CN117396077A - 用于实验室生长肉和其他应用的生长因子 - Google Patents

Abstract

本披露总体上涉及例如，用于生产基于细胞的肉类和其他培育产品的改良的细胞培养生长培养基，或应用。例如，某些实施例涉及包含血小板裂解物(PL)和富血小板血浆(PRP)的细胞培养生长因子补充剂。例如，这样的溶液可以用于通过提高细胞增殖的速率和频率来增加生物反应器中的细胞生物质。在一些实施例中，从活体动物的全血中分离富血小板血浆。富血小板血浆中的血小板可以例如通过离心进行浓缩，以生产血小板浓缩物。在一些实施例中，可以培育血小板浓缩物并使用激动剂将其活化以释放生长因子。在一些实施例中，可以从血小板中分离生长因子溶液，并将其添加到含有基于细胞的肉类产品的生物反应器中。

Description

用于实验室生长肉和其他应用的生长因子

相关申请

本申请要求以下专利申请的权益：于2021年3月10日提交的名称为“Constructsfor Meat Cultivation and Other Applications[用于肉类培育和其他应用的构建体]”的美国临时专利申请序列号63/159,403；于2021年11月15日提交的名称为“ConstructsComprising Fibrin or Other Blood Products for Meat Cultivation and OtherApplications[用于肉类培育和其他应用的包含纤维蛋白或其他血液产品的构建体]”的美国临时专利申请序列号63/279,617；于2021年11月15日提交的名称为“Methods andSystems of Preparing Cultivated Meat from Blood or Cellular Biomass[从血液或细胞生物质制备培育肉的方法和系统]”的美国临时专利申请序列号63/279,631；于2021年11月15日提交的名称为“Systems and Methods of Producing Fat Tissue for Cell-Based Meat Products[生产用于基于细胞的肉类产品的脂肪组织的系统和方法]”的美国临时专利申请序列号63/279,642；于2021年11月15日提交的名称为“Production of Hemefor Cell-Based Meat Products[用于基于细胞的肉类产品的血红素的生产]”的美国临时专利申请序列号63/279,644；于2022年1月18日提交的名称为“Animal-DerivedAntimicrobial Systems and Methods[动物源性抗微生物系统和方法]”的美国临时专利申请序列号US 63/300,577；于2021年3月22日提交的名称为“Growth Factor forLaboratory Grown Meat[用于实验室生长肉的生长因子]”的美国临时专利申请序列号63/164,397；于2021年3月22日提交的名称为“Methods of Producing Animal DerivedProducts[生产动物源性产品的方法]”的美国临时专利申请序列号63/164,387；于2022年2月25日提交的名称为“Growth Factors for Laboratory Grown Meat and OtherApplications[用于实验室生长肉和其他应用的生长因子]”的美国临时专利申请序列号63/314,171；以及于2022年2月25日提交的名称为“Methods and Systems of ProducingProducts Such as Animal Derived Products[生产产品例如动物源性产品的方法和系统]”的美国临时专利申请序列号63/314,191。这些专利申请中的每一个通过引用以其全文并入本文。

技术领域

本披露涉及一种改良的细胞培养生长培养基，用于生产培养的动物源性产品，包括培育肉。

背景技术

培育肉或基于细胞的肉类是使用体外细胞培养或生物反应器生产的肉类，而不是从活体动物收获的肉类。在很多情况下，生产的肉类可以包括肌肉细胞和脂肪细胞。例如，这样的肉可以包括鸡肉、牛肉、猪肉或鱼肉。这样的技术有可能彻底改变农业，例如，通过减少生产肉类所需的土地量、避免无伦理的动物养殖、或增加可用的食品供应。然而，培育肉的制造困难且昂贵，因此需要进行改良。

基于细胞的培育肉是食品行业的最新创新。基于细胞的肉类可以通过体外培养非人动物细胞生产肉类来制造，而不是以传统方式养殖动物来制造。如本文所用，基于细胞的肉类与培育肉、培养肉、细胞肉、免屠宰肉和合成肉等相关术语同义。

在从不同的动物物种(包括哺乳动物、鱼类和昆虫)中生产各种基于细胞的肉类方面，已经进行了大量的研究。预计到2030年，世界人口将超过85亿。这一预计将需要过量的粮食生产才能满足。美国农业部估计，每年产生4.5亿吨动物废物。

此外，随着人口增长、个人经济增长和城市化推动需求上升，全球肉类生产和消费继续激增。2012年，联合国粮食及农业组织(FAO)预计，到2050年，全球对肉类的需求将达到4.55亿公吨(比2005年增长76％)。同样，预计到2050年，全球对鱼类的需求将达到1.4亿公吨。

这种不断增长的需求是有问题的，因为目前的大规模畜牧业方法会与公共卫生并发症、环境退化和动物福利问题相关。对于人类健康而言，畜牧产业与食源性疾病、饮食相关疾病、抗生素抗性和传染病息息相关。值得注意的是，人畜共患疾病(例如尼帕病毒、甲型流感)与农业集约化有关。畜牧业还导致环境问题，包括温室气体排放、土地和水的使用。联合国政府间气候变化专门委员会在2018年发布了一份报告，声称到2030年必须将温室气体排放量减少45％，以防止全球气温上升1.5℃；这是一项可以减少与升温2.0℃相关的灾难的目标。传统的减少技术包括再造林、土壤保持、废物管理以及税收政策、补贴和分区规划方面的改善。虽然这些策略仍然很重要，但气候变化的紧迫性可能需要更具变革性的方法。最后，关于动物福利问题，每年有数十亿动物因人类食物系统而被直接(例如，农场动物屠宰，海鲜捕捞)或间接(例如，副渔获物，由于栖息地破坏而导致野生动物减少)杀害或遭受苦难。

上述大多数问题可以归因于这样一个事实，即传统肉类生产的原材料投入(即动物)本身不卫生、低效和有感知能力。通过将动物从制造过程中移除，几个外部特征可能会减轻。

培育肉或基于细胞的肉类是替代基于动物的肉类的替代性肉类来源。预计基于细胞的肉类将在几年内在全球市场上普遍存在，尽管主要挑战之一是与培育肉生产相关的高成本。不幸的是，基于细胞的肉类生产的经济意义在大规模商业化方面存在问题。据报道，马斯特里赫特大学在2013年培育的培养牛肉汉堡的生产成本为280,400美元(2,470,000美元/kg)。所述生产方法涉及三名研究人员使用实验室规模技术在三个月内扩增20,000个肌肉细胞，并作为概念验证而不是试图进行规模化生产。几个小组已进行了初步的经济学分析，以预计基于细胞的肉类在大规模生产场景中的成本。2008年，体外肉研究联盟(InVitro Meat Consortium)估计，通过基于单细胞蛋白质生产数据进行资本成本和生长培养基成本建模，基于细胞的肉类的成本可能大约是鸡肉的两倍。2014年，一项对村庄规模的基于细胞的肉类生产的技术、社会和经济因素进行推测的研究计算出，根据生长培养基的价格，成本范围为11-520美元/kg。选定的公司正在将目标对准高价值产品(例如鹅肝、蓝鳍金枪鱼、袋鼠肉)，以降低达到价格平衡的门槛。

基于细胞的肉类生产在经济学方面的一个挑战与用于这样的生产的合适生长培养基的价格和可用性有关。目前，来自牛胎儿的胎牛血清(FBS)是用于细胞培养的主要生长因子补充剂之一。获得大规模生产培育肉所需的大量FBS是不切实际的，因为它涉及屠宰怀孕的牛，并且，与传统肉类生产相比导致更多动物被屠宰。由于FBS仍然是基于细胞的肉类生产的优选培养基之一，因此需要可持续和可保留的替代品，以便将基于细胞的肉类推向市场。

为干细胞培养和人治疗性目的开发的完全定义的培养基(例如，Essential 8^TM)不适合培育成肌细胞、成纤维细胞和脂肪细胞，而这些细胞通常是培育肉生产所必需的。此外，需要用生长因子(例如从商业供应商处以冻干粉末形式获得)对这样的溶液进行补充，这种方式非常昂贵，并且可能会给培育肉所需规模下的制造带来巨大的生产成本。

在最近的尝试中，好食品研究所(Good Food Institute)开发了一种更务实的计算方法，用于计算使用基于Essential 8^TM(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisherScientific))的生长培养基生产培育肉的成本。根据该计算方法，生长培养基的成本代表了这样的生产中最大费用，即使以大规模并以食品级(而不是医药级)规格生产也是如此。

本披露感兴趣的是提出使用人血小板裂解物(hPL)作为FBS的替代品，用于在用于各种生物医学应用(例如干细胞疗法和组织工程化)的人细胞培养中作为无动物源性生长因子使用，以避免与使用非人动物产品相关的调控障碍。已表明hPL可用作许多细胞类型(特别是干细胞)的生长补充剂。hPL通常是出于其他治疗性目的捐献的血小板的副产品。通常，捐献的血小板的有效期为一周，之后将其冷冻，并在解冻后将其称为血小板裂解物。由于血小板大量负载多种生长因子，因此血小板释放在解冻过程中释放自血小板后对细胞生长有用的生长因子。事实上，血小板的主要生物学功能是它们在损伤部位释放生长因子以促进损伤组织的愈合。尽管已将人血小板裂解物用于治疗性应用，例如伤口愈合，或辅助其他损伤(如肌腱和软骨的损伤)愈合，以及培养人细胞用于治疗性应用，但动物血小板裂解物较少用于治疗性目的。例如，可以提取马PL并注射到动物关节中，以促进损伤关节或韧带的愈合。

感兴趣的是Dietz于美国专利公开2011/0171731中的披露，其披露了用于使用血小板裂解物组合物生长干细胞的方法和材料。Dietz于美国专利公开2015/0329820中披露了用于使哺乳动物细胞生长的细胞培养基组合物，其包括含有裂解的人单采术(apheresis)血小板制剂的人血小板裂解物。

来自不同动物(例如牛、马和犬)的动物源性血小板裂解物(PL)或富血小板血浆(PRP)已在兽医学中用于治疗各种损伤。

感兴趣的是Strunk于美国专利公开2012/0276632中的披露，其提出例如通过单采术获得的人富血小板血浆(PRP)的裂解物在人细胞培养基中作为FBS的替代品的用途。

胎牛血清(FBS)通常被本领域普通技术人员优选作为细胞培养物的生长培养基，因为它含有如此丰富的营养物质，但它相对昂贵并且供应有限。因此，本领域仍然需要用于生产培养的动物源性产品(包括基于细胞的肉类生产)的改良生长培养基及其生产方法。

发明内容

本披露涉及一种改良的细胞培养基，用于生产培养的动物源性产品，包括培育肉。在一些情况下，本披露的主题涉及相关产品、特定问题的可替代解决方案、和/或一种或多种系统和/或制品的多种不同用途。

在某些实施例中，改良的培养基包含血小板裂解物(PL)与富血小板血浆(PRP)的组合，所述组合物不仅便宜而且在促进细胞培养物生长方面与胎牛血清(FBS)等效。在某些情况下，提供了包含血小板裂解物(PL)与富血小板血浆(PRP)的组合物，任选地包含其他营养成分。在一些实施例中，血小板裂解物(PL)加富血小板血浆(PRP)的浓度占整个组合物的2至20重量百分比。

在一些实施例中，血小板裂解物加富血小板血浆的浓度占整个组合物的5至15重量百分比。在一些实施例中，血小板裂解物加富血小板血浆的浓度占整个组合物的约10重量百分比。细胞培养生长培养基中血小板裂解物和/或富血小板血浆的浓度可以使用本领域技术人员已知的任何技术进行测量。例如，可以使用分光光度法在280nm处测定这样的溶液中生长因子的总浓度。在一些实施例中，细胞培养基中血小板和血小板组分的浓度在2mg/mL和20mg/mL之间。在一些实施例中，细胞培养基中血小板和血小板组分的浓度在9mg/mL和11mg/mL之间。

虽然PL和PRP可以从屠宰牲畜的血液和血液产品中获得，但在一些实施例中，PL+PRP组合可以根据于2021年3月22日提交的名称为“Methods of Producing AnimalDerived Products[生产动物源性产品的方法]”的USSN 63/164,387(其披露内容通过引用特此并入)中的方法可持续地从活体动物中获取，以生产培养的动物源性产品。

在一些实施例中，包含血小板裂解物(PL)和富血小板血浆(PRP)的细胞培养生长培养基可以包括从同一或多种脊椎动物或无脊椎动物物种获得的那些组分。示例性物种包括但不限于各种哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鸟类和鱼类物种，包括但不限选自由以下组成的组的那些：牛、绵羊、山羊、猪、鹿、骆驼、鲸、家禽、鱼、蟹和虾。

根据本披露的一个方面，细胞培养生长培养基包含含有血小板裂解物(PL)的血小板裂解物和含有富血小板血浆(PRP)的富血小板血浆。

在一些实施例中，血小板裂解物(PL)和富血小板血浆(PRP)可以以多种方式获得，包括从作为食物屠宰的动物中获得，但这些也可以从出于以可持续的方式提供这样的材料的目的而饲养的活体动物中收获，这与利用牛生产奶没有什么不同。例如，所述成分可以从动物(例如饲养的牛和山羊)收获，并用于生产奶制品或其他用途，例如对绵羊进行修剪来生产羊毛。如本领域技术人员将知晓，来自不同动物(例如牛、马和犬)的动物源性血小板裂 解物(PL)或富血小板血浆(PRP)已在兽医学中用于治疗的各种损伤，并已提出用于培育人干细胞作为FBS的动物友好性替代品。在其他实施例中，动物可以专门出于可持续性生产血液产品的目的而饲养。

在一些实施例中，血小板裂解物(PL)和/或富血小板血浆(PRP)可以使用例如单采术的方法或如本领域已知的方法(使用重力分离细胞(例如，在大气压或高压下将红细胞离心或沉降))可持续地从活体动物收获，其中将红细胞和白细胞从活体动物中移出，并且移出血浆和其他血液成分，包括血小板、红细胞、纤维蛋白和其他蛋白质和血液成分(包括血小板和其他血浆可溶性因子，如纤维蛋白、白蛋白、矿物质、维生素和生长因子)，然后将剩余的血液产品返回至动物。因此，这样的血液衍生物可以从活体动物获得，其伦理负担小，并且其方式类似于定期从人身上获得血清的方式。在一些实施例中，来自屠宰场的废弃血液产品也可以用作廉价的次级来源，以生产用于培育肉的PL和PRP补充剂。

在一些实施例中，血小板裂解物(PL)可以根据各种物理方法通过处理从血液和血清中分离的血小板来生产。例如，已知物理处理可以诱导血小板裂解或生长因子从血小板释放，所述物理处理例如选自由以下组成的组的那些：对血小板进行冷冻和解冻、物理剪切(例如通过声处理释放其内容物，包括细胞因子和生长因子)、搅拌、老化和使其粘附到表面。

在一些实施例中，富血小板血浆可以使用本领域技术人员已知的各种化学和生物化学方法进行处理，以释放细胞因子和生长因子。合适的化学和生物化学处理包括用选自由以下组成的组的成员进行处理：柠檬酸盐、EDTA、氯化钙、纤溶酶原活化因子和凝血酶。

在一些实施例中，细胞培养生长培养基可以另外包括肽、维生素、细胞因子和生长因子、合成和/或重组蛋白，并且根据本发明的一个方面，这些组分中的一种或多种可以从动物的血液中提取，包括作为获得血小板裂解物(PL)和富血小板血浆的过程的一部分。

在一些实施例中，细胞培养生长培养基包含至少一种非人动物血液成分和至少一种添加剂。所述一种非人动物血液成分可以是如本文所述的任何血液成分，例如血小板裂解物、富血小板血浆或血浆产品。至少一种非人动物血液成分可以使用如本文所述的任何技术(例如通过单采术)收获。在一些实施例中，至少一种添加剂可以包含肽、维生素、细胞因子和生长因子，并且可以从血液中获得，或以化学或生物方式合成，例如使用重组技术。

本披露的一些方面涉及在培养中(例如，在生物反应器中)饲养非人动物细胞的方法，所述方法包括提供细胞培养生长培养基，所述培养基包含血小板裂解物(PL)与富血小板血浆(PRP)的组合以促进培养的细胞的增殖和分化。在一些实施例中，培养的细胞包含从脊椎动物和无脊椎动物中分离出来的成肌细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、血管细胞、成骨细胞、乳腺、上皮细胞、腱细胞、角质形成细胞、神经细胞、胚胎干细胞、间充质干细胞等并被饲养以生产培养的动物源性产品，例如像肉类(肌肉)、脂肪、皮肤、角或其他器官(例如肝脏和肠)。在一些实施例中，培养的细胞包括哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鸟类和鱼类物种。例如，在一些实施例中，非人动物细胞的培养物可以包含牛、绵羊、山羊、猪、鹿、骆驼、鲸、家禽、鱼、蟹、虾和昆虫，并且可以用于生产培养的动物源性产品，例如肉类产品。应当理解，培养的动物源性肉类产品包括典型地由培养的肌肉、脂肪和成纤维细胞生产的传统的肉类产品，但也可以包括通过培养细胞(例如器官细胞、上皮细胞和角质形成细胞)生产的器官组织，例如肝脏和獠牙或皮肤。

在一些实施例中，本领域普通技术人员已知的任何适合细胞培养的细胞类型都可以用于例如生产基于细胞的肉类产品。非限制性实例包括干细胞、胚胎干细胞、骨髓源性干细胞、脂肪组织源性干细胞、间充质干细胞和诱导多能干细胞。

在一些实施例中，细胞培养生长培养基中的血小板裂解物(PL)和/或富血小板血浆(PRP)可以提取自与正在培育的细胞相同的物种的血液；在其他实施例中，细胞培养生长培养基中的血小板裂解物(PL)和/或富血小板血浆(PRP)可以提取自一种或多种与正在培育的细胞不同的物种的血液。根据一些实施例，细胞培养生长培养基中的血小板裂解物和/或富血小板血浆可以从多种不同物种的血液中提取并汇集在一起。

在一些实施例中，本披露涉及用于培育基于细胞的肉类的细胞培养基，所述细胞培养基包含使用非人动物可持续地收获的血小板裂解物和富血小板血浆。

在一些实施例中，本披露涉及用于培育基于细胞的产品的细胞培养基，所述细胞培养基包含补充有多种外源性生长因子的血小板裂解物和/或富血小板血浆。

在一些实施例中，本披露涉及用于生产基于细胞的肉类的细胞培养生长培养基，所述细胞培养生长培养基包含血小板裂解物，其中所述血小板使用单采术从活体动物收获。

在一些实施例中，本披露涉及用于生产基于细胞的肉类的细胞培养生长培养基，所述细胞培养生长培养基包含富血小板血浆，其中所述富血小板血浆使用单采术从活体动物收获。

在一些实施例中，本披露涉及用于生产基于细胞的肉类的细胞培养生长培养基，所述细胞培养生长培养基包含血浆产品，其中所述血浆产品使用单采术从活体动物收获。

在一些实施例中，本披露涉及用于生产基于细胞的肉类的细胞培养生长培养基，所述细胞培养生长培养基包含至少一种非人动物血液成分和至少一种添加剂。

在一些实施例中，本披露涉及细胞培养生长因子补充剂，所述细胞培养生长因子补充剂包含血小板裂解物(PL)和富血小板血浆(PRP)。

在一些实施例中，本披露涉及包含基于细胞的肉类产品的制品，所述基于细胞的肉类产品包含血小板裂解物和富血小板血浆，其中基于细胞的肉类产品中至少0.1％的细胞是血小板细胞。

在一些实施例中，本披露涉及包含基于细胞的肉类产品的制品，所述基于细胞的肉类产品包含血小板裂解物和血浆产品，其中基于细胞的肉类产品中至少0.1％的细胞是血小板细胞。

在一些实施例中，本披露涉及包含基于细胞的肉类产品的制品，所述基于细胞的肉类产品包含富血小板血浆和血浆产品，其中基于细胞的肉类产品中至少0.1％的细胞是血小板细胞。

在一些实施例中，本披露涉及包含细胞培养基和非人血小板裂解物的制品。

在一些实施例中，本披露涉及包含细胞培养基和非人血浆产品的物品。

在一些实施例中，本披露涉及包含细胞培养基和非人富血小板血浆的制品。

在一些实施例中，本披露涉及包含细胞培养基、血小板裂解物和牛富血小板血浆的制品。

在一些实施例中，本披露涉及制品，所述制品包含细胞培养基、血小板裂解物和富血小板血浆，其中所述血小板裂解物和富血小板血浆占所述细胞培养基的按重量计2％至20％。

在一些实施例中，本披露涉及制品，所述制品包含细胞培养基、血小板裂解物和血浆，其中所述血小板裂解物和血浆占所述细胞培养基的按重量计2％至20％。

在一些实施例中，本披露涉及制品，所述制品包含细胞培养基、血浆和富血小板血浆，其中所述血浆和富血小板血浆占所述细胞培养基的按重量计2％至20％。

在一些实施例中，本披露涉及制品，所述制品包含细胞培养基、血小板裂解物和牛富血小板血浆，其中所述牛富血小板血浆占所述细胞培养基的按重量计10％。

在一些实施例中，本披露涉及制品，所述制品包含细胞培养基、血浆和牛富血小板血浆，其中所述牛富血小板血浆占所述细胞培养基的按重量计10％。

在一些实施例中，本披露涉及在培养中饲养非人细胞以获得基于细胞的产品的方法，所述方法包括：

在生物反应器中将多个非人细胞暴露于包含血小板裂解物和富血小板血浆的细胞培养基，所述血小板裂解物和富血小板血浆提取自非人动物，而无需屠宰所述非人动物。

在一些实施例中，本披露涉及一种方法，所述方法包括将血小板裂解物和富血小板血浆添加到含有细胞培养生长培养基的生物反应器中，将动物细胞添加到生物反应器中，以及使基于细胞的肉类产品在生物反应器中生长。

在一些实施例中，本披露涉及一种方法，所述方法包括将血浆添加到含有细胞培养生长培养基的生物反应器中，将动物细胞添加到生物反应器中，以及使基于细胞的肉类产品在生物反应器中生长。

在一些实施例中，本披露涉及一种方法，所述方法包括将血小板裂解物添加到含有细胞培养生长培养基的生物反应器中，将动物细胞添加到生物反应器中，以及使基于细胞的肉类产品在生物反应器中生长。

在一些实施例中，本披露涉及一种方法，所述方法包括将富血小板血浆添加到含有细胞生长培养基的生物反应器中，将动物细胞添加到生物反应器中，以及使基于细胞的肉类产品在生物反应器中生长。

在一些实施例中，本披露涉及一种方法，所述方法包括将捐献的血小板浓缩物进行冷冻解冻以生产血小板裂解物，将血小板裂解物添加到含有细胞生长培养基的生物反应器中，以及在生物反应器中培育基于细胞的肉类产品。

在一些实施例中，本披露涉及一种方法，所述方法包括从活体动物中收获全血样品，从全血样品中分离富血小板血浆，以及将富血小板血浆添加到生物反应器中，其中所述生物反应器含有基于细胞的肉类产品。

在一些实施例中，本披露涉及一种方法，所述方法包括从活体动物中收获全血样品，从全血样品中分离血浆产品，以及将血浆产品添加到生物反应器中，其中所述生物反应器含有基于细胞的肉类产品。

在另一方面，本披露涵盖制备一个或多个本文所述的实施例，例如细胞培养生长培养基的方法。在仍另一方面，本披露涵盖使用一个或多个本文所述的实施例，例如细胞培养生长培养基的方法。

当结合附图考虑时，本披露的其他优点和新颖特征从以下对本披露的各个非限制性实施例的详细描述中将变得清楚。

附图说明

将参考附图通过示例的方式描述本披露的非限制性实施例，这些附图是示意性的，并且不旨在按比例绘制。在附图中，所展示的每个相同的或几乎相同的组成部分典型地由单个数字表示。为清晰起见，在不需要图示说明来使本领域的普通技术人员了解本披露的情况下，没有在每个附图中都标记出每个组成部分，也没有示出本披露的每个实施例的每个组成部分。在附图中：

图1描绘了根据一些实施例，不同细胞培养生长培养基对羔羊成肌细胞增殖的影响。

图2A和图2B描述了根据一些实施例，不同细胞培养生长培养基对(图2A)所得细胞计数和(图2B)倍增时间的影响；

图3展示了根据一些实施例，用生长因子补充富血小板血浆对牛肌细胞增殖的影响；

图4展示了根据一些实施例，从不同牛分离的富血小板血浆对牛肌细胞增殖的影响；

图5A至5E展示了在培养基中改变从各种牛分离的富血小板血浆浓度对牛成肌细胞增殖的影响。根据一些实施例，从(图5A)牛2371、(图5B)牛4321、(图5C)牛4266、(图5D)牛4348和(图5E)牛14583分离富血小板血浆；

图6A至6F展示了在培养基中改变从各种牛分离的富血小板血浆浓度对人肝细胞增殖的影响。根据一些实施例，从(图6A)牛2398、(图6B)牛14347、(图6C)牛4266、(图6D)牛2371、(图6E)牛4321和(图6F)牛14424分离富血小板血浆；

图7A至7H展示了根据一些实施例，牛4266的血液学和血液化学结果，包括：(图7A)红细胞(M/微升)、(图7B)血红蛋白(g/dL)、(图7C)白细胞(K/微升)、(图7D)血小板(K/微升)、(图7E)纤维蛋白原(mg/dL)、(图7F)白蛋白(g/dL)、(图7G)天冬氨酸氨基转移酶(U/L)和(图7H)碱性磷酸酶(U/L)；

图8A至8H展示了根据一些实施例，牛4348的血液学和血液化学结果，包括：(图8A)红细胞(M/微升)、(图8B)血红蛋白(g/dL)、(图8C)白细胞(K/微升)、(图8D)血小板(K/微升)、(图8E)纤维蛋白原(mg/dL)、(图8F)白蛋白(g/dL)、(图8G)天冬氨酸氨基转移酶(U/L)和(图8H)碱性磷酸酶(U/L)；

图9A至9H展示了根据一些实施例，牛2315的血液学和血液化学结果，包括：(图9A)红细胞(M/微升)、(图9B)血红蛋白(g/dL)、(图9C)白细胞(K/微升)、(图9D)血小板(K/微升)、(图9E)纤维蛋白原(mg/dL)、(图9F)白蛋白(g/dL)、(图9G)天冬氨酸氨基转移酶(U/L)和(图9H)碱性磷酸酶(U/L)；

图10A至10H展示了根据一些实施例，牛2371的血液学和血液化学结果，包括：(图10A)红细胞(M/微升)、(图10B)血红蛋白(g/dL)、(图10C)白细胞(K/微升)、(图10D)血小板(K/微升)、(图10E)纤维蛋白原(mg/dL)、(图10F)白蛋白(g/dL)、(图10G)天冬氨酸氨基转移酶(U/L)和(图10H)碱性磷酸酶(U/L)；

图11A至11H展示了根据一些实施例，牛5211的血液学和血液化学结果，包括：(图11A)红细胞(M/微升)、(图11B)血红蛋白(g/dL)、(图11C)白细胞(K/微升)、(图11D)血小板(K/微升)、(图11E)纤维蛋白原(mg/dL)、(图11F)白蛋白(g/dL)、(图11G)天冬氨酸氨基转移酶(U/L)和(图11H)碱性磷酸酶(U/L)；

图12A至12H展示了根据一些实施例，牛5276的血液学和血液化学结果，包括：(图12A)红细胞(M/微升)、(图12B)血红蛋白(g/dL)、(图12C)白细胞(K/微升)、(图12D)血小板(K/微升)、(图12E)纤维蛋白原(mg/dL)、(图12F)白蛋白(g/dL)、(图12G)天冬氨酸氨基转移酶(U/L)和(图12H)碱性磷酸酶(U/L)；

图13A至13H展示了根据一些实施例，牛14424的血液学和血液化学结果，包括：(图13A)红细胞(M/微升)、(图13B)血红蛋白(g/dL)、(图13C)白细胞(K/微升)、(图13D)血小板(K/微升)、(图13E)纤维蛋白原(mg/dL)、(图13F)白蛋白(g/dL)、(图13G)天冬氨酸氨基转移酶(U/L)和(图13H)碱性磷酸酶(U/L)；

图14A至14H展示了根据一些实施例，牛14583的血液学和血液化学结果，包括：(图14A)红细胞(M/微升)、(图14B)血红蛋白(g/dL)、(图14C)白细胞(K/微升)、(图14D)血小板(K/微升)、(图14E)纤维蛋白原(mg/dL)、(图14F)白蛋白(g/dL)、(图14G)天冬氨酸氨基转移酶(U/L)和(图14H)碱性磷酸酶(U/L)；

图15A至15L展示了在另一个实施例中，涉及每两周或每周对牛进行多次单采术的实验，表明这样的收集对与牛健康相关的某些生物标志物没有显著影响；

图16示出了在一些实施例中，每周或每两周从幼龄荷斯坦(Holstein)小母牛、幼龄阉牛(Steer)和成熟荷斯坦牛抽血后血液中成纤维细胞生长因子-2的浓度；

图17示出了在一些实施例中，每周或每两周从幼龄荷斯坦小母牛、幼龄阉牛和成熟荷斯坦奶牛抽血后血液中胰岛素生长因子的浓度；

图18展示了向牛成肌细胞培养物中添加从各种牛分离的10％富血小板血浆的细胞增殖影响。每周从牛4266、牛4321和4348分离富血小板血浆。根据一些实施例，每两周从牛14347、牛14424和牛14583分离富血小板血浆；

图19比较了向牛成肌细胞培养物中添加10％富血小板血浆的细胞增殖影响。根据一些实施例，从成熟牛(2371、2348和2315)或幼龄牛(14347、14424和14583)分离富血小板血浆；以及

图20示出了根据一些实施例，从公牛或母牛分离的富血小板血浆对牛成肌细胞增殖的影响。

具体实施方式

基于细胞的培育肉是培养的动物源性产品，并且是食品行业的最新创新。基于细胞的肉类是在体外条件下使用动物细胞(典型地非人细胞)并使用细胞培养基生产肉类来制造的，而不是以传统方式养殖动物来制造的。术语基于细胞的肉类与培育肉、培养肉、细胞肉、免屠宰肉和合成肉等相关术语同义。

因此，本披露总体上涉及例如，用于生产基于细胞的肉类和其他培育产品的改良的细胞培养生长培养基，或应用。例如，某些实施例涉及包含血小板裂解物(PL)和富血小板血浆(PRP)的细胞培养生长因子补充剂。例如，这样的溶液可以用于通过提高细胞增殖的速率和频率来增加生物反应器中的细胞生物质。在一些实施例中，从活体动物的全血中分离富血小板血浆。富血小板血浆中的血小板可以例如通过离心进行浓缩，以生产血小板浓缩物。在一些实施例中，可以培育血小板浓缩物并使用激动剂将其活化以释放生长因子。在一些实施例中，可以从血小板中分离生长因子溶液，并将其添加到含有基于细胞的肉类产品的生物反应器中。在一些实施例中，血小板浓缩物可以被裂解以生产血小板裂解物。在一些实施例中，可以将包含血小板裂解物和富血小板血浆的细胞培养基添加到生物反应器中。其他实施例总体上涉及血小板裂解物和/或富血小板血浆的组合物和使用方法、使用这些组合物和方法生产的培育肉产品、涉及这些组合物和方法的试剂盒等。

基于细胞的肉类由细胞生物质组成。因此，以可持续和具有成本效益的方式最大程度地生产细胞生物质的技术是所希望的。目前此领域的黄金标准是利用胎牛血清刺激非人动物细胞的细胞增殖，以生产细胞生物质。胎牛血清含有刺激多种不同哺乳动物细胞类型(例如成肌细胞、干细胞等)的生长因子。然而，胎牛血清的使用是有争议的，因为它是在屠宰场经由封闭的收集系统从牛胎获得的。此外，收获胎牛血清需要大规模的动物饲养设施，这些设施与公共卫生并发症、环境退化和动物福利问题相关。

因此，本披露的一些方面涉及以安全、人道和环境可持续的方式获取生长因子。例如，在一些实施例中，生长因子可以直接或间接地从采集自不用于屠宰的活体动物(例如牛、猪、山羊等)的全血样品中获得。在一些实施例中，可以将全血样品例如通过单采术或离心分离成血液成分，例如血浆、富血小板血浆、血小板浓缩物等。如本领域技术人员所理解的那样，血浆和/或富血小板血浆(其含有刺激细胞增殖的必需生长因子)可以直接添加到基础细胞培养基中以生产细胞培养生长培养基，例如，用于培育基于细胞的肉类产品。

在其他实施例中，富血小板血浆可以被活化以释放至少一种生长因子。在一些情况下，血小板可以会被活化，例如，通过暴露于抗原或激动剂。在一些实施例中，活化富血小板血浆产生了包含至少一种生长因子的血清溶液。例如，可以将这样的溶液添加到细胞培养基中，并用于刺激成肌细胞和其他非人动物细胞的细胞增殖，用于生产基于细胞的肉类。在一些实施例中，血清溶液可以从活化的血小板分离，并添加到细胞培养溶液中以生产细胞培养生长培养基。

生长因子也可以通过以下方式生产：例如对富血小板血浆内的或来自捐献的血小板浓缩物的血小板进行裂解，以生产血小板裂解物。血小板可以使用本领域技术人员已知的任何技术进行裂解，例如冷冻解冻、渗透失衡、声空化、挤出等。例如，细胞可以通过多孔膜反复挤出，所述多孔膜对细胞施加高剪切力，从而导致细胞破裂，因此释放生长因子。

本披露的其他方面涉及从非人动物重复采集血液，例如，以获得富血小板血浆或血小板裂解物等。例如，在一些实施例中，可以以一定间隔从动物抽取血液，以便使动物有时间恢复并产生新血液。例如，可以每2周、每4周、每6周、每2个月等从动物抽取血液。可以对抽血进行处理，例如，如本文所讨论的。例如，血液可以用于获得富血小板血浆以刺激生物反应器中的细胞生长，例如，如本文所讨论的。以这种方式，在某些实施例中，这样的细胞可以以可持续和具有成本效益的方式(例如，无需杀死所述动物)获得。在某些实施例中，这种用法可以使得碳排放、水和土地的使用等减少。

以上讨论是本披露的一个实施例的非限制性实例，总体上涉及例如基于富血小板血浆的细胞培养生长培养基，其可以用于增加生物反应器中的细胞生物质。然而，其他实施例也是可能的。因此，更一般地，本披露的多个方面涉及各种细胞培养生长培养基，例如，用于在肉类和其他培育产品的培育期间使用。

因此，例如，本披露的一些方面涉及例如在含有产品(如培育肉产品)的生物反应器或其他生物反应器或应用中使用富血小板血浆和/或血小板裂解物来增强细胞增殖。例如，一些实施例涉及活化富血小板血浆和/或血小板浓缩物的培养物，以生产包含至少一种生长因子的血清溶液。在一些情况下，细胞可以从血清溶液中过滤出来。这种血清溶液(含或不含细胞)可以用于多种应用。例如，它可以在相同或不同的生物反应器中使用，以增强细胞粘附和增殖。合适应用的其他实例包括但不限于生物药品、动物毛皮、基于细胞的器官等，其可以例如如本文所讨论的进行制造。

血清溶液可以如本文所讨论的进行制备和使用，例如，在制备后相对较快地使用。然而，在一些实施例中，血清溶液可以在室温或其他温度(例如4℃、0℃、-4℃、-20℃等)下储存至少1周、至少2周、至少1个月、至少6个月、至少12个月等。作为非限制性实例，在某些实施例中，可以将血清溶液冷冻干燥。此外，在一些实施例中，冻干血清溶液可以重构，例如，以其原始浓度，或以更高或更低的浓度，例如浓度为原始血清溶液浓度的至少10倍、至少50倍或至少100倍。

本披露的某些方面涉及从各种血液成分获得生长因子和/或其他成分，例如，在一些实施例中，血小板、血浆和/或富血小板血浆可以直接从非人动物(例如，牛、猪、绵羊、山羊、鹿、鱼、鸭、火鸡、虾等)的血液中分离。

因此，富血小板血浆(PRP)可以源自例如通过离心去除红细胞的全血。血浆也可以源自全血，通过例如使用单采术来获得，或通过使用例如离心从富血小板血浆产品中去除血小板来获得。血浆和富血小板血浆(PRP)含有血液中多种生长因子，例如，转化生长因子β、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、胰岛素样生长因子2、血管内皮生长因子、表皮生长因子、白细胞介素8、角质形成细胞生长因子和结缔组织生长因子。此外，裂解富血小板血浆中的血小板可以释放血小板源性生长因子。富血小板血浆(PRP)可根据其白细胞和纤维蛋白含量而分类为富白细胞PRP(L-PRP)、白细胞减少PRP(P-PRP)；白细胞减少或纯PRP、(4)富白细胞血小板纤维蛋白和纯富血小板纤维蛋白(L-PRF)。如本文所用，“富血小板血浆”(“PRP”)是其血小板浓度为血液中正常血小板浓度的至少2倍、至少5倍或至少10倍的血浆。“贫血小板血浆”是包含一些血小板，但浓度低于血液中正常血小板浓度的血浆。

血浆和/或富血小板血浆含有增强生物质产生的生长因子和本领域技术人员已知的其他溶质。例如，血浆和/或富血小板血浆包含粘附蛋白，例如纤维蛋白原，这些粘附蛋白可以促进非人细胞(例如成肌细胞)粘附在微载体(例如纤维蛋白微载体)上；血浆和/或富血小板血浆还包含增强细胞增殖的生长因子，例如，血小板源性生长因子。血浆和/或富血小板血浆的其他溶质包括溶解蛋白(按重量计6％-8％)(例如血清白蛋白、球蛋白和纤维蛋白原)、葡萄糖、凝血因子、电解质(Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、HCO₃ ^-、Cl^-等)和激素等。因此，在一些实施例中，血浆和/或富血小板血浆可以添加到任何细胞培养基中以生产细胞培养生长培养基并使非人细胞例如在生物反应器中生长，以生产基于细胞的肉类产品。例如，在一些情况下，可以将血浆和/或富血小板血浆添加到任何细胞培养基(例如DMEM或Essential 8)中以生产细胞培养生长培养基，并将其添加到例如含有基于细胞的肉类产品的生物反应器中。

在一些情况下，可能希望直接从全血中获得血小板浓缩物，例如通过单采术获得，或通过例如离心或本领域技术人员已知的其他技术(例如切向流动过滤)从富血小板血浆获得。在一些实施例中，富血小板血浆中的最终血小板浓度为在血小板浓缩物中至少10⁵个血小板/mL、至少10⁶个血小板/mL、至少10⁷个血小板/mL、至少10⁸个血小板/mL、至少10⁹个血小板/mL、至少10¹⁰个血小板/mL等。

在一些情况下，可能希望活化富血小板血浆和/或血小板浓缩物中的血小板以生产包含至少一种生长因子(例如，以增强生物反应器中动物细胞的生长)的血清溶液。例如，在一些实施例中，激动剂可以用于活化血小板。本领域技术人员已知的任何激动剂均可以用于生产活化的血小板。可以用于生产活化的血小板的激动剂的非限制性实例包括二磷酸腺苷(ADP)、血栓素、凝血酶、肾上腺素、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯、凝血酶受体激动剂肽等。在一些实施例中，富血小板血浆和/或血小板浓缩物可以在活化之前进行培养；在其他实施例中，富血小板血浆和/或血小板浓缩物可以在活化之后进行培养。在一些实施例中，富血小板血浆和/或血小板浓缩物的悬浮液可以在不培养的情况下被活化。

在一些实施例中，活化富血小板血浆和/或血小板浓缩物所需的激动剂浓度为至少1微克/mL、至少5微克/mL、至少10微克/mL、至少40微克/mL、至少80微克/mL、至少100微克/mL、至少500微克/mL、至少1mg/mL、至少10mg/mL、至少50mg/mL、至少100mg/mL、至少500mg/mL、至少1g/mL等。此外，在一些实施例中，激动剂的浓度可以不超过1g/mL、不超过500mg/mL、不超过100mg/mL、不超过50mg/mL、不超过10mg/mL、不超过1mg/mL、不超过500微克/mL、不超过400微克/mL、不超过300微克/mL、不超过100微克/mL、不超过80微克/mL、不超过40微克/mL、不超过10微克/mL、不超过5微克/mL、不超过1微克/mL等。此外，在某些实施例中，这些范围中任何范围的组合也是可能的。如果存在多于一种激动剂，它们可以独立地具有相同或不同的浓度。

在某些实施例中，抗原可以用于活化富血小板血浆和/或血小板浓缩物。示例性抗原包括外毒素(例如肉毒杆菌产生的肉毒杆菌毒素)和内毒素(例如脂多糖复合物(LPS))，所述内毒素例如与革兰氏阴性病原体(例如大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、假单胞菌等)外膜相关。

在一些实施例中，活化富血小板血浆和/或血小板浓缩物所需的抗原浓度为至少1微克/mL、至少5微克/mL、至少10微克/mL、至少40微克/mL、至少80微克/mL、至少100微克/mL、至少500微克/mL、至少1mg/mL、至少10mg/mL、至少50mg/mL、至少100mg/mL、至少500mg/mL、至少1g/mL等。此外，在一些实施例中，抗原的浓度可以不超过1g/mL、不超过500mg/mL、不超过100mg/mL、不超过50mg/mL、不超过10mg/mL、不超过1mg/mL、不超过500微克/mL、不超过400微克/mL、不超过300微克/mL、不超过100微克/mL、不超过80微克/mL、不超过40微克/mL、不超过10微克/mL、不超过5微克/mL、不超过1微克/mL等。此外，在某些实施例中，这些范围中任何范围的组合也是可能的。如果存在多于一种的抗原，它们可以独立地具有相同或不同的浓度。

在一些实施例中，富血小板血浆和/或血小板浓缩物可以通过暴露于剪切力而被活化。例如，使用螺旋桨进行混合的生物反应器在生物反应器内的细胞上施加剪切力。在一些实施例中，可以通过将细胞暴露于至少5达因/平方厘米、至少10达因/平方厘米、至少15达因/平方厘米、至少20达因/平方厘米、至少25达因/平方厘米、至少30达因/平方厘米、至少35达因/平方厘米、至少40达因/平方厘米、至少45达因/平方厘米、至少50达因/平方厘米等的剪切力来活化细胞。

在一些实施例中，活化的富血小板血浆和/或血小板浓缩物可以通过使这样的细胞粘附到生物反应器中的基质(例如纤维蛋白微载体)上来生产。微载体的非限制性实例包括在美国专利申请序列号63/159,403中描述的那些，将所述专利申请通过引用以其全文并入本文。

在一些实施例中，可以将微载体(例如纤维蛋白微载体)添加到生物反应器中以活化血小板。在一些实施例中，活化血小板所需的微载体的浓度为至少10mg/mL、至少40mg/mL、至少80mg/mL、至少100mg/mL、至少500mg/mL、至少1g/mL、至少5g/mL、至少10g/mL等。此外，在一些情况下，浓度可以不超过10g/mL、不超过5g/mL、不超过1g/mL、不超过500mg/mL、不超过100mg/mL、不超过80mg/mL、不超过40mg/mL、不超过10mg/mL等。此外，在某些情况下，这些范围中任何范围的组合也是可能的。

此外，应当理解，在某些实施例中，富血小板血浆和/或血小板浓缩物可以通过使用本文所述的活化技术的任意组合来活化。例如，可以使用激动剂、抗原、剪切力、粘附到基质上等的任意组合来活化血小板。

然而，还应当理解，并非所有的血小板都将在用本文所述的一种或多种方法处理后被活化。例如，在一些实施例中，活化的血小板可以含有至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％和/或不超过50％、不超过40％、不超过30％、不超过20％、不超过10％、不超过5％、不超过1％等的非活化血小板。然而，在其他情况下，基本上所有的血小板都可以被活化。

在一些情况下，可能希望裂解血小板以生产血小板裂解物。在一些实施例中，血小板裂解物包括非人血小板裂解物；在其他实施例中，血小板裂解物包括人血小板裂解物。如本文其他地方所述，血小板含有储存生长因子的颗粒和本领域技术人员已知的其他溶质，以促进细胞粘附和增殖。因此，一些实施例涉及生产包含至少一种生长因子的血小板裂解物。在一些实施例中，富血小板血浆和/或血小板浓缩物可以例如被裂解并添加到细胞培养基中。

因此，应当理解，在一些实施例中，血小板裂解物可以从捐献的血小板浓缩物获得，例如从如医疗机构(例如医院)获得的捐献的人血小板浓缩物。在其他实施例中，血小板浓缩物可以例如从兽医医院或屠宰场获得。在一些实施例中，血小板浓缩物中的血小板浓度为至少10⁹个血小板/mL，并且包含至少5x 10¹⁰个血小板。但是，将理解的是，这些值仅仅是非限制性实例。例如，在一些情况下，血小板的浓度可以是至少10⁵、至少10⁶、至少10⁷、至少10⁸、至少10⁹、至少10¹⁰个血小板/mL等。在一些情况下，在给定样品中可以有至少10⁵、至少10⁶、至少10⁷、至少10⁸、至少10⁹、至少10¹⁰个血小板等。

本领域普通技术人员将理解，捐献的血小板浓缩物在捐献后可以具有约7天的有效寿命，并且在此时间段到期后，可以将血小板浓缩物冷冻和解冻，这可以裂解部分或全部细胞。在一些情况下，寿命可以为至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天等。

在一些实施例中，血小板浓缩物可以使用两步法获得，其中对全血样品进行多次离心。在第一次离心中，富血小板血浆(PRP)与全血分离。在一些实施例中，第一次离心后血小板的浓度为约3x 10⁸个血小板/mL。在一些实施例中，可以通过第二次离心的步骤来提高富血小板血浆级分中的血小板浓度。在一些实施例中，第二次离心的步骤后血小板浓度为至少10⁹个或更多个血小板。然而，将理解，这只是一个非限制性实例，并且其他从血液样品获得血小板的技术可以用于其他实施例，例如，单采术或其他技术，例如本文所述的那些。此外，离心后获得的血小板浓度可能会有所不同；例如，所述浓度可以是上述任何血小板浓度。

已经发现，根据一组实施例，与浓缩的血小板裂解物相比，从牛血中生产PRP更容易、更经济，并且产生了改善的细胞增殖结果。因此，在一些实施例中，富血小板血浆包含牛富血小板血浆。例如，图2A和图2B中的数据表明，无论初始血小板计数如何，包含2％浓度的牛PL的细胞培养生长培养基均提供了相似的细胞生长功效，但添加浓度高达10％的牛PRP的细胞培养生长培养基使增殖速率提高。图1中呈现的数据还表明，将牛血浆添加到人血小板裂解物中，可将PL的功效改善高达两倍。这些数据强调，血浆中生长因子、细胞因子、蛋白质、维生素和矿物质的存在对细胞增殖具有重要意义。因此，在一些实施例中，细胞培养生长培养基包含牛富血小板血浆和人血小板裂解物。然而，这些数据旨在是示例性的而非限制性的。

如前所述，某些实施例总体上涉及生产裂解物，例如血小板裂解物。例如，在一组实施例中，可以通过将细胞暴露于低渗水(例如蒸馏水)来裂解细胞。因此，在某些实施例中，将富血小板血浆和/或血小板浓缩物暴露于低渗溶液以导致细胞裂解。在一些实施例中，细胞可以暴露于至少足以裂解血小板的一定体积的低渗水。例如，所述体积可以占含有细胞的溶液体积的至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％。这些百分比是按体积计的百分比。

此外，其他实施例中可以使用裂解细胞的其他方法。作为一个非限制性实例，声能可以用于裂解细胞。例如，可以将细胞暴露于超声仪或超声波浴以导致细胞裂解。在另一组实施例中，细胞可暴露于一次或多次冷冻解冻循环，例如，其中温度降低到溶液的冰点以下，从而导致冰的形成，进而杀死至少一些细胞。作为第三个实例，在一些实施例中，血小板裂解物可以通过搅拌血小板来生产。作为第四个实例，血小板裂解物可以通过将血小板老化至少5天来生产。作为第五个实例，按照另一组实施例，血小板裂解物可以通过将血小板均质化来生产。在又一个实施例中，细胞可以例如反复通过挤出膜，其中在通过膜孔期间诱导的剪切应力使细胞裂解。

在某些实施例中，细胞可以被裂解，使得至少50％的细胞已经裂解或破裂，并且在一些实施例中，使得至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的细胞已被裂解或破裂。此外，在各种实施例中可以使用一种或多种裂解技术。

在一些情况下，可能希望将富血小板血浆和/或血小板浓缩物从包含至少一种生长因子的血小板裂解物或血清溶液中分离。在一些实施例中，可以使用本领域技术人员已知的任何技术将血小板从包含至少一种生长因子的裂解物或血清溶液中分离。这些技术可以包括，例如，沉降、过滤、分选、离心、免疫密度细胞分离、色谱法等。在一些情况下，可以使用过滤技术分离血小板，例如重力过滤、真空过滤、冷过滤、热过滤、多层过滤、机械过滤、表面过滤、深度过滤、切向流动过滤等。在一些实施例中，可以使用细胞分选技术例如荧光活性细胞分选(FACS)、微流控细胞分选等来分离血小板。在其他实施例中，可以使用例如密度梯度离心或亲和色谱法分离细胞。在一些实施例中，血清溶液可以通过倾析从血小板分离。

在一些情况下，血小板裂解物或血清溶液可以在室温或环境温度下储存在冷藏机或冰箱等中。在一些实施例中，血浆和/或血清溶液例如在这样的温度下储存时，可以储存至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少10天、至少14天等。

在一些实施例中，可以将包含生长因子的血小板裂解物、血浆或血清溶液冷冻干燥。本领域普通技术人员将知晓用于冷冻干燥化合物的系统和方法。此外，在一些实施例中，冻干溶液可以重构，例如，以其原始浓度，或以更高或更低的浓度，例如浓度为原始溶液浓度的至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少200倍、至少300倍、至少400倍、至少500倍、至少600倍、至少700倍、至少800倍、至少900倍、至少1000倍。

此外，本披露的某些方面涉及生产细胞培养生长培养基，例如，用于培育基于细胞的肉类或其他动物源性产品，或其他技术，例如本文所述的那些。在一些实施例中，细胞培养生长培养基包含细胞培养基。可通过商业供应商(例如吉布科公司(gibco)、赛多利斯公司(Sartorius)等)购买或由本领域技术人员合成的示例性细胞培养基包括DMEM、RPMI1640、MEM、DMEM/F12、Ham’s F-10营养混合物、Ham’s F-12营养混合物、培养基199、勃脉力复方电解质注射液(Plasma-Lyte)、PBS等。

在一些情况下，可能希望向细胞培养基中添加一种或多种血液成分，例如血浆、血清、富血小板血浆、血小板裂解物等，例如增强细胞培养基的生物活性，例如促进细胞增殖。在一些实施例中，血液成分，例如血浆、血清、血小板、富血小板血浆等，可以来源于选自由以下组成的组的非人活体动物：牛、绵羊、山羊、猪、鹿、骆驼、鲸、家禽、鱼、蟹和虾。在一些实施例中，细胞培养基包含血小板裂解物，其中使用单采术从活体动物收获血小板；在另一组实施例中，细胞培养基包含富血小板血浆，其中使用单采术从活体动物收获富血小板血浆。在其他实施例中，细胞培养生长培养基包含血浆产品，其中使用单采术从活体动物收获血浆产品。

在一些实施例中，富血小板血浆和/或血小板裂解物的浓度为细胞培养生长培养基的按重量计至少2％、按重量计至少5％、按重量计至少10％、按重量计至少15％、按重量计至少20％等。在一些实施例中，血小板裂解物和富血小板血浆的浓度为细胞培养基的按重量计至少2％至20％。在其他实施例中，血小板裂解物和富血小板血浆的浓度为细胞培养基的按重量计至少5％至15％。在一些实施例中，血小板裂解物和富血小板血浆为细胞培养基的按重量计至少10％。在一些实施例中，血浆和/或血清的浓度为细胞培养生长培养基的按重量计至少2％、按重量计至少5％、按重量计至少10％、按重量计至少15％、按重量计至少20％等。

在一些实施例中，细胞培养生长培养基可以包含人血小板裂解物；在其他实施例中，细胞培养生长培养基可以包含牛富血小板血浆。在一些情况下，根据一些实施例，细胞培养基可以包含人血小板裂解物和牛富血小板血浆。在一些实施例中，细胞培养生长培养基中人血小板裂解物的浓度为按重量计至少1％、按重量计至少2％、按重量计至少3％、按重量计至少5％、按重量计至少10％等。在一些实施例中，细胞培养生长培养基中牛富血小板血浆的浓度为在细胞培养生长培养基中按重量计至少2％、按重量计至少5％、按重量计至少10％、按重量计至少15％和按重量计至少20％。在一些实施例中，细胞培养生长培养基中人血小板裂解物与牛富血小板血浆的比例为至少1:2、至少1:4、至少1:6、至少1:8、至少1:10或至少1:12等。

在一些实施例中，细胞培养基可以包含血小板。如本文其他地方所述，血小板可以从非人活体动物收获，例如牛、绵羊、山羊、猪(pig，swine)、鹿、骆驼、鲸、家禽、鱼、蟹或虾。然而，在一些实施例中，血小板可以由医疗机构(例如，人血小板)、兽医机构或屠宰场捐献。在一些实施例中，使用单采术从非人活体动物(例如牛)收获血小板，其中将较小百分比的血小板从动物中移出，将剩余的血液成分(例如，红细胞，血浆等)返回至动物。

如本文其他地方所述，可以将激动剂和/或抗原添加到细胞培养基中以活化血小板。可以添加到细胞培养基中以活化血小板的激动剂的非限制性实例包括二磷酸腺苷(ADP)、血栓素、凝血酶、肾上腺素、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯、凝血酶受体激动剂肽等。

在一些实施例中，细胞培养基可以包含多种添加剂。添加剂可以是天然存在的(即自然界中发现的)或合成的(即人造的)。例如，在一些实施例中，细胞培养生长培养基可以包含肽、维生素、细胞因子和生长因子；在其他实施例中，细胞培养基可以包含合成和/或重组蛋白、维生素、细胞因子和生长因子。其他添加剂的非限制性实例包括柠檬酸盐、EDTA、氯化钙、碱性成纤维细胞生长因子和纤溶酶原。此外，在某些实施例中，添加剂的组合也是可能的。如果存在多于一种的添加剂，它们可以独立地具有相同或不同的浓度。在一些实施例中，添加剂选自由以下组成的组：蛋白质、肽、维生素、细胞因子和生长因子。在一些实施例中，添加剂是合成的化合物；在其他实施例中，添加剂是重组化合物。在一些实施例中，生长因子。生长因子的非限制性实例，例如，包括转化生长因子β、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、胰岛素样生长因子2、血管内皮生长因子、表皮生长因子、白细胞介素8、角质形成细胞生长因子和结缔组织生长因子。在一些实施例中，细胞培养生长培养基中生长因子的浓度为至少1ng/mL、至少2ng/mL、至少5ng/mL、至少100ng/mL、至少1000ng/mL。在一些实施例中，细胞培养生长培养基中成纤维细胞生长因子的浓度不大于1000ng/mL、不大于100ng/mL、不大于5ng/mL、不大于2ng/mL、和不大于1ng/mL。在一些实施例中，生长因子是成纤维细胞生长因子。此外，细胞培养生长培养基可以进一步包含至少一种非人动物血液成分，如本文所述。在一些实施例中，至少一种非人动物血液成分包含富血小板血浆；在其他实施例中，至少一种非人动物血液成分包含血浆产品；并且在其他实施例中，至少一种非人动物血液成分还包含血小板裂解物。

在一些情况下，可能希望生产不含血小板的细胞培养生长培养基(尽管在其他情况下，细胞培养生长培养基可能含有血小板)。因此，在一些实施例中，可以将包含至少一种生长因子的血浆和/或血清溶液(或血清溶液的浓缩形式)添加到细胞培养基中以生产细胞培养生长培养基。在一些实施例中，血浆和/或血清溶液(或血清溶液的浓缩形式)的浓度为细胞培养生长培养基的按重量计至少2％、按重量计至少5％、按重量计至少10％、按重量计至少15％或按重量计至少20％。

值得注意的是，已经发现，在一组实施例中，将细胞培养物中PRP的浓度增加到超过一定水平并不一定产生更好的结果。因此，在一些实施例中，将PRP浓度从10％增加到20％和30％不会使动物细胞(例如像羔羊肌成纤维细胞)的增殖提高。然而，在其他实施例中，将细胞培养中PRP的浓度增加到超过一定水平可能会产生更好的结果。

在一组实施例中，细胞培养生长培养基包含细胞培养基和血小板裂解物；在实施例的亚组中，细胞培养生长培养基进一步包含血浆和/或富血小板血浆。在第二组实施例中，细胞培养基包含细胞培养基和血浆；在实施例的亚组中，细胞培养基进一步包含血小板裂解物和/或富血小板血浆。在第三组实施例中，细胞培养基包含细胞培养基和富血小板血浆；在实施例的亚组中，细胞培养生长培养基进一步包含血浆和/或血小板裂解物。在另一组实施例中，细胞培养生长培养基包含细胞培养基、血小板裂解物和牛富血小板血浆；在实施例的亚组中，血小板裂解物是非人血小板裂解物。

细胞培养生长培养基的其他组成也是可能的。例如，在一些实施例中，细胞培养生长培养基可以包含细胞培养基、血小板裂解物和富血小板血浆，其中血小板裂解物和富血小板血浆占细胞培养基的按重量计2％至20％。在其他实施例中，细胞培养生长培养基包含细胞培养基、血小板裂解物和血浆，其中血小板裂解物和血浆占细胞培养基的按重量计2％至20％。在另一组实施例中，细胞培养生长培养基包含血浆和富血小板血浆，其中血浆和富血小板血浆占细胞培养基的按重量计2％至20％。在另一个非限制性实施例中，细胞培养生长培养基可以包含血浆和牛富血小板血浆，其中牛富血小板血浆占细胞培养基的按重量计10％。

本披露的其他方面涉及在包含至少一种血液成分的细胞培养生长培养基中培养细胞的方法，例如，以生产基于细胞的肉类产品。在一些实施例中，所述方法包括在生物反应器中将多个非人细胞暴露于包含血小板裂解物和富血小板血浆的细胞培养基，所述血小板裂解物和富血小板血浆提取自非人动物，而无需屠宰所述非人动物。在一些实施例中，细胞培养基进一步包含血浆产品，例如牛血浆产品。此外，在某些实施例中，组合也是可能的；例如，在一些实施例中，细胞培养基包含血浆。在其他实施例中，细胞培养基包含富血小板血浆和/或血小板裂解物。

本领域技术人员已知的任何类型的非人细胞都可以使用包含血小板裂解物和富血小板血浆的细胞培养生长培养基进行培养，包括例如成肌细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、血管细胞、乳腺、上皮细胞、成骨细胞、腱细胞、神经细胞等。在一些实施例中，非人细胞选自由以下组成的组：干细胞、间充质干细胞和诱导多能干细胞。此外，非人细胞可以来源于任何动物，包括例如牛、绵羊、山羊、猪、鹿、骆驼、鲸、家禽、鱼、蟹、虾或昆虫。

在一些实施例中，细胞生长培养基中的血小板裂解物和富血小板血浆与非人细胞来源于相同的动物物种；在其他实施例中，细胞生长培养基中的血小板裂解物和富血小板血浆与非人细胞来源于不同的物种。在另一组实施例中，细胞生长培养基中的血小板裂解物和富血小板血浆来源于多种不同的物种。

在其他实施例中，用于培育细胞的其他方法也是可能的。例如，在一些实施例中，所述方法包括将血小板裂解物和富血小板血浆添加到含有细胞培养生长培养基的生物反应器中，将动物细胞添加到生物反应器，以及使基于细胞的肉类在生物反应器中生长。根据一些实施例，另一种方法包括将血浆添加到含有细胞培养生长培养基的生物反应器中，将动物细胞添加到生物反应器中，以及使基于细胞的肉类在生物反应器中生长。根据其他实施例，第三种方法包括将血小板裂解物添加到含有细胞培养生长培养基的生物反应器中，将动物细胞添加到生物反应器中，以及使基于细胞的肉类产品在生物反应器中生长。根据另一组实施例，第四种方法包括将富血小板血浆添加到含有细胞生长培养基的生物反应器中，将动物细胞添加到生物反应器中，以及使基于细胞的肉类产品在生物反应器中生长。根据一些实施例，用于培育细胞的第五种方法包括将捐献的血小板浓缩物进行冷冻解冻以生产血小板裂解物，将血小板裂解物添加到含有细胞生长培养基的生物反应器中，以及在生物反应器中培育基于细胞的肉类产品。在其他实施例中，所述方法包括从活体动物中收获全血样品，从全血样品中分离富血小板血浆，以及将富血小板血浆添加到生物反应器中，其中所述生物反应器含有基于细胞的肉类产品。在另一个实施例中，所述方法包括从活体动物中收获全血样品，从全血样品中分离血浆产品，以及将血浆产品添加生物反应器中，其中所述生物反应器含有基于细胞的肉类产品。在一些实施例中，可以将如本文所述的细胞培养生长培养基添加到生物反应器中，例如，以用生物反应器刺激细胞生长。生物反应器可以用于生产多种产品中的任一种，例如生物药品、色素、酶等。作为另一个实例，在一些实施例中，生物反应器含有培养的动物源性肉类产品。在另一个实例中，在一些实施例中，生物反应器用于生产酒精饮品。在又一个实例中，生物反应器处理生物质。生物质是来自植物和动物的可再生的有机材料。生物质的应用包括但不限于将生物原料转化为生物燃料(例如生物乙醇和生物丁醇、化学品、材料和可燃气体)、酵母生物质等。在一些实施例中，生物反应器包含酶。在酶生物反应器中，酶用于催化生物化学转化和/或化学反应以生成所希望的产品。在一些实施例中，生物反应器包含酸乳；在一些实施例中，生物反应器包含乳酸饮品。在一些实施例中，生物反应器包含芳香族化合物。芳香族化合物在食品、饲料、化妆品和制药工业中很重要。在一些实施例中，生物反应器包含色素。在一些实施例中，生物反应器包含由细菌表达系统产生的蛋白质。

此外，本披露的某些方面涉及可持续地获取血液成分，用于在生物反应器中培育产品，例如像基于细胞的肉类或生物药品。在一些实施例中，可以从非人动物中收集血液，例如以获得血小板、富血小板血浆等。例如，从非人动物中重复采集血液可以用于获得免疫细胞等。

如将被本领域技术人员所理解的，动物源性产品，例如血浆、血小板和/或富血小板血浆(PRP)，可以例如通过单采术从不同的动物(例如牛、马和犬)安全地收获，并在兽医学中用于治疗各种损伤。还已提出将人血小板裂解物用于培育人干细胞作为FBS的动物友好性替代品。因此，在一些实施例中，血浆、血小板和富血小板血浆可以从动物重复收获，例如，不会造成动物健康问题。例如，血小板裂解物和富血小板血浆可以每30天收获至少1次、至少2次、至少3次、至少4次等，或以其他速率，如本文所述的那些进行收获。以这种方式，可以根据某些实施例经济地生产细胞培养生长培养基，用于大规模生产例如培育肉，而无需屠宰动物和/或不会因饲养动物进行屠宰而对环境造成不利影响。

在一些实施例中，单采术可以用于以不同的时间间隔从非人活体动物中收获血液成分。如本文所述，单采术允许从血液中选择性地移出一种或多种血液成分，并将未使用的血液成分返回至动物。单采术可以用于选择性地收获血浆、红细胞、白细胞、富血小板血浆、贫血小板血浆等。在一些实施例中，单采术可以用于以一定间隔收获一种或多种血液成分，而不影响动物的健康。例如，在一些实施例中，单采术可以用于以一定比率移出血液产品，例如血浆，所述比率为：每周抽血一次，为至少体重的1％；每周抽血一次，为至少体重的1.25％；每周抽血一次，为至少体重的1.5％；每周抽血一次，为至少体重的1.75％；每周抽血一次，为至少体重的2％；每周抽血一次，为至少体重的2.25％；每周抽血一次，为至少体重的2.5％；每周抽血一次，为至少体重的2.75％；每周抽血一次，为至少体重的3.0％；或每周抽血一次，为至少体重的3.5％。在一些实施例中，单采术可以用于以一定比率移出血液产品，例如血浆，所述比率为：每周抽血一次，不大于体重的3.5％；每周抽血一次，不大于体重的3.0％；每周抽血一次，不大于体重的2.75％；每周抽血一次，不大于体重的2.5％；每周抽血一次，不大于体重的2.25％；每周抽血一次，不大于体重的2％；每周抽血一次，不大于体重的1.75％；每周抽血一次，不大于体重的1.5％；每周抽血一次，不大于体重的1.25％；每周抽血一次，不大于体重的1％。

在其他实施例中，单采术可以用于以一定比率移出血液产品，例如血浆，所述比率为：每2周抽血一次，为至少体重的1％；每两周抽血一次，为至少体重的1.25％；每两周抽血一次，为至少体重的1.5％；每两周抽血一次，为至少体重的1.75％；每两周抽血一次，为至少体重的2％；每两周抽血一次，为至少体重的2.25％；每两周抽血一次，为至少体重的2.5％；每两周抽血一次，为至少体重的2.75％；每两周抽血一次，为至少体重的3.0％；或每两周抽血一次，为至少体重的3.5％。在一些实施例中，单采术可以用于以一定比率移出血液产品，例如血浆，所述比率为：每两周抽血一次，不大于体重的3.5％；每两周抽血一次，不大于体重的3.0％；每两周抽血一次，不大于体重的2.75％；每两周抽血一次，不大于体重的2.5％；每两周抽血一次，不大于体重的2.25％；每两周抽血一次，不大于体重的2％；每两周抽血一次，不大于体重的1.75％；每两周抽血一次，不大于体重的1.5％；每两周抽血一次，不大于体重的1.25％；每两周抽血一次，不大于体重的1％。

液体替代疗法可以用于较大量抽血。血液采样的频率可以取决于总体积。在一些实施例中，在不进行补液治疗的情况下，单次抽血可占血容量的15％，如果在两周时间段内进行补液治疗，则单次抽血可占血容量的高达20％。补液治疗有助于补充丢失的血容量，并且可以用于防止动物进入低血容量性休克。可以使用本领域技术人员已知的任何合适的液体，包括生理盐水、勃脉力复方电解质注射液(Plasma-Lyte)、葡聚糖40等。因此，在一组实施例中，可以从非人动物中抽取或获取一次或多次抽血，例如，生产血浆产品、血小板裂解物(PL)和/或富血小板血浆(PRP)，例如，包括本文所述的那些。非人动物的示例性实施例包括鸡、牛、猪、羊(mutton)、山羊、鹿、鱼、鸭、火鸡、虾或其他通常被认为可供人广泛食用的动物。在一些情况下，可以使用任何合适的技术(例如离心和单采术)对血液进行处理以分离各种成分，例如血浆、富血小板血浆、红细胞等。例如，单采术可以用于通过将血液通过编程为移出特定血液成分(例如血小板、免疫细胞等)的机器来分离血液成分。在一些情况下，未使用的血液成分可以返回至动物，这允许更频繁地捐献体内快速补充的血液成分，例如血小板。在一些情况下，可以抽取血液样品并例如通过离心进行处理，以分离富血小板血浆、免疫细胞(即血沉棕黄层(buffy coat))、红细胞等。

在一些情况下，可以以一定间隔从供体动物进行抽血，所述间隔可以是规律的或不规律的。在抽血的间隔期，动物可以恢复并产生新的血液。可以使用任何合适的间隔。例如，可以每2周、每4周、每6周、每2个月等从动物抽取血液。例如，在一些实施例中，可以从动物抽取血液，并且在适当的间隔后，可以从动物再次抽取血液。此循环也可以重复任何合适的次数。可以对抽血进行分别处理，例如，如本文所讨论的。例如，血液可以用于分离血小板和/或富血小板血浆。

此外，还可以例如以间隔(例如本文讨论的)对动物进行第二次、第三次等抽血。每次抽血中抽取的血液可以以相同或不同的方式处理，这取决于应用。在一些实施例中，动物在抽血的间隔期保持存活，并且可以恢复并产生新血液。以这种方式，虽然由动物来生产血液，但为了使动物继续生产血液，动物不会被屠宰。

此外，在一些情况下，本文所述的任何细胞和血液成分都可以从屠宰动物的血液中分离。

一般认为，根据一些实施例，用血小板裂解物(PL)和富血小板血浆(PRP)代替胎牛血清作为细胞培养基中生长因子的主要来源，可以减轻大规模生产培育肉的经济负担，使生产成本与传统肉类产品相似，加之对环境的影响较低，并且对动物没有不利影响。例如，根据一项计算，一头存活约15至20年的牛可以提供足够的血液产品来生产足以相当于50头为屠宰而饲养的牛的培育肉。因此，在本披露的某些实施例中描述的做法可能能够大幅减少传统农业做法对环境的影响。

此外，本披露的一些方面涉及基于细胞的肉类产品，例如，使用如本文所述的细胞培养生长培养基在生物反应器中生长或生产的肉类产品。在一些实施例中，基于细胞的肉类产品包括非人细胞，例如血小板、干细胞、成肌细胞、肌管、成纤维细胞、脂肪细胞等。非人细胞可以来源于任何合适的来源，包括牛、猪、绵羊、山羊、鹿、鱼、鸭、火鸡、虾或任何其他通常被认为可供人广泛食用的动物。在一些实施例中，基于细胞的肉类产品包含肌肉复制品，例如描述于Hosseini等人，于2021年11月15日提交的名称为“Constructs ComprisingFibrin or Other Blood Products for Meat Cultivation and Other Applications[用于肉类培育和其他应用的包含纤维蛋白或其他血液产品的构建体]”的美国序列号63/279,617中，将其通过引用以其全文并入本文。肌肉复制品可以包括肌肉细胞，例如成肌细胞，所述细胞在生物反应器或其他细胞培养系统中于微载体或其他基质(例如纤维蛋白微载体)上培养。在一些实施例中，成肌细胞可以融合在一起形成肌管(肌管通常是肌肉纤维和肉的基础)，以生产类似于碎牛肉的产品。此外，在一些情况下，微载体或支架可能具有例如凹槽结构，可以使细胞(例如成肌细胞)在特定方向上对齐，尽管这不是必需的。这样的结构描述于Khademhosseini等人，于2021年3月10日提交的名称为“Constructs for MeatCultivation and Other Applications[用于肉类培育和其他应用的构建体]”的美国序列号63/159,403中，将其通过引用以其全文并入本文。

在一些实施例中，基于细胞的肉类产品包含脂肪复制品，以改善肉类产品的外观、味道和质地，例如描述于Hosseini等人，于2021年11月15日提交的名称为“Systems andMethods of Producing Fat Tissue for Cell-Based Meat Products[生产用于基于细胞的肉类产品的脂肪组织的系统和方法]”的美国序列号63/279,642中，将其通过引用以其全文并入本文。例如，脂肪复制品可以通过将脂肪(例如任何动物或植物油，例如葵花籽油)或基于动物的细胞(例如脂肪细胞)分散在非人血浆中，然后使血浆交联和/或凝结，例如形成含有脂肪分散体的水凝胶来形成。在其他实施例中，可以将脂肪细胞(fat cell)(例如脂肪细胞(adipocyte)或脂肪祖细胞)接种在微载体或其他可食用支架材料上，并允许其例如在细胞培养系统(例如生物反应器)中生长以生产可以与肌肉复制品混合的脂肪复制品。

在一些实施例中，基于细胞的肉类产品包含红细胞裂解物，以使得肉产品着色或“发红”，例如描述于Hosseini等人，于2021年11月15日提交的名称为“Production of Hemefor Cell-Based Meat Products[用于基于细胞的肉类产品的血红素的生产]”的美国序列号63/279,644中，将其通过引用以其全文并入本文。因此，一些实施例涉及红细胞的裂解物。如本文所述，这样的裂解物可以例如通过使用各种裂解技术(例如暴露于低渗水、声空化或通过膜挤出)中的任何一种裂解红细胞来生产。

肌肉复制品、脂肪复制品、红细胞裂解物和血小板可以以任何合适的量与基于细胞的肉类产品一起存在。例如，肌肉复制品可以以至少10wt％、至少20wt％、至少30wt％、至少40wt％、至少50wt％、至少60wt％、至少70wt％、至少80wt％、至少90wt％等和/或不超过95wt％、不超过90wt％、不超过80wt％、不超过70wt％、不超过60wt％、不超过50wt％、不超过40wt％、不超过30wt％、不超过20wt％、不超过10wt％等存在。类似地，脂肪复制品可以以至少10wt％、至少20wt％、至少30wt％、至少40wt％、至少50wt％、至少60wt％、至少70wt％、至少80wt％、至少90wt％等和/或不超过95wt％、不超过90wt％、不超过80wt％、不超过70wt％、不超过60wt％、不超过50wt％、不超过40wt％、不超过30wt％、不超过20wt％、不超过10wt％等存在。细胞裂解物也可以以至少10wt％、至少20wt％、至少30wt％、至少40wt％、至少50wt％、至少60wt％、至少70wt％、至少80wt％、至少90wt％等和/或不超过95wt％、不超过90wt％、不超过80wt％、不超过70wt％、不超过60wt％、不超过50wt％、不超过40wt％、不超过30wt％、不超过20wt％、不超过10wt％等存在。

在一些实施例中，富血小板血浆占最终基于细胞的肉类产品中细胞的至少0.1％、至少0.2％、至少0.3％、至少0.4％、至少0.5％、至少0.6％、至少0.7％、至少0.8％、至少0.9％、至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％等和/或最终基于细胞的肉类产品中细胞的不超过10％、不超过9％、不超过8％、不超过7％、不超过6％、不超过5％、不超过4％、不超过3％、不超过2％、不超过1％、不超过0.9％、不超过0.8％、不超过0.7％、不超过0.6％、不超过0.5％、不超过0.4％、不超过0.3％、不超过0.2％、不超过0.1％等。在一些实施例中，基于细胞的肉类产品中至少0.1％的细胞是富血小板血浆。在一些实施例中，富血小板血浆包含牛富血小板血浆。

在一些实施例中，基于细胞的肉类产品包含血小板裂解物。如本文所述，这样的裂解物可以例如通过使用各种裂解技术(例如暴露于低渗水、声空化或通过膜挤出)中的任何一种裂解血小板来生产。在一些实施例中，血小板裂解物占最终基于细胞的肉类产品中细胞的至少0.1％、至少0.2％、至少0.3％、至少0.4％、至少0.5％、至少0.6％、至少0.7％、至少0.8％、至少0.9％、至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％等和/或最终基于细胞的肉类产品中细胞的不超过10％、不超过9％、不超过8％、不超过7％、不超过6％、不超过5％、不超过4％、不超过3％、不超过2％、不超过1％、不超过0.9％、不超过0.8％、不超过0.7％、不超过0.6％、不超过0.5％、不超过0.4％、不超过0.3％、不超过0.2％、不超过0.1％等。在一些实施例中，基于细胞的肉类产品中至少0.1％的细胞是血小板裂解物。在一些实施例中，血小板裂解物包含血小板裂解物。

在一些实施例中，基于细胞的肉类产品包含血小板裂解物和血浆产品，其中基于细胞的肉类产品中至少0.1％的细胞是血小板细胞。在另一个实施例中，基于细胞的肉类产品包含富血小板血浆和血浆产品，其中基于细胞的肉类产品中至少0.1％的细胞是血小板细胞。在又一个实施例中，基于细胞的肉类产品包含富血小板血浆和血小板裂解物，其中基于细胞的肉类产品中至少0.1％的细胞是血小板细胞。

此外，本披露的一些方面涉及生产培育产品，例如，使用如本文所述的细胞培养生长培养基在生物反应器中生长或生产的产品。在一些实施例中，培育产品包含可以用于例如生产服装和纺织品的皮革产品。培育产品的其他非限制性实例包括奶、毛皮、毛发、羊毛、器官、角、獠牙等。

以下专利申请各自通过引用以其全文并入本文：于2021年3月10日提交的名称为“Constructs for Meat Cultivation and Other Applications[用于肉类培育和其他应用的构建体]”的美国临时专利申请序列号63/159,403；于2021年11月15日提交的名称为“Constructs Comprising Fibrin or Other Blood Products for Meat Cultivationand Other Applications[用于肉类培育和其他应用的包含纤维蛋白或其他血液产品的构建体]”的美国临时专利申请序列号63/279,617；于2021年11月15日提交的名称为“Methodsand Systems of Preparing Cultivated Meat from Blood or Cellular Biomass[从血液或细胞生物质制备培育肉的方法和系统]”的美国临时专利申请序列号63/279,631；于2021年11月15日提交的名称为“Systems and Methods of Producing Fat Tissue forCell-Based Meat Products[生产用于基于细胞的肉类产品的脂肪组织的系统和方法]”的美国临时专利申请序列号63/279,642；于2021年11月15日提交的名称为“Production ofHeme for Cell-Based Meat Products[用于基于细胞的肉类产品的血红素的生产]”的美国临时专利申请序列号63/279,644；于2022年1月18日提交的名称为“Animal-DerivedAntimicrobial Systems and Methods[动物源性抗微生物系统和方法]”的美国临时专利申请序列号US 63/300,577；于2021年3月22日提交的名称为“Growth Factor forLaboratory Grown Meat[用于实验室培育肉的生长因子]”的美国临时专利申请序列号63/164,397；于2021年3月22日提交的名称为“Methods of Producing Animal DerivedProducts[生产动物源性产品的方法]”的美国临时专利申请序列号63/164,387；于2022年2月25日提交的名称为“Growth Factors for Laboratory Grown Meat and OtherApplications[用于实验室培育肉和其他应用的生长因子]”的美国临时专利申请序列号63/314,171；以及于2022年2月25日提交的名称为“Methods and Systems of ProducingProducts Such as Animal Derived Products[生产产品例如动物源性产品的方法和系统]”的美国临时专利申请序列号63/314,191。

以下实例旨在说明本披露的某些实施例，但未举例说明本披露的全部范围。

实例1

根据本实例，评估了人血小板裂解物(hPL)在0.5％、1％和2％浓度下以及2％hPL与8％牛血浆的组合对羔羊成肌细胞增殖的影响，并且将其与已知用于培养培育肉的可商购培养基配方Essential 8^TM(赛默飞世尔科技公司)和作为对照的不含补充剂的基础无血清细胞培养基(来自吉布科公司的杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco’smodifiedEagle Medium，DMEM)、GlutaMAX^TM和丙酮酸钠)进行比较。将从羔羊分离的原代成肌细胞在96孔板中以每平方厘米4000个细胞的初始密度培养5天，所得细胞计数如图1所示。这些结果表明，2％人血小板裂解物(hPL)与8％牛血浆的组合是对细胞增殖最有效的配方。

实例2

根据本实例，评估了各种培养基组合物对原代羔羊成肌细胞生长的影响。将羔羊成肌细胞在96孔板中以每平方厘米4000个细胞的初始密度培养5天，培养基每隔一天更换一次。测试了以下培养基配方：(1)使用不含补充剂的基础无血清培养基(来自吉布科公司的DMEM、Glutamax、丙酮酸盐)作为对照；(2)2％牛血小板裂解物(bPL)，初始血小板计数为2x 10⁹个/ml：(3)2％牛血小板裂解物(bPL)，初始血小板计数为0.2x 10⁹个/ml；(4)来自柠檬酸盐血的牛贫血小板血浆(bPP血浆-1)；(5)来自脱纤维蛋白血的牛贫血小板血浆(bPP血浆-2)；(6)牛富血小板血浆(通过以300g离心25min获得)(bPRP)，其中血小板通过冷冻解冻裂解：(7)来自商业供应商(干细胞科技公司(Stem Cell Technologies)，美国)的人血小板裂解物(hPL)；以及(8)FBS：胎牛血清(英杰公司(Invitrogen)，美国)。对于每种培养基，图2A中示出了所得细胞计数，以及图2B中示出了细胞倍增时间。这些结果表明，牛富血小板血浆的生长结果在统计学上与利用胎牛血清的生长结果相当，并且显著优于对照和其余的生长培养基。

实例3

本实例证明了与胎牛血清相比，改良的细胞培养生长培养基(包含富血小板血浆)能够增强牛成肌细胞增殖。将牛成肌细胞悬浮于含有10％胎牛血清的DMEM中，并以10,000个细胞/孔的细胞密度接种，以使其粘附到培养基质上。6小时后，去除培养基并添加新鲜的DMEM(无血清)。12小时后，再次去除细胞培养基，并替换为含有10％牛富血小板血浆的DMEM。随后将细胞在37℃下于95％ O₂和5％ CO₂中孵育24小时，之后去除细胞培养基。在实验亚组中，向牛富血小板血浆补充浓度递增的表皮生长因子(EFG，10ng/mL、50ng/mL或100ng/mL)，胰岛素生长因子(IGF，50ng/mL、100ng/mL或200ng/mL)，成纤维细胞生长因子(FGF，2ng/mL、10ng/mL或20ng/mL)，或IGF(100ng/mL)、EGF(50ng/mL)和FGF(10ng/mL)的组合。然后用磷酸盐缓冲盐水洗涤培养的细胞3次以去除所有培养基，将培养的细胞胰蛋白酶化以将其从培养基质中释放，并使用光学技术确定细胞数量。结果表明，富血小板血浆在刺激成肌细胞增殖方面与胎牛血清效果相当。结果还证明了用另外的生长因子补充富血小板血浆以浓度依赖性方式提高了细胞增殖(图3)。

实例4

本实例证明了来自不同牛的富血小板血浆分离物的性能。表1包括与所使用牛的类型、其出生日期、体重、所捐的富血小板血浆总体积和捐血频率相关的信息。然后从每只动物获取富血小板血浆并将富血小板血浆用于生产细胞培养生长培养基。为了确定这样的溶液的增殖潜力，将牛成肌细胞悬浮于含有10％胎牛血清的DMEM中，并以10,000个细胞/孔的细胞密度接种，以使其粘附到培养基质上。6小时后，去除培养基并添加新鲜的DMEM(无血清)。12小时后，再次去除细胞培养基，并替换为含有来自各种牛的10％牛富血小板血浆分离物的DMEM。将对照样品与10％胎牛血清或10％猪富血小板血浆(从屠宰场获得)一起孵育。随后将细胞在37℃下于95％O₂和5％ CO₂中孵育24小时，之后去除细胞培养基。然后用磷酸盐缓冲盐水洗涤培养的细胞3次以去除所有培养基，将培养的细胞胰蛋白酶化以将其从培养基质中释放，并使用光学技术确定细胞数量。结果表明，相对于无血清培养基，从牛供体分离的富血小板血浆显著增强了细胞增殖，并且与胎牛血清效果相当，无论供体牛如何(图4)。此外，表1示出了与所使用牛的类型、其出生日期、体重、所捐的富血小板血浆体积和捐血频率相关的信息。

表1

实例5

本实例证明了改变从各种供体牛(参见表1)分离的富血小板血浆浓度对牛成肌细胞增殖的影响。获得来自一头成熟荷斯坦牛(2371)和几头幼龄荷斯坦小母牛(4321、4266、4348和14583)的富血小板血浆，并以2.5wt％、5wt％或10wt％的最终浓度添加到DMEM中。为了确定这样的溶液的增殖潜力，将牛成肌细胞悬浮于含有10％胎牛血清的DMEM中，并以10,000个细胞/孔的细胞密度接种，以使其粘附到培养基质上。6小时后，去除培养基并添加新鲜的DMEM(无血清)。12小时后，再次去除细胞培养基，并替换为含有不同浓度的牛富血小板血浆(如上所述)的DMEM。将对照样品在无血清DMEM或含有10％胎牛血清的DMEM中孵育。随后将细胞在37℃下于95％ O₂和5％ CO₂中孵育24小时，之后去除细胞培养基。然后用磷酸盐缓冲盐水洗涤培养的细胞3次以去除所有培养基，将培养的细胞胰蛋白酶化以将其从培养基质中释放，并使用光学技术确定细胞数量。结果表明，细胞增殖随着富血小板血浆浓度的增加而增加；并且10％富血小板血浆在促进细胞增殖方面与10％胎牛血清效果一样(图5)。

实例6

本实例证明了改变从各种供体牛(参见表1)分离的富血小板血浆浓度对人肝细胞增殖的影响。获得来自一头成熟荷斯坦牛(2371)和几头幼龄荷斯坦小母牛(4321、4266、4348和14583)的富血小板血浆，并以2.5wt％、5wt％、7.5wt％或10wt％的最终浓度添加到DMEM中。为了确定这样的溶液的增殖潜力，将人肝细胞悬浮于含有10％胎牛血清的DMEM中，并以10,000个细胞/孔的细胞密度接种，以使其粘附到培养基质上。6小时后，去除培养基并添加新鲜的DMEM(无血清)。12小时后，再次去除细胞培养基，并替换为含有不同浓度的牛富血小板血浆(如上所述)的DMEM。将对照样品在无血清DMEM中孵育。随后将细胞在37℃下于95％ O₂和5％ CO₂中孵育24小时，之后去除细胞培养基。然后用磷酸盐缓冲盐水洗涤培养的细胞3次以去除所有培养基，将培养的细胞胰蛋白酶化以将其从培养基质中释放，并使用光学技术确定细胞数量。结果表明，细胞增殖随着富血小板血浆浓度的增加而增加，其中10％富血小板血浆是最有效的(图6)。

实例7

本实例证明了重复抽血对动物供体健康的影响(参见表1)。每周抽取幼龄荷斯坦小母牛(4266，4348)或每两周抽取成熟荷斯坦牛(2315，2371)、幼龄阉牛(5211，5276)和幼龄荷斯坦小母牛(14424和14583)的富血小板血浆，持续9周、12周或13周。捐献的富血小板血浆总体积从9L到14L不等(作为参考，牛的总血容量为约55mL/kg，或对于体重1350磅的牛而言总血容量为约33L)。在捐献富血小板血浆时进行全血抽取，并进行标准的血液学和血液化学检查。这些测试是兽医学的常规测试，并且提供了有关动物健康的信息。这些测试报告了红细胞计数(例如，贫血指标)、血红蛋白水平(例如，贫血指标)、白细胞计数(例如，感染指标)、血小板计数(例如，凝血病症指标)、纤维蛋白原浓度(例如，凝血障碍指标)、白蛋白水平(例如，肝脏健康指标)、AST水平(例如，肝损伤指标)和ALP水平(例如，肝损伤指标)。如从图8至15中可以看出，没有观察到从幼龄或成熟的荷斯坦牛和幼龄阉牛重复捐献的富血小板血浆对健康的不良影响。

实例8

本实例说明了以下实验：对牛使用单采术方法以每周和每两周方案收集体积相当于牛体重的1.6％的富血小板血浆，持续时间长达3个月。图16中示出了每两周(图16A至16F)和每周(图16G至16L)抽血的研究结果。

这项研究表明，相对于每两周进行收集，每周进行收集没有影响与牛健康相关的主要血液和肝脏标志物。在这些图中，虚线示出了从临床角度常规检查的特定标志物(包括红细胞、血红蛋白和血细胞比容)的上限和下限。

实例9

本实例说明了重复抽血对碱性成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)和转化生长因子β(TGF-β)的血液浓度水平的影响。使用单采术每周或每两周从幼龄荷斯坦小母牛、幼龄阉牛和成熟荷斯坦牛提取富血小板血浆，持续13周。使用标准酶联免疫吸收测定法来测定富血小板血浆中FGF-2和TGF-β的浓度。重复抽血对两种生长因子的血浆浓度水平均无影响(图16和图17)。有趣的是，一项回顾性分析示出，成熟母牛的生长因子浓度似乎更高。

实例10

本实例说明了重复抽血对从幼龄和成熟的两种性别的牛分离的富血小板血浆(PRP)的增殖能力的影响。在3个月时间段内从表1中列出的牛中分离PRP。评估在3个月时间段的开始、中期和结束时分离的PRP样品刺激牛成肌细胞增殖的能力。在每个相应的时间点，从新鲜肌肉活检分离牛成肌细胞，从组织解离，重悬于补充有20％胎牛血清的DMEM中，并以25,000个细胞/孔的上样密度接种在24孔板上。4小时后，去除细胞培养基，并将细胞与10％ PRP或10％ FBS在DMEM(加1％P/S+Normocin和肝素)中一起孵育。72小时后，使用计数载玻片计数每个孔的细胞数并确定细胞增殖程度(将数据相对于FBS处理组归一化)。本实例中的结果表明如下：(1)3个月内，PRP的增殖能力没有随着重复收集而降低，(2)在成熟群组中，重复收集PRP提高了其增殖能力，(3)每周收集PRP比每两周收集更好地增强了牛肌肉增殖，以及(4)牛的性别对PRP促进细胞增殖的能力没有显著影响。

考虑到前述对本发明当前优选实施例的描述，本领域技术人员预期在本发明的实践中会发生许多修改和变化。因此，应当对本发明的范围施加的唯一限制是在所附权利要求中出现的那些限制。

此外，尽管本文已经描述和示出了本披露的几个实施例，但本领域普通技术人员将容易地设想到用于执行本文描述的功能和/或获得本文描述的结果和/或一个或多个优点的多种其他手段和/或结构，并且这样的变型和/或修改各自都被认为在本披露的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易理解，本文描述的所有参数、尺寸、材料和构造旨在是示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或构造将取决于本披露的传授内容要用于的一个或多个特定的应用。本领域技术人员将认知到、或不使用过度常规实验就能够确定本文描述的本披露的特定实施例的许多等效形式。因此，应当理解的是，前述实施例仅作为实例呈现，并且在所附权利要求及其等同物的范围内，本披露可以以不同于所特别描述和要求保护的方式来实践。本披露涉及本文所述的每个单独特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法。另外，如果这样的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法并非相互矛盾，则两种或更多种这样的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法的任何组合均包括在本披露的范围内。

在本说明书和通过引用并入的文献包括冲突和/或不一致的披露的情况下，应以本说明书为准。如果通过引用并入的两个或更多个文献包含相互冲突和/或不一致的披露，则以具有较晚有效日期的文献为准。

如本文所定义和使用的所有定义应理解为优先于字典定义、通过引用并入的文献中的定义和/或所定义的术语的普通含义。

如本文在说明书和权利要求书中所用，不定冠词“一个/种(a/an)”应理解为意指“至少一个/种”，除非明确指出与此相反。

如本文在说明书和权利要求书中所用，短语“和/或”应理解为意指被如此结合的要素中的“任一个或两个”，即，在一些情况下相伴存在而在其他情况下分开存在的要素。用“和/或”列出的多个要素应该以相同的方式解释，即“一个或多个”被这样结合的要素。除了由“和/或”子句特别指出的要素之外，可以任选地存在其他要素，无论是否与那些特别指出的要素相关或不相关。因此，作为非限制性实例，当与诸如“包括”之类的开放式语言结合使用时，对“A和/或B”的提及在一个实施例中可以仅指A(任选地包括除B之外的要素)；在另一个实施例中可以仅指B(任选地包括除A之外的要素)；在又一个实施例中可以指A和B两者(任选地包括其他要素)；等。

如本文在说明书和权利要求书中所用，“或”应当理解为具有与如上所定义的“和/或”相同的含义。例如，当分隔列表中的项时，“或”或“和/或”应被理解为包含性的，即包含至少一个，但也包括多个要素或要素列表中的多于一个，以及任选的其他未列出的项。只有明确相反的术语如“仅一个”或“恰好一个”或者当在权利要求中使用时，“由...组成”将指包含多个要素或要素列表中的恰好一个要素。一般来讲，如本文所用，术语“或”仅应被理解为表示前面带有排他性术语诸如“任一个”、“一个”、“仅一个”或“恰好一个”的排他性替代物(即“一个或另一个但不是二者全部”)。

如本文在说明书和权利要求书中所用，关于一个或多个要素的列表，短语“至少一个”应理解为意指选自要素列表中任一个或多个要素的至少一个要素，但不一定包括要素列表中特别列出的每一个要素中的至少一个，并且不排除要素列表中要素的任何组合。该定义还允许除了在短语“至少一个”所指的要素列表内特别指出的要素之外，可任选地存在要素，无论是与特别指出的那些要素相关还是无关。因此，作为非限制性实例，“A和B中的至少一者”(或等效地“A或B中的至少一者”，或等效地“A和/或B中的至少一者”)可以在一个实施例中指至少一个A，任选地包括多于一个A，而不存在B(并且任选地包括除B之外的要素)；在另一个实施例中指至少一个B，任选地包括多于一个B，而不存在A(并且任选地包括除A之外的要素)；在又一个实施例中指至少一个A，任选地包括多于一个A，以及至少一个B，任选地包括多于一个B(并且任选地包括其他要素)；等。

当在本文中关于数字使用词语“约”时，应理解本披露的仍另一实施例包括未因词语“约”的存在而被修饰的数字。

还应当理解，除非有相反的明确说明，否则在本文要求保护的包括多于一个步骤或动作的任何方法中，所述方法的步骤或动作的顺序不一定限于列举所述方法的步骤或动作时的顺序。

在权利要求中以及在上述说明书中，所有连接词，如“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“由……构成”等应被理解为是开放式的，即，意指包括但不限于。如美国专利局专利审查程序手册(United States Patent Office Manual of PatentExamining Procedures)第2111.03节所述，只有连接词“由……组成”和“基本上由……组成”应分别为封闭或半封闭连接词。

Claims (121)

1.一种用于培育基于细胞的肉类的细胞培养基，所述细胞培养基包含使用非人动物可持续地收获的血小板裂解物和富血小板血浆。

2.如权利要求1所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基进一步包含血浆产品。

3.如权利要求1-2中任一项所述的细胞培养基，其中所述血小板裂解物和富血小板血浆占所述细胞培养基的按重量计至少2％至20％。

4.如权利要求1-3中任一项所述的细胞培养基，其中所述血小板裂解物和所述富血小板血浆占所述细胞培养基的按重量计至少5％至15％。

5.如权利要求1-4中任一项所述的细胞培养基，其中所述血小板裂解物和所述富血小板血浆占所述细胞培养基的按重量计至少10％。

6.如权利要求1-5中任一项所述的细胞培养基，其中所述血小板裂解物包括非人血小板裂解物。

7.如权利要求1-6中任一项所述的细胞培养基，其中所述富血小板血浆包括牛富血小板血浆。

8.如权利要求1-7中任一项所述的细胞培养基，其中所述细胞培养基进一步包含血小板。

9.如权利要求8所述的细胞培养基，其中所述血小板从活体动物收获。

10.如权利要求8或9中任一项所述的细胞培养基，其中所述血小板使用单采术从活体动物收获。

11.如权利要求8-10中任一项所述的细胞培养基，其中所述血小板来源于选自由以下组成的组的动物：牛、绵羊、山羊、猪、鹿、骆驼、鲸、家禽、鱼、蟹和虾。

12.如权利要求8-11中任一项所述的细胞培养基，所述细胞培养基进一步包含活化血小板的激动剂。

13.如权利要求8-12中任一项所述的细胞培养基，所述细胞培养基进一步包含活化血小板的抗原。

14.如权利要求1-13中任一项所述的细胞培养基，其中所述富血小板血浆从非人活体动物收获。

15.如权利要求14所述的细胞培养基，其中所述富血小板血浆使用单采术从非人活体动物收获。

16.如权利要求1-15中任一项所述的细胞培养基，其中所述富血小板血浆来源于选自由以下组成的组的动物：牛、绵羊、山羊、猪、鹿、骆驼、鲸、家禽、鱼、蟹和虾。

17.如权利要求1-16中任一项所述的细胞培养基，其中所述血小板裂解物通过将血小板冷冻解冻来生产。

18.如权利要求1-17中任一项所述的细胞培养基，其中所述血小板裂解物通过搅拌血小板生产。

19.如权利要求1-18中任一项所述的细胞培养基，其中所述血小板裂解物通过将血小板老化至少5天来生产。

20.如权利要求1-19中任一项所述的细胞培养基，其中所述血小板裂解物是通过将血小板均质化来生产。

21.如权利要求1-20中任一项所述的细胞培养基，所述细胞培养基进一步包含柠檬酸盐。

22.如权利要求1-21中任一项所述的细胞培养基，所述细胞培养基进一步包含EDTA。

23.如权利要求1-22中任一项所述的细胞培养基，所述细胞培养基进一步包含氯化钙。

24.如权利要求1-23中任一项所述的细胞培养基，所述细胞培养基进一步包含纤溶酶原活化因子。

25.如权利要求1-24中任一项所述的细胞培养基，所述细胞培养基进一步包含凝血酶。

26.如权利要求1-25中任一项所述的细胞培养基，所述细胞培养基进一步包含维生素。

27.如权利要求1-26中任一项所述的细胞培养基，所述细胞培养基进一步包含细胞因子。

28.如权利要求1-27中任一项所述的细胞培养基，所述细胞培养基进一步包含生长因子。

29.如权利要求28所述的细胞培养基，其中所述生长因子是碱性成纤维细胞生长因子。

30.如权利要求29所述的细胞培养基，其中所述碱性成纤维细胞生长因子的浓度为至少2ng/mL。

31.一种用于培育基于细胞的产品的细胞培养基，所述细胞培养基包含补充有多种外源性生长因子的血小板裂解物和/或富血小板血浆。

32.一种在培养中饲养非人细胞以获得基于细胞的产品的方法，所述方法包括：

在生物反应器中将多个非人细胞暴露于包含血小板裂解物和富血小板血浆的细胞培养基，所述血小板裂解物和富血小板血浆提取自非人动物，而无需屠宰所述非人动物。

33.如权利要求32所述的方法，所述方法进一步包括在所述生物反应器中将所述多个非人细胞暴露于血浆产品。

34.如权利要求32或33中任一项所述的方法，其中所述非人细胞包含成肌细胞。

35.如权利要求32-34中任一项所述的方法，其中所述非人细胞包含成纤维细胞。

36.如权利要求32-35中任一项所述的方法，其中所述非人细胞包含脂肪细胞。

37.如权利要求32-36中任一项所述的方法，其中所述非人细胞包含血管细胞。

38.如权利要求32-37中任一项所述的方法，其中所述非人细胞包含成骨细胞。

39.如权利要求32-38中任一项所述的方法，其中所述非人细胞选自由以下组成的组：腱细胞、乳腺、上皮细胞和神经细胞。

40.如权利要求32-39中任一项所述的方法，其中所述非人细胞来源于牛。

41.如权利要求32-40中任一项所述的方法，其中所述非人细胞来源于绵羊。

42.如权利要求32-41中任一项所述的方法，其中所述非人细胞来源于山羊。

43.如权利要求32-42中任一项所述的方法，其中所述非人细胞来源于猪。

44.如权利要求32-43中任一项所述的方法，其中所述非人细胞来源于鹿。

45.如权利要求32-44中任一项所述的方法，其中所述非人细胞来源于骆驼。

46.如权利要求32-45中任一项所述的方法，其中所述非人细胞来源于鲸。

47.如权利要求32-46中任一项所述的方法，其中所述非人细胞来源于家禽。

48.如权利要求32-47中任一项所述的方法，其中所述非人细胞来源于鱼。

49.如权利要求32-48中任一项所述的方法，其中所述非人细胞来源于蟹。

50.如权利要求32-49中任一项所述的方法，其中所述非人细胞来源于虾。

51.如权利要求32-50中任一项所述的方法，其中所述非人细胞来源于昆虫。

52.如权利要求32-51中任一项所述的方法，其中所述生物反应器含有培养的动物源性肉类产品。

53.如权利要求32-52中任一项所述的方法，其中所述生物反应器含有培育产品。

54.如权利要求53所述的方法，其中所述培育产品包含皮革。

55.如权利要求53或54中任一项所述的方法，其中所述培育产品包含奶制品。

56.如权利要求53-55中任一项所述的方法，其中所述培育产品选自由以下组成的组：毛皮、毛发和羊毛。

57.如权利要求53-56中任一项所述的方法，其中所述培育产品包含器官。

58.如权利要求53-57中任一项所述的方法，其中所述培育产品包含角。

59.如权利要求53-58中任一项所述的方法，其中所述培育产品包含獠牙。

60.如权利要求32-59中任一项所述的方法，其中所述非人细胞选自由以下组成的组：干细胞、间充质干细胞和诱导多能干细胞。

61.如权利要求32-60中任一项所述的方法，其中所述细胞生长培养基中的所述血小板裂解物和富血小板血浆与所述非人细胞来源于相同的动物物种。

62.如权利要求32-61中任一项所述的方法，其中所述细胞生长培养基中的所述血小板裂解物和富血小板血浆与所述非人细胞来源于不同的物种。

63.如权利要求32-62中任一项所述的方法，其中所述细胞生长培养基中的所述血小板裂解物和富血小板血浆来源于多种不同的物种。

64.一种制品，所述制品包含：

细胞培养基；以及

非人血小板裂解物。

65.如权利要求64所述的制品，所述制品进一步包含非人血浆。

66.如权利要求64或65中任一项所述的制品，所述制品进一步包含非人富血小板血浆。

67.一种制品，所述制品包含：

细胞培养基；以及

非人血浆产品。

68.如权利要求67所述的制品，所述制品进一步包含非人血小板裂解物。

69.如权利要求67或68中任一项所述的制品，所述制品进一步包含非人富血小板血浆。

70.一种制品，所述制品包含：

细胞培养基；以及

非人富血小板血浆。

71.如权利要求70所述的制品，所述制品进一步包含非人血小板裂解物。

72.如权利要求70或71中任一项所述的制品，所述制品进一步包含非人血浆。

73.一种制品，所述制品包含：

细胞培养基；

血小板裂解物；以及

牛富血小板血浆。

74.如权利要求73所述的制品，其中所述血小板裂解物是非人血小板裂解物。

75.一种制品，所述制品包含细胞培养基、血小板裂解物和富血小板血浆，其中所述血小板裂解物和富血小板血浆占所述细胞培养基的按重量计2％至20％。

76.一种制品，所述制品包含细胞培养基、血小板裂解物和血浆，其中所述血小板裂解物和血浆占所述细胞培养基的按重量计2％至20％。

77.一种制品，所述制品包含细胞培养基、血浆和富血小板血浆，其中所述血浆和富血小板血浆占所述细胞培养基的按重量计2％至20％。

78.一种制品，所述制品包含细胞培养基、血小板裂解物和牛富血小板血浆，其中所述牛富血小板血浆占所述细胞培养基的按重量计10％。

79.一种制品，所述制品包含细胞培养基、血浆和牛富血小板血浆，其中所述牛富血小板血浆占所述细胞培养基的按重量计10％。

80.一种方法，所述方法包括：

将血小板裂解物和富血小板血浆添加到含有细胞培养生长培养基的生物反应器中；

将动物细胞添加到所述生物反应器中；以及

使基于细胞的肉类产品在所述生物反应器中生长。

81.一种方法，所述方法包括：

将血浆添加到含有细胞培养生长培养基的生物反应器中；

将动物细胞添加到所述生物反应器中；以及

使基于细胞的肉类产品在所述生物反应器中生长。

82.一种方法，所述方法包括：

将血小板裂解物添加到含有细胞培养生长培养基的生物反应器中；

将动物细胞添加到所述生物反应器中；以及

使基于细胞的肉类产品在所述生物反应器中生长。

83.一种方法，所述方法包括：

将富血小板血浆添加到含有细胞生长培养基的生物反应器中；

将动物细胞添加到所述生物反应器中；以及

使基于细胞的肉类产品在所述生物反应器中生长。

84.一种方法，所述方法包括：

将捐献的血小板浓缩物进行冷冻解冻以生产血小板裂解物；

将所述血小板裂解物添加到含有细胞生长培养基的生物反应器中；以及

在所述生物反应器中培育基于细胞的肉类产品。

85.一种方法，所述方法包括：

从活体动物收获全血样品；

从所述全血样品分离富血小板血浆；以及

将所述富血小板血浆添加到生物反应器中，其中所述生物反应器含有基于细胞的肉类产品。

86.一种方法，所述方法包括：

从活体动物收获全血样品；

从所述全血样品分离血浆产品；以及

将所述血浆产品添加到生物反应器中，其中所述生物反应器含有基于细胞的肉类产品。

87.一种制品，所述制品包含：

基于细胞的肉类产品，其包含血小板裂解物和富血小板血浆，其中所述基于细胞的肉类产品中至少0.1％的细胞是血小板细胞。

88.一种制品，所述制品包含：

基于细胞的肉类产品，其包含血小板裂解物和血浆产品，其中所述基于细胞的肉类产品中至少0.1％的细胞是血小板细胞。

89.一种制品，所述制品包含：

基于细胞的肉类产品，其包含富血小板血浆和血浆产品，其中所述基于细胞的肉类产品中至少0.1％的细胞是血小板细胞。

90.一种用于生产基于细胞的肉类的细胞培养生长培养基，所述细胞培养生长培养基包含血小板裂解物，其中所述血小板使用单采术从活体动物收获。

91.一种用于生产基于细胞的肉类的细胞培养生长培养基，所述细胞培养生长培养基包含富血小板血浆，其中所述富血小板血浆使用单采术从活体动物收获。

92.一种用于生产基于细胞的肉类的细胞培养生长培养基，所述细胞培养生长培养基包含血浆产品，其中所述血浆产品使用单采术从活体动物收获。

93.一种用于生产基于细胞的肉类的细胞培养生长培养基，所述细胞培养生长培养基包含：

至少一种非人动物血液成分；以及

至少一种添加剂。

94.如权利要求93所述的细胞培养生长培养基，其中所述至少一种非人动物血液成分包含富血小板血浆。

95.如权利要求93或94中任一项所述的细胞培养生长培养基，其中所述至少一种非人动物血液成分包括血浆产品。

96.如权利要求93-95中任一项所述的细胞培养生长培养基，其中所述至少一种非人动物血液成分包括血小板裂解物。

97.如权利要求93-96中任一项所述的细胞培养生长培养基，其中所述至少一种添加剂是从非人全血样品中提取的。

98.如权利要求97所述的细胞培养生长培养基，其中所述至少一种添加剂选自由以下组成的组：蛋白质、肽、维生素、细胞因子和生长因子。

99.如权利要求93-98中任一项所述的细胞培养生长培养基，其中所述至少一种添加剂是合成的化合物。

100.如权利要求93-99中任一项所述的细胞培养生长培养基，其中所述至少一种添加剂是重组化合物。

101.一种细胞培养生长因子补充剂，所述细胞培养生长因子补充剂包含血小板裂解物PL和富血小板血浆PRP。

102.如权利要求101所述的组合物，其中所述血小板裂解物PL加富血小板血浆PRP的浓度占所述组合物的2-20重量百分比，优选地5-15重量百分比或更优选约10重量百分比。

103.如权利要求101所述的组合物，其中所述血小板裂解物是人裂解物hPL，并且所述富血小板血浆是牛富血小板血浆bPRP。

104.如权利要求101-103中任一项所述的组合物，其中所述血小板裂解物是非人血小板裂解物，并且所述富血小板血浆是牛富血小板血浆。

105.如权利要求101-104中任一项所述的组合物，其中所述血小板裂解物PL和/或富血小板血浆PRP从活体动物中收获。

106.如权利要求105所述的组合物，其中所述血小板裂解物PL和/或富血小板血浆PRP使用单采术从活体动物中收获。

107.如权利要求101-106中任一项所述的组合物，其中所述血小板裂解物PL和/或富血小板血浆PRP从选自由以下组成的组的脊椎动物和无脊椎动物收获：牛、绵羊、山羊、猪、鹿、骆驼、鲸、家禽、鱼、蟹和虾。

108.如权利要求101-107中任一项所述的组合物，其中所述血小板裂解物PL通过对血小板进行物理、化学和生物化学处理以释放细胞因子和生长因子生来产。

109.如权利要求108所述的组合物，其中所述化学和生物化学处理包括用选自由以下组成的组的成员进行处理：柠檬酸盐、EDTA、氯化钙、纤溶酶原活化因子和凝血酶。

110.如权利要求108所述的组合物，其中所述物理处理选自由以下组成的组：对血小板进行冷冻和解冻、搅拌、老化和使其粘附到表面。

111.如权利要求101-110中任一项所述的组合物，所述组合物进一步包含肽、维生素、细胞因子和生长因子；合成和/或重组蛋白质、肽、维生素、细胞因子和生长因子。

112.如权利要求101-111中任一项所述的组合物，其中所述蛋白质、肽、维生素、细胞因子和生长因子是从动物血液中提取的。

113.如权利要求101-112中任一项所述的组合物，其中所述细胞培养生长因子补充剂进一步包含血浆产品。

114.一种在培养中饲养细胞的方法，所述方法包括提供含有如权利要求101-113中任一项所述的组合物的生长培养基。

115.如权利要求114所述的方法，其中所述培养的细胞选自由以下组成的组：从脊椎动物和无脊椎动物分离的成肌细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、血管细胞、成骨细胞、腱细胞、上皮细胞、乳腺细胞和神经细胞。

116.如权利要求114或115中任一项所述的方法，其中所述培养的细胞选自由来源于以下的细胞组成的组：牛、绵羊、山羊、猪、鹿、骆驼、鲸、家禽、鱼、蟹、虾、野牛和昆虫。

117.如权利要求113-116中任一项所述的方法，其中饲养所述细胞以生产培养的动物源性肉类产品。

118.如权利要求113-117中任一项所述的方法，其中所述细胞选自由以下组成的组：干细胞、间充质干细胞和诱导多能干细胞。

119.如权利要求113-118中任一项所述的方法，其中所述培养基中存在的所述血小板裂解物PL和/或富血小板血浆PRP提取自与正在培育的细胞相同的物种的血液。

120.如权利要求113-119中任一项所述的方法，其中所述培养基中存在的所述血小板裂解物PL和/或富血小板血浆PRP提取自与正在培育的细胞不同的物种的血液。

121.如权利要求113-120中任一项所述的方法，其中所述培养基中存在的所述血小板裂解物PL和/或富血小板血浆PRP从多种不同物种的血液中提取并汇集在一起。