CN117396066A - 富含萝卜硫苷的十字花科属间杂种植物及其制作方法 - Google Patents

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Abstract

得到一种萝卜硫苷含量高的十字花科植物。将被分类为不同的属的十字花科植物即第一母体植物和第二母体植物进行杂交而得到属间杂种植物。所述第一母体植物包含5mg/100g(鲜重)以上的萝卜硫苷。所述第二母体植物包含功能缺失型还原型萝卜硫苷合成酶基因。

Description

富含萝卜硫苷的十字花科属间杂种植物及其制作方法
技术领域
本发明涉及富含萝卜硫苷(Glucoraphanin)的十字花科属间杂种植物及其制作方法。
背景技术
作为异硫氰酸酯的一种的萝卜硫素是十字花科的植物，特别是芸苔属甘蓝种(甘蓝(Brassica Oleracea))所包含的植物化学物质的一种。萝卜硫素是功能性成分，已知其除了通过激活人体内的解毒酶的生成而产生的癌症预防效果以外，还具有肝功能提高效果、抗氧化效果等生理活性(例如参照非专利文献1)。
通常，在植物细胞内，萝卜硫素以作为前体的萝卜硫苷的状态存在。萝卜硫苷是也被称为芥子油苷的次生代谢物硫代葡萄糖苷的一种。细胞中的萝卜硫苷通过咀嚼等露出到细胞外，通过与存在于植物体内的酶淀粉酶反应，或者被肠内细菌分解而变为萝卜硫素。
在专利文献1中公开了一种方法，即：将野生型芸苔种和甘蓝育种系统进行杂交，得到选择具有比原来的育种系统多的4-甲基亚磺酰丁基硫代葡萄糖苷(萝卜硫苷)量的杂种的富含萝卜硫苷的芸苔种。在专利文献2中公开了一种硫代葡萄糖苷含量高的甘蓝植物，包含来自甘蓝麦(Brassica villosa)的Myb28等位基因、且缺乏来自甘蓝麦的与Myb等位基因遗传连锁的ELONG等位基因的缺失。
在十字花科萝卜属(Raphanus)中，通常在可用水平下不包含萝卜硫苷。在专利文献3中公开了一种方法，即：筛选芝麻菜苷(Glucoerucin)含量高、4-甲硫基-3-丁烯基硫代葡萄糖苷(还原型萝卜硫苷，Glucoraphasatin)含量为芝麻菜苷含量的1/5以下的个体，进行近亲繁殖，由此制作萝卜硫苷含量高的萝卜系统。
在非专利文献2中，报告了在十字花科萝卜属的萝卜上，在异属间杂交芸苔属的羽衣甘蓝而得到的萝卜甘蓝(Raphanobrassica)中，检测出高含量的萝卜硫苷及萝卜苷(Glucoraphenin)。
通常，已知萝卜中所含的硫代葡萄糖苷的9成以上由还原型萝卜硫苷所占。在非专利文献3中，报告了已鉴定出还原型萝卜硫苷合成酶(GRS)基因。另外，在专利文献4中公开了如下方法：为了减少来自于还原型萝卜硫苷的分解产物的萝卜的独特气味、黄变，将具有功能缺失型GRS基因的萝卜个体杂交，而得到还原型萝卜硫苷的含量低的萝卜系统。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2002-511235号公报
专利文献2：日本特开2014-76045号公报
专利文献3：日本特开2012-110238号公报
专利文献4：日本特开2016-86761号公报
非专利文献
非专利文献1：Zhang,Y.et al.,P.Proc.Natl.Acad.Sci.,Vol.91,pp.3147-3150(1994)
非专利文献2：长野县农业相关试验场主页研究信息、研究成果“技术信息”“成果名”萝卜甘蓝“长·野48号”有望作为包含很多功能性成分的新型蔬菜(URL https://www.agries-nagano.jp/wp/wp-content/uploads/2019/04/2018-2-g10.pdf)
非专利文献3：Kakizaki,T.et.al.,Plant Physiology,Vol.173,pp.1583-1593(2017)
发明内容
发明所要解决的技术问题
本发明的目的在于得到萝卜硫苷含量高的十字花科植物。
用于解决技术问题的技术方案
为了实现上述目的，本发明人们进行了深入研究，结果发现，在将芸苔属植物和具有功能缺失型GRS基因的萝卜属植物进行杂交而得到的属间杂种中，萝卜硫苷含量变高，从而完成了本发明。
本发明包含以下内容。
(1)一种植物，为芸苔属植物及萝卜属植物的属间杂种植物，萝卜硫苷含量相对于萝卜苷含量之比为1.0以上。
(2)根据(1)所述的植物，其中，萝卜硫苷含量为20mg/100g(鲜重)以上。
(3)根据(1)或(2)所述的植物，其中，萝卜苷含量为50mg/100g(鲜重)以下。
(4)一种植物，为芸苔属植物及萝卜属植物的属间杂种植物，包含功能缺失型还原型萝卜硫苷合成酶基因。
(5)根据(4)所述的植物，其中，功能缺失型还原型萝卜硫苷合成基因为下述(a)和/或(b)的基因：
(a)在构成编码由序列号1中记载的氨基酸序列或与该氨基酸序列显示出90％以上的序列同一性的氨基酸序列构成的蛋白质的基因的外显子内，伴随着编码蛋白质中的2-氧代戊二酸-铁(II)依赖性加氧酶域的全部或一部分的缺失的基因；
(b)包含与序列号2或3中记载的碱基序列具有70％以上的序列同一性的碱基序列的基因。
(6)根据(1)～(5)中任一项所述的植物，其中，所述芸苔属植物为甘蓝。
(7)根据(1)～(6)中任一项所述的植物，其中，所述萝卜属植物为萝卜。
(8)根据(1)～(7)中任一项所述的植物，其中，所述植物具有多倍体化的染色体。
(9)一种方法，为制作十字花科的属间杂种植物的方法，包括：将第一母体植物和第二母体植物进行杂交的工序；以及获取所述第一母体植物和所述第二母体植物的属间杂种植物的工序，所述第一母体植物和所述第二母体植物为十字花科植物，且为不同的属，所述第一母体植物包含5mg/100g(鲜重)以上的萝卜硫苷，所述第二母体植物含包含功能缺失型还原型萝卜硫苷合成酶基因。
(10)根据(9)所述的方法，其中，功能缺失型还原型萝卜硫苷合成酶基因为下述(a)和/或(b)的基因：
(a)在构成编码由序列号1中记载的氨基酸序列或与该氨基酸序列显示出90％以上的序列同一性的氨基酸序列构成的蛋白质的基因的外显子内，伴随着编码蛋白质中的2-氧代戊二酸-铁(II)依赖性加氧酶域的全部或一部分的缺失的基因；
(b)包含与序列号2或3中记载的碱基序列具有70％以上的序列同一性的碱基序列的基因。
(11)根据(9)或(10)所述的方法，其中，所述方法还包括：筛选所述属间杂种植物中的包含功能缺失型还原型萝卜硫苷合成酶基因的属间杂种植物的工序。
(12)根据(9)～(11)中任一项所述的方法，其中，所述第一母体植物为芸苔属植物，所述第二母体植物为萝卜属植物。
(13)根据(9)～(12)中任一项所述的方法，其中，所述芸苔属植物为甘蓝。
(14)根据(9)～(13)中任一项所述的方法，其中，所述萝卜属植物为萝卜。
(15)根据(9)～(14)中任一项所述的方法，其中，所述属间杂种植物包含多倍体化的染色体。
(16)一种生产十字花科植物的方法，包括栽培(1)～(7)中任一项所述的植物的工序。
(17)一种食品，以(1)～(7)中任一项所述的植物为原材料。
(18)一种方法，为提高十字花科植物的萝卜硫苷含量的方法，包括：准备含有5mg/100g(鲜重)以上的萝卜硫苷的十字花科植物作为第一母体植物的第一工序；准备还原型萝卜硫苷合成酶的功能已缺失或下降的与第一母体植物不同属的十字花科植物作为第二母体植物的第二工序；以及将所述第一母体植物与所述第二母体植物进行杂交的第三工序。
(19)根据(18)所述的方法，其中，所述第二工序包括改变还原型萝卜硫苷合成酶基因，来使还原型萝卜硫苷合成酶的功能缺失或下降。
本说明书包括成为本申请的优先权的基础的日本专利申请号2021-063196号的公开内容。
发明效果
根据本发明，能够得到萝卜硫苷含量更高的十字花科植物。
附图说明
图1是表示十字花科植物中的萝卜硫苷及萝卜苷的生物合成路径的简图。
图2是表示野生型GRS1基因的结构、和序列号2及序列号3所示的碱基序列中的逆转录酶的插入位置的简图。图2的A表示野生型GRS1基因的结构。图2的B表示序列号2所示的碱基序列的结构。图2的C表示序列号3所示的碱基序列的结构。
图3是表示十字花科植物中的各个体的叶与种子的萝卜硫苷含量的相关性的图表。
具体实施方式
在本说明书中，如果没有特别说明，记载的化学式包括所有几何异构体以及光学异构体。在本说明书中，如果没有特别说明，“含量”是指重量浓度(w/w)。在本说明书中，“衍生物”是指被改变到不影响化合物的骨架结构的程度的化合物。
1.芸苔属植物及萝卜属植物的属间杂种植物
本发明的芸苔属植物及萝卜属植物的属间杂种植物(以下也称为“本发明的植物”)的第一实施方式的特征在于，萝卜硫苷含量相对于萝卜苷含量之比为1.0以上。本发明的植物的第二实施方式的特征在于，包含功能缺失型还原型萝卜硫苷合成酶基因。本发明的植物既可以单独具备第一及第二实施方式的特征，也具备这两者。
在本说明书中，在仅称为“植物”的情况下，只要没有特别特定部位等，并且只要没有特别矛盾，则包含叶、茎、花、蕾、根及种子的任何部位。本发明的植物至少在叶、茎、花、蕾、根及种子中的任一部位中具有上述的特征。
在本说明书中，“萝卜硫苷”是指用下述式(I)表示的化合物、其衍生物或盐。
在本说明书中，“萝卜苷”是指用下述式(II)表示的化合物、其衍生物或盐。
明确了萝卜硫苷及萝卜苷在十字花科植物中通过图1所示的生物合成路径进行生物合成。即，将蛋氨酸作为引发物质，通过约20种酶反应，合成芝麻菜苷。芝麻菜苷被氧化来合成萝卜硫苷。在一部分的十字花科植物中，芝麻菜苷通过还原型萝卜硫苷合成酶(GRS1)基因转化为还原型萝卜硫苷，还原型萝卜硫苷被氧化而合成萝卜苷。还原型萝卜硫苷通过水解酶芥子苷酶(myrosinase)的作用转化为辛味成分还原型萝卜硫素(Raphasatin)后，转化为臭味成分、黄变物质。
在本说明书中，“十字花科植物”是被分类为被子植物门、双子叶植物网、五桠果亚纲、白花菜目的一个科，包含碎米荠属、硬毛南芥属、芸苔属、蔊菜属、萝卜属、山芥属等多个属的植物。
在本说明书中，“芸苔属植物”是被分类为十字花科的一个属的植物，包括油菜、水菜、小白菜，青梗菜、小松菜、芜菁、大白菜、卷心菜、西蓝花、叶牡丹、芥菜、羽衣甘蓝、球茎甘蓝、花椰菜等。作为本发明的植物的母体植物使用的芸苔属植物优选为羽衣甘蓝、西蓝花、卷心菜、球茎甘蓝、花椰菜等包含比较大量的萝卜硫苷的植物。优选芸苔属植物为甘蓝(Brassica Oleracea)。特别优选含有5mg/100g(鲜重(FW))以上、或10mg/100gFW以上的萝卜硫苷。这样的富含萝卜硫苷的甘蓝例如可以通过专利文献1中记载的方法获取。
在本说明书中，“萝卜属植物”是被分类为十字花科的一个属的植物，包括萝卜、野萝卜等。作为本发明的植物的母体植物使用的萝卜属植物优选为萝卜(Raphanussativus)。
萝卜属植物、特别是萝卜具有包含在相同的十字花科近缘种中不被合成的还原型萝卜硫苷的特征。从萝卜中鉴定出将芝麻菜苷转换为还原型萝卜硫苷的还原型萝卜硫苷合成酶的基因，明确了通过该特征基因，还原型萝卜硫苷被合成。
在萝卜中，如专利文献4等所记载那样，在一部分中存在还原型萝卜硫苷含量低的突变体。已知在该突变体中，存在于萝卜的第一连锁群末端的还原型萝卜硫苷合成酶基因的结构从野生型发生变化，失去了其功能。正常的还原型萝卜硫苷合成酶基因型为显性，所以命名为GRS1(Glucoraphasatin Synthase 1)基因，失去了功能的隐性基因型被命名为grs1基因。GRS1基因编码的氨基酸序列具有作为普遍存在于植物的氧化酶的2-氧代戊二酸-铁(II)依赖性加氧酶域。
本发明中使用的萝卜属植物优选为包含功能缺失型还原型萝卜硫苷合成酶(grs1)基因的萝卜属植物。萝卜属植物所含有的grs1既可以作为纯合型被包含，也可以作为杂合型被包含。含有功能缺失型还原型萝卜硫苷合成酶(grs1)基因的萝卜属植物例如能够使用专利文献4中记载的DNA标记验证的方法来筛选。具体而言，能够使用将从样本植物中提取出的DNA作为模板，利用了特异性地扩增GRS1基因的引物组及特异性地扩增grs1基因的引物组的聚合酶链反应(PCR)法。
包含grs1基因的萝卜属植物可以利用上述方法从通过远亲繁殖交配制作出的许多后代系统筛选突变体来使用，但也可以使用改变野生型的萝卜属植物的GRS1基因来使其功能缺失或下降的植物。作为改变GRS1基因的方法，能够使用任意公知的方法。例如，能够举出伴随着借助转座子、逆转录酶、植物病毒等的插入序列导入的变异导入。另外，能够举出针对种子的放射线照射处理、重离子束处理、包含变异源物质的溶液中的处理等突变处理。
在本说明书中，“属间杂种植物”是指在被分类为不同的属的生物之间杂交而形成的杂种、即杂交后代。与相同的属内的不同种类生物间的杂种亦即种间杂种明确区分。
本发明的植物是通过芸苔属植物与萝卜属植物的杂交而制作出的杂交后代。本发明的植物的第一实施方式的萝卜硫苷含量相对于萝卜苷含量之比为1.0以上。在本实施方式中，本发明的植物所包含的萝卜硫苷的量优选为20mg/100gFW以上，特别优选为30mg/100gFW以上、50mg/100gFW以上、100mg/100gFW以上或150mg/100FW以上。另外，本发明的植物所包含的萝卜苷的量为50mg/100gFW以下，特别优选为20mg/100gFW以下、10mg/100gFW以下、5mg/100gFW以下、3mg/100gFW以下或2mg/100gFW以下。
本发明的植物的第二实施方式包含功能缺失型还原型萝卜硫苷合成酶基因。在本实施方式中，本发明的植物通过使用以纯合型或杂合型保有功能缺失型还原型萝卜硫苷合成基因grs1基因的萝卜属植物作为母体植物来制作。此外，在使用以杂合型保有grs1基因的萝卜属植物的情况下，属间杂种植物中的一半成为功能缺失型，因此通过筛选功能缺失型来得到后代而能够得到本发明的植物。作为筛选功能缺失型的植物的方法，例如能够使用专利文献4中记载的DNA标记验证的方法。具体而言，能够使用将从样本植物中提取出的DNA作为模板，利用了特异性地扩增GRS1基因的引物组及特异性地扩增grs1基因的引物组的PCR法。
在本实施方式中，所述grs1基因只要是GRS1的功能缺失的结构，则没有特别限定其结构，但优选包含下述(a)和/或(b)的碱基序列。
(a)在构成编码由序列号1中记载的氨基酸序列或与该氨基酸序列显示出90％以上的序列同一性的氨基酸序列构成的蛋白质的基因的外显子内，伴随着编码蛋白质中的2-氧代戊二酸-铁(II)依赖性加氧酶域的全部或一部分的缺失的碱基序列；
(b)与序列号2或3中记载的碱基序列具有70％以上的序列同一性的碱基序列。
grs1基因优选包含在构成编码由序列号1中记载的氨基酸序列或与该氨基酸序列显示出91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、或99％以上的序列同一性的氨基酸序列构成的蛋白质的基因的外显子内，伴随着编码蛋白质中的2-氧代戊二酸-铁(II)依赖性加氧酶域的全部或一部分的缺失的碱基序列。和/或优选包含与序列号2或3中记载的碱基序列具有75％以上、80％以上、85％以上、90％以上或95％以上的序列同一性的碱基序列。
序列号2及3所示的碱基序列表示grs1基因的碱基序列的例子。具体而言，序列号2及3所示的碱基序列均具有在GRS1基因的外显子序列中插入了逆转录酶的结构。在图2中示出野生型GRS1基因的结构、和序列号2及序列号3所示的碱基序列中的逆转录酶的插入位置。图2的A表示野生型GRS1基因的结构。GRS1基因具有3个外显子(第一外显子、第二外显子及第三外显子)、和2个内含子(第一内含子及第二内含子)。图2的B表示序列号2所示的碱基序列的结构。在该序列中，在GRS1基因的第一外显子插入有约9kbp的逆转录酶。图2的C表示序列号3所示的碱基序列的结构。在该序列中，在GRS1基因的第三外显子插入有约1.2kbp的逆转录酶。
本发明的植物通过包含功能缺失型的还原型萝卜硫苷合成酶基因，能够含有高浓度的萝卜硫苷。推测在以纯合型含有功能缺失型的还原型萝卜硫苷合成酶基因的萝卜属植物(特别是萝卜)中，通过阻碍从芝麻菜苷向还原型萝卜硫苷的转换，从而芝麻菜苷积蓄。在萝卜的叶中未发现将芝麻菜苷高效地转换为萝卜硫苷的功能，但芸苔属植物(特别是甘蓝)具有从芝麻菜苷生物合成萝卜硫苷的功能。本发明的属间杂种植物可以说在保持从来自于芸苔属植物的芝麻菜苷向萝卜硫苷的转换能力的同时，抑制从芝麻菜苷向还原型萝卜硫苷的转换，从而促进从芝麻菜苷向萝卜硫苷的转换，实现了含有高浓度的萝卜硫苷。
本发明的植物可以是二倍体，但例如也可以是三倍体或四倍体的异质多倍体。通过为这样的异质多倍体，能够使能育性恢复或提高。这样的异质多倍体可以通过公知的任意方法制作，例如能够通过秋水仙碱处理而制作(例如，参照张等，育种学研究，Vol.3,pp.31-41(2001)、小笠原等，圆学研，Vol.11,No.2,pp.189-194(2012)等)。
本发明的植物能够作为食品或饲料的材料来使用。作为食品，除了作为通常的蔬菜的使用以外，例如能够为液体(饮料)、粉末、颗粒等。或者，能够作为用于提取精制萝卜硫苷的材料来使用。精制出的萝卜硫苷例如能够用于营养辅助食品(保健品)、医药品等。
2.制作十字花科的属间杂种植物的方法
制作本发明的十字花科的属间杂种植物的方法(以下也称为“本发明的制作方法”)的特征在于，包括：将第一母体植物和第二母体植物进行杂交的工序；和获取所述第一母体植物和所述第二母体植物的属间杂种植物的工序，所述第一母体植物和所述第二母体植物为十字花科植物，且为不同的属，所述第一母体植物包含5mg/100gFW以上的萝卜硫苷，所述第二母体植物包含功能缺失型还原型萝卜硫苷合成酶基因。
在本发明的制作方法中，“第一母体植物”是含有萝卜硫苷5mg/100gFW以上、优选10mg/100gFW以上的被分类为不同于第二母体植物的属的十字花科的植物。只要是被分类为不同于第二母体植物的属的十字花科植物，则没有特别限定，但优选为芸苔属植物，特别优选为羽衣甘蓝、西蓝花、卷心菜、球茎甘蓝、花椰菜等包含比较大量的萝卜硫苷的植物。优选为甘蓝。这种富含萝卜硫苷的甘蓝例如也可以通过专利文献1中记载的方法获取。
在本发明的制作方法中，“第二母体植物”是包含功能缺失型还原型萝卜硫苷合成酶基因的被分类为不同于第一母体植物的属的十字花科植物。只要是被分类为不同于第一母体植物的属的十字花科植物，则没有特别限定，但优选为萝卜属植物。优选为萝卜。
在所述第二母体植物中，功能缺失型还原型萝卜硫苷合成酶(grs1)基因既可以作为纯合型被包含，也可以作为杂合型被包含。作为筛选含有grs1基因的第二母体植物的方法，例如能够使用专利文献4中记载的方法。具体而言，能够使用将从样本植物提取出的DNA为模板，利用了特异性地扩增GRS1基因的引物组及特异性地扩增grs1基因的引物组的PCR法。
包含grs1基因的第二母体植物可以利用上述方法从通过远亲繁殖交配制作出的许多后代系统筛选突变体来使用，但也可以使用改变野生型的GRS1基因来使其功能缺失或下降的植物。作为改变GRS1基因的方法，能够使用任意公知的方法。例如，能够举出伴随着借助转座子、逆转录酶、植物病毒等的插入序列导入的变异导入。另外，能够举出针对种子的放射线照射处理、重离子束处理、含有变异源物质的溶液中的处理等突变处理。
所述第二母体植物所含有的所述grs1基因只要是GRS1的功能缺失的结构，则没有特别限定其结构，但优选包含下述(a)和/或(b)的碱基序列。
(a)在构成编码由序列号1中记载的氨基酸序列或与该氨基酸序列显示出90％以上的序列同一性的氨基酸序列构成的蛋白质的基因的外显子内，伴随着编码蛋白质中的2-氧代戊二酸-铁(II)依赖性加氧酶域的全部或一部分的缺失的碱基序列；
(b)与序列号2或3中记载的碱基序列具有70％以上的序列同一性的碱基序列。
grs1基因优选包含在构成编码由序列号1中记载的氨基酸序列或与该氨基酸序列显示出91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上的序列同一性的氨基酸序列构成的蛋白质的基因的外显子内，伴随着编码蛋白质中的2-氧代戊二酸-铁(II)依赖性加氧酶域的全部或一部分的缺失的碱基序列。和/或优选包含与序列号2或3中记载的碱基序列具有75％以上、80％以上、85％以上、90％以上或95％以上的序列同一性的碱基序列。
作为第二母体植物，在使用以杂合型保有grs1基因的植物的情况下，属间杂种植物中的一半成为功能缺失型。在该情况下，本发明的制作方法优选包括筛选功能缺失型的植物的工序。作为筛选功能缺失型的植物的方法，例如能够使用专利文献4中记载的方法。具体而言，能够使用将从样本植物提取出的DNA作为模板，利用了特异性地扩增GRS1基因的引物组及特异性地扩增grs1基因的引物组的PCR法。
在本发明的制作方法中，第一母体植物和第二母体植物被分类为不同的属，通过杂交而得到属间杂种植物。这里，杂交没有特别限定，能够使用在品种改良等中通常使用的杂交技术。另外，关于通过杂交得到的植物，也可以进一步遍及数代地进行近亲繁殖交配，或者遍及数代地进行回交，或者适当反复进行近亲繁殖交配与回交。
本发明的制作方法可以是制作二倍体的方法，但也可以为制作三倍体或四倍体的异质多倍体的方法。
本发明的制作方法中使用的母体植物等的详细条件、制作出的植物的详细性状等只要没有特别记载在本项中，并且只要不特别矛盾，则与“1.芸苔属植物及萝卜属植物的属间杂种植物”项中记载的条件、性状等相同。
3.生产十字花科植物的方法
生产本发明的十字花科植物的方法(以下也称为“本发明的生产方法”)的特征在于，包括栽培“1.芸苔属植物及萝卜属植物的属间杂种植物”项中记载的本发明的植物的工序。根据本发明的生产方法，能够获取富含萝卜硫苷的植物。
通过本发明的生产方法生产的植物为芸苔属植物和萝卜属植物的属间杂种植物。优选通过本发明的生产方法生产的植物为食用植物或饲料用植物，更优选为食用的蔬菜。优选通过本发明的生产方法生产的植物为甘蓝与萝卜的杂种、即萝卜甘蓝。根据上述的优选方式，能够获取人类或动物(例如，狗、猫、牛、马、猪、羊、猴子、雪貂等哺乳动物、鸡等鸟类)能够摄取大量的萝卜甘蓝的植物。
通过本发明的生产方法制作的植物可以是使芸苔属植物与萝卜属植物杂交而得到的F1代属间杂种植物，但也可以是使F1代近亲繁殖而得到的F2代，还可以是使F2代以后反复近亲繁殖而得到的属间杂种植物。或者也可以是在F2代以后进行回交而得到的属间杂种植物。
4.食品
本发明的食品的特征在于，将“1.芸苔属植物及萝卜属植物的属间杂种植物”项中记载的本发明的植物作为原材料。在本说明书中“食品”是指适于人类摄取的形式的物质或组合物。本发明的食品既可以是作为蔬菜的植物本身，也可以是使用蔬菜的料理。另外，例如，也可以是将所述植物加工而成的液体(饮料)、粉末、颗粒等。或，也可以是从上述植物提取精制而成的包含萝卜硫苷的饮料、粉末、颗粒、片剂、胶囊剂等营养辅助食品(保健品)等。
5.提高十字花科植物的萝卜硫苷含量的方法
提高本发明的十字花科植物的萝卜硫苷含量的方法(以下也称为“本发明的高含有化方法)的特征在于，包括：准备含有5mg/100gFW以上的萝卜硫苷的十字花科植物作为第一母体植物的第一工序；准备还原型萝卜硫苷合成酶的功能已缺失或下降的与第一母体植物不同属的十字花科植物作为第二母体植物的第二工序；以及将所述第一母体植物和所述第二母体植物进行杂交的第三工序。
在本发明的高含有化方法中，第一工序是准备含有5mg/100gFW以上、优选10mg/100FW以上萝卜硫苷的十字花科植物作为第一母体植物的工序。这里，“第一母体植物”只要是被分类为不同于第二母体植物的属的十字花科植物，则没有特别限定，但优选为芸苔属植物，特别优选为羽衣甘蓝、西蓝花、卷心菜、球茎甘蓝、花椰菜等含有比较大量的萝卜硫苷的植物。优选为甘蓝(Brassica oleracea)。
制作含有5mg/100gFW以上的萝卜硫苷的植物的方法没有特别限定，但例如可以为专利文献1中记载的方法。或者，例如可采取以下的方法。关于芸苔属植物，通过远亲繁殖交配制作许多后代系统。在得到的后代系统中，筛选出1株或多株含有高浓度的萝卜硫苷的植物，进行近亲繁殖交配或远亲繁殖交配，根据需要反复进行交配，得到富含萝卜硫苷的芸苔属植物的系统。
在本发明的高含有化方法中，第二工序是准备还原型萝卜硫苷合成酶的功能已缺失或下降的与第一母体植物不同属的十字花科植物作为第二母体植物的工序。这里，“第二母体植物”只要是被分类为不同于第一母体植物的属的十字花科植物，则没有特别限定，优选为萝卜属植物。优选为萝卜。
所述第二母体植物是还原型萝卜硫苷合成酶(GRS1)的功能已缺失或下降的植物。更具体而言，是包含功能缺失型还原型萝卜硫苷合成酶(grs1)基因的植物。grs1基因既可以作为纯合型被包含，也可以作为杂合型被包含。作为筛选包含grs1基因的第二母体植物的方法，例如能够使用专利文献4中记载的方法。具体而言，能够使用将从样本植物中提取出的DNA作为模板，利用了特异性地扩增GRS1基因的引物组及特异性地扩增grs1基因的引物组的PCR法。
包含grs1基因的第二母体植物可以利用上述方法从通过远亲繁殖交配制作出的许多后代系统筛选突变体来使用，但也可以使用改变野生型的GRS1基因来使其功能缺失或下降的植物。作为改变GRS1基因的方法，能够使用任意公知的方法。例如，能够举出伴随着借助转座子、逆转录酶、植物病毒等的插入序列导入的变异导入。另外，能够举出针对种子的放射线照射处理、重离子束处理、含有变异源物质的溶液中的处理等突变处理。
本发明的高含有化方法的第三工序是将所述第一母体植物和所述第二母体植物进行杂交的工序。杂交没有特别限定，能够使用在品种改良等中通常使用的杂交技术。另外，关于通过杂交得到的植物，也可以遍及数代地进行近亲繁殖交配，或者遍及数代地进行回交，或者适当反复进行近亲繁殖交配与回交。
本发明的高含有化方法能够通过具备上述的工序而富含十字花科植物的萝卜硫苷。经过本发明的高含有化方法而得到的十字花科植物优选含有20mg/100gFW以上、30mg/100gFW以上、50mg/100gFW以上、100mg/100gFW以上、或150mg/100gFW以上的萝卜硫苷。
本发明的高含有化方法中使用的母体植物等的详细条件、制作出植物的详细性状等只要没有特别记载在本项中，并且只要不特别矛盾，则与“1.芸苔属植物及萝卜属植物的属间杂种植物”以及“2.十字花科植物的制作方法”项中记载的条件、性状等相同。
【实施例】
以下，通过实施例对本发明进一步详细地进行说明，但本发明的技术范围并不限定于以下的实施例。
[实施例1]属间杂种植物(萝卜甘蓝)的制作
按以下的步骤制作出了萝卜属植物与十字花科植物的属间杂种植物。作为十字花科植物，使用了含有萝卜硫苷的羽衣甘蓝系统“KK-45”。作为萝卜属植物，使用了市售的萝卜品种“西町理想”。已知西町理想在品种内混合以功能型、功能缺失型杂合保有GRS1基因的个体(参照专利文献4)。预先进行西町理想的DNA标记验证，在苗阶段选拔杂合保有的个体(以下也称为“AKO”)，将4株(AKO103、AKO108、AKO110及AKO118)作为种子亲本供杂交。使用的各品种、系统及制作出的属间杂种如表1所示。
【表1】
西町理想的DNA标记验证及各杂交后代的DNA标记验证按以下的步骤实施。从西町理想的叶中提取DNA，使用由表2所示的3个引物构成的引物组进行了PCR反应。在观察到392bp的DNA扩增的情况下判定为存在“功能缺失型”基因，在观察到222bp的DNA扩增的情况下判定为存在“功能型”基因。
【表2】
在西町理想中，将识别出392bp和222bp双方的DNA扩增的个体判定为“杂合型”，将仅识别出222bp的DNA扩增的个体判定为“野生型”。按以下的步骤实施了各杂交后代的DNA标记验证。在杂交后代中，将保有功能型GRS1基因的个体判定为“功能型”杂交后代，将保有功能缺失型GRS1(grs1)基因的个体判定为“功能缺失型”杂交后代。
[实施例2]叶所含的各种硫代葡萄糖苷含量的测定
用于硫代葡萄糖苷含量的分析的样本按以下的步骤进行了制备。从田地中每株采集了3片叶长20cm的真叶。从各叶采集叶身的前端10cm，去除了在叶的中央分布的叶脉。冷冻干燥4～5天(LABCONCO公司制冷冻干燥机)，对干燥样本进行了粉碎(安井机械公司制MULTI-BEADS SHOCKER)。精确称量0.1g的干燥粉末，添加5mL的80％甲醇，在室温下振荡搅拌了30分钟。将以3000rpm离心分离了10钟的上清液作为硫代葡萄糖苷提取物。使硫代葡萄糖苷提取物吸附于DEAE琼脂糖柱，通过酸性硫酸酯酶进行了脱硫(25℃18个小时)。用离子交换水洗脱脱硫后的硫代葡萄糖苷作为脱磺-硫代葡萄糖苷溶液。在下述的条件下将脱磺-硫代葡萄糖苷溶液供于HPLC，以UV检测波长229nm得到了色谱图。
·使用设备：LC-20A,Shimadzu Corp.,Japan
·柱的种类：COSMOSIL 5C18-II,150×4.6mm,Nacalai-Tesque Inc.,Japan
·移动相溶剂组成：20％乙腈
·样本注入量：20μl
·流速：1.5mL/min
·柱温：30℃
基于预先将浓度已知的各硫代葡萄糖苷标准品在相同条件下供于HPLC的结果，计算出了样本中的各硫代葡萄糖苷(萝卜硫苷、萝卜苷、芝麻菜苷、还原型萝卜硫苷)的含量。将每个杂交组合的各硫代葡萄糖苷的测定结果示出在表3中。
【表3】
n.d.:未检测出
在所有杂交组合中，保有功能缺失型的群体的萝卜硫苷含量的平均值高于保有功能型的群体。功能缺失型/功能型的萝卜硫苷含量之比为1.97～2.56倍的范围。功能缺失型的个体未发现或仅有极少量的萝卜苷和还原型萝卜硫苷。这些结果表明，通过在萝卜甘蓝中抑制GRS1基因的表达，大部分的芝麻菜苷代谢为萝卜硫苷，萝卜硫苷的含量提高。
[实施例3]根、蕾及茎所含的硫代葡萄糖苷含量的测定
按以下的步骤制备了用于硫代葡萄糖苷含量的分析的根、蕾及茎的样本。从田地中从根掘起各种10株的个体，进行了水洗。将根在茎和胚轴的边界约5cm以下的位置切为厚度0.5-1cm的切片。蕾是从抽出的各种10株个体中采集了顶花蕾。茎是从抽出的各种10株个体中，从与蕾的边界以下约10cm进行采集。将各样本冷冻干燥4～5天，对干燥样本进行了粉碎。之后，按与实施例2同样的步骤进行提取，进行了脱硫及HPLC测定。将各种样本中的各硫代葡萄糖苷的测定结果示出在表4中。
【表4】
n.d.:未检测出
如表4所示，在功能缺失型的个体中，与功能型个体相比，在任何部位萝卜硫苷含量的平均值均升高。另外，功能缺失型个体未发现或极少含有萝卜苷和还原型萝卜硫苷。根据这些结果表明，通过抑制萝卜甘蓝的GRS1基因的表达，与采集部位无关，萝卜硫苷的含量均升高。
[实施例4]十字花科蔬菜的种子及叶所含的萝卜硫苷含量的相关性
按以下的步骤制备了用于萝卜硫苷含量的分析的十字花科蔬菜的种子及叶的样本。作为十字花科蔬菜，使用了KK-45及市售的羽衣甘蓝品种，共计68个系统。从温室中，针对各系统1株的个体，采集了3片叶长20cm的真叶。从各叶采集叶身的前端10cm，去除了在叶的中央分布的叶脉。种子从采集叶的同株中采集，每1株使用0.5g的种子。将各样本冷冻干燥4～5天，对干燥样本进行了粉碎。之后，通过与实施例2同样的步骤进行了提取、脱硫及HPLC测定。HPLC的测定条件如下。
·使用设备：LC-20A,Shimadzu Corp.,Japan
·柱的种类：COSMOSIL 5C18-II,150×4.6mm,Nacalai-Tesque Inc.,Japan
·移动相溶剂组成：20％乙腈
·样本注入量：20μl
·流速：1.5mL/min
·柱温：30℃
将来自于各个体的叶和种子的样本的萝卜硫苷的HPLC峰面积(含量)的相关性示出在图3中。
如图3所示，来自于十字花科蔬菜的叶子和种子的样本的萝卜硫苷的HPLC峰面积可见相关性，示出了在叶子中的萝卜硫苷含量高的品种中，其种子的萝卜硫苷含量也高。这些结果表明，即使在十字花科的属间杂种植物中，在叶子的萝卜硫苷含量高的个体中，种子的硫代葡萄糖苷含量也高。
工业上的可利用性
本发明是能够在农业、食品制造业、医药品制造业等中利用的发明。
本说明书中引用的所有出版物、专利及专利申请直接通过引用并入本说明书中。
序列表
<110> 日本国立农业食品产业技术综合研究机构
可果美株式会社
<120> 高萝卜硫苷含量的属间十字花科植物及其制造方法
<130> PH-9333-PCT
<150> JP 2021-063196
<151> 2021-04-01
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 372
<212> PRT
<213> 萝卜
<400> 1
Met Ser Ser Asn Val Val Ser Gly Val Glu Met Asp Gly Ser Asn Glu
1 5 10 15
Arg Lys Val Phe Asp Asp Lys Lys Met Gly Val Lys Ala Leu Ala Asp
20 25 30
Ala Gly Ile Lys Glu Leu Pro Ala Met Phe Arg Ala Pro Pro Ser Ile
35 40 45
Leu Glu Ser Leu Lys Ala Ala Arg Ala Ser Gln Asp Ala Asn Leu Phe
50 55 60
Pro Thr Ile Asp Leu Lys Gly Val Ser Leu His Tyr Lys Asp Gln Asp
65 70 75 80
Leu Met Thr Arg Arg Asn Val Val Glu Gln Ile Arg Asp Ala Ser Ala
85 90 95
Lys Trp Gly Phe Phe Arg Val Thr Asn His Gly Phe Ser Lys Asp Leu
100 105 110
Gln Glu Arg Met Leu Glu Gly Leu Arg Arg Phe His Ala Gln Asp Pro
115 120 125
Ser Val Lys Arg Gln Tyr Tyr Thr Arg Asp His Thr Arg Asn Phe Leu
130 135 140
Tyr Tyr Thr Asn Val Asp Leu Phe Thr Ser Asp Ser Ala Ser Trp Arg
145 150 155 160
Asp Thr Thr Ile Cys Tyr Thr Ala Pro Asp Arg Pro Arg Pro Glu Asp
165 170 175
Leu Pro Ala Val Leu Gly Glu Val Ile Leu Glu Tyr Ser Lys Glu Met
180 185 190
Thr Ser Leu Gly Glu Leu Ile Phe Glu Leu Leu Ser Glu Ala Leu Gly
195 200 205
Leu Asp Thr Asn Tyr Phe Lys Asp Leu Asp Cys Val Lys Ser Gln Met
210 215 220
Met Leu Gly Gln Tyr Tyr Pro Pro Cys Pro Gln Pro Asp Leu Thr Leu
225 230 235 240
Gly Leu Ser Lys His Ser Asp Phe Ser Phe Leu Thr Val Leu Leu Gln
245 250 255
Asp Asn Ile Gly Gly Leu Gln Val Leu His Asp Asp Ala Trp Phe Asp
260 265 270
Val Pro Pro Val Pro Gly Cys Phe Val Val Asn Ile Gly Asp Leu Leu
275 280 285
Gln Phe Ile Thr Asn Asp Met Phe Ile Ser Ala Glu His Arg Val Leu
290 295 300
Ala His Thr Ala Ser Val Pro Arg Val Ser Val Pro Tyr Phe Phe Thr
305 310 315 320
Thr Phe Lys Lys Val Asn Pro Arg Val Tyr Gly Pro Ile Lys Glu Leu
325 330 335
Leu Ser Glu Asp Asn Pro Arg Lys Tyr Arg Asp Cys Ser Met Thr Glu
340 345 350
Ile Ser Glu Ile Phe Ser Ser Asn Glu Ile Thr Ile Pro Arg Leu His
355 360 365
Gln Leu Arg Ile
370
<210> 2
<211> 10555
<212> DNA
<213> 萝卜
<400> 2
atagcattag aaaagctttt aaagaaacaa tgtccagcaa cgtcgttagt ggggtcgaaa 60
tggatggttc gaatgaaaga aaagttttcg acgataagaa aatgggcgta aaagccctgg 120
cggatgcagg aatcaaagag ctcccagcca tgttccgtgc acctccgagt attttagaaa 180
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tcagagatgc gtctgcgaaa tggggtttct tccgagtgac caatcacggg ttctcgaagg 360
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tcttcacctc tgattccgcc agttggagag acacaactat ttgttacaca gccccggatc 540
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atccgattta tactcagtca cacatcgact agagacggac cagtttacta atcttgtcac 720
tcgacaataa cacaggacaa gctatcccaa cctggatact ctcctattag actgcttctc 780
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aaacaacata agtcatagat cacaggaaaa gaagtgatac tcttactcct cagacgaaca 1500
cgaacgttct ttagatctgt aatgagacga tcaatgtctt ctgcaagatc aggaagacta 1560
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acaaacttga gtcgttcctg attcatggag gtgtagttca tggtgggaag ccaatttgca 1860
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cagtttgggt catcctcaga accaggaata cagtacagtg aattgataag ccccggagac 2040
agcgtaacca ctgaccctct gagatacacc gccacaccat catctctctc ctcagcatct 2100
ggcaggttgg cgacaaactc ccgaatcacg gttggttgaa aggcgtcgga gtcaaccacg 2160
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attagcctca tacatagcct ggaacatggc tcgactctct tcgtatctgg gctcttttgg 2400
aagaagagtc tcttcgatgg gaacatcagt gtggttctca ccattgctgt catcttcaga 2460
cacagaatct gcggcgactt cggttgggtc ggacggagat ggatgatgac gacggcgaac 2520
acgcttctta ctccctctcg aggactcacc ggaagttgga gcattaaccc aaattggttc 2580
atcgttcacc ggcgagctca tagatcgact caagcgagtg ctccttcgag gcggctgcat 2640
gttggatttg tgcaagagaa ccaaagtgcc tcatccttaa cgacaaccct aagaataagt 2700
cactcagaca ttgggccgtt agtaacaaca caaaagccca taagacttaa caataaccca 2760
agctagaatc aggtccatta gcatcaaatt tttgaccaag tgttagagac attcacttac 2820
agaggcaaga gaatcagaga gagataagga cttcgagcga agcacacgga caacagatac 2880
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agaagaacca ctgacattat tgctgactca taggtattca tcaaaagaat ttcaagagta 3000
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aagtgttgta acacccaact ccggctgggt tacttcaaat ggtagattct ttctctgcct 3300
agtccggaca gtgatcgaac tcagagtcag agtgtgatag caccctgctc cgacacgagt 3360
atccatcatt ccaggccttt attttgaagt ctcatgtatc cagtttcatg tgttactcat 3420
tgttttggac atgtagcaca cctacttttg attggcactc accttcacca atgtttcctt 3480
gttcaatcca gacagtgatc aatgctcaaa cgtagaatgt tgcagcatcc tagtccaaga 3540
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tcaaggagaa acttgttgag gcaaggtttt agttgtgtga tgaaatccct acagatagca 3660
gcaactatat acagcaattc tactctctca tttgaacttg ttcagaggtc aatgattccc 3720
aacgccttcc taagaccaag aaaggtgttg taatccaatg gttttgtgaa aagatcagcc 3780
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acaaagtgat gcctaatatc cacatgtttg gtgcgtgaat gctgaacagg attcttagac 3900
agatttatag cactcatgtt atcacagtga acaagcatag attccgaaat gataccataa 3960
tcaactagca tctgtcgcat ccagagtagt tgagtgcaac aactccccaa ggctattata 4020
ctctgcctcg gctgtcgata gagagacaca attttgcttc ttgctgtgcc atgacaccat 4080
gtttgtttcc taggaagaag catccttcct gacgtgcttg tgtctatcat ctaaacaccc 4140
tgcccaatcg gcatcgcaaa atcctgcaag attcacgtta gtttcaaaag tgtaatgaag 4200
gccaaagtcc aatgtacctt tcacatattt gattattcgt ttgacagcgt tcatgtggga 4260
ttccttcgga tgagcctggt atcgtgcaca tattcctacg cttaagcaaa gatccggtct 4320
gcttgcagtg agatatagca gacttccaat catggctctg tagagctttt catcaactgg 4380
ttttccatct tcgtctctcg aaagtttagt ggatgtgctc atcggggtct tagcaatttt 4440
gctggtttgc attccaaatc gtttgataag gttcttggca tatgtacttt gagacaccgt 4500
gataccatca gggagctgtt tgacttgtaa accgagaaag taactcagtt cacctaccat 4560
gctcatctca aactccttcg tcattgtctt gacaaactca tccaccatcg attgatctgt 4620
acttcccgaa gataatgtca tcaacgtaga cttgaatgat taggatgtcc ttcccattct 4680
ctcctatgaa cagagtttta tctactcctc ctcgctgaaa gccagcctta atgagaaact 4740
cagtcagtct ctcataccaa gctcgtggag cttgttttag accataaaga gctttcttaa 4800
gcttgtagac atgatctgga aaatgtggat cttcaaaccc tttaggttgt gaaacgtaaa 4860
cctcttcttg aagtatccca tttaagaaag cacttttgac gtccatttga tagagtttga 4920
ttcgaagact gcaggccatg ccaaatagca gtctgatcga ttcaagccta gcaactggag 4980
cgaaggtctc atcgaaatcc acaccttcaa tctgagcata tccttgcccg acaagtcttg 5040
acttgtttct gatcacattt ccttcctcat ctgtcttgtt tttatgaatc catttcgttc 5100
caatgatgtt cacattttca ggtcttggaa ccaaagccca cacatcaagt cgttcaaact 5160
gttcaagctc ttggtgcatt gaatcggtcc agtactcatc ctcaagagct tcttgtagat 5220
tcttaggttc aaagagagac acaaagcact caactttatt caactcctcc acgaagaacg 5280
ccagcttcac catttctttg aagtcaatct ttttcttcct ggtgactcgt tcatcaaata 5340
ctccaccaat gacgtcagat gaggagtgat tgcgatgaac ttttcctttg tctagatcga 5400
ctttgatact gttctgctca ttttcatctc cagactcatc tttgagctcg gtttcagttg 5460
atgtactgac gggctgtgtc acacactcaa ttgtttgtgt caccttagct tgataaaaac 5520
ctatgttgtc atcaaacacc acattgacat tatcaccaac aaatttggta cgctgggttg 5580
aatactctgt aagctgagct gtttgtagag taaccgagaa acatttcaac atcactctta 5640
gcctcaaatt ttcctagatg atcctgatcg ttcaatatgt aacagagaca tccgaacaca 5700
tgcatatgac tcaaatttgg tgtttttcct ttgaagatct catagggtgt catcgtagtc 5760
tttggcttta cgtacactcg attgattatg tagcaagccg tagctacagc ttctgcccag 5820
aaaccggaag ggacactgtt tccacataac attgctctag ccatctcctg cagtgttctg 5880
ttctttcttt caacaacccc gttttgttgt ggagttctag gagcagcata ttgatgacgg 5940
attccttgac tctgacagaa tttatcaaac tgttcatttt gaaattctcc tccgtgatca 6000
ctcttgatct gaataatgcc tccttttact tgtttgagtt gcagtgccaa gatacgaaag 6060
ctctcaagtg catctgattt cttcctcaga aaatcaatcc aagtgtatct cgagaaatca 6120
tcaaccataa caagaatgta gcgtttacca gcaatgctct caggtgtgat tggacccata 6180
agatccatgt gtactaattc aagaacacgc ttagagtgaa tctctgaaat ctgtttatgt 6240
tgcaccttga tctgctttcc ctgacagcat cctccacaca ctgtatccgt ttctttttcg 6300
agctcaggta ctcctctcac aacctcagca ttcactagtt ttgtcagtcc tcgagtgttc 6360
atgtgtccaa gcttcttgtg ccagagatca agtttggatt ctcttgcaga taagcacagt 6420
tgcgatggtt tccacatgta gcagttgttg cctgaacgaa ctccatacag aactaaattc 6480
cctttcgcat caacagctct gcattcttta ctgttgaaaa tgacttccaa tccatcatca 6540
cacagttggc tcacactgat cagatttgcc ttgagtccat ccactaggta gacatttatg 6600
agacgaggaa gatctggtct ttccagtact ccaacaccac ggattcttcc ctgaccacca 6660
tctccaaaag tgacttttcc tccttgaaga agctcaagtt tctcaacaaa ttccagcttt 6720
ccagtcatat gtttggagca accactgtca aagtaccacg gggtatcatt tgcattgcta 6780
ctctcagcac tagtgtacgc aacattactc acaaactcgt cctcactatg tattcgtgca 6840
aggttgcact caatttcagt ctctggattg gtgtgtagct catctcgttc gtcatgtgac 6900
acaacttgtt gtacttcttt atagtttggg tacaagtctc gcttggctat ccagacatga 6960
ccgtagagag ttggttccat gaagcacaga tttaacctcc acgctctctc atactgatgt 7020
cttcggaagt aacaatactt aacatgatgt ccacgttttc cacagaactg acatgcattt 7080
cttcgatgtg gaatctgtac tgagttcgtg tttttttctt tctgagtgga agctctcatg 7140
atgctgactt gaggaagttt tgcagatact ggtttctctt cttctacagc ttcttttaca 7200
aagacaactt gttttccctt ctcttcagct gtatacttgg taccttgata cccgagaccc 7260
ttgttggtgc taggacattg tcctatagta agaagatgat ccagtgttga tgtgcctgag 7320
gtgagcattt taactttctt cagattttct gcaagttgat tctgaagaag tttactcttt 7380
atccatctct tctgctagta gattggtcag ttgttcaatc ttgacttcaa acaaatttct 7440
gacatctctc ttgttctacc actgctcgtt tcaaagacag aacctcttga tcagattcct 7500
tcagaattga gagattggag ctcttacccg atggttgttc tagctccaga atgttcactt 7560
gtgctttcaa cattgccttg tctttgagaa gttgcaagtt ttcatggcta agctcagcaa 7620
atttgtcaaa gagagtcttg tactctgttt caagatcctg accaagagtg ttgtcatctt 7680
cttcatcgcc tgattctgat ttctcatcat cttcctgtcc aattaaagcc atgaaattta 7740
gatgaagttc ttcttcctca ctgtcattat cagactcaga gtcactgaaa cacacaagcg 7800
atttgtcctt cttcaaagtg ttaggacact cactcctagt atggccaatt cccttacatt 7860
caatacactt cagctccttt ctcttagtaa ggggacattc attcttgaag tgaccgtatc 7920
cttcacactc atgacactga agatccttct tcttagatgt tcttgatgca tcttgttttg 7980
agtattgaga actgcttcga tcagattccc ctcgctgaaa acgattattt gagcgacctg 8040
ttcctttctc catgcgtttc acaaacttgt tgaagtttcg agccaattaa tcctagattc 8100
tcttcaatct tggtaactct atcactttcc ttagagtcag cagagaaggc aaatactctt 8160
ctgagaattt gatgctcgat cagatttttc caaagtcgtg aaccttcagt atcccagata 8220
actgatcaaa cttcatttca tccgtgtcta ctgcaatgtt tagaacagct ttgtatgcat 8280
caaacctagg aggtaggcat ctcagtaatt tcttcactaa gtctttctcc tcgtacttct 8340
taccaagaac tgaagactca ttagcaatct cgctaatctt ggagataaaa ccatcaatag 8400
gatcatcatc tcccattcgc agattttcga acctagatgc aagatgatca attcgtgtac 8460
gtcgtacact ggtgtttcct tcaaaatgat ttatcagggt atcccaagct tccttggcag 8520
actcgcatcc ttgtatgatc ttaaattgat ccagatcaac tgatgaaaag atcacagtca 8580
aagctttaga attgaatttt gatgcagctt tttctgcttc agtccattga tccttaggtt 8640
taggacccag agttttatct tccatcataa ctgtgggagc tgaccatcct tcttcaacgg 8700
cagtccatgc atcttcgtta atcgccctga tcacatgtct cattctggcc ttccagtgac 8760
caaagtttcc accgtctaac atgattggtt tgtgtaaacg tgatgagttc cttcatactg 8820
tccatgatct ccgcagggat cttcacctgt tagtggtatt agataccaca gaggttccct 8880
gctctgatac caaatgaaag ttcagggaca ataagttaat aaggaacgca cagaacttcc 8940
aagaacactt ccttgattaa tcagaaacct tttaaacaat cttcctagat ctgtttaatc 9000
cgatttatac tcagtcacac acgactagag acggaccagt tactaatctt gtcactcgac 9060
aataacacag gacaagctat cccaacctgg atactctcct attagactgc ttctcaagaa 9120
cactcttctt gcttaagcac gtcaaaacac taaaaaccgt aacctaaatc tacccaaggt 9180
aatttggtta tatacacctc tcacaatatc tcccctgaga tatcgtgata tatacaaatc 9240
cccatcgtta ttcatctctc cgagatatca ggttcaaacg attgcctcgt cgccacgtca 9300
tcattcagct actttctcgc gtcaccatgt gttacacaac gctccatatg tgtaactcac 9360
taatcttgtt ccttgtctca caagcactaa tccttggtgc tttcaaggat ctgcccgccg 9420
ttttggggta aggtttcact agtgtctggt ttttaacacg gtctgtccgt tgttacgtga 9480
cagtttgatt aattaatcat gcatggatat tatagtttta ttggatttac aaatgattta 9540
gatgtgttag tgaatactaa atagctattg cttagttaca atagctagga atgaaaacta 9600
aaggtgatgc taactaagca tggaaaacat ttgatgtggc atgcagggag gttatattgg 9660
agtactcaaa ggaaatgacg agtttaggtg aattgatctt tgagcttcta tcagaggctt 9720
tgggattaga cactaattat ttcaaggatt tggattgcgt caagtctcag atgatgttgg 9780
gccaatatta tccaccttgc cctcagcctg accttacttt aggcttaagc aagcacagtg 9840
atttttcttt tctcactgtt cttcttcaag acaatatagg agggcttcaa gttctccatg 9900
acgatgcctg gtttgatgtt cctcctgtcc ctggatgttt tgtcgttaac attggagatc 9960
ttctacaggt taagatcata aactgctgtg gcttgtaatt aacggtttta aacataaaat 10020
atatatgaag ctcttttgtt gttgttgtgt gcagttcata accaatgaca tgttcataag 10080
cgcggagcat agggtgctag cgcatactgc ttctgtaccg agggtttcag tgccatattt 10140
cttcaccacg ttcaagaagg tgaatcctcg tgtatatgga cccatcaaag agctcctctc 10200
agaagataac cctcgcaagt atagagactg ttccatgacc gagatctcag agatcttcag 10260
ttcaaatgag atcaccattc ctaggttaca ccagctcagg atctgaaaca tcaatcattg 10320
ctataatctc tccaactcta tgttatgttt ggtcttctta gttcctctta aaatatctgc 10380
cgcaataact acttcctctt cttctctcga actgtgtttg aaagatatct gaaaatcttc 10440
gaataaggtg ttattttgta attgagttct ttagttatta agtaagttat catgttgtat 10500
caaaagttgt gtgtaagagt cgtgacttta gattggagaa ttgtgtctct tattc 10555
<210> 3
<211> 2662
<212> DNA
<213> 长羽裂萝卜 MR050E
<400> 3
atagcattag aaaagctttt aaagaaacaa tgtccagcaa cgtcgttagt ggggtcgaaa 60
tggatggttc gaatgaaaga aaagttttcg acgataagaa aatgggcgta aaagccctgg 120
cggatgcagg aatcaaagag ctcccagcca tgttccgtgc acctccgagt attttagaaa 180
gcctgaaagc agcacgagct tctcaggatg cgaacctctt cccgaccatt gatctgaaag 240
gagtgagcct gcactacaag gatcaagatt tgatgacgcg gcggaacgtg gtggagcaga 300
tcagagatgc gtctgcgaaa tggggtttct tccgagtgac caatcacggg ttctcgaagg 360
atttgcagga gaggatgctt gaagggcttc gtcggtttca cgcgcaagat ccatcagtta 420
agagacagta ctacacacgt gatcacactc ggaactttct ttactacacc aacgtcgatc 480
tcttcacctc tgattccgcc agttggagag acacaactat ttgttacaca gccccggatc 540
gtccccgacc tgaggatctg cccgccgttt tggggtaagg tttcactagt gtctggtttt 600
taacacggtc tgtccgttgt tacgtgacag tttgattaat taatcatgca tggatattat 660
agttttattg gatttacaaa tgatttagat gtgttagtga atactaaata gctattgctt 720
agttacaata gctaggaatg aaaactaaag gtgatgctaa ctaagcatgg aaaacatttg 780
atgtggcatg cagggaggtt atattggagt actcaaagga aatgacgagt ttaggtgaat 840
tgatctttga gcttctatca gaggctttgg gattagacac taattatttc aaggatttgg 900
attgcgtcaa gtctcagatg atgttgggcc aatattatcc accttgccct cagcctgacc 960
ttactttagg cttaagcaag cacagtgatt tttcttttct cactgttctt cttcaagaca 1020
atataggagg gcttcaagtt ctccatgacg atgcctggtt tgatgttcct cctgtccctg 1080
gatgttttgt cgttaacatt ggagatcttc tacaggttaa gatcataaac tgctgtggct 1140
tgtaattaac ggttttaaac ataaaatata tatgaagctc ttttgttgtt gttgtgtgca 1200
gttcataacc aatgacatgt tcataagcgc ggagcatagg gtgtgatgta gcgcaagcta 1260
cgataacaca atgaatccta tttagtctga gaatacctag gatcaaagtc ttcttgattc 1320
gttgagaact ctcgagttct agccgtaaca aggaaataaa agggtttcaa acctctcttt 1380
ataaaatatc aatatcaata aaactgatta caagtctaag cataaaacac ctatttatat 1440
gaaaaccaaa taatctaaaa actattaaaa tccttaagat aattataact aattaagata 1500
aatatcaaaa caaataataa actagataat taagatattt ggaatatatc taaatatctc 1560
tctgcatcat tctctccggg ttggagaaag attcgtcctc gaatcttaac cgtggtcttc 1620
gattaatttt cctcttttat accatatata aaataattct tcaagccatc gaatatattg 1680
atcctttgta taaaatcctt ttgtttgcca aaaaacaatt acgccacatg gcataatcaa 1740
ttgcctcttt gcccttttga acttcacagc aaatttagat gaagaatcca atacgtcttc 1800
aacaccttgc ggtggagcaa gtgccgacca attaccttct ttagaccttg atatttgact 1860
tttgacagca ccaaaaaagt ctctcacgtg cttgtttgtt gacttgaaca catccttgta 1920
taatatcaaa tcgaccggtt tgataataat cacgtcttca ccgtattgat catatattgc 1980
aggaccaata atctctttgt actctccgta caaatctgtt gtcgaattaa atggatattc 2040
atccgtttga taaaaacacc caaacgacat ggtattgaac gaagcagaat caactttgat 2100
ttagaaaacc aaagtgttgg ctctgatacc aaactgatgt agcgcaagct acgataacac 2160
aatgaatcct atttagtctg agaataccta ggatcaaagt cttcttgatt cgttgagaac 2220
tctcgagttc tagccgtaac aaggaaataa aagggtttca aacctctctt tataaaatat 2280
caatatcaat aaaactgatt acaagtctaa gcataaaaca cctatttata tgaaaaccaa 2340
ataatctaaa aactattaaa atccttaaga taattataac taattaagat aaatatcaaa 2400
acaaataata aactagataa ttaagatatt tggaatatat ctaaatatct ctctgcatca 2460
gggtgctagc gcatactgct tctgtaccga gggtttcagt gccatatttc ttcaccacgt 2520
tcaagaaggt gaatcctcgt gtatatggac ccatcaaaga gctcctctca gaagataacc 2580
ctcgcaagta tagagactgt tccatgaccg agatctcaga gatcttcagt tcaaatgaga 2640
tcaccattcc taggttacac ca 2662
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 4
tccaggttgg gatagcttgt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 5
tgaaacctta ccccaaaacg 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 6
gcaggagagg atgcttgaag g 21

Claims (19)

1.一种植物，为芸苔属植物及萝卜属植物的属间杂种植物，
萝卜硫苷含量相对于萝卜苷含量之比为1.0以上。
2.根据权利要求1所述的植物，其中，
以鲜重计，萝卜硫苷含量为20mg/100g以上。
3.根据权利要求1或2所述的植物，其中，
以鲜重计，萝卜苷含量为50mg/100g以下。
4.一种植物，为芸苔属植物及萝卜属植物的属间杂种植物，
包含功能缺失型还原型萝卜硫苷合成酶基因。
5.根据权利要求4所述的植物，其中，
功能缺失型还原型萝卜硫苷合成基因为下述(a)和/或(b)的基因：
(a)在构成编码由序列号1中记载的氨基酸序列或与该氨基酸序列显示出90％以上的序列同一性的氨基酸序列构成的蛋白质的基因的外显子内，伴随着编码蛋白质中的2-氧代戊二酸-铁(II)依赖性加氧酶域的全部或一部分的缺失的基因；
(b)包含与序列号2或3中记载的碱基序列具有70％以上的序列同一性的碱基序列的基因。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的植物，其中，
所述芸苔属植物为甘蓝。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的植物，其中，
所述萝卜属植物为萝卜。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的植物，其特征在于，
所述植物具有多倍体化的染色体。
9.一种方法，为制作十字花科的属间杂种植物的方法，包括：
将第一母体植物和第二母体植物进行杂交的工序；以及
获取所述第一母体植物和所述第二母体植物的属间杂种植物的工序，
所述第一母体植物和所述第二母体植物为十字花科植物，且为不同的属，
以鲜重计，所述第一母体植物包含5mg/100g以上的萝卜硫苷，所述第二母体植物包含功能缺失型还原型萝卜硫苷合成酶基因。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，
功能缺失型还原型萝卜硫苷合成酶基因为下述(a)和/或(b)的基因：
(a)在构成编码由序列号1中记载的氨基酸序列或与该氨基酸序列显示出90％以上的序列同一性的氨基酸序列构成的蛋白质的基因的外显子内，伴随着编码蛋白质中的2-氧代戊二酸-铁(II)依赖性加氧酶域的全部或一部分的缺失的基因；
(b)包含与序列号2或3中记载的碱基序列具有70％以上的序列同一性的碱基序列的基因。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中，
所述方法还包括：筛选所述属间杂种植物中的包含功能缺失型还原型萝卜硫苷合成酶基因的属间杂种植物的工序。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，其中，
所述第一母体植物为芸苔属植物，所述第二母体植物为萝卜属植物。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的方法，其中，
所述芸苔属植物为甘蓝。
14.根据权利要求9至13中任一项所述的方法，其中，
所述萝卜属植物为萝卜。
15.根据权利要求9至14中任一项所述的方法，其中，
所述属间杂种植物包含多倍体化的染色体。
16.一种生产十字花科植物的方法，包括栽培权利要求1至7中任一项所述的植物的工序。
17.一种食品，以权利要求1至7中任一项所述的植物为原材料。
18.一种方法，为提高十字花科植物的萝卜硫苷含量的方法，包括：
第一工序，以鲜重计，准备含有5mg/100g以上的萝卜硫苷的十字花科植物作为第一母体植物；
第二工序，准备还原型萝卜硫苷合成酶的功能已缺失或下降的与第一母体植物不同属的十字花科植物作为第二母体植物；以及
第三工序，将所述第一母体植物和所述第二母体植物进行杂交。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，
所述第二工序包括：改变还原型萝卜硫苷合成酶基因来使还原型萝卜硫苷合成酶的功能缺失或下降。
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