 항체가 바람직하다. 클라우딘 9 대비 클라우딘 6의 결합 선택성을 평가하기 위해, 클라우딘 6 또는 클라우딘 9 중 하나를 과발현하는 2개의 CHO 세포주를 이미지 기반 세포 결합 분석에 사용하였다. 도 6c에 나타낸 바와 같이, 1912Ab5는 CHO-클라우딘 9 세포에 결합하지 않고 CHO-클라우딘 6 세포에 결합한다.
실시예 6: CD137에 대한 CLDN6/CD137 BsAb의 결합
SPR 검정 및 면역형광 이미징 검정으로 CD137에 대한 클라우딘 6-CD137 BsAb의 결합을 측정하였다. 도 7a에 나타낸 바와 같이, 1912Ab5는 인간 CD137에 결합할 경우 바람직한 신속-온 신속-오프 동역학을 갖는다. 3개의 실험으로부터, 1912Ab5는 1.33E+06(1/Ms)의 평균 ka 값, 및 4.62E-02(1/s)의 평균 kd 값을 갖는다는 것을 알 수 있다. 평균 KD는 3.46E+08 M이었다. 간헐적 결합은 T 세포를 과-자극하고 T 세포 고갈을 야기할 위험을 잠재적으로 낮출 수 있다.
인간 CD137 발현 작제물로 안정적으로 형질감염된 HEK293T 세포를 세포 기반 결합 분석에 사용하여 CD137 결합 친화도를 평가하였다. 10% FBS가 포함된 DMEM을 함유하는 완전 배지에 세포를 도말한 다음, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 세포를 4℃에서 2시간 동안 시험 항체로 염색한 후 실온에서 15분 동안 세포를 고정시켰다. 고정된 세포를 PBS로 3회 세척한 다음, 검출을 위해 실온에서 Alexa Fluor® 488 염소 항-인간 IgG (H+L) 이차 항체(Invitrogen, Cat#: A-11013)로 1시간 동안 염색하였다. 세포를 이미징하고 Cytation Imager(Biotek, VT)을 사용하여 형광 강도를 정량화함으로써 결합 신호를 평가하였다.
도 7c에 나타낸 결과는 이중특이체 항체 1912Ab3 및 1912Ab4, 그리고 단일특이체 대조군 항체 1923Ab4는, 10 μg/ml 농도에서, 유사한 수준으로 인간 CD137에 결합하였음을 나타낸다. 1912Ab5의 농도 의존적 결합 곡선은 도 7c에 도시되어 있다. 1912Ab5는 0.28 nM의 결합 EC50 값으로 HEK293-클라우딘 6 세포에 결합하며, 벤치마크 대조군 우렐루맙-NR의 결합 EC50은 0.22 nM이었다.
실시예 7: CD137 신호전달의 클라우딘 6 의존성 활성화
CLDN6/CD137 BsAb를 클라우딘 6 의존성 CD137 작용을 유도하는 이들의 능력에 대해 평가하였다. 요약하면, CD137을 안정적으로 발현하고 NFkB-Luc 리포터를 함유하는 Jurkat T 리포터 세포주를 사용하여 CD137 신호전달을 정량화하고, 세포 표면 상에서 내인성 클라우딘 6을 발현한 NEC8 WT 세포를 표적 세포로서 사용하여 클라우딘 6을 수득하였다. 클라우딘 6 의존성을 입증하기 위해, NEC8 클라우딘 6 KO 세포를 음성 대조군으로서 사용하였다. 본 개시된 항체 1912Ab3 및 1912Ab4는 클라우딘 6 및 CD137 둘 모두에 결합하는 이중특이체 항체이다. 단일특이체 항체 우렐루맙-NR은 단지 CD137에만 결합하며, 이는 대조군 항체로서 사용된다. Jurkat T 리포터 세포를 NEC8 WT 또는 클라우딘 6 KO 세포와 공동 배양하고, 본 개시된 결합 단백질로 37℃에서 5% CO2로 16시간 동안 자극하였다. ONE-GloTM 루시페라아제 시약(Promega, Cat #: E6130)을 첨가하고, 플레이트를 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. Synergy Neo2 플레이트 판독기(Biotek)로 발광 신호를 측정하고, GraphPad Prism으로 데이터를 분석하였다. 도 8a는 우렐루맙-NR만이 NEC8 WT 및 클라우딘 6 KO 표적 세포 둘 모두에서 CD137 신호전달을 활성화하였음을 입증한다. 1912Ab3 및 1912Ab4는 NEC8 WT 세포의 존재 하에 우렐루맙-NR보다 더 강한 CD137 신호전달을 유도하였다. 클라우딘 6 녹아웃 NEC8 세포에서는 배경 활성만이 검출되었다.
도 8b는 NEC8 WT 세포의 존재 하에서 CD137 신호전달을 유도하는 데 있어서의 1912Ab3, 1912Ab4, 및 우렐루맙-NR의 투여량 반응 곡선을 나타낸다. 1912Ab3, 1912Ab4, 및 우렐루맙-NR의 EC50 값(효능)은 각각 0.20 nM, 0.18 nM, 및 0.31 nM이었다. 1912Ab3 및 1912Ab4 둘 모두 우렐루맙-NR보다 더 양호한 효능(더 높은 E최대)을 나타냈다.
유사하게, NEC8 세포(도 8c) 또는 OV90 세포(도 8d)를 사용하는 CD137 신호전달 검정으로 1912Ab5 및 우렐루맙-NR을 평가하였다. 도면에 나타낸 바와 같이, 1912Ab5는 투여량 의존성 CD137 신호전달을 유도하였으며, EC50 값(효능)은 각각 0.066 nM 및 0.064 nM이었다. 대조군 항체 우렐루맙-NR은 각각 0.28 nM 및 0.62 nM의 EC50 값을 나타냈다. 1912Ab5는 우렐루맙-NR에 비해 T 세포 CD137 신호전달에서 보다 강한 작용을 나타냈다.
실시예 8: CD8 T 세포의 클라우딘 6 의존성 활성화
공동 배양 실험을 사용하여 클라우딘 6-CD137 BsAb에 의한 T 세포 활성화를 측정하였다. 건강한 공여자의 CD8 T 세포 및 NEC8 세포를 각각 효과기 및 표적 세포로서 사용하였다. 이들 2개의 세포를 10% FBS 및 0.5 ug/ml의 마우스 항-hCD3 클론 OKT3(Biolegend, Cat #: 317325)이 보충된 RPMI1640 배지에서 공동 배양하였다. 본 개시된 결합 단백질을 첨가하여 T 세포를 자극하였다. 본 개시된 항체 1912Ab3 및 1912Ab4는 클라우딘 6 및 CD137 둘 모두에 결합하는 이중특이체 항체이다. 단일특이체 항체 우렐루맙-NR은 단지 CD137에만 결합하며, 이는 대조군 항체로서 사용된다. 플레이트를 37℃에서 5% CO2로 3일 동안 인큐베이션하였다. 72시간의 인큐베이션 후, 상청액을 수집하고, 제조사의 지침에 따른 프로토콜을 사용하여 AlphaLISA(PerkinElmer, Cat #: AL217C/F)로 분비된 IFNγ를 측정하는 데 사용하였다. IFNγ의 양은 T 세포 활성화를 나타낸다.
도 9a는 우렐루맙-NR이 클라우딘 6 발현과 독립적으로 T 세포 활성화를 자극한다는 것을 나타낸다. CD8 T 세포를 NEC8 WT 또는 NEC8 클라우딘 6 KO 세포와 공동 배양했을 경우, 유사한 수준의 IFNγ가 검출되었다. 그러나, 1912Ab3 및 1912Ab4는 NEC8 WT 세포가 존재하고 NEC8 클라우딘 6 KO 세포는 존재하지 않을 경우에만 CD8 T 세포 활성화를 자극한다. 이러한 결과는 본 개시된 이중특이체 결합 단백질의 클라우딘 6 의존성 T 세포 활성화 활성을 입증한다.
도 9b는 NEC8 WT 세포의 존재 하에서 CD8 T 세포 활성화를 유도하는 데 있어서의 1912Ab3, 1912Ab4, 및 우렐루맙-NR의 투여량 반응 곡선을 나타낸다. 1912Ab3, 1912Ab4, 및 우렐루맙-NR의 EC50 값(효능)은 각각 0.042 nM, 0.15 nM, 및 0.9 nM이었다. 1912Ab3 및 1912Ab4 둘 모두 T 세포 활성화의 특징인 IFNγ 생산의 유도에 있어서 우렐루맙-NR보다 더 양호한 효능 및 효과(더 높은 E최대)를 나타냈다.
유사하게, NEC8 세포(도 9c) 또는 NEC8 클라우딘 6 KO 세포(도 9d) 중 하나를 사용하는 T 세포 활성화 검정으로 1912Ab5 및 우렐루맙-NR을 평가하였다. 도면에 나타낸 바와 같이, 1912Ab5는 투여량 의존성 CD137 신호전달을 유도하였으며, EC50 값(효능)은 NEC8 야생형 세포의 존재 하에서 단지 0.17 nM이었다. 대조적으로, 대조군 항체 우렐루맙-NR은 NEC8 야생형 및 NEC8 클라우딘 6 KO 세포 연구에서 각각 0.82 nM 및 0.99 nM의 EC50 값으로 활성을 나타냈으며, 이는 이의 활성이 클라우딘 6 발현에 독립적임을 나타낸다. 1912Ab5는 T 세포 활성화 연구에서 표적 종양 항원이 이용 가능할 경우에만 우렐루맙-NR에 비해 더 높은 수준의 작용을 나타냈다.
실시예 9: BsAb CLDN6/CD137에 의해 유도된 CD8 T 세포의 종양 사멸 활성
BsAb 1912Ab3 및 1912Ab4에 의해 매개된 T 세포 유래 종양 사멸 활성(TDCC)을 평가하기 위해 공동 배양 실험을 수행하였다. 요약하면, 건강한 공여자로부터의 CD8 T 세포를 ImmunoCultTM 인간 CD3/CD28 T 세포 활성화제(Stemcell, Cat #: 10971)로 2일 동안 사전 활성화시켰다. 활성화된 세포를 세척하여 CD3/CD28 활성화제를 제거하였다. 그런 다음, 활성화된 CD8 T 세포를 GFP 발현 작제물로 안정적으로 형질감염시킨 NEC8 종양 세포와 공동 배양하고, 본 개시된 이중특이체 결합 단백질로 108시간 동안 치료하였다. 본 개시된 항체 1912Ab3 및 1912Ab4는 클라우딘 6 및 CD137 둘 모두에 결합하는 이중특이체 항체이다. 세포의 수를, Cytation(Biotek, VT)을 사용하여, 녹색 형광 세포의 면적으로 측정하였다. 사멸 백분율을 다음의 식으로 계산하였다:
사멸(%) = (결합 단백질 미치료 웰로부터의 GFP 세포의 면적 - 결합 단백질 처리 웰로부터의 GFP 세포의 면적) / 결합 단백질 미치료 웰로부터의 GFP 세포의 면적 * 100%
도 10a는 1912Ab3 및 1912Ab4가 강한 T 세포 매개 세포독성을 유도하였음을 입증한다. BsAb를 사용한 치료의 108시간 후 CD8 T 세포에 의해 종양 세포의 약 80%가 사멸되었다. 1912Ab3 및 1912Ab4의 EC50 값은 각각 0.11 nM 및 0.16 nM이었다.
BsAb 1912Ab5의 TDCC 효과를 평가하기 위해, 유사한 공동 배양 실험을 수행하였다. 요약하면, 건강한 공여자로부터의 CD8 T 세포를 마우스 항-hCD3 클론 OKT3(Biolegend, Cat #: 317325)의 존재 하에 GFP로 안정적으로 형질감염시킨 난소암 세포주 OV90 세포와 공동 배양하였다. 공동 배양된 세포를 BsAb 1912Ab5 또는 대조군으로 144시간 동안 치료하였다. 본 개시된 항체 1912Ab5는 클라우딘 6 및 CD137 둘 모두에 결합하는 이중특이체 항체이다. Cytation(Biotek, VT)을 사용하여 살아있는 세포의 수를 측정하였다. 사멸 백분율을 다음의 식으로 계산하였다:
사멸(%) = (결합 단백질 미치료 웰로부터의 GFP 세포의 면적 - 결합 단백질 처리 웰로부터의 GFP 세포의 면적) / 결합 단백질 미치료 웰로부터의 GFP 세포의 면적 * 100%
도 10b는 1912Ab5가 강한 T 세포 매개 세포독성을 유도하였음을 입증한다. BsAb를 사용한 치료의 144시간 후 CD8 T 세포에 의해 종양 세포의 약 70%가 사멸되었다. 1912Ab5의 EC50 값은 0.036 nM이었다.
실시예 10: 인간화 B-h4-1BB 마우스의 피하, 동계 MC38-h클라우딘 6 마우스 종양 모델에서의 종양 성장에 대한 CLDN6/CD137 BsAb의 효과
체중이 16-20 g인 6-8주령의 암컷 B-h4-1BB 마우스(Biocytogen)를 연구 시작 전 7일 동안 순응시켰다. MC38 쥣과 결장 암종 세포주를 인간 클라우딘 6을 과발현하도록 유전자적으로 변형시켰다. 세포를 5%의 분위기 37℃에서 10% 열 불활성화 FBS가 보충된 DMEM 중 단층 배양물로서 시험관 내에서 유지하였다. 세포를 수확하고, 종양 발생을 위해 100 μl의 PBS 중 5 x 105개 세포를 우측 전방 옆구리에 피하 이식하였다. 7일차에, 종양 보유 마우스를 평균 종양 크기가 약 100-150 mm3인 3개의 시험군에 무작위로 등록시켰다. 각각의 군은 6마리의 마우스로 구성되었다. 종양 크기는 캘리퍼를 사용하여 2차원적으로 주 2회 측정하였고, 종양의 부피는 다음 식을 사용하여 mm3 단위로 표현하였다. V = 0.5 a Х b2, 식 중 a 및 b는 각각 종양의 장변(long) 치수 및 단변(short) 치수이다. 7, 11, 14 및 18일차에, 5 mg/kg의 1912Ab3, 1912Ab4 또는 음성 대조군으로서 PBS의 복강내 주사로 마우스를 치료하였다. 연구는 28일차에 종료되었다.
도 11a는 세 치료군 모두에 대한 종양 성장 곡선을 나타낸다. 1912Ab3 및 1912Ab4 둘 모두 비히클 대조군 대비 종양 성장을 유의하게 억제하였다. 1912Ab3을 주사한 모든 마우스, 및 1912Ab4를 주사한 6마리의 마우스 중 5마리는 28일차에 완전한 종양 관해를 나타냈다.
21일차 혈청 샘플로부터 마우스 혈청 중 ALT 및 AST 활성을 측정하여 생체독성을 모니터링하였다. 도 11b에 나타낸 바와 같이, 치료군을 대조군과 비교 시 ALT 수준은 유의한 증가를 보이지 않는다. 유사하게, 도 11c에 나타낸 바와 같이, AST 수준은 치료군으로부터 유의한 증가를 보이지 않으며, 이는 항체 유래 간독성의 위험이 낮다는 것을 나타낸다.
bsAb 클라우딘 6/CD137이 완전한 종양 관해를 보인 마우스에서 종양 면역을 유도할 수 있는지의 여부를 평가하였다. 이전에 1912Ab3으로 치료한 4마리의 마우스, 및 1912Ab로 치료한 4마리의 마우스에 대해 이전 치료의 최종 투여 후 45일차에 MC38-클라우딘 6 종양으로 다시 재접종하였다. 본 연구에서는 4마리의 미처리 마우스를 대조군으로서 사용하였다. 도 11d에 나타낸 바와 같이, 모든 미처리 마우스에서는 종양이 발생하였지만, 완전한 종양 관해를 갖는 이전에 치료된 마우스 중 어느 것도 재접종 후 종양이 발생하지 않았다.
항체 1912Ab5의 유효 투여량을 조사하기 위해 투여량 적정 연구를 수행하였다. Biocytogen(Boston, MA)으로부터의 암컷 B-h4-1BB 마우스에게 5 x 105 생존 MC38 세포를 피하 접종하였다. 종양 크기가 약 100 mm3에 도달했을 때, 마우스를 3개의 군으로 무작위 배정하고, 복강내 주사로 치료를 개시하였다. 1군은 비히클 대조군을 투여받았고; 2군은 0.3 mpk 1912Ab5 항체를 투여받았고; 3군은 1 mpk 1912Ab5 항체를 투여받았으며; 4군은 3 mpk 1912Ab5 항체를 투여받았다. 치료는 2주 동안 주 2회 투여되었다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 단일 제제 1912Ab5는 강력한 효능을 나타냈다. 0.3 mpk의 투여량에서, 종양 접종 후 32일차에 97.7%의 종양 성장 억제(TGI)를 나타냈고; 1 mpk의 1912Ab5는 종양 접종 후 32일차에 106.2%의 종양 성장 억제(TGI)를 나타냈으며, 3 mpk의 1912Ab5는 종양 접종 후 32일차에 106.4%의 종양 성장 억제(TGI)를 나타냈다.
Ab 1912Ab5의 효능을 벤치마크 CD137 Ab 우렐루맙-NR과 비교하기 위한 후속 연구를 수행하였다. Biocytogen(Boston, MA)으로부터의 암컷 B-h4-1BB 마우스에게 5 x 105 생존 MC38 세포를 피하 접종하였다. 종양 크기가 약 100 mm3에 도달했을 때, 마우스를 3개의 군으로 무작위 배정하고, 복강내 주사로 치료를 개시하였다. 1군은 비히클 대조군을 투여받았고; 2군은 0.1 mpk 1912Ab5 항체를 투여받았으며, 3군은 0.1 mpk 우렐루맙-NR을 투여받았다. 치료는 2주 동안 주 2회 투여되었다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 단일 제제 1912Ab5는 벤치마크 항체 우렐루맙-NR에 비해 우월한 효능을 입증하였다. 0.1 mpk의 투여량에서, 1912Ab5는 종양 접종 후 27일차에 77.2%의 종양 성장 억제(TGI)를 나타낸 반면; 0.1 mpk의 우렐루맙-NR은 단지 36.6%의 종양 성장 억제(TGI)를 나타냈다.
클라우딘 6/CD137 이중특이체 Ab가 이미 성장한 대형 종양을 치료하는 데 사용될 수 있는지의 여부를 조사하였다. Biocytogen(Boston, MA)으로부터의 암컷 B-h4-1BB 마우스에게 5 x 105 생존 MC38 세포를 피하 접종하였다. 종양 크기가 약 400 mm3에 도달했을 때, 마우스를 2개의 군에 무작위 배정하고 1주일 동안 주 2회 치료하였다. 1군은 비히클 대조군을 투여받았고; 2군은 2 mpk 1912Ab5 항체의 2회 투여량을 투여받았다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 1912Ab5는 종양 접종 후 35일차에 강력한 효능, 즉 62.7%의 종양 성장 억제(TGI)를 나타냈다.
실시예 11: 클라우딘 6-CD137 항체 치료 종양의 면역 상황 분석
다중 형광 면역조직화학(IHC) 연구 및 종양 침윤 림프구(TIL) 분석을 수행하여 클라우딘 6/CD137 bsAb 치료 후 종양 내 면역 세포 함량을 평가하였다.
Biocytogen(Boston, MA)으로부터의 암컷 B-h4-1BB 마우스에게 5 x 105 생존 MC38 세포를 피하 접종하였다. 종양 크기가 약 100 mm3에 도달했을 때, 마우스를 2개의 군에 무작위 배정하고(군 당 8마리 마우스), 15일차 및 19일차에 2회 치료하였다. 1군은 비히클 대조군으로 치료하였으며, 2군은 1 mpk 1912Ab5로 치료하였다. 종양 접종 후 26일차에, 마우스를 안락사시키고 IHC 및 Til 연구를 위해 신선한 종양을 채취하였다.
각각의 치료군으로부터의 2개의 종양을 포르말린 고정하고 파라핀 포매하였다. 5 mm의 FFPE 조직 절편으로 형광 IHC를 수행하였다. 파라핀 제거 후, 다중 면역 세포 프로파일링을 위해 CD45, CD3, CD4 및 CD8을 검출하는 일차 항체로 슬라이드를 염색하였다. 도 15는 대표적인 이미지를 나타낸다. 1912Ab5로 치료한 종양은 비히클 대조군(도 15a)과 비교하여 림프구 침윤, 및 CD4 및 CD8 T 세포 침윤(도 15b)을 유의하게 증가시켰다.
각각의 치료군으로부터의 6개의 신선한 종양을 사용하여 종양 침윤 림프구 분석을 수행하였다. 효소 기반 방법을 사용하여 종양을 해리하였다. 분해된 종양으로부터의 세포를 여과하고, 세척하고, 이를 다중화된 유세포 계측법에 사용하였다. T 세포 집단을 살아있는 CD45+ CD3+로 게이팅하고; CD4T 세포를 살아있는 CD45+ CD3+ CD4+ CD8-로 게이팅하고; CD8 T 세포를 살아있는 CD45+ CD3+ CD4- CD8+로 게이팅하고; 고갈된 T 세포를 살아있는 CD45+ CD3+ Tim-3+로 게이팅하고; 중심 기억 T 세포를 CD45+ CD3+ CD8+ CD44고CD62L고로 게이팅하고; 상주 기억 T 세포를 살아있는 CD45+ CD3+ CD8+ CD69+ CD103+로 게이팅하고; M2-유사 대식세포를 살아있는 CD45+ CD11b+ F4/80++ CD206+로 게이팅하였다.
도 16에 나타낸 바와 같이, 1912Ab5로 치료한 모든 종양에서, CD4 세포(도 16a) 및 CD8 세포(도 16b) 둘 모두가 증가하였으며, 이는 T 세포 유래 종양 사멸이 강화되었음을 시사한다. 또한, 1912Ab5로 치료한 동물에서 관찰된 종양 면역과 함께, T 기억 세포, 중심 기억 T 세포(도 16c) 및 상주 기억 T 세포(도 16d)가 유의하게 증가하였으며(도 11d), 이는 클라우딘 6-CD137 bsAb 치료가 항종양 기억 형성을 촉진할 수 있음을 시사한다. 또한, 고갈 T 세포 감소(도 16e) M2-유사 대식세포 감소(도 16f)는 클라우딘 6-CD137 bsAb의 종양 미세환경 조절 효과를 나타낸다.
본원에 개시된 데이터에 기초하여, CLDN6/CD137 BsAb 치료의 항종양 효과는 조절된 TME로 이어질 것으로 예상되며, 림프구 침윤의 증가는 억제성 TME를 염증성 TME로 전환시킬 것으로 예상된다. 종양 세포 의존성 CD137 활성화는 종양 경험 T 세포 활성화를 특이적으로 향상시키고 T 기억 형성을 촉진할 것이며, bsAb의 신속 오프 동역학은 T 세포 고갈을 감소시키는 데 도움이 될 수 있다. 감소된 M2 대식세포는 TME에서의 억제성 사이토카인 방출을 감소시킴으로써 T 세포 활성화를 개선할 것이다.
실시예 12: PD1 내성 모델 B16F10에서의 클라우딘 6-CD137 항체의 평가
PD1 내성 환자에서의 클라우딘 6/CD137 항체 치료의 치료 가능성을 예측하기 위해, PD1 내성 종양 모델 B16F10 흑색종 모델을 사용하여 항체 1912Ab5의 효능을 평가하였다. Biocytogen(Boston, MA)으로부터의 6 내지 7주령 암컷 동형접합체 B-h4-1BB 마우스에게 1 x 105 생존 B16-F10 세포를 우측 옆구리에 피하 주사하였다. 종양 크기가 75 내지 100 mm3에 도달했을 때, 마우스를 2개의 군으로 무작위 배정하고, 복강내 주사로 치료를 개시하였다. 1군은 비히클 대조군을 투여받았고; 2군은 3 mpk 1912Ab5 항체를 투여받았다. 치료는 2주 동안 주 2회 투여되었다.
주 2회 체중을 측정하였다. 종양 부피는 식 V = 1/2 * L x W x W를 사용하여 상이한 시점에 측정하였으며, 여기에서 L은 이종이식편의 장변 치수이고 W는 단변 치수이다. 2500 mm3를 초과하는 종양을 가진 임의의 마우스를 희생시켰다. 종양 이식 후 최장 27일까지 마우스의 생존을 모니터링하였다.
도 17에 나타낸 바와 같이, 3 mpk 1912Ab5 항체 치료군의 마우스는 종양 이식 후 20일차에 67.1%의 TGI 값을 나타냈으며, 유의한 효능을 입증하였다.
실시예 13: 세포 표면 상의 클라우딘 18.2에 대한 CLDN18.2/CD137 BsAb의 결합
실시예 3에 기술된 바와 같이 이중특이체 CLDN18.2/CD137 항체를 생성하고, 생산하고, 정제하였다. 이들 결합 단백질의 클라우딘 18.2에 대한 결합 활성을 조사하기 위해, 인간 클라우딘 18.2를 내인성으로 발현하는 NUGC4 세포를 면역형광 결합 분석에 사용하였다. 세포를 10% FBS와 함께 RPMI 배지에서 배양하였다. 실험 당일, 세포를 수집하고, 세척하고, 4℃에서 2시간 동안 BsAbs 1901Ab2 및 1901Ab3, 그리고 단일특이체 항-CLDN18.2 대조군 항체 1901Ab1로 염색한 다음, 실온에서 15분 동안 파라포름알데히드로 세포를 고정시켰다. 단클론 항체 1901Ab1는 클라우딘 18.2에 특이적으로 결합한다. 이어서, 고정된 세포를 PBS로 3회 세척한 다음, 검출을 위해 실온에서 Alexa Fluor® 488 염소 항-인간 IgG 항체(Invitrogen, Cat#: A-11013)로 1시간 동안 세포를 염색하였다. iQue Screener PLUS(Sartorius, MI)를 사용하여 형광 강도를 정량화함으로써 결합 신호를 평가하였다.
도 18에 나타낸 바와 같이, 10 μg/ml의 농도에서, 1901Ab2 및 1901Ab3을 포함하는 본 개시된 이중특이체 결합 단백질은 대조군 단클론 항체 1901Ab1과 비교하여, NUGC4 세포 상에서 인간 클라우딘 18.2에 대해 유사하게 결합하였다.
실시예 14: 세포 표면 상의 CD137에 대한 CLDN18/CD137 BsAb의 결합
면역형광 영상화 검정을 사용하여 CLDN18.2/CD137 BsAb 1901Ab2 및 1901Ab3의 결합 친화도를 평가하였다. 요약하면, 10% FBS가 포함된 DMEM을 함유하는 완전 배지에 인간 CD137을 안정적으로 발현하는 HEK293T-huCD137 세포를 도말한 다음, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 세포를 4℃에서 2시간 동안 BsAb와 결합시킨 다음, 실온에서 15분 동안 파라포름알데히드로 세포를 고정시켰다. 단일특이체 항체 1923Ab4는 단지 CD137에만 결합하며, 이는 대조군 항체로서 사용된다. 고정된 세포를 PBS로 3회 세척한 다음 검출을 위해 실온에서 Alexa Fluor® 488 염소 항-인간 IgG 항체(Invitrogen, Cat#: A-11013)로 1시간 동안 염색하였다. 세포를 이미징하고 Cytation Imager(Biotek, VT)을 사용하여 형광 강도를 정량화함으로써 결합 신호를 평가하였다.
도 19에 나타낸 바와 같이, 10 μg/ml의 농도에서, 본 개시된 이중특이체 결합 단백질 1901Ab2 및 1901Ab3은 이들의 단클론 항체 대조군 1923Ab4와 같이, 세포 상에서 인간 CD137에 대해 유사하게 결합하였다.
실시예 15: CLDN18.2/CD137 BsAb에 의한 CD137 신호전달의 표적 세포 의존성 활성화
항-CLDN18.2/CD137 BsAb 1901Ab2 및 1901Ab3을 표적 세포 의존성 CD137 작용을 유도하는 이들의 능력에 대해 또한 평가하였다. 요약하면, CD137을 안정적으로 발현하고 NFkB-luc 리포터를 함유하는 Jurkat T 리포터 세포주를 사용하여 CD137 신호 전달을 정량화하였다. 세포 표면 상에서 내인성 클라우딘 18.2를 발현한 NUGC4 세포를 표적 세포로서 사용하였다. Jurkat T 리포터 세포를 NUGC4 표적 세포를 포함하거나 포함하지 않고 공동 배양하고, 본 개시된 결합 단백질로 37℃에서 5% CO2로 16시간 동안 자극하였다. 이어서 ONE-GloTM 루시페라아제 시약(Promega, Cat #: E6130)을 첨가하고, 플레이트를 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. (공개적으로 이용 가능한 서열 정보에 기초하여 NovaRock Biotherapeutics에 의해 생성된) 단일특이적 항체 우렐루맙-NR은 단지 CD137에만 결합하며, 이는 대조군 항체로서 사용된다. Synergy Neo2 플레이트 판독기(Biotek)로 발광 신호를 측정하고, GraphPad Prism으로 데이터를 분석하였다.
도 20a는, 예상된 바와 같이, 우렐루맙-NR이 NUGC4 표적 세포의 존재와 독립적으로 CD137 신호전달을 활성화하였음을 입증한다. 대조적으로, 1901Ab2는 NUGC4 표적 세포의 존재 하에서만 CD137 신호전달을 유도하였다. 또한, 1901Ab2는 NUGC4 표적 세포의 존재 하에서 우렐루맙-NR보다 더 강력한 CD137 신호전달을 유도하였다. 이러한 결과는 결합 단백질이 NUGC4 세포의 세포 표면 상에서 발현되는 클라우딘 18.2와 결합했을 경우 1901Ab2가 단지 CD137 작용만을 나타냈음을 입증한다. NUGC4 세포의 부재 시 1901Ab2의 작용 활성은 검출되지 않았다.
도 20b는 NUGC4 세포의 존재 하에서 CD137 신호전달을 유도하는 데 있어서의 1901Ab2, 1901Ab3, 및 우렐루맙-NR의 투여량 반응 곡선을 나타낸다. 1901Ab2, 1901Ab3, 및 우렐루맙-NR의 EC50 값(효능)은 각각 0.047 nM, 0.10 nM, 및 0.21 nM이었다. 1901Ab2 및 1901Ab3 둘 모두 CD137 신호전달의 유도에 있어서 우렐루맙-NR보다 더 양호한 EC50 값 및 보다 높은 신호전달 강도(E최대)를 나타냈다.
실시예 16: CLDN18.2/CD137 BsAb에 의한 CD8 T 세포의 활성화
공동 배양 실험을 사용하여 TCR 신호전달의 존재 하에서의 BsAb 1901Ab2 및 1901Ab3에 의한 T 세포 활성화를 측정하였다. 건강한 공여자의 CD8 T 세포 및 NUGC4 세포를 효과기 및 표적 세포로서 사용하였다. 이들 2개의 세포를 10% FBS 및 0.5 ug/ml의 마우스 항-hCD3 클론 OKT3(Biolegend, Cat #: 317325)이 보충된 RPMI1640 배지에서 함께 배양하였고 TCR 신호전달을 제공하였다. 본 개시된 결합 단백질을 첨가하여 T 세포를 자극하였다. 플레이트를 37℃에서 5% CO2로 3일 동안 인큐베이션하였다. 72시간의 인큐베이션 후, 상청액을 수집하고, 제조사의 지침에 따른 프로토콜을 사용하여 AlphaLISA(PerkinElmer, Cat #: AL217C/F)로 분비된 IFNγ를 측정하는 데 사용하였다. IFNγ의 양은 T 세포 활성화를 나타낸다.
도 21은 NUGC4 세포의 존재 하에서 CD8 T 세포 활성화를 유도하는 데 있어서의 1901Ab2, 1901Ab3, 및 우렐루맙-NR의 투여량 반응 곡선을 나타낸다. 1901Ab2, 1901Ab3, 및 우렐루맙-NR의 EC50 값은 각각 0.081 nM, 0.12 nM, 및 0.51 nM이었다. 1901Ab2 및 1901Ab3 둘 모두 T 세포 활성화의 특징인 IFNγ 생산의 유도에 있어서 우렐루맙-NR보다 더 양호한 효능 및 보다 높은 E최대를 나타냈다.
실시예 17: CLDN18.2/CD137 BsAb에 의해 유도된 CD8 T 세포 유래 종양 사멸 활성
CLDN18.2/CD137 BsAb 1901Ab2 및 1901Ab3으로 치료한 CD8 T 세포의 종양 사멸 활성을 측정하기 위해 공동 배양 실험을 수행하였다. 요약하면, 건강한 공여자로부터의 CD8 T 세포를 ImmunoCultTM 인간 CD3/CD28 T 세포 활성화제(Stemcell, Cat #: 10971)로 2일 동안 사전 활성화시켰다. 다음으로, 활성화된 세포를 세척하여 CD3/CD28 활성화제를 제거하였다. 그런 다음, 활성화된 CD8 T 세포를 GFP로 안정적으로 형질감염시킨 NUGC4 종양 세포와 공동 배양하고, 본 개시된 이중특이체 결합 단백질로 96시간 동안 치료하였다. Cytation(Biotek, VT)을 사용하여 세포 수를 녹색 형광 강도로 측정하였다. 사멸 백분율을 다음의 식으로 계산하였다:
사멸(%) = (결합 단백질 미치료 웰로부터의 GFP 신호 - 항체 치료 웰로부터의 GFP 신호) / 결합 단백질 미치료 웰로부터의 GFP 신호 * 100%
도 22는 1901Ab2 및 1901Ab3이 강한 T 세포 매개 세포독성을 유도하였음을 입증한다. 본 개시된 이중특이체 결합 단백질로 96시간 동안 치료한 후, 종양 세포의 약 75%가 CD8 T 세포에 의해 사멸되었다. 1901Ab2 및 1901Ab3의 EC50 값은 각각 0.043 nM 및 0.033 nM이었다.
실시예 18: 인간화 B-h4-1BB 마우스의 피하, 동계 MC38-h클라우딘 18.2 마우스 종양 모델에서의 종양 성장에 대한 CLDN18.2/CD137 BsAb 1901Ab2의 효과
체중 16-20 g인 6-8주령의 암컷 B-h4-1BB 마우스(Biocytogen)를 연구 시작 전 7일 동안 순응시켰다. MC38 쥣과 결장 암종 세포주를 인간 클라우딘 18.2를 과발현하도록 유전자적으로 변형시켰다. 세포를 5%의 분위기 37℃에서 10% 열-불활성화 FBS가 보충된 DMEM 중 단층 배양물로서 시험관 내에서 유지하였다. 세포를 수확하고, 종양 발생을 위해 100 μl의 PBS 중 5 x 105개 세포를 우측 전방 옆구리에 피하 이식하였다. 7일차에, 종양 보유 마우스를 평균 종양 크기가 약 100-150 mm3인 3개의 시험군(각 군은 6마리의 마우스로 구성됨)에 무작위로 등록시켰다. 종양 크기는 캘리퍼를 사용하여 2차원적으로 주 2회 측정하였고, 종양의 부피는 다음 식을 사용하여 mm3 단위로 표현하였다. V = 0.5 a Х b2, 식 중 a 및 b는 각각 종양의 장변(long) 치수 및 단변(short) 치수이다. 7, 10, 14, 및 17일차에, 마우스를 5 mg/kg의 1901Ab2 또는 PBS 대조군을 복강내 주사로 치료하였다. 연구는 34일차에 종료되었다.
도 23은 2개의 치료군에 대한 종양 성장 곡선을 나타낸다. 1901Ab2는 PBS 치료 대조군과 비교하여 종양 성장을 유의하게 억제하였다. 1901Ab2가 주사된 6마리의 마우스 중 4마리는 34일차에 완전한 종양 관해를 나타냈다.
실시예 19: 세포 표면 상에서의 넥틴 4에 대한 넥틴-4/CD137 BsAb의 결합
실시예 4에 기술된 바와 같이 이중특이체 넥틴-4/CD137 결합 단백질을 생성하고, 생산하고, 정제하였다. 넥틴 4에 대한 BsAb 1925Ab1, 1925Ab2 및 1925Ab3의 결합 활성을 조사하기 위해, 인간 넥틴 4를 발현하는 CHO 세포를 면역형광 결합 분석에 사용하였다. 세포를 10% FBS와 함께 F12K 배지에서 배양하였다. 실험 당일, 세포를 수집하고, 세척하고, 4℃에서 2시간 동안 결합 단백질로 염색한 다음, 실온에서 15분 동안 파라포름알데히드로 세포를 고정시켰다. 개시된 항체 1925Ab1, 1925Ab2 및 1925Ab3은 넥틴-4 및 CD137 둘 모두에 결합하는 이중특이체 항체이다. 단일특이체 항체 1925Ab4(부모 쥣과 항체)는 넥틴-4에만 결합하며, 이는 대조군 항체로서 사용된다. 이어서, 고정된 세포를 PBS로 3회 세척한 다음, 검출을 위해 세포를 실온에서 Alexa Fluor® 488 염소 항-인간 IgG 항체(Invitrogen, Cat#: A-11013)로 1시간 동안 염색하였다. iQue Screener PLUS(Sartorius, MI)를 사용하여 형광 강도를 정량화함으로써 결합 신호를 평가하였다.
도 24에 나타낸 바와 같이, 10 μg/ml의 농도에서, 1925Ab1, 1925Ab2 및 1925Ab3을 포함하는 본 개시된 이중특이체 결합 단백질은 대조군 단클론 항체 1925Ab4와 비교하여, CHO 상의 인간 넥틴 4에 대해 유사하게 결합하였다.
실시예 20: 세포 표면 상에서의 CD137에 대한 넥틴-4/CD137 BsAb의 결합
면역형광 영상화 검정을 사용하여 BsAbs 1925Ab1, 1925Ab2 및 1925Ab3의 결합 친화도를 평가하였다. 10% FBS가 포함된 DMEM을 함유하는 완전 배지에 인간 CD137을 안정적으로 발현하는 HEK293T-huCD137 세포를 도말한 다음, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 세포를 4℃에서 2시간 동안 본 개시된 결합 단백질과 결합시킨 다음, 실온에서 15분 동안 파라포름알데히드로 세포를 고정시켰다. 개시된 항체 1925Ab1, 1925Ab2 및 1925Ab3은 넥틴-4 및 CD137 둘 모두에 결합하는 이중특이체 항체이다. 단일특이체 항-CD137 항체 1923Ab4는 단지 CD137에만 결합하며, 이는 대조군 항체로서 사용된다. 고정된 세포를 PBS로 3회 세척한 다음 검출을 위해 실온에서 Alexa Fluor® 488 염소 항-인간 IgG 항체(Invitrogen, Cat#: A-11013)로 1시간 동안 염색하였다. 세포를 이미징하고 Cytation Imager(Biotek, VT)을 사용하여 형광 강도를 정량화함으로써 결합 신호를 평가하였다.
도 25에 나타낸 바와 같이, 10 μg/ml의 농도에서, 1925Ab1, 1925Ab2 및 1925Ab3을 포함하는 본 개시된 이중특이체 결합 단백질은 이들의 단클론 항체 대조군 1923Ab4와 같이, 세포 상에서 인간 CD137에 대해 유사하게 결합하였다.
실시예 21: 넥틴-4/CD137 BsAb에 의한 CD137 신호전달의 표적 세포 의존성 활성화
넥틴-4/CD137 BsAb 1925Ab1, 1925Ab2, 1925Ab3을 표적 세포 의존성 CD137 작용을 유도하는 이들의 능력에 대해 평가하였다. 요약하면, CD137을 안정적으로 발현하고 NFkB-luc 리포터를 함유하는 Jurkat T 리포터 세포주를 사용하여 CD137 신호 전달을 정량화하였다. 인간 넥틴 4로 안정적으로 형질감염된 CHO 세포(CHO-넥틴 4)를 표적 세포로서 사용하였다. Jurkat T 리포터 세포를 CHO-넥틴 4 표적 세포를 포함하거나 포함하지 않고 공동 배양하고, 본 개시된 결합 단백질로 37℃에서 5% CO2로 16시간 동안 자극하였다. 이어서 ONE-GloTM 루시페라아제 시약(Promega, Cat #: E6130)을 첨가하고, 플레이트를 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 개시된 항체 1925Ab1, 1925Ab2 및 1925Ab3은 넥틴-4 및 CD137 둘 모두에 결합하는 이중특이체 항체이다. 단일특이체 항체 우렐루맙-NR은 단지 CD137에만 결합하며, 이는 대조군 항체로서 사용된다. Synergy Neo2 플레이트 판독기(Biotek)로 발광 신호를 측정하고, GraphPad Prism으로 데이터를 분석하였다.
우렐루맙-NR은 공개적으로 이용 가능한 우렐루맙 서열에 기초하여 NovaRock Biotherapeutics에 의해 생성되었다. 도 26a는, 예상된 바와 같이, 우렐루맙-NR이 CHO-넥틴 4 표적 세포의 존재와 독립적으로 CD137 신호전달을 활성화하였음을 입증한다. 대조적으로, 1925Ab1, 1925Ab2 및 1925Ab3은 CHO-넥틴 4 표적 세포의 존재 하에서만 CD137 신호전달을 유도하였다. 또한, 1925Ab1, 1925Ab2 및 1925Ab3은 NUGC4 표적 세포의 존재 하에서 우렐루맙-NR보다 더 강력한 CD137 신호전달을 유도하였다. 이러한 결과는, 결합 단백질이 CHO 세포의 세포 표면 상에서 발현되는 넥틴 4와 결합했을 경우 본 개시된 이중특이체 결합 단백질이 단지 CD137 작용만을 나타냈음을 입증한다. 이들 개시된 이중특이체 결합 단백질의 작용 활성은 CHO-넥틴 4 세포의 부재 시 검출되지 않았다.
도 26b는 NUGC4 세포의 존재 하에서 CD137 신호전달을 유도하는 데 있어서의 1925Ab1, 1925Ab2, 1925Ab3, 및 우렐루맙-NR의 투여량 반응 곡선을 나타낸다. 1925Ab1, 1925Ab2, 1925Ab3, 및 우렐루맙-NR의 EC50 값(효능)은 각각 0.027 nM, 0.080 nM, 0.049 nM 및 0.26 nM이었다. 1925Ab1, 1925Ab2 및 1925Ab3을 포함하는 본 개시된 이중특이체 결합 단백질은 CD137 신호전달에 있어서 우렐루맙-NR보다 더 양호한 EC50 값 및 보다 높은 신호 전달 강도(E최대)를 나타냈다.
실시예 22: 마우스 간에서의 항체 유래 면역 세포 침윤의 평가
간 독성은 이전의 CD137 작용제 항체 치료제 중 일부의 알려진 부작용이다. 우렐루맙은 ≥ 0.3 mg/kg의 투여량에서 0.1 mg/kg의 최대 내약 투여량(MTD)으로 염증성 간독성을 유도하는 것으로 보고되었으며, 이는 이의 치료 윈도우를 제한한다(Segal NH 등의 문헌[Clin Cancer Res. 2017;23(8):1929-1936]). 이전의 연구에 따르면, 우렐루맙에 의한 간 독성은 간에서의 면역 세포 침윤 및 혈청 ALT 수치의 유의한 상승으로 나타나는 간 염증에 기인한다(Zhang H 등의 문헌[Journal for ImmunoTherapy of Cancer 2020;8]).
CD137 및 종양 연관 항원(TAA)에 결합하는 이중특이체 항체는 종양 미세환경(TME)에 대해 표적화된 강력한 공자극의 이점 및 치료 윈도우를 확장할 수 있는 간 염증/간독성의 위험 감소를 제공한다.
본 개시된 이중특이체 TAA-CD137 항체의 보다 낮은 간 독성을 입증하기 위해, 16-20 g의 체중을 갖는 6-8주령의 암컷 B-h4-1BB 마우스(Biocytogen)를 연구 등록 전 7일 동안 순응시켰다. B-h4-1BB 마우스를 3개의 시험군에 무작위로 등록시켰다. 각각의 군은 6마리의 마우스로 구성되었다. 0, 3, 7, 및 10일차에, 10 mg/kg의 우렐루맙-NR, 1912Ab5 또는 음성 대조군으로서 PBS의 복강내 주사로 마우스를 치료하였다. 연구는 13일차에 종료되었다. 각각의 치료군으로부터의 간을 포르말린 고정하고 파라핀 포매하였다. 5 mm의 FFPE 조직 절편으로 형광 IHC를 수행하였다. 파라핀 제거 후, 면역 세포 식별을 위해 CD4, CD8 T 세포 및 대식세포를 검출하는 일차 항체로 슬라이드를 염색하였다.
도 27에서, 마우스 CD4(A), CD8(B) T 세포, 및 마우스 대식세포(C) 침윤은 우렐루맙-NR 치료 마우스에서만 유의하게 증가하였으며, 1912Ab5 치료 마우스에서는 그렇지 않았다.
실시예 10, 도 11b 및 도 11c와 일관적으로, 1912Ab5에 의해 유도된 면역 세포 침윤의 결여는 CLDN6/CD137 bsAb-유래 간독성의 위험이 낮다는 것을 나타낸다.
달리 명시되지 않는 한, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 성분의 양, 특성, 예컨대, 분자량, 반응 조건 등을 표현하는 모든 숫자는, 모든 경우에 용어 "약"을 동반하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 달리 명시적으로 나타내지 않는 한, 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 제시된 수치 파라미터는 본 개시에 의해 얻고자 하는 원하는 특성에 따라 달라질 수 있는 대략적인 값이다. 적어도, 청구범위의 범주에 대한 균등론의 적용을 제한하려는 시도로서가 아니라, 각각의 수치 파라미터는 적어도 보고된 유효 자릿수의 수를 고려하여, 그리고 통상적인 반올림 기술을 적용하여 해석되어야 한다.
본 개시에서 넓은 범위를 설명하는 수치 범위 및 파라미터는 근사치임에도 불구하고, 특정 실시예에 제시된 수치 값은 가능한 한 정확하게 보고된다. 그러나, 임의의 수치 값은 본질적으로 각각의 시험 측정에서 발견되는 표준 편차로부터 필연적으로 초래되는 소정의 오차를 포함한다.
본 개시를 설명하는 맥락에서 (특히 다음의 청구범위의 맥락에서) 사용되는 용어 "일", "하나", "그" 및 이와 유사한 참조는, 본원에서 달리 표시되거나 문맥에 의해 명백히 모순되지 않는 한, 단수형 및 복수형 둘 모두를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본원의 값의 범위의 인용은 단지 해당 범위 내에 속하는 각각의 별도의 값을 개별적으로 지칭하는 간략화 방법으로서 기능하는 것으로 의도된다. 본원에서 달리 명시되지 않는 한, 각각의 개별 값은 본원에서 마치 개별적으로 인용되는 것과 동등하게 본 명세서에 포함된다. 본원에 기술된 모든 방법은 본원에 달리 명시되지 않거나 문맥에 의해 명백히 모순되지 않는, 한 임의의 적절한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 예 그리고 모든 예, 또는 예시적인 언어(예를 들어, "예컨대")의 사용은 단지 본 개시를 보다 잘 나타내기 위한 것이며, 청구된 본 개시의 범주에 대한 제한을 달리 제기하지 않는다. 본 명세서에서의 어떠한 언어라도 본 개시의 실시에 필수적인 임의의 청구되지 않은 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본원에 개시된 본 개시의 대안적인 요소 또는 구현예의 군은 제한적인 의미로 해석되어서는 안 된다. 각각의 군의 구성원은 개별적으로 또는 해당 군의 다른 구성원 또는 본원에서 발견되는 다른 요소와의 임의의 조합으로 언급되고 청구될 수 있다. 군의 하나 이상의 구성원은 편의 및/또는 특허성을 이유로 해당 군에 포함되거나 해당 군으로부터 삭제될 수 있을 것으로 예상된다. 이러한 임의의 포괄 또는 배제가 발생할 경우, 본 명세서는 수정된 군을 포함하는 것으로 간주되며, 이에 따라 첨부된 청구범위에 사용되는 모든 마쿠시(Markush) 군의 서면 설명을 충족시킨다.
본 개시의 특정 구현예는 본 개시를 수행하기 위해 발명자에게 공지된 최상의 모드를 포함하여 본원에 설명된다. 물론, 이들 설명된 구현예에 대한 변형은 전술한 설명을 읽을 때 당업자에게 명백해질 것이다. 본 발명자는 당업자가 이러한 변형을 적절하게 사용할 것으로 예상하며, 본 발명자는 본 개시가 본원에 구체적으로 기술된 것과 달리 실시되는 것을 의도한다. 따라서, 본 개시는 관련 법률에서 허용하는 바에 따라 본 명세서에 첨부된 청구범위에 인용된 주제의 모든 변형 및 등가물을 포함한다. 또한, 전술한 요소의 모든 가능한 변형에서의 이들의 임의의 조합은 본원에서 달리 표시되거나 문맥에 의해 달리 명백히 모순되지 않는 한 본 개시에 포함된다.
본원에 개시된 특정 구현예는 "~로 이루어지는" 또는 "~로 본질적으로 이루어지는" 이라는 언어를 사용하여 청구범위에서 추가로 제한될 수 있다. 청구범위에 사용될 경우, 보정에 따라 출원되거나 추가되었는지의 여부에 관계 없이, 전환 용어 "~로 이루어지는"은 해당 청구범위에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 전환 용어 "~로 본질적으로 이루어지는"은 해당 청구범위의 범위를 특정 재료 또는 단계 및 기본적이고 신규한 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것으로 제한한다. 이렇게 청구된 본 개시의 구현예는 본질적으로 또는 명시적으로 본원에 설명되고 구현된다.
본원에 개시된 본 개시의 구현예는 본 개시의 원리를 예시하는 것임을 이해해야 한다. 사용될 수 있는 다른 변형 또한 본 개시의 범주 내에 있다. 따라서, 비제한적인 예로서, 본 개시의 대안적인 구성이 본원의 교시에 따라 이용될 수 있다. 따라서, 본 개시는 도시되고 설명된 바와 같이 정확하게 이에 한정되지 않는다.
본 개시는 다양한 특정 물질, 절차 및 실시예를 참조하여 본원에 설명되고 예시되었지만, 본 개시는 해당 목적을 위해 선택된 물질 및 절차의 특정 조합에 제한되지 않는 것으로 이해된다. 이러한 세부 사항의 많은 변형은 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이 암시될 수 있다. 본 명세서 및 실시예는 단지 예시적인 것으로 간주되고, 본 개시의 진정한 범주 및 사상은 다음의 청구범위로 표시되는 것으로 의도된다. 본 출원에서 언급된 모든 참조 문헌, 특허 및 특허 출원은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
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Claims (67)

  1. 종양 연관 항원 및 CD137에 결합하는 이중특이체 결합 단백질로서:
    (a) 종양 연관 항원에 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 종양 연관 항원에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 항체 스캐폴드 모듈;
    (b) CD137에 결합하는 제3 항원 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 제1 결합 모듈을 포함하는, 이중특이체 결합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 종양 연관 항원: 클라우딘 6, 클라우딘 18.2, 및 넥틴-4로 이루어진 군으로부터 선택되는, 이중특이체 결합 단백질.
  3. 제2항에 있어서, 종양 연관 항원은 클라우딘 6인, 이중특이체 결합 단백질.
  4. 제2항에 있어서, 종양 연관 항원은 클라우딘 18.2인, 이중특이체 결합 단백질.
  5. 제2항에 있어서, 종양 연관 항원은 넥틴-4인, 이중특이체 결합 단백질.
  6. 제1항에 있어서, 항체 스캐폴드 모듈은 IgG인, 이중특이체 결합 단백질.
  7. 제3항에 있어서, 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위 둘 모두는 클라우딘 6에 결합하고:
    (i) CDR1: 서열번호 45, CDR2: 서열번호 46, 및 CDR3: 서열번호 47을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 CDR1: 서열번호 48, CDR2: 서열번호 49, 및 CDR3: 서열번호 50을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열; 또는
    (ii) CDR1: 서열번호 51, CDR2: 서열번호 52, 및 CDR3: 서열번호 53을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 CDR1: 서열번호 54, CDR2: 서열번호 55, 및 CDR3: 서열번호 56을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 이중특이체 결합 단백질.
  8. 제7항에 있어서, 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위 둘 모두는 클라우딘 6에 결합하고, 서열번호 25 또는 서열번호 27에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 26 또는 서열번호 28에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 이중특이체 결합 단백질.
  9. 제8항에 있어서, 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위 둘 모두는 클라우딘 6에 결합하고:
    (i) 서열번호 25에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 26에 제시된 경쇄 가변 영역 서열; 또는
    (ii) 서열번호 27에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 28에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 이중특이체 결합 단백질.
  10. 제4항에 있어서, 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위 둘 모두는 클라우딘 18.2에 결합하고:
    CDR1: 서열번호 33, CDR2: 서열번호 34, 및 CDR3: 서열번호 35를 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 CDR1: 서열번호 36, CDR2: 서열번호 37, 및 CDR3: 서열번호 38을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 이중특이체 결합 단백질.
  11. 제10항에 있어서, 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위 둘 모두는 클라우딘 18.2에 결합하고, 서열번호 21에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 22에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 이중특이체 결합 단백질.
  12. 제5항에 있어서, 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위 둘 모두는 넥틴-4에 결합하고:
    CDR1: 서열번호 57, CDR2: 서열번호 58, 및 CDR3: 서열번호 59를 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 CDR1: 서열번호 60, CDR2: 서열번호 61, 및 CDR3: 서열번호 62를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 이중특이체 결합 단백질.
  13. 제12항에 있어서, 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위 둘 모두는 넥틴-4에 결합하고, 서열번호 29 또는 서열번호 31에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 30 또는 서열번호 32에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 이중특이체 결합 단백질.
  14. 제13항에 있어서, 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위 둘 모두는 넥틴-4에 결합하고:
    (i) 서열번호 29에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 30에 제시된 경쇄 가변 영역 서열; 또는
    (ii) 서열번호 31에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 32에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 이중특이체 결합 단백질.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이체 결합 단백질은 하나의 제1 결합 모듈을 포함하는, 이중특이체 결합 단백질.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 단백질은 2개의 제1 결합 모듈을 포함하는, 이중특이체 결합 단백질.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 결합 모듈은 항체 단편인, 이중특이체 결합 단백질.
  18. 제17항에 있어서, 항체 단편은 scFv인, 이중특이체 결합 단백질.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 결합 모듈은 CD137에 결합하는, 이중특이체 결합 단백질.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 결합 모듈은 CD137에 결합하는 scFv인, 이중특이체 결합 단백질.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 스캐폴드 모듈은 둘 모두 C-말단 및 N-말단을 갖는 2개의 중쇄 서열을 포함하고, 항체 스캐폴드 모듈은 둘 모두 C-말단 및 N-말단을 갖는 2개의 경쇄 서열을 포함하며, 제1 결합 모듈은 상기 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 하나 또는 둘 모두의 C-말단, 상기 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 하나 또는 둘 모두의 C-말단, 상기 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 하나 또는 둘 모두의 N-말단, 상기 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 하나 또는 둘 모두의 N-말단, 또는 이들의 조합에 공유 부착되고, 여기에서 제1 결합 모듈 및 항체 스캐폴드 모듈은 직접적으로 또는 인터링커를 통해 서로 공유 부착되는, 이중특이체 결합 단백질.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 결합 모듈 및 항체 스캐폴드 모듈은 서열번호 64 또는 서열번호 65에 제시된 서열을 갖는 인터링커를 통해 서로 공유 부착되는, 이중특이체 결합 단백질.
  23. 제21항에 있어서, 제1 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 둘 모두의 C-말단에 공유 부착되는, 이중특이체 결합 단백질.
  24. 제21항에 있어서, 제1 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 경쇄 서열의 둘 모두의 C-말단에 공유 부착되는, 이중특이체 결합 단백질.
  25. 제21항에 있어서, 제1 결합 모듈은 항체 스캐폴드 모듈 중쇄 서열의 둘 모두의 N-말단에 공유 부착되는, 이중특이체 결합 단백질.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 결합 모듈은 CD137에 결합하고:
    CDR1: 서열번호 39, CDR2: 서열번호 40, 및 CDR3: 서열번호 41을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 CDR1: 서열번호 42, CDR2: 서열번호 43, 및 CDR3: 서열번호 44를 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 이중특이체 결합 단백질.
  27. 제26항에 있어서, 제1 결합 모듈은 CD137에 결합하고, 서열번호 23에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 24에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 이중특이체 결합 단백질.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이체 결합 단백질은 CD137에 결합하는 2개의 결합 모듈을 포함하고, 여기에서:
    제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위 둘 모두는 클라우딘 18.2에 결합하고, 서열번호 21에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 22에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하고;
    상기 제1 결합 모듈은 각각 서열번호 23에 제시된 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 24에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하되,
    상기 제1 결합 모듈은 글리신-세린 링커에 의해 항체 스캐폴드 모듈의 각각의 중쇄의 C-말단에 별도로 부착되는, 이중특이체 결합 단백질.
  29. 제28항에 있어서, 글리신-세린 링커는 3xG4S 링커(서열번호 64)인, 이중특이체 결합 단백질.
  30. 제28항에 있어서, 제1 결합 모듈의 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열은 글리신-세린 링커에 의해 부착되는, 이중특이체 결합 단백질.
  31. 제30항에 있어서, 글리신-세린 링커는 4xG4S 링커(서열번호 65)인, 이중특이체 결합 단백질.
  32. 제28항에 있어서, 항체 스캐폴드 모듈의 중쇄, 글리신-세린 링커, 및 제1 결합 모듈은 서열번호 3에 제시된 서열을 포함하는, 이중특이체 결합 단백질.
  33. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이체 결합 단백질은 CD137에 결합하는 2개의 결합 모듈을 포함하고, 여기에서:
    제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위 둘 모두는 클라우딘 18.2에 결합하고, 서열번호 21에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 22에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하고;
    상기 제1 결합 모듈은 각각 서열번호 23에 제시된 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 24에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하되,
    상기 제1 결합 모듈은 글리신-세린 링커에 의해 항체 스캐폴드 모듈의 각각의 경쇄의 C-말단에 별도로 부착되는, 이중특이체 결합 단백질.
  34. 제33항에 있어서, 글리신-세린 링커는 3xG4S 링커(서열번호 64)인, 이중특이체 결합 단백질.
  35. 제33항에 있어서, 제1 결합 모듈의 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열은 글리신-세린 링커에 의해 부착되는, 이중특이체 결합 단백질.
  36. 제35항에 있어서, 글리신-세린 링커는 4xG4S 링커(서열번호 65)인, 이중특이체 결합 단백질.
  37. 제36항에 있어서, 항체 스캐폴드 모듈의 경쇄, 글리신-세린 링커, 및 제1 결합 모듈은 서열번호 5에 제시된 서열을 포함하는, 이중특이체 결합 단백질.
  38. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이체 결합 단백질은 CD137에 결합하는 2개의 결합 모듈을 포함하고, 여기에서:
    제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위 둘 모두는 클라우딘 6에 결합하고, 서열번호 25 또는 27에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 26 또는 28에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하고;
    상기 제1 결합 모듈은 각각 서열번호 23에 제시된 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 24에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하되,
    상기 제1 결합 모듈은 글리신-세린 링커에 의해 항체 스캐폴드 모듈의 각각의 중쇄의 C-말단에 별도로 부착되는, 이중특이체 결합 단백질.
  39. 제38항에 있어서, 글리신-세린 링커는 3xG4S 링커(서열번호 64)인, 이중특이체 결합 단백질.
  40. 제38항에 있어서, 제1 결합 모듈의 중쇄 가변 영역 서열 및 중쇄 가변 영역 서열은 글리신-세린 링커에 의해 부착되는, 이중특이체 결합 단백질.
  41. 제40항에 있어서, 글리신-세린 링커는 3xG4S 링커(서열번호 64)인, 이중특이체 결합 단백질.
  42. 제41항에 있어서, 항체 스캐폴드 모듈의 중쇄, 글리신-세린 링커, 및 제1 결합 모듈은 서열번호 12, 72 또는 13에 제시된 서열을 포함하는, 이중특이체 결합 단백질.
  43. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이체 결합 단백질은 CD137에 결합하는 2개의 결합 모듈을 포함하고, 여기에서:
    제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위 둘 모두는 넥틴-4에 결합하고, 서열번호 29 또는 31에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 30 또는 32에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하고;
    상기 제1 결합 모듈은 각각 서열번호 23에 제시된 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 24에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하되,
    상기 제1 결합 모듈은 글리신-세린 링커에 의해 항체 스캐폴드 모듈의 각각의 경쇄의 C-말단에 별도로 부착되는, 이중특이체 결합 단백질.
  44. 제43항에 있어서, 글리신-세린 링커는 3xG4S 링커(서열번호 64)인, 이중특이체 결합 단백질.
  45. 제43항에 있어서, 제1 결합 모듈의 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열은 글리신-세린 링커에 의해 부착되는, 이중특이체 결합 단백질.
  46. 제45항에 있어서, 글리신-세린 링커는 4xG4S 링커(서열번호 65)인, 이중특이체 결합 단백질.
  47. 제46항에 있어서, 항체 스캐폴드 모듈의 경쇄, 글리신-세린 링커, 및 제1 결합 모듈은 서열번호 17에 제시된 서열을 포함하는, 이중특이체 결합 단백질.
  48. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이체 결합 단백질은 CD137에 결합하는 2개의 결합 모듈을 포함하고, 여기에서:
    제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위 둘 모두는 넥틴-4에 결합하고, 서열번호 29 또는 31에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 30 또는 32에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하고;
    상기 제1 결합 모듈은 각각 서열번호 23에 제시된 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 24에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하되,
    상기 제1 결합 모듈은 글리신-세린 링커에 의해 항체 스캐폴드 모듈의 각각의 중쇄의 N-말단에 별도로 부착되는, 이중특이체 결합 단백질.
  49. 제48항에 있어서, 글리신-세린 링커는 4xG4S 링커(서열번호 65)인, 이중특이체 결합 단백질.
  50. 제48항에 있어서, 제1 결합 모듈의 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열은 글리신-세린 링커에 의해 부착되는, 이중특이체 결합 단백질.
  51. 제50항에 있어서, 글리신-세린 링커는 4xG4S 링커(서열번호 65)인, 이중특이체 결합 단백질.
  52. 제51항에 있어서, 제1 결합 모듈, 글리신-세린 링커, 및 항체 스캐폴드 모듈의 중쇄는 서열번호 18에 제시된 서열을 포함하는, 이중특이체 결합 단백질.
  53. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이체 결합 단백질은 CD137에 결합하는 2개의 결합 모듈을 포함하고, 여기에서:
    제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위 둘 모두는 넥틴-4에 결합하고, 서열번호 29 또는 31에 제시된 중쇄 가변 영역 서열; 및 서열번호 30 또는 32에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하고;
    상기 제1 결합 모듈은 각각 서열번호 23에 제시된 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열번호 24에 제시된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하되,
    상기 제1 결합 모듈은 글리신-세린 링커에 의해 항체 스캐폴드 모듈의 각각의 중쇄의 C-말단에 별도로 부착되는, 이중특이체 결합 단백질.
  54. 제53항에 있어서, 글리신-세린 링커는 3xG4S 링커(서열번호 64)인, 이중특이체 결합 단백질.
  55. 제53항에 있어서, 제1 결합 모듈의 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열은 글리신-세린 링커에 의해 부착되는, 이중특이체 결합 단백질.
  56. 제55항에 있어서, 글리신-세린 링커는 4xG4S 링커(서열번호 65)인, 이중특이체 결합 단백질.
  57. 제56항에 있어서, 항체 스캐폴드 모듈의 중쇄, 글리신-세린 링커, 및 제1 결합 모듈은 서열번호 14에 제시된 서열을 포함하는, 이중특이체 결합 단백질.
  58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 스캐폴드 모듈은 불변 영역을 추가로 포함하는, 이중특이체 결합 단백질.
  59. 제58항에 있어서, 불변 영역은 Fc 침묵 돌연변이를 포함하는, 이중특이체 결합 단백질.
  60. 제59항에 있어서, Fc 침묵 돌연변이는 LALA 또는 N297A인, 이중특이체 결합 단백질.
  61. 제58항에 있어서, 불변 영역은 서열번호 66, 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69 또는 서열번호 73을 포함하는, 결합 단백질.
  62. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항의 이중특이체 결합 단백질 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 약학적 조성물.
  63. 암의 치료 또는 예방을 위한 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항의 이중특이체 결합 단백질을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  64. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항의 이중특이체 결합 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  65. 제64항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터.
  66. 제64항의 폴리뉴클레오티드, 및/또는 제65항의 벡터를 포함하는, 세포.
  67. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항의 이중특이체 결합 단백질의 생산 방법으로서, 상기 방법은 제66항의 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
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