CN117417390A - 一种长梗秦艽环烯醚萜类提取物的制备及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种长梗秦艽环烯醚萜类提取物的制备及应用，该制备方法包含：将长梗秦艽粉末和60～80％的乙醇混合，于55℃下提取，过滤，再于55℃下重复提取后，将提取液合并、减压回收溶剂得到浸膏；将浸膏溶解后用AB‑8大孔树脂柱上样，依次用浓度为30％、40％、60％、80％和95％的乙醇进行梯度洗脱，收集并合并40％和60％乙醇洗脱部分，减压回收溶剂，冷冻干燥。本发明解决了现有长梗秦艽中的龙胆苦苷和獐牙菜苦苷的含量较低，限制了其在药效学研究和临床应用的问题。长梗秦艽环烯醚萜类活性成分对大肠杆菌的最小抑菌浓度为75mg/mL，对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为150mg/mL。

Description

一种长梗秦艽环烯醚萜类提取物的制备及应用
技术领域
本发明涉及一种长梗秦艽的提取物，具体涉及一种长梗秦艽环烯醚萜类提取物的制备及应用。
背景技术
长梗秦艽(Gentiana waltonii Burk)为龙胆科龙胆属多年生草本，为秦艽、粗茎秦艽、小秦艽和麻花秦艽的的同属近缘植物，主要分布在四川西北部、青海、甘肃和西藏自治区的拉萨、林芝、浪卡子和日喀则等地，多生于海拔为3000～4800米左右的山坡草地、山坡砾石地及林下。
长梗秦艽是藏药“解吉那保”的基原植物之一，多以其花、干燥根入药，其根具有祛风除湿、活络止痛的作用。在涉藏地区，长梗秦艽作为民间用药的历史悠久，在人医和兽医临床应用中常用来作为医治风湿关节炎、结核病潮热、黄疸、抗炎和疼痛等的主药之一，多用于治疗风湿性关节炎及肝胆疾病。近年来，随着道地药材的需求量不断攀升，过度采挖等原因致使长梗秦艽的野生资源临近濒危，已将其同属植物列为重点保护的野生植物。现代药理学研究表明，龙胆属药用植物的化学成分以环烯醚萜类成分为主，如含量较高的龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷和落干酸等，通常具有苦味，具有抗感染、抗氧化、保肝利胆、抗肿瘤、抗炎、镇痛、降血糖、通便和增强免疫等多种药理活性。
此外，长梗秦艽还含有含量较低的龙胆苦苷等，由于其含量相对较低在一定程度上限制了其药效学研究和临床应用。因此，长梗秦艽的研究主要集中在化学成分的分离鉴定及其含量分析等方面，而对于其抗菌活性评价及其物质基础等系统性研究尚属空白。
发明内容
本发明的目的是提供一种长梗秦艽环烯醚萜类提取物的制备及应用，解决了现有长梗秦艽中的龙胆苦苷和獐牙菜苦苷的含量较低，限制了其在药效学研究和临床应用的问题。
为了达到上述目的，本发明提供了一种长梗秦艽环烯醚萜类提取物的制备方法，该包含：
(1)将长梗秦艽粉末和60～80％的乙醇混合，于55℃下提取，过滤后得到长梗秦艽渣；
(2)将长梗秦艽渣于55℃下重复提取后，将乙醇提取液合并、减压回收溶剂得到浸膏：将得到的浸膏溶解后用AB-8大孔树脂柱上样，依次用浓度为30％、40％、60％、80％和95％的乙醇进行梯度洗脱(用不同的体积分数乙醇进行环烯醚萜类成分的梯度洗脱，以分析环烯醚萜类成分主要集中在某个梯度乙醇的洗脱液中，然后对之进行富集以提高环烯醚萜类成分)，收集并合并40％和60％乙醇洗脱部分，减压回收溶剂，冷冻干燥得到长梗秦艽环烯醚萜类提取物；其中，所述重复提取的次数为3次以上。
优选地，在步骤(1)中，所述提取的时间为60～150min。
更优选地，所述提取的时间为120min。
优选地，在步骤(1)中，所述乙醇的浓度为80％。
优选地，在步骤(1)中，所述长梗秦艽粉末和乙醇的质量体积比为1g∶(10～30)mL。
更优选地，所述长梗秦艽粉末和乙醇的质量体积比为1g∶20mL。
本发明还提供了一种如所述的制备方法制得的长梗秦艽环烯醚萜类提取物。
优选地，该提取物含有环烯醚萜类活性成分。
本发明还提供了一种如所述的长梗秦艽环烯醚萜类提取物在制备防治大肠杆菌或/和金黄色葡萄球菌药物中的应用。
优选地，长梗秦艽环烯醚萜类提取物对大肠杆菌的最小抑菌浓度为75mg/mL，对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为150mg/mL。
本发明的一种长梗秦艽环烯醚萜类提取物的制备及应用，解决了现有长梗秦艽中的长梗秦艽酮含量相对较低和稳定性较差，限制了其在药效学研究和临床应用，具有以下优点：
1、与现有技术相比，本发明较低的最小抑菌浓度是主要由药物和菌株来源两个因素决定的，本发明自然采集甘孜州理塘县野生的新鲜药材具有来源和技术专属性。目前长梗秦艽尚无人工种植和药店出售，不能直接从人工种植或药店购买获得。
2、本发明仅用乙醇作为提取溶剂对采自理塘县的野生长梗秦艽进行总环烯醚萜类成分粗提，同时采用不同浓度梯度乙醇对粗提物进行梯度洗脱，进一步精制总环烯醚萜类成分，能够避免现有技术使用多种有毒有害溶剂而增加提取物中有机溶剂残留引起潜在毒性的弊端。
3、本发明仅通过正交设计对长梗秦艽的总环烯醚萜类成分进行提取工艺优化，结果显示同样条件下龙胆苦苷和獐牙菜苦苷的含量较高，且表现出较强的抗菌活性。
4、本发明对长梗秦艽环烯醚萜类成分进行体外抗大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性实验得知，长梗秦艽环烯醚萜类活性成分对大肠杆菌的最小抑菌浓度为75mg/mL，对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为150mg/mL。同时其对致泻大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混合感染引起的犊牦牛腹泻病的防治效果，长梗秦艽环烯醚萜组的治疗效果与庆大霉素组差异不显著，为长梗秦艽环烯醚萜类成分的临床应用提供治疗参考和数据支持。
附图说明
图1为本发明龙胆苦苷和獐牙菜苦苷的标准曲线图。
图2为本发明混合标准品溶液和供试品溶液的HPLC色谱图。
图3为本发明乙酸-铜离子的显色反应图。
图4为本发明乙醇体积分数对长梗秦艽环烯醚萜类活性成分提取率的影响结果图。
图5为本发明料液比对长梗秦艽环烯醚萜类活性成分提取率的影响结果图。
图6为本发明提取时间对长梗秦艽环烯醚萜类活性成分提取率的影响结果图。
图7为本发明不同正交设计试验组对长梗秦艽环烯醚萜类活性成分提取率的影响结果图。
图8为本发明采用微量肉汤稀释法验证药物敏感性结果图。
图9为本发明采用多点接种仪法验证药物敏感性结果图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例及实验例中涉及的试剂、药物、菌株和仪器等，具体如下：
1、试剂与药物
长梗秦艽全草于2022年7月中旬采自四川省甘孜州理塘县(北纬30°15′，东经100°65′)，经西南民族大学兽医药理学与毒理学实验室陈朝喜副教授鉴定为龙胆科龙胆属植物长梗秦艽(Gentiana waltonii Burk)的全草，药物标本编号并保存在兽医药理学与毒理学实验室。
试验中用到的主要试剂如表1所示。其他化学试剂均为分析纯级别，水为超纯水。
表1主要试验试剂
2、菌株
本发明中用于评价长梗秦艽环烯醚萜类成分体外抑菌活性的大肠杆菌(Escherichia coli，ATCC25922)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，ATCC43300)标准菌株保存于西南民族大学畜牧兽医学院兽医药理学与毒理学实验室。商品化致泻大肠杆菌EPECCVCC1396购自中国兽医药品监察所，商品化金黄色葡萄球菌SACICC10384购买于工业微生物保存中心。
3、仪器设备
试验中使用的主要仪器设备如表2所示。
表2主要实验仪器设备
实施例1
一种长梗秦艽环烯醚萜类提取物的制备方法，该方法包含：
(1)准确称取长梗秦艽粉末2.0g置于50mL离心管，加入40mL浓度为60％的乙醇，于55℃下提取90min，纱布过滤后得到长梗秦艽渣；
(2)将长梗秦艽渣于55℃下再次提取；重复操作三次后，将合并的乙醇浸提液减压回收溶剂得到浸膏，加水溶解后用AB-8大孔树脂柱上样，依次用浓度为30％、40％、60％、80％和95％的乙醇进行梯度洗脱，收集并合并40％和60％乙醇洗脱部分，减压回收溶剂后冷冻干燥成冻干粉，得到长梗秦艽环烯醚萜类组分的提取物冻干粉。
实验例1考察长梗秦艽环烯醚萜类活性成分提取率的影响因素
以长梗秦艽全草为原料，洗净根部泥土后去除干枯茎叶，自然风干后粉碎机粉碎，过80目药典筛，在55℃温度条件下，选取对提取率影响较大的乙醇体积分数、料液比、提取时间等因素进行单因素试验考察，以热回流提取法进行提取。
1、对照品的配制
一种龙胆苦苷和獐牙菜苦苷对照品及其混合样本溶液的制备方法，该方法包含：
(1)分别精密称取龙胆苦苷和獐牙菜苦苷对照品5.00mg装于5mL棕色容量瓶中，加入甲醇溶液1mL超声溶解，冷却到室温并将其摇匀后定容，得到龙胆苦苷对照品溶液和獐牙菜苦苷对照品溶液。
(2)分别取500μL上述龙胆苦苷对照品溶液和獐牙菜苦苷对照品溶液，混合均匀后配制成龙胆苦苷、獐牙菜苦苷的质量浓度分别为0.5mg/mL的混合对照品溶液。
(3)龙胆苦苷和獐牙菜苦苷标准曲线绘制：分别精密移取0.5mg/mL的龙胆苦苷、獐牙菜苦苷的混合对照品溶液12.5、25、50、100、200μL至容量瓶中，甲醇定容后配制成终浓度为7.8125、15.625、31.25、62.5、125、250、500μg/mL的溶液，然后在龙胆苦苷和獐牙菜苦苷高效液相色谱检测条件下依次进样，以浓度(X)作为横坐标，峰面积(Y)作为纵坐标，分别绘制龙胆苦苷和獐牙菜苦苷的标准曲线。其中，龙胆苦苷和獐牙菜苦苷高效液相色谱检测条件：色谱系统利用PerkinElmer Altus-10高效液相色谱仪，C18色谱柱(Thermo ScientificAcclaim 120，4.6×250mm，5μm)，按下列表3中的流动相条件进行样品分析(流动相A：甲醇；流动相B：水；检测波长：254nm；3D图谱)。
表3 HPLC流动相梯度洗脱条件
如图1所示，本发明龙胆苦苷和獐牙菜苦苷的标准曲线图，其中A为龙胆苦苷标，B为獐牙菜苦苷。由图1可知，绘制得到的龙胆苦苷的回归方程为Y＝8207.6X+2384.6，R2＝0.9998，獐牙菜苦苷的回归方程为Y＝8715.9X+15.19，R2＝0.9999。表明在7.8125～500μg/mL范围内龙胆苦苷、獐牙菜苦苷均存在较好的线性关系。
2、考察乙醇体积分数因素
考察乙醇体积分数对长梗秦艽环烯醚萜类活性成分提取率的影响，其具体的过程为：准确称取长梗秦艽粉末2.0g置于50mL离心管，分别加入40mL浓度为40％、50％、70％、80％的乙醇，于55℃下提取90min，纱布过滤后将药渣在相同提取条件下再次提取，重复操作三次后将合并的乙醇浸提液减压回收溶剂得到浸膏，加水溶解后用AB-8大孔树脂柱上样，依次用浓度为30％、40％、60％、80％和95％的乙醇进行梯度洗脱，收集并合并40％和60％乙醇洗脱部分，减压回收溶剂后冷冻干燥成冻干粉。
称量上述的冻干粉0.1g，溶于1mL“实验例1的对照品的配制”中的流动相中，流动相稀释25倍为4mg/mL的药液，0.45μm一次性微孔滤膜过滤，即得到供试品溶液；以龙胆苦苷、獐牙菜苦苷浓度为考察指标，按“实验例1的对照品的配制”中的色谱条件下依次进样进行测定并记录其峰面积，根据标准曲线换算成长梗秦艽提取液中龙胆苦苷和獐牙菜苦苷的综合质量分数。
如图4所示，本发明乙醇体积分数对长梗秦艽环烯醚萜类活性成分提取率的影响结果图。从图4可知，环烯醚萜类成分的提取效率随着乙醇浓度的增加而提高，在70％浓度时其提取效率达到最大值；随后乙醇浓度提高，其提取效率反而降低。分析其原因如下：当乙醇含量较低时，长梗秦艽环烯醚萜类活性成分的溶解力相对较低，随着乙醇含量的增加，在一定浓度范围内，长梗秦艽环烯醚萜类主要组分的溶出率逐渐增大。然而，较高的乙醇浓度下，提取物中可溶于乙醇的成分趋于饱和，其它可溶性脂肪类成分也可能同时被提取出来，与环烯醚萜的有效活性成分发生竞争，从而导致其溶解度下降。因此，本发明最终确定70％乙醇体积分数为中心水平，在后续进行正交设计试验优化长梗秦艽环烯醚萜类成分的最佳提取工艺。
3、考察不同料液比因素
考察不同料液比对长梗秦艽环烯醚萜类活性成分提取率的影响，其具体的过程为：准确称取长梗秦艽粉末2.0g置于50mL离心管，分别加入10、15、20、25、30倍量的70％乙醇(10、15、20、25和30倍量是指70％乙醇的体积与长梗秦艽粉末重量的倍数，即料液比)，于55℃下提取90min，纱布过滤后将药渣在相同提取条件下再次提取，重复操作三次后将合并的乙醇浸提液减压回收溶剂得到浸膏，加水溶解后用AB-8大孔树脂柱上样，依次用30％、40％、60％、80％和95％乙醇梯度洗脱，收集并合并40％和60％乙醇洗脱部分，减压回收溶剂后冷冻干燥成冻干粉。
称量上述的冻干粉0.1g，溶于1mL“实验例1的对照品的配制”中的流动相中，流动相稀释25倍为4mg/mL的药液，0.45μm一次性微孔滤膜过滤，即得到供试品溶液；以龙胆苦苷、獐牙菜苦苷浓度为考察指标，按“实验例1的对照品的配制”中的色谱条件下依次进样进行测定并记录其峰面积，根据标准曲线换算成长梗秦艽提取液中龙胆苦苷和獐牙菜苦苷的综合质量分数。
如图5所示，本发明料液比对长梗秦艽环烯醚萜类活性成分提取率的影响结果图。从图5可知，在料液比从1∶10开始不断增加的情况下，环烯醚萜类活性成分的提取率也随之提高，当料液比达到1∶20时，提取率达到了最大值，但随着料液比继续增加，其提取率出现了降低的趋势。分析其原因可能是料液比较低时，环烯醚萜活性成分不能充分溶解，增加料液比时可以提高环烯醚萜类活性成分的溶解率，且随着料液比的增加混合更为均匀，接触面积也会变大，更有利于环烯醚萜类活性成分的溶解；但随着环烯醚萜类活性成分的持续溶解，料液比的增大则会导致植物药材细胞内和细胞外的浓度差减小，从而使其渗透压力降低，对环烯醚萜类活性物质的溶出产生一定的影响，而且由于料液比过大，导致了溶剂的挥发和浓缩负担过大，因此在确保提取效率的前提下，应尽可能地降低溶剂的使用量。因此，本发明最终选择料液比1∶20作为中心水平，在后续进行正交设计试验优化长梗秦艽环烯醚萜类成分的最佳提取工艺。
4、考察提取时间因素
考察提取时间对长梗秦艽环烯醚萜类活性成分提取率的影响，其具体的过程为：准确称取长梗秦艽粉末2.0g置于50mL离心管，加入40mL的60％乙醇，分别于55℃下提取30min、60min、120min、150min，纱布过滤后将药渣在相同提取条件下再次提取，重复操作三次后将合并的乙醇浸提液减压回收溶剂得到浸膏，加水溶解后用AB-8大孔树脂柱上样，依次用30％、40％、60％、80％和95％乙醇梯度洗脱，收集并合并40％和60％乙醇洗脱部分，减压回收溶剂后冷冻干燥成冻干粉。
称量上述的冻干粉0.1g，溶于1mL“实验例1的对照品的配制”中的流动相中，流动相稀释25倍为4mg/mL的药液，0.45μm一次性微孔滤膜过滤，即得到供试品溶液；龙胆苦苷、獐牙菜苦苷作为龙胆属的主要活性成分，以龙胆苦苷、獐牙菜苦苷浓度为考察指标，按“实验例1的对照品的配制”中的色谱条件下依次进样进行测定并记录其峰面积，根据标准曲线换算成长梗秦艽提取液中龙胆苦苷和獐牙菜苦苷的综合质量分数。
如图6所示，本发明提取时间对长梗秦艽环烯醚萜类活性成分提取率的影响结果图。从图6可知，当提取时间在30min～90min范围时，环烯醚萜类活性成分的提取率逐渐上升，可能是因为提取时间太短，提取溶剂无法充分渗透从而将环烯醚萜类活性成分提取出来，致使提取率较低；而当提取时间大于90min时，环烯醚萜类活性成分的提取率逐步降低，可能是因为提取时间太长，环烯醚萜类活性成分中的某些活性成分的稳定性降低，加上一些非环烯醚萜类物质也不断溶解，可能与环烯醚萜类活性成分的溶解形成竞争性抑制导致提取率降低。故以提取时间90min为中心水平，在后续进行正交设计试验优化长梗秦艽环烯醚萜类成分的最佳提取工艺。
5、正交设计试验
以分析上述实验例1的部分1～3的乙醇体积分数(60％、70％和80％)、料液比(1∶20、1∶25和1∶30)和提取时间(60min、90min和120min)作为考察因素，进行三因素三水平的L9(33)正交设计试验(详见表4)，以龙胆苦苷、獐牙菜苦苷浓度为考察指标，确定长梗秦艽环烯醚萜类活性成分的最佳提取工艺。根据最佳提取工艺参数，进行三次独立的重复性试验，验证最佳提取工艺的重复性和可行性。
表4 L9(33)正交因素水平表
该实验的，其具体的过程为：称取长梗秦艽粉末2.0g置于50mL离心管，按照表4中的不同因素水平组合进行提取，纱布过滤后将药渣在相同提取条件下再次提取，重复操作三次后将合并的乙醇浸提液减压回收溶剂得到浸膏，加水溶解后用AB-8大孔树脂柱上样，依次用30％、40％、60％、80％和95％乙醇梯度洗脱，收集并合并40％和60％乙醇洗脱部分，减压回收溶剂后冷冻干燥成冻干粉。
称量上述的冻干粉0.1g，溶于1mL“实验例1的对照品的配制”中的流动相中，流动相稀释25倍为4mg/mL的药液，0.45μm一次性微孔滤膜过滤，即得到供试品溶液；以龙胆苦苷、獐牙菜苦苷浓度为考察指标，按“实验例1的对照品的配制”中的色谱条件下依次进样进行测定并记录其峰面积，根据标准曲线换算成长梗秦艽提取液中龙胆苦苷和獐牙菜苦苷的综合质量分数。
如图7所示，本发明不同正交设计试验组对长梗秦艽环烯醚萜类活性成分提取率的影响结果图。结合图7的正交设计试验分析结果可以得知：各因素(乙醇体积分数、提取时间、料液比)对长梗秦艽环烯醚萜类活性成分提取率的影响大小顺序为A>C>B，即溶剂乙醇体积分数＞提取时间＞料液比；最优提取条件为A3B1C3，即乙醇体积分数为80％，料液比1∶20，提取时间120min的提取条件下长梗秦艽环烯醚萜类活性成分提取效率最高(详见表5)。因此，最终确定长梗秦艽环烯醚萜类成分的最佳提取条件为：乙醇体积分数为80％，料液比1∶20，提取时间120min。
表5正交设计试验结果
此外，根据最佳提取工艺条件，进行三次独立的重复性试验以验证其可行性。从表6中可以看出，该提取工艺重复性较好，具有较强的可行性，能够保证长梗秦艽环烯醚萜类活性成分提取率的最优化。
表6最佳提取工艺验证性试验
实验例1定性鉴别
分别采用高效液相色谱法和乙酸-铜离子反应显色反应对实施例1、2得到的供试品溶液中环烯醚萜类成分进行定性鉴别。
液相色谱法：以龙胆苦苷和獐牙菜苦苷对照品溶液为对照，按照“实验例1的对照品的配制”中的色谱条件，将实施例1、2中的各供试品溶液进行定性检测并记录其色谱图，在龙胆苦苷和獐牙菜苦苷对照品对应的保留时间处出现色谱峰，证实含有环烯醚萜类成分。
如图2所示，本发明混合标准品溶液和供试品溶液的HPLC色谱图，其中A为混合标准品溶液，B为供试品溶液。从图2可以看出，长梗秦艽供试品溶液中除了含有混合标准品溶液HPLC色谱图(图2的A)对应的峰1(獐牙菜苦苷)和峰2(龙胆苦苷)外，还含有峰3、峰4等成分(图2的B)。
乙酸-铜离子显色反应：将实施例1、2中的各供试品溶液冻干，取少量冻干粉分别溶于400μL乙酸，同时加入400μL硫酸铜溶液(乙酸：铜离子＝1：1)，在60℃下水浴加热15min，观察其显色变化，显蓝色反应为阳性反应。
如图3所示，本发明乙酸-铜离子的显色反应图。由图3可知，乙酸-铜离子反应显色结果表明，长梗秦艽环烯醚萜类成分提取物溶于乙酸后，加入少量铜离子，水浴加热后显示蓝绿色，表明其含有环烯醚萜类活性成分。
实验例2抗菌活性试验
1、制备菌悬液
将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌标准菌株分别接种到LB肉汤中，37℃恒温培养箱中培养8～16h进行活化以获得活化菌株；移液枪吸取200μL LB肉汤活化菌株至96孔板中，使用酶标仪测其在600nm下的吸光度，将活化后菌液用LB肉汤稀释配制成0.5麦氏比浊度，此时细菌浓度约为108CFU/mL；将体积比为1∶1000的细菌菌液(浓度为108CFU/mL)与MH肉汤进行稀释，得到菌液浓度约为105CFU/mL的菌悬液。
2、微量肉汤稀释法测MIC
采用微量肉汤稀释法测定长梗秦艽环烯醚萜类提取物大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的标准菌株体外抗菌活性，测定最小抑菌浓度(MIC值)，具体步骤如下：
准确称取0.3g冻干粉(实施例1制得的)溶于1mL灭菌水中制备300mg/mL浓度的药液，在96孔板第2～12列各孔加入100μL配制好并经过高压灭菌的LB肉汤，在第1列的A1、B1、D1、E1各孔加入200μL浓度为300mg/mL的药液，在第2列的各孔加入100μL浓度为300mg/mL的药液，然后第2～12列各孔用移液枪吹打3～5次使其混合均匀，使得1～11列(即为A1～A11、B1～B11、D1～A11和E1～E11)从左至右各孔中药液倍比稀释浓度依次为300mg/mL、150mg/mL、75mg/mL、37.5mg/mL、18.75mg/mL、9.38mg/mL、4.69mg/mL、2.34mg/mL、1.17mg/mL、0.59mg/mL、0.29mg/mL、0.14mg/mL；A1～A11、B1～B11各孔均加入100μL大肠杆菌菌悬液(浓度约为105CFU/mL的菌悬液)，D1～D11、E1～E11各孔均加入100μL金黄色葡萄球菌菌悬液(浓度约为105CFU/mL的菌悬液)，并用移液枪吹打3～5次将药液与菌液混合均匀，第12列作为阴性对照；将其放置于37℃恒温培养箱中8h后进行观察，试验重复操作三次。同时，为了避免药液本身浑浊无法肉眼观察判断最小抑菌浓度，采用肉汤添加红四氮唑(TTC)结合多点接种仪法判定MIC：在96孔板的每个孔中加入40μL 0.5％的TTC溶液，放置0.5h后眼观96孔板内溶液的颜色变化情况，澄清无红色沉淀的孔对应的最低药物浓度为该药物的MIC；为了确保MIC判定结果的准确性，将96孔板在恒温培养箱中培养8h后，使用多点接种仪器将96孔板溶液转印至琼脂培养基，并将其放于37℃恒温培养箱中继续培养8h后观察结果。
如图8所示，本发明采用微量肉汤稀释法验证药物敏感性结果图。
如图9所示，本发明采用多点接种仪法验证药物敏感性结果图。
由图8～9可知，在最佳提取工艺条件(乙醇体积分数为80％，料液比1:20，提取时间120min)下，长梗秦艽环烯醚萜类活性成分对大肠杆菌的最小抑菌浓度为75mg/mL，对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为150mg/mL。
3、长梗秦艽环烯醚萜类活性成分对致泻大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混合感染引起犊牦牛腹泻治疗效果评价
选取21头体重范围相差不大、日龄相近的健康犊牦牛(空白对照组、庆大霉素组和长梗秦艽环烯醚萜组，每组7头)为临床效果评价对象，对致泻大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混合感染引起的腹泻治疗效果，具体步骤为：首先，将过夜培养的致泻大肠杆菌和金黄色葡萄球菌用无菌生理盐水将其调整为109CFU/mL左右，然后按照体积比为1∶1的进行混合；每组犊牦牛禁食禁水12h后，分别按照相同的剂量灌服上述混合菌液5mL；空白对照组不作任何治疗处理，庆大霉素组按3mg/kg·bw的剂量(庆大霉素)灌服5天，长梗秦艽环烯醚萜组同时按3g/天/头的剂量(长梗秦艽环烯醚萜)灌服5天，期间仔细观察并记录各组动物腹泻次数及用药反应等情况，以腹泻率和腹泻指数评价临床治疗效果。
腹泻率＝腹泻犊牦牛头次/(试验犊牦牛头数×试验天数)×100％
腹泻指数＝腹泻率×腹泻评分
长梗秦艽环烯醚萜类活性成分对致泻大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混合感染引起犊牦牛腹泻治疗效果评价结果见表7：
5天喂养试验中，空白对照组、庆大霉素组和长梗秦艽环烯醚萜组发生腹泻的犊牦牛的头数分别为6头、3头、3头，腹泻的天数分别4天、3天、3天；空白对照组、庆大霉素组和长梗秦艽环烯醚萜组犊牦牛腹泻评分分别为4分、2分、3分。与空白对照组相比，庆大霉素组和长梗秦艽环烯醚萜组腹泻次数、腹泻率及外在表现等均得到不同程度地改善，其中长梗秦艽环烯醚萜组的治疗效果与庆大霉素组差异不显著。
表7长梗秦艽环烯醚萜对致泻大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混合感染所致引起犊牦牛泻的治疗效果
注：*与空白对照组比较差异性显著；#与庆大霉素组比较差异性不显著。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims (10)

1.一种长梗秦艽环烯醚萜类提取物的制备方法，其特征在于，该制备方法包含：
(1)将长梗秦艽粉末和60～80％的乙醇混合，于55℃下提取，过滤后得到长梗秦艽渣；
(2)将长梗秦艽渣于55℃下重复提取后，将乙醇提取液合并、减压回收溶剂得到浸膏；将得到的浸膏溶解后用AB-8大孔树脂柱上样，依次用浓度为30％、40％、60％、80％和95％的乙醇进行梯度洗脱，收集并合并40％和60％乙醇洗脱部分，减压回收溶剂，冷冻干燥得到长梗秦艽环烯醚萜类提取物；
其中，所述重复提取的次数为3次以上。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述提取的时间为60～150min。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述提取的时间为120min。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述乙醇的浓度为80％。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述长梗秦艽粉末和乙醇的质量体积比为1g∶(10～30)mL。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述长梗秦艽粉末和乙醇的质量体积比为1g∶20mL。
7.一种如权利要求1-6任一项所述的制备方法制得的长梗秦艽环烯醚萜类提取物。
8.根据权利要求7所述的长梗秦艽环烯醚萜类提取物，其特征在于，该提取物含有环烯醚萜类活性成分。
9.一种如权利要求7所述的长梗秦艽环烯醚萜类提取物在制备防治大肠杆菌或/和金黄色葡萄球菌药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，长梗秦艽环烯醚萜类提取物对大肠杆菌的最小抑菌浓度为75mg/mL，对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为150mg/mL。
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