WO2022210099A1 - グルコラファニンを高含有するアブラナ科属間雑種植物及びその作出方法 - Google Patents

グルコラファニンを高含有するアブラナ科属間雑種植物及びその作出方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2022210099A1
WO2022210099A1 PCT/JP2022/013175 JP2022013175W WO2022210099A1 WO 2022210099 A1 WO2022210099 A1 WO 2022210099A1 JP 2022013175 W JP2022013175 W JP 2022013175W WO 2022210099 A1 WO2022210099 A1 WO 2022210099A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
plant
gene
parent
genus
glucoraphanin
Prior art date
Application number
PCT/JP2022/013175
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
智博 柿崎
隆由 小原
悦子 板橋
光代 川崎
亮太 遠藤
悠介 牛田
Original Assignee
国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
カゴメ株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, カゴメ株式会社 filed Critical 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
Priority to JP2023511018A priority Critical patent/JPWO2022210099A1/ja
Priority to CN202280025948.5A priority patent/CN117396066A/zh
Priority to KR1020237035164A priority patent/KR20230156136A/ko
Publication of WO2022210099A1 publication Critical patent/WO2022210099A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/02—Methods or apparatus for hybridisation; Artificial pollination ; Fertility
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/04—Processes of selection involving genotypic or phenotypic markers; Methods of using phenotypic markers for selection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/20—Brassicaceae, e.g. canola, broccoli or rucola
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L19/00—Products from fruits or vegetables; Preparation or treatment thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits

Definitions

  • the present invention relates to a cruciferous intergeneric hybrid plant containing a high amount of glucoraphanin and a method for producing the same.
  • Sulforaphane which is a kind of isothiocyanate, is a kind of phytochemicals contained in plants of the Brassicaceae family, particularly in the genus Brassica oleracea (Brassica Oleracea).
  • Sulforaphane is a functional ingredient known to have bioactivities such as cancer prevention effects by activating the production of detoxification enzymes in the human body, as well as liver function improvement effects and antioxidant effects (for example, non See U.S. Pat.
  • Glucoraphanin is a class of secondary metabolite glucosinolates, also called mustard oil glycosides.
  • Glucoraphanin in the cells is exposed outside the cells by chewing or the like, reacts with the enzyme myrosinase endogenous in the plant body, or is degraded by intestinal bacteria to change to sulforaphane.
  • Patent Document 1 a wild-type Brassica species and a Brassica oleracea breeding line are crossed, and a hybrid having a higher amount of 4-methylsulfinylbutyl glucosinolate (glucoraphanin) than the original breeding line is selected.
  • a method for obtaining glucoraphanin-rich Brassica species is disclosed.
  • No. 2005/0000003 discloses a high glucosinolate content Brassica oleracea containing a deletion of the Myb28 allele from Brassica villosa and the ELONG allele from Brassica villosa genetically linked to the Myb allele.
  • a plant is disclosed.
  • the genus Raphanus of the family Brassicaceae does not normally contain glucoraphanin at available levels.
  • Patent Document 3 individuals having a high glucoerucin content and a 4-methylthio-3-butenyl glucosinolate (glucorafasatin) content of 1/5 or less of the glucoerucin content are selected and self-fertilized.
  • a method for producing a radish line with a high glucoraphanin content is disclosed.
  • Non-Patent Document 2 reports that a high content of glucoraphanin and glucoraphenin was detected in Raphanobrasica, which is a heterogeneous cross between radish of the family Brassicaceae and kale of the genus Brassica.
  • Non-Patent Document 3 reports that the glucorafasatin synthase (GRS) gene was identified.
  • Patent Document 4 in order to reduce the peculiar odor and yellowing of radish derived from the decomposition products of glucorafasatin, radish individuals having a function-deficient GRS gene are crossed to contain glucorafasatin. A method for obtaining low abundance radish lines is disclosed.
  • An object of the present invention is to obtain a cruciferous plant with a high glucoraphanin content.
  • the present inventors have made intensive studies, and as a result, an intergeneric hybrid obtained by crossing a plant of the genus Brassica and a plant of the genus Radish having a defective GRS gene containing glucoraphanin The inventors have found that the amount becomes high, and have completed the present invention.
  • the present invention includes the following.
  • a plant which is an intergeneric hybrid plant of a plant of the genus Brassica and a plant of the genus Radish, wherein the ratio of glucoraphanin content to glucoraphenin content is 1.0 or more.
  • the plant according to (1) which has a glucoraphanin content of 20 mg/100 g (fresh weight) or more.
  • the plant according to (1) or (2) which has a glucoraphenin content of 50 mg/100 g (fresh weight) or less.
  • the loss-of-function glucorafasatin synthesis gene is the following gene (a) and/or (b): (a) 2-oxoglutarate-iron (2-oxoglutarate-iron) in the coding protein in the exon constituting the gene encoding the protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence showing 90% or more sequence identity with the amino acid sequence; II) genes with deletion of all or part of the dependent oxygenase domain; (b) A gene comprising a nucleotide sequence having 70% or more sequence identity with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:2 or 3.
  • a method for producing an intergeneric hybrid plant of the family Brassicaceae comprising the step of crossing a first parent plant and a second parent plant; obtaining an intergeneric hybrid plant, wherein the first parent plant and the second parent plant are cruciferous plants and belong to different genera, and the first parent plant is A method comprising 5 mg/100 g (fresh weight) or more of glucoraphanin, and wherein the second parent plant comprises a function-deficient glucoraphasatin synthase gene.
  • the loss-of-function glucorafasatin synthase gene is the following gene (a) and/or (b): (a) 2-oxoglutarate-iron (2-oxoglutarate-iron) in the coding protein in the exon constituting the gene encoding the protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence showing 90% or more sequence identity with the amino acid sequence; II) genes with deletion of all or part of the dependent oxygenase domain; (b) A gene comprising a nucleotide sequence having 70% or more sequence identity with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:2 or 3.
  • a method for increasing the glucoraphanin content of a cruciferous plant comprising: a first step of preparing a cruciferous plant containing 5 mg/100 g (fresh weight) or more of glucoraphanin as a first parent plant; A second step of preparing, as a parent plant of 2, a cruciferous plant of a genus different from that of the first parent plant in which the function of glucorafasatin synthase is lacking or reduced, and the first parent plant and the second parent plant.
  • a cruciferous plant with a higher glucoraphanin content can be obtained.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing biosynthetic pathways of glucoraphanin and glucoraphenin in cruciferous plants.
  • 1 is a schematic diagram showing the structure of a wild-type GRS1 gene and the insertion positions of retrotransposons in the base sequences shown in SEQ ID NO:2 and SEQ ID NO:3.
  • FIG. (A) shows the structure of the wild-type GRS1 gene.
  • (B) shows the structure of the base sequence shown in SEQ ID NO:2.
  • C shows the structure of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:3.
  • 1 is a graph showing the correlation between glucoraphanin content in leaves and seeds of each individual plant in the family Cruciferae.
  • the chemical formulas described herein include all geometric isomers and optical isomers.
  • content refers to weight concentration (w/w) unless otherwise specified.
  • derivative refers to a compound that has been modified to such an extent that the skeletal structure of the compound is not affected.
  • a first embodiment of an intergeneric hybrid plant of a plant of the genus Brassica and a plant of the genus Radish of the present invention (hereinafter also referred to as a "plant of the present invention") is glucoraphenin.
  • the ratio of glucoraphanin content to content is 1.0 or more.
  • a second embodiment of the plant of the present invention is characterized by comprising a function-deficient glucorafasatin synthase gene.
  • the plant of the present invention may have the features of the first and second embodiments alone or both.
  • plant includes any part of leaves, stems, flowers, buds, roots and seeds, unless otherwise specified or inconsistent. and The plant of the present invention has the above characteristics at least in any part of leaves, stems, flowers, buds, roots and seeds.
  • glucoraphanin refers to a compound represented by the following formula (I), a derivative or a salt thereof.
  • glucoraphenin refers to a compound represented by the following formula (II), a derivative or a salt thereof.
  • glucoraphanin and glucoraphenin are biosynthesized by the biosynthetic pathway shown in Fig. 1 in cruciferous plants. That is, glucoerucin is synthesized by about 20 types of enzymatic reactions using methionine as a starting material. Glucoerucin is oxidized to glucoraphanin. In some cruciferous plants, glucoerucin is converted to glucoraphasatin by the glucorafasatin synthase (GRS1) gene, and glucorafasatin is oxidized to synthesize glucorafenin. Glucorafasatin is converted to rafasatin, a pungent component, by the action of the hydrolytic enzyme myrosinase, and then to odor components and yellowing substances.
  • GRS1 glucorafasatin synthase
  • cruciferous plants are classified into one family of the phylum Angiosperm, Dicotyledonous, Subclass Biwamodoki, and the family of the order Coleoptera. It contains many genera of plants such as Radish and Porcupine.
  • Brassica plant is a plant classified into one genus of the Brassicaceae family, including rape, mizuna, taisai, bok choy, komatsuna, turnip, Chinese cabbage, cabbage, broccoli, habotan, mustard, kale. , kohlrabi, cauliflower, etc.
  • Brassica plants used as parent plants for the plants of the present invention are preferably plants containing a relatively large amount of glucoraphanin, such as kale, broccoli, cabbage, kohlrabi, and cauliflower.
  • the Brassica plant is Brassica Oleracea.
  • glucoraphanin preferably contains 5 mg/100 g (fresh weight (FW)) or more, or 10 mg/100 g FW or more of glucoraphanin.
  • FW fresh weight
  • Such Brassica oleracea containing a high amount of glucoraphanin may be obtained by the method described in Patent Document 1, for example.
  • a "plant of the genus Radish” is a plant classified into a genus of the Brassicaceae family, and includes radish, radish and the like.
  • the radish plant used as the parent plant of the plant of the present invention is preferably Raphanus sativus.
  • Radish plants are characterized by containing glucorafasatin, which is not synthesized in the same cruciferous relatives.
  • a gene for glucoraphasatin synthase which converts glucoerucin to glucoraphasatin, has been identified from Japanese radish, and it was revealed that this characteristic gene synthesizes glucorafasatin.
  • radish has some mutants with low glucoraphasatin content. It is known that in this mutant, the structure of the glucoraphasatin synthase gene present at the end of the first linkage group of Japanese radish is changed from that of the wild type, and its function is lost. Since the normal glucoraphasatin synthase genotype is dominant, it was named the GRS1 (Glucoraphasatin Synthase 1) gene, and the recessive genotype that lost function was named the grs1 gene. The amino acid sequence encoded by the GRS1 gene has a 2-oxoglutarate-iron(II)-dependent oxygenase domain, an oxygenase ubiquitous in plants.
  • GRS1 Glucoraphasatin Synthase 1
  • the radish genus plant used in the present invention is preferably a radish genus plant containing a function-deficient glucoraphasatin synthase (grs1) gene.
  • Grs1 contained in a plant belonging to the radish genus may be contained as a homozygous form or as a heterozygous form.
  • a radish plant containing a function-deficient glucorafasatin synthase (grs1) gene can be selected using, for example, the DNA marker assay technique described in Patent Document 4.
  • DNA extracted from a sample plant is used as a template, and a polymerase chain reaction (PCR) method using a primer set that specifically amplifies the GRS1 gene and a primer set that specifically amplifies the grs1 gene is used.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a radish genus plant containing the grs1 gene may be used by selecting a mutant by the above method from a large number of progeny lines produced by allogamous crossing, but the GRS1 gene of a wild-type radish genus plant may be modified. It is also possible to use those whose functions are lost or reduced. Any known technique can be used as a technique for modifying the GRS1 gene. For example, mutagenesis accompanied by insertion sequence introduction via transposons, retrotransposons, plant viruses, and the like can be mentioned. In addition, mutagenesis treatments such as radiation irradiation treatment, heavy ion beam treatment, and treatment with a solution containing a mutagen can also be mentioned.
  • intergeneric hybrid plant refers to a hybrid formed by crossing between organisms classified into different genera, that is, a hybrid progeny. It is distinct from interspecific hybrids, which are hybrids between different organisms within the same genus.
  • the plant of the present invention is a hybrid progeny produced by crossing a plant of the genus Brassica and a plant of the genus Radish.
  • a first embodiment of the plant of the present invention has a ratio of glucoraphanin content to glucoraphenin content of 1.0 or more.
  • the amount of glucoraphanin contained in the plant of the present invention is preferably 20 mg/100 g FW or more, particularly 30 mg/100 g FW or more, 50 mg/100 g FW or more, 100 mg/100 g FW or more, or 150 mg/100 g FW or more. .
  • the amount of glucoraphenin contained in the plant of the present invention is 50 mg/100 g FW or less, particularly 20 mg/100 g FW or less, 10 mg/100 g FW or less, 5 mg/100 g FW or less, 3 mg/100 g FW or less, or 2 mg/100 g FW or less. is preferred.
  • a second embodiment of the plant of the present invention contains a function-deficient glucorafasatin synthase gene.
  • the plant of the present invention is produced by using, as a parent plant, a plant of the radish genus having a homozygous or heterozygous glucorafasatin synthase gene grs1 gene.
  • a radish genus plant that possesses the grs1 gene in a heterozygous form half of the intergeneric hybrid plants are of the function-deficient type. can be obtained.
  • the DNA marker assay technique described in Patent Document 4 can be used. Specifically, a PCR method using a DNA extracted from a sample plant as a template and a primer set that specifically amplifies the GRS1 gene and a primer set that specifically amplifies the grs1 gene can be used.
  • the structure of the grs1 gene is not particularly limited as long as it lacks the function of GRS1, but preferably includes the following base sequences (a) and/or (b).
  • the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 2 and 3 are examples of the nucleotide sequence of the grs1 gene. Specifically, the base sequences shown in SEQ ID NOs: 2 and 3 both have a structure in which a retrotransposon is inserted into the exon sequence of the GRS1 gene.
  • FIG. 2 shows the structure of the wild-type GRS1 gene and the insertion positions of the retrotransposons in the base sequences shown in SEQ ID NO:2 and SEQ ID NO:3.
  • FIG. 2(A) shows the structure of the wild-type GRS1 gene.
  • the GRS1 gene has 3 exons (1st exon, 2nd exon and 3rd exon) and 2 introns (1st intron and 2nd intron).
  • FIG. 2(B) shows the structure of the base sequence shown in SEQ ID NO:2. This sequence inserts an approximately 9 kbp retrotransposon into the first exon of the GRS1 gene.
  • FIG. 2(C) shows the structure of the base sequence shown in SEQ ID NO:3. This sequence inserts a retrotransposon of about 1.2 kbp into the third exon of the GRS1 gene.
  • the plant of the present invention can contain a high concentration of glucoraphanin by containing a function-deficient glucoraphasatin synthase gene.
  • a function-deficient glucoraphasatin synthase gene in plants of the radish genus (especially Japanese radish) containing a homozygous loss-of-function glucoraphasatin synthase gene, glucoerucin is presumed to accumulate due to inhibition of the conversion of glucoerucin to glucoraphasatin.
  • plants of the genus Brassica especially Brassica oleracea
  • the intergeneric hybrid plant of the present invention maintains the ability to convert glucoerucin derived from a plant belonging to the genus Brassica to glucoraphanin, while suppressing the conversion of glucoerucin to glucoraphasatin, thereby converting glucoerucin to glucoraphanin. It can be said that the conversion was accelerated and it was possible to contain a high concentration of glucophanin.
  • the plant of the present invention may be a diploid, but may be, for example, a triploid or a tetraploid allopolyploid. Fertility can be restored or improved by making it allopolyploid.
  • Such allopolyploids may be produced by any known method, for example, by colchicine treatment (for example, Zhang et al., Breeding Research, Vol. 3, pp. 31-41 ( 2001), Ogasawara et al., Sono Gakken, Vol. 11, No. 2, pp. 189-194 (2012)).
  • the plant of the present invention can be used as a food or feed material.
  • As food in addition to being used as ordinary vegetables, for example, liquids (beverages), powders, granules, etc. can be used. Alternatively, it can be used as a material for extracting and purifying glucoraphanin. Purified glucoraphanin can be used, for example, in nutritional supplements (supplements), pharmaceuticals, and the like.
  • a method for producing an intergeneric hybrid plant of the family Brassicaceae comprises a first parent plant and a second parent plant. and obtaining an intergeneric hybrid plant of the first parent plant and the second parent plant, wherein the first parent plant and the second parent plant are , a cruciferous plant and a different genus, wherein the first parent plant contains 5 mg/100 g FW or more of glucoraphanin, and the second parent plant contains a function-deficient glucorafasatin synthase gene characterized by comprising
  • the "first parent plant” is a plant of the Brassicaceae family, which contains 5 mg/100 gFW or more, preferably 10 mg/100 gFW or more of glucoraphanin and is classified into a genus different from that of the second parent plant. be.
  • it is not particularly limited as long as it is a cruciferous plant classified into a different genus from the second parent plant, it is preferably a cruciferous plant, especially kale, broccoli, cabbage, kohlrabi, cauliflower, etc.
  • a plant containing rafanine is preferred.
  • Preferred is Brassica oleracea.
  • Such Brassica oleracea containing a high amount of glucoraphanin may be obtained by the method described in Patent Document 1, for example.
  • the "second parent plant” is a cruciferous plant classified into a genus different from that of the first parent plant, which contains a function-deficient glucorafasatin synthase gene.
  • the plant is not particularly limited as long as it is a cruciferous plant classified into a genus different from that of the first parent plant, but a radish plant is preferable.
  • it is Rafanus sativus.
  • the loss-of-function glucoraphasatin synthase (grs1) gene may be contained as a homozygous type or as a heterozygous type.
  • the method described in Patent Document 4 can be used. Specifically, a PCR method using a DNA extracted from a sample plant as a template and a primer set that specifically amplifies the GRS1 gene and a primer set that specifically amplifies the grs1 gene can be used.
  • the second parent plant containing the grs1 gene may be used by selecting a mutant from a large number of progeny lines produced by allogamous crossing by the above method, but modifying the wild-type GRS1 gene and using it. Those with missing or reduced functions may be used. Any known technique can be used as a technique for modifying the GRS1 gene. For example, mutagenesis accompanied by insertion sequence introduction via transposons, retrotransposons, plant viruses, and the like can be mentioned. In addition, mutagenesis treatments such as radiation irradiation treatment, heavy ion beam treatment, and treatment with a solution containing a mutagen can also be mentioned.
  • the structure of the grs1 gene contained in the second parent plant is not particularly limited as long as it has a structure in which the function of GRS1 is deleted. is preferred.
  • the grs1 gene is 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence.
  • the production method of the present invention preferably includes a step of selecting a function-deficient plant.
  • a method for selecting a function-deficient plant for example, the method described in Patent Document 4 can be used. Specifically, a PCR method using a DNA extracted from a sample plant as a template and a primer set that specifically amplifies the GRS1 gene and a primer set that specifically amplifies the grs1 gene can be used.
  • the first parent plant and the second parent plant are classified into different genera, and an intergeneric hybrid plant is obtained by crossing.
  • crossbreeding is not particularly limited, and crossbreeding techniques commonly used in breeding and the like can be used.
  • plants obtained by crossing may be further subjected to self-breeding over several generations, backcrossing over several generations, or repeating self-breeding and backcrossing as appropriate.
  • the production method of the present invention may be a method for producing a diploid, but may be a method for producing a triploid or tetraploid allopolyploid.
  • a method for producing a cruciferous plant The method for producing a cruciferous plant of the present invention (hereinafter also referred to as "the production method of the present invention") is described in the section "1. Intergeneric hybrid plant of a plant of the genus Brassica and a plant of the genus Radish.” 1., including the step of cultivating the plant of the present invention. According to the production method of the present invention, it is possible to obtain a plant with a high content of glucoraphanin.
  • a plant produced by the production method of the present invention is an intergeneric hybrid plant between a plant of the genus Brassica and a plant of the genus Radish.
  • the plants produced by the production method of the present invention are edible plants or feed plants, more preferably edible vegetables.
  • the plant produced by the production method of the present invention is a hybrid of Brassica oleracea and Rafanus sativus, ie Rafanobrassica.
  • a plant capable of ingesting a large amount of Rafanobrasica by humans or animals for example, mammals such as dogs, cats, cows, horses, pigs, sheep, monkeys, and ferrets, and birds such as chickens
  • mammals such as dogs, cats, cows, horses, pigs, sheep, monkeys, and ferrets, and birds such as chickens
  • the plant cultivated by the production method of the present invention may be an intergeneric hybrid plant of the F1 generation obtained by crossing a plant of the genus Brassica and a plant of the genus Radish, or obtained by selfing the F1 generation. It may be an F2 generation, or an intergeneric hybrid plant obtained by repeated selfing after the F2 generation. Alternatively, it may be an intergeneric hybrid plant obtained by backcrossing after the F2 generation.
  • the food of the present invention is characterized by using the plant of the present invention described in the section "1. Intergeneric hybrid plant of Brassica plant and Radish plant” as a raw material.
  • the term "food” refers to a substance or composition in a form suitable for human consumption.
  • the food of the present invention may be a plant itself as a vegetable, or may be a dish using vegetables. Alternatively, for example, a liquid (beverage), powder, granules, or the like obtained by processing the plant may be used. Alternatively, it may be a beverage containing glucoraphanin extracted and purified from the plant, or a nutritional supplement (supplement) such as powder, granules, tablets, capsules, or the like.
  • a method for increasing the glucoraphanin content of a cruciferous plant of the present invention comprises: In the first step of preparing a cruciferous plant containing 5 mg/100 gFW or more of glucoraphanin, the second parent plant is a genus different from the first parent plant in which the function of glucorafasatin synthase is lost or reduced. A second step of preparing a cruciferous plant, and a third step of crossing the first parent plant and the second parent plant.
  • the first step is to prepare a cruciferous plant containing 5 mg/100 gFW or more, preferably 10 mg/100 FW or more, of glucoraphanin as a first parent plant.
  • the "first parent plant” is not particularly limited as long as it is a cruciferous plant classified into a different genus from the second parent plant, but is preferably a plant of the genus Brassica, particularly kale, broccoli, Plants containing a relatively large amount of glucoraphanin, such as cabbage, kohlrabi, and cauliflower, are preferred.
  • Preferred is Brassica oleracea.
  • a method for producing a plant containing 5 mg/100 g FW or more of glucoraphanin is not particularly limited, but may be, for example, the method described in Patent Document 1. Alternatively, for example, the following method can be taken.
  • For Brassica plants many progeny lines are produced by allogamous crossing. Among the obtained progeny lines, one strain or multiple strains containing a high concentration of glucoraphanin are selected, and self-breeding or outbreeding is performed. A line of high content Brassica plants is obtained.
  • the second step is to prepare, as a second parent plant, a cruciferous plant of a genus different from that of the first parent plant, in which the function of glucorafasatin synthase is deficient or reduced.
  • the "second parent plant” is not particularly limited as long as it is a plant of the Brassicaceae family classified into a genus different from that of the first parent plant, but is preferably a plant of the genus Radish. Preferably, it is Rafanus sativus.
  • the second parent plant is a plant in which the function of glucorafasatin synthase (GRS1) is deficient or reduced. More specifically, it is a plant containing a function-deficient glucorafasatin synthase (grs1) gene.
  • the grs1 gene may be contained as a homozygous form or as a heterozygous form.
  • the method described in Patent Document 4 can be used. Specifically, a PCR method using a DNA extracted from a sample plant as a template and a primer set that specifically amplifies the GRS1 gene and a primer set that specifically amplifies the grs1 gene can be used.
  • the second parent plant containing the grs1 gene may be used by selecting a mutant from a large number of progeny lines produced by allogamous crossing by the above method, but modifying the wild-type GRS1 gene and using it. Those with missing or reduced functions may be used. Any known technique can be used as a technique for modifying the GRS1 gene. For example, mutagenesis accompanied by insertion sequence introduction via transposons, retrotransposons, plant viruses, and the like can be mentioned. In addition, mutagenesis treatments such as radiation irradiation treatment, heavy ion beam treatment, and treatment with a solution containing a mutagen can also be mentioned.
  • the third step of the method for increasing the content of the present invention is the step of crossing the first parent plant and the second parent plant.
  • Crossbreeding is not particularly limited, and crossbreeding techniques commonly used in breeding and the like can be used.
  • plants obtained by crossing may be further subjected to self-breeding over several generations, backcrossing over several generations, or repeating self-breeding and backcrossing as appropriate.
  • the method for increasing the content of the present invention can increase the content of glucoraphanin from cruciferous plants by including the above steps.
  • the cruciferous plant obtained through the high content method of the present invention preferably contains 20 mg/100 g FW or more, 30 mg/100 g FW or more, 50 mg/100 g FW or more, 100 mg/100 g FW or more, or 150 mg/100 g FW or more of glucoraphanin. contains.
  • Example 1 Production of an intergeneric hybrid plant (Rafano brassica) An intergeneric hybrid plant between a radish plant and a cruciferous plant was produced by the following procedure. As a cruciferous plant, a kale line "KK-45" containing glucoraphanin was used. As a plant belonging to the radish genus, a commercially available radish variety "Nishimachi ideal" was used. In Nishimachi ideal, it is known that individuals having a heterozygous GRS1 gene of functional type and non-functional type coexist within the cultivar (see Patent Document 4).
  • Nishimachi's ideal DNA marker test was carried out in advance, hetero-bearing individuals (hereinafter also referred to as "AKO") were selected at the seedling stage, and 4 strains (AKO103, AKO108, AKO110 and AKO118) were used as seed parents for crossbreeding. .
  • the cultivars, lines and intergeneric hybrids produced are shown in Table 1.
  • Nishimachi's ideal DNA marker test and DNA marker test of each hybrid progeny were carried out according to the following procedure.
  • DNA was extracted from leaves of Nishimachi ideal, and a PCR reaction was performed using a primer set consisting of three primers shown in Table 2.
  • a "deficient" gene was determined to be present when a 392 bp DNA amplification was observed, and a "functional” gene was determined to be present when a 222 bp DNA amplification was observed.
  • Example 2 Measurement of various glucosinolate contents in leaves Samples used for analysis of glucosinolate contents were prepared by the following procedure. Three true leaves with a leaf length of 20 cm were collected from the field. A 10 cm tip of the leaf blade was taken from each leaf and the vein running down the middle of the leaf was removed. It was freeze-dried (freeze dryer manufactured by LABCONCO) for 4 to 5 days, and the dried sample was crushed (multi-bead shocker manufactured by Yasui Kikai Co., Ltd.). 0.1 g of dry powder was precisely weighed, 5 mL of 80% methanol was added, and the mixture was shaken and stirred at room temperature for 30 minutes.
  • the supernatant after centrifugation at 3000 rpm for 10 minutes was used as the glucosinolate extract.
  • the glucosinolate extract was adsorbed onto a DEAE Sepharose column and desulfurized with acid sulfatase (25°C for 18 hours).
  • the desulfurized glucosinolate was eluted with deionized water to obtain a desulfo-glucosinolate solution.
  • the desulfo-glucosinolate solution was subjected to HPLC under the following conditions, and a chromatogram was obtained at a UV detection wavelength of 229 nm.
  • the average glucoraphanin content of the population carrying the loss-of-function type was higher than that of the population carrying the functional type.
  • the ratio of deficient/functional glucoraphanin content ranged from 1.97-2.56 fold.
  • Deficient individuals contained no or very little glucoraphenin and glucorafasatin.
  • Example 3 Measurement of glucosinolate content in roots, buds and stems Roots, buds and stems samples for analysis of glucosinolate content were prepared by the following procedure. From the field, 10 individual strains of each species were dug up from the roots and washed with water. Roots were cut into 0.5-1 cm thick slices across a position approximately 5 cm below the stem-hypocotyl junction. As for the buds, apical flower buds were collected from 10 individual strains of each type that were bolted. Stems about 10 cm below the boundary with the buds were collected from each of the 10 individual strains that were bolted. Each sample was lyophilized for 4-5 days and the dried sample was crushed. Thereafter, extraction, desulfurization and HPLC measurement were performed in the same procedure as in Example 2. Table 4 shows the measurement results of each glucosinolate in various samples.
  • Example 4 Correlation of glucoraphanin content in seeds and leaves of cruciferous vegetables
  • Samples of seeds and leaves of cruciferous vegetables used for analysis of glucoraphanin content were prepared by the following procedure.
  • cruciferous vegetables KK-45 and commercially available kale varieties, a total of 68 strains, were used. From the house, three true leaves with a leaf length of 20 cm were collected for each strain of each strain. A 10 cm tip of the leaf blade was taken from each leaf and the vein running down the middle of the leaf was removed. Seeds were collected from the same strain from which the leaves were collected, and 0.5 g of seeds were used per strain. Each sample was lyophilized for 4-5 days and the dried sample was crushed.
  • FIG. 3 shows the correlation of HPLC peak areas (contents) of glucoraphanin in samples derived from leaves and seeds of each individual.
  • the present invention is an invention that can be used in agriculture, the food manufacturing industry, the pharmaceutical manufacturing industry, and the like. All publications, patents and patent applications cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

グルコラファニン含有量の高いアブラナ科植物を得る。　異なる属に分類されるアブラナ科植物である、第１の親植物と第２の親植物とを交雑して属間雑種植物を得る。前記第１の親植物は、グルコラファニンを５ｍｇ／１００ｇ（新鮮重量）以上含む。前記第２の親植物は、機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子を含む。

Description

グルコラファニンを高含有するアブラナ科属間雑種植物及びその作出方法
　本発明は、グルコラファニンを高含有するアブラナ科属間雑種植物及びその作出方法に関する。
　イソチオシアネートの一種であるスルフォラファンは、アブラナ科の植物、特に、アブラナ属オレラセア種（ブラシカ・オレラセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ　Ｏｌｅｒａｃｅａ））に含まれるフィトケミカルの一種である。スルフォラファンは、ヒト体内の解毒酵素の生成を活性化することによるガン予防効果の他、肝機能向上効果、抗酸化効果等の生理活性を有することが知られる、機能性成分である（例えば、非特許文献１を参照のこと）。
　通常、植物細胞内では、スルフォラファンは、前駆体であるグルコラファニンの状態で存在する。グルコラファニンは、カラシ油配糖体とも呼ばれる二次代謝物グルコシノレートの一種である。細胞中のグルコラファニンが、咀嚼などによって細胞外に露出し、植物体内に内在する酵素ミロシナーゼと反応したり、腸内細菌に分解されたりすることでスルフォラファンに変化する。
　特許文献１には、野生型ブラシカ種とブラシカ・オレラセア育種系統とを交雑し、元の育種系統よりも多くの４－メチルスルフィニルブチルグルコシノレート（グルコラファニン）量を有する雑種を選択する、グルコラファニン高含有のブラシカ種を得る方法が開示されている。特許文献２には、ブラシカ・ビロサ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｖｉｌｌｏｓａ）からのＭｙｂ２８アレルと、Ｍｙｂアレルに遺伝的に連結したブラシカ・ビロサからのＥＬＯＮＧアレルの欠失を含む、グルコシノレート含有量の高いブラシカ・オレラセア植物が開示されている。
　アブラナ科ダイコン属（Ｒａｐｈａｎｕｓ）には、通常、グルコラファニンは利用可能なレベルでは含まれない。特許文献３には、グルコエルシン含有量が高く、４－メチルチオ－３－ブテニルグルコシノレート（グルコラファサチン）含有量がグルコエルシン含有量の１／５以下である個体を選別して、自殖操作を行うことで、グルコラファニン含有量の高いダイコン系統を作出する方法が開示されている。
　非特許文献２には、アブラナ科ダイコン属のダイコンにアブラナ属のケールを異属間で交雑したラファノブラシカにおいて、高含有量のグルコラファニン及びグルコラフェニンが検出されたことが報告されている。
　通常、ダイコンに含まれるグルコシノレートの９割以上は、グルコラファサチンが占めることが知られる。非特許文献３には、グルコラファサチン合成酵素（ＧＲＳ）遺伝子が同定されたことが報告されている。また、特許文献４には、グルコラファサチンの分解産物に由来するダイコンの独特の臭いや黄変を低減するために、機能欠損型ＧＲＳ遺伝子を有するダイコン個体を交配して、グルコラファサチンの含有量の低いダイコン系統を得る方法が開示されている。
特表２００２－５１１２３５号公報 特開２０１４－７６０４５号公報 特開２０１２－１１０２３８号公報 特開２０１６－８６７６１号公報
Zhang, Y. et al., P. Proc. Natl. Acad. Sci., Vol.91, pp. 3147-3150 (1994) 長野県農業関係試験場ホームページ研究情報、研究成果「技術情報」［成果名］ラファノブラシカ「長・野４８号」は機能性成分を多く含む新たな野菜として有望である（URL https://www.agries-nagano.jp/wp/wp-content/uploads/2019/04/2018-2-g10.pdf） Kakizaki, T. et. al., Plant Physiology, Vol. 173, pp. 1583-1593 (2017)
　本発明は、グルコラファニン含有量の高いアブラナ科植物を得ることを目的とする。
　上述した目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、アブラナ属植物と、機能欠損型ＧＲＳ遺伝子を有するダイコン属植物とを交雑して得られた属間雑種で、グルコラファニン含有量が高くなることを見いだし、本発明を完成するに至った。
　本発明は以下を包含する。
（１）アブラナ属植物及びダイコン属植物の属間雑種植物であって、グルコラフェニン含有量に対するグルコラファニン含有量の比が１．０以上である、植物。
（２）グルコラファニン含有量が２０ｍｇ／１００ｇ（新鮮重量）以上である、（１）に記載の植物。
（３）グルコラフェニン含有量が、５０ｍｇ／１００ｇ（新鮮重量）以下である、（１）又は（２）に記載の植物。
（４）アブラナ属植物及びダイコン属植物の属間雑種植物であって、機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子を含む植物。
（５）機能欠損型グルコラファサチン合成遺伝子が、下記（ａ）及び／又は（ｂ）の遺伝子である、（４）に記載の植物：
　（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を構成するエクソン内に、コードタンパク質における２オキソグルタル酸－鉄（ＩＩ）依存性オキシゲナーゼドメインの全部又は一部の欠失を伴う、遺伝子；
　（ｂ）配列番号２若しくは３に記載の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含む遺伝子。
（６）前記アブラナ属植物がブラシカ・オレラセアである、（１）～（５）のいずれかに記載の植物。
（７）前記ダイコン属植物がラファナス・サティバスである、（１）～（６）のいずれかに記載の植物。
（８）倍数化された染色体を有する、（１）～（７）のいずれかに記載の植物。
（９）アブラナ科の属間雑種植物を作出する方法であって、第１の親植物と第２の親植物とを交雑する工程と、前記第１の親植物と前記第２の親植物の属間雑種植物を取得する工程と、を含み、前記第１の親植物と前記第２の親植物とは、アブラナ科植物であり、かつ、異なる属であり、前記第１の親植物は、グルコラファニンを５ｍｇ／１００ｇ（新鮮重量）以上含み、前記第２の親植物は、機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子を含む、方法。
（１０）機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子が、下記（ａ）及び／又は（ｂ）の遺伝子である、（９）に記載の方法：
　（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を構成するエクソン内に、コードタンパク質における２オキソグルタル酸－鉄（II）依存性オキシゲナーゼドメインの全部又は一部の欠失を伴う、遺伝子；
　（ｂ）配列番号２若しくは３に記載の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含む遺伝子。
（１１）前記属間雑種植物のうち、機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子を含む属間雑種植物を選別する工程、をさらに含む、（９）又は（１０）に記載の方法。
（１２）前記第１の親植物がアブラナ属植物であり、前記第２の親植物がダイコン属植物である、（９）～（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）前記アブラナ属植物がブラシカ・オレラセアである、（９）～（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）前記ダイコン属植物がラファナス・サティバスである、（９）～（１３）のいずれかに記載の方法。
（１５）前記属間雑種植物が、倍数化された染色体を含む、（９）～（１４）のいずれかに記載の方法。
（１６）（１）～（７）のいずれかに記載の植物を栽培する工程、を含む、アブラナ科植物を生産する方法。
（１７）（１）～（７）のいずれかに記載の植物を原材料とする、食品。
（１８）アブラナ科植物のグルコラファニンを高含有させる方法であって、第１の親植物としてグルコラファニンを５ｍｇ／１００ｇ（新鮮重量）以上含有するアブラナ科植物を準備する第１工程、第２の親植物として、グルコラファサチン合成酵素の機能が欠損又は低下した、第１の親植物とは異なる属のアブラナ科植物を準備する第２工程、及び前記第１の親植物と前記第２の親植物とを交雑する第３工程、を含む、方法。
（１９）前記第２工程が、グルコラファサチン合成酵素遺伝子を改変して、グルコラファサチン合成酵素の機能を欠損又は低下させることを含む、（１８）に記載の方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2021-063196号の開示内容を包含する。
　本発明によると、よりグルコラファニン含有量の高いアブラナ科植物を得ることができる。
アブラナ科植物におけるグルコラファニン及びグルコラフェニンの生合成経路を示す概略図である。 野生型ＧＲＳ１遺伝子の構造と、配列番号２及び配列番号３に示される塩基配列におけるレトロトランスポゾンの挿入位置を示す概略図である。（Ａ）は、野生型ＧＲＳ１遺伝子の構造を示す。（Ｂ）は、配列番号２に示される塩基配列の構造を示す。（Ｃ）は、配列番号３に示される塩基配列の構造を示す。 アブラナ科植物における、各個体の葉と種子のグルコラファニン含有量の相関を示すグラフである。
　本明細書において、記載される化学式は、特に記載のない限り、あらゆる幾何学異性体及び光学的異性体を含むものとする。本明細書において「含有量」とは、特に記載のない限り、重量濃度（ｗ／ｗ）を指すものとする。本明細書において、「誘導体」とは、化合物の骨格構造には影響を与えない程度に改変された化合物を指す。
１．アブラナ属植物及びダイコン属植物の属間雑種植物
　本発明のアブラナ属植物及びダイコン属植物の属間雑種植物（以下、「本発明の植物」とも称する）の第１の実施形態は、グルコラフェニン含有量に対するグルコラファニン含有量の比が１．０以上である、ことを特徴とする。本発明の植物の第２の実施形態は、機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子を含む、ことを特徴とする。本発明の植物は、第１及び第２の実施形態の特徴を単独で備えていてもよく、両方備えていてもよい。
　本明細書において、単に「植物」と称する場合、特に部位の特定等がない限り、また、特に矛盾のない限り、葉、茎、花、蕾、根及び種子のいずれの部位をも包含するものとする。本発明の植物は、少なくとも葉、茎、花、蕾、根及び種子のいずれかの部位において、上記の特徴を有する。
　本明細書において、「グルコラファニン」とは、下記式（Ｉ）で示される化合物、その誘導体又は塩を指す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　本明細書において、「グルコラフェニン」とは、下記式（ＩＩ）で示される化合物、その誘導体又は塩を指す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　グルコラファニン及びグルコラフェニンは、アブラナ科植物において、図１に示す生合成経路で生合成されることが明らかにされている。すなわち、メチオニンを開始物質として、約２０種類の酵素反応により、グルコエルシンが合成される。グルコエルシンが酸化されてグルコラファニンが合成される。一部のアブラナ科植物においては、グルコエルシンはグルコラファサチン合成酵素（ＧＲＳ１）遺伝子によってグルコラファサチンに変換され、グルコラファサチンが酸化されてグルコラフェニンが合成される。グルコラファサチンは、加水分解酵素ミロシナーゼの働きにより辛み成分ラファサチンに変換された後、臭み成分や黄変物質へと変換される。
　本明細書において、「アブラナ科植物」は、被子植物門、双子葉植物網、ビワモドキ亜綱、フウチョウソウ目の１つの科に分類されるであり、タケツケバナ属、ヤマハタザオ属、アブラナ属、イヌガラシ属、ダイコン属、ヤマガラシ属等多くの属の植物を含む。
　本明細書において、「アブラナ属植物」は、アブラナ科の１つの属に分類される植物であり、アブラナ、ミズナ、タイサイ、チンゲンサイ、コマツナ、カブ、ハクサイ、キャベツ、ブロッコリー、ハボタン、セイヨウカラシ、ケール、コールラビ、カリフラワー等を含む。本発明の植物の親植物として使用するアブラナ属植物は、ケール、ブロッコリー、キャベツ、コールラビ、カリフラワー等の比較的多量のグルコラファニンを含む植物とすることが好ましい。好ましくは、アブラナ属植物は、ブラシカ・オレラセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ　Ｏｌｅｒａｃｅａ）である。特に、グルコラファニンを５ｍｇ／１００ｇ（新鮮重量（ＦＷ））以上、又は１０ｍｇ／１００ｇＦＷ以上含むものとすることが好ましい。このようなグルコラファニンを高含有するブラシカ・オレラセアは、例えば、特許文献１に記載される方法で取得してもよい。
　本明細書において、「ダイコン属植物」は、アブラナ科の１つの属に分類される植物であり、ダイコン、ハマダイコン等を含む。本発明の植物の親植物として使用するダイコン属植物は、好ましくは、ラファナス・サティバス（Ｒａｐｈａｎｕｓ　ｓａｔｉｖｕｓ）である。
　ダイコン属植物、特にダイコンは、同じアブラナ科近縁種では合成されないグルコラファサチンを含む、という特徴を有する。ダイコンからは、グルコエルシンをグルコラファサチンに変換するグルコラファサチン合成酵素の遺伝子が同定されており、この特徴的な遺伝子により、グルコラファサチンが合成されることが明らかとなった。
　ダイコンには、特許文献４等に記載される通り、一部にグルコラファサチン含有量の低い突然変異体が存在する。該突然変異体においては、ダイコンの第１連鎖群末端に存在するグルコラファサチン合成酵素遺伝子の構造が野生型から変化しており、その機能が失われていることが知られる。正常なグルコラファサチン合成酵素遺伝子型は優性であることから、ＧＲＳ１（Ｇｌｕｃｏｒａｐｈａｓａｔｉｎ　Ｓｙｎｔｈａｓｅ　１）遺伝子と名付けられ、機能を失った劣性遺伝子型は、ｇｒｓ１遺伝子と名付けられた。ＧＲＳ１遺伝子がコードするアミノ酸配列は、普遍的に植物に存在する酸素添加酵素である２オキソグルタル酸－鉄（ＩＩ）依存性オキシゲナーゼドメインを有する。
　本発明で使用されるダイコン属植物は、機能欠損型グルコラファサチン合成酵素（ｇｒｓ１）遺伝子を含むダイコン属植物であることが好ましい。ダイコン属植物に含まれるｇｒｓ１は、ホモ型として含まれていてもよく、ヘテロ型として含まれていてもよい。機能欠損型グルコラファサチン合成酵素（ｇｒｓ１）遺伝子を含むダイコン属植物は、例えば、特許文献４に記載されるＤＮＡマーカー検定の手法を用いて選別することができる。具体的には、サンプルの植物から抽出したＤＮＡを鋳型として、ＧＲＳ１遺伝子を特異的に増幅するプライマーセット及びｇｒｓ１遺伝子を特異的に増幅するプライマーセットを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を使用することができる。
　ｇｒｓ１遺伝子を含むダイコン属植物は、他殖交配により作出した多数の後代系統から、突然変異体を上記手法により選別して使用してもよいが、野生型のダイコン属植物のＧＲＳ１遺伝子を改変してその機能を欠損又は低下させたものを使用してもよい。ＧＲＳ１遺伝子を改変する手法としては、公知の手法をいずれも使用することができる。例えば、トランスポゾン、レトロトランスポゾン、植物ウイルス等を介した挿入配列導入を伴う変異導入を挙げることができる。また、種子に対する放射線照射処理、重イオンビーム処理、変異源物質を含む溶液での処理等の突然変異処理を挙げることができる。
　本明細書において、「属間雑種植物」とは、異なる属に分類される生物の間で交雑されて形成された雑種、すなわち交雑後代を指す。同じ属内の異種生物間の雑種である種間雑種とは明確に区別される。
　本発明の植物は、アブラナ属植物とダイコン属植物の交雑によって作出された交雑後代である。本発明の植物の第１の実施形態は、グルコラフェニン含有量に対するグルコラファニン含有量の比が１．０以上である。本実施形態において、本発明の植物に含まれるグルコラファニンの量は、２０ｍｇ／１００ｇＦＷ以上、特に３０ｍｇ／１００ｇＦＷ以上、５０ｍｇ／１００ｇＦＷ以上、１００ｍｇ／１００ｇＦＷ以上、又は１５０ｍｇ／１００ＦＷ以上であることが好ましい。また、本発明の植物に含まれるグルコラフェニンの量は、５０ｍｇ／１００ｇＦＷ以下、特に２０ｍｇ／１００ｇＦＷ以下、１０ｍｇ／１００ｇＦＷ以下、５ｍｇ／１００ｇＦＷ以下、３ｍｇ／１００ｇＦＷ以下、又は２ｍｇ／１００ｇＦＷ以下であることが好ましい。
　本発明の植物の第２の実施形態は、機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子を含む。本実施形態において、本発明の植物は、機能欠損型グルコラファサチン合成遺伝子ｇｒｓ１遺伝子をホモ型又はヘテロ型で保有するダイコン属植物を親植物として使用することで作出される。なお、ｇｒｓ１遺伝子をヘテロ型で保有するダイコン属植物を使用する場合、属間雑種植物のうち半分が機能欠損型となることから、機能欠損型を選別して後代を得ることで本発明の植物を得ることができる。機能欠損型の植物を選別する手法としては、例えば特許文献４に記載のＤＮＡマーカー検定の手法を使用することができる。具体的には、サンプルの植物から抽出したＤＮＡを鋳型として、ＧＲＳ１遺伝子を特異的に増幅するプライマーセット及びｇｒｓ１遺伝子を特異的に増幅するプライマーセットを用いたＰＣＲ法を使用することができる。
　本実施形態において、前記ｇｒｓ１遺伝子は、ＧＲＳ１の機能が欠損される構造であれば特にその構造は限定されないが、下記（ａ）及び／又は（ｂ）の塩基配列を含むことが好ましい。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を構成するエクソン内に、コードタンパク質における２オキソグルタル酸－鉄（ＩＩ）依存性オキシゲナーゼドメインの全部又は一部の欠失を伴う塩基配列；
（ｂ）配列番号２若しくは３に記載の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列。
　ｇｒｓ１遺伝子は、配列番号１に記載のアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を構成するエクソン内に、コードタンパク質における２オキソグルタル酸－鉄（ＩＩ）依存性オキシゲナーゼドメインの全部又は一部の欠失を伴う塩基配列を含むことが好ましい。及び／あるいは、配列番号２若しくは３に記載の塩基配列と７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上又は９５％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むことが好ましい。
　配列番号２及び３に示される塩基配列は、ｇｒｓ１遺伝子の塩基配列の例を示す。具体的には、配列番号２及び３に示される塩基配列は、どちらもＧＲＳ１遺伝子のエクソン配列にレトロトランスポゾンが挿入された構造を有する。図２に、野生型ＧＲＳ１遺伝子の構造と、配列番号２及び配列番号３に示される塩基配列におけるレトロトランスポゾンの挿入位置を示す。図２（Ａ）は、野生型ＧＲＳ１遺伝子の構造を示す。ＧＲＳ１遺伝子は３つのエクソン（第１エクソン、第２エクソン及び第３エクソン）と、２つのイントロン（第１イントロン及び第２イントロン）を有する。図２（Ｂ）は、配列番号２に示される塩基配列の構造を示す。この配列では、ＧＲＳ１遺伝子の第１エクソンに約９ｋｂｐのレトロトランスポゾンが挿入されている。図２（Ｃ）は、配列番号３に示される塩基配列の構造を示す。この配列では、ＧＲＳ１遺伝子の第３エクソンに約１．２ｋｂｐのレトロトランスポゾンが挿入されている。
　本発明の植物は、機能欠損型のグルコラファサチン合成酵素遺伝子を含むことにより、高濃度のグルコラファニンを含有することが可能である。機能欠損型のグルコラファサチン合成酵素遺伝子をホモ型で含むダイコン属植物（特にダイコン）では、グルコエルシンからグルコラファサチンへの変換が阻害されることで、グルコエルシンが蓄積していると推察される。ダイコンの葉には、グルコエルシンを効率よくグルコラファニンに変換する機能は認められていないが、アブラナ属植物（特にブラシカ・オレラセア）は、グルコエルシンからグルコラファニンを生合成する機能を有する。本発明の属間雑種植物は、アブラナ属植物由来のグルコエルシンからグルコラファニンへの変換能を保持しつつ、グルコエルシンからグルコラファサチンへの変換が抑制されることで、グルコエルシンからグルコラファニンへの変換が促進され、高濃度のグルコファニンを含有することができたものといえる。
　本発明の植物は、二倍体であってもよいが、例えば、三倍体又は四倍体の異質倍数体であってもよい。このような異質倍数体とすることで、稔性を回復又は向上させることができる。このような、異質倍数体は、公知のいずれの方法で作出してもよく、例えば、コルヒチン処理により作出することができる（例えば、張ら，育種学研究，Vol. 3, pp. 31-41 (2001)、小笠原ら，園学研，Vol. 11, No. 2, pp. 189-194 (2012)等を参照のこと）。
　本発明の植物は、食品又は飼料の材料として使用することができる。食品としては、通常の野菜としての使用の他、例えば、液体（飲料）、粉末、顆粒等とすることができる。あるいは、グルコラファニンを抽出・精製するための材料として使用することができる。精製されたグルコラファニンは、例えば、栄養補助食品（サプリメント）、医薬品等に使用することができる。
２．アブラナ科の属間雑種植物を作出する方法
　本発明のアブラナ科の属間雑種植物を作出する方法（以下、「本発明の作出方法」とも称する）は、第１の親植物と第２の親植物とを交雑する工程と、前記第１の親植物と前記第２の親植物の属間雑種植物を取得する工程と、を含み、前記第１の親植物と前記第２の親植物とは、アブラナ科植物であり、かつ、異なる属であり、前記第１の親植物は、グルコラファニンを５ｍｇ／１００ｇＦＷ以上含み、前記第２の親植物は、機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子を含む、ことを特徴とする。
　本発明の作出方法において、「第１の親植物」は、グルコラファニンを５ｍｇ／１００ｇＦＷ以上、好ましくは１０ｍｇ／１００ｇＦＷ以上含む、第２の親植物と異なる属に分類されるアブラナ科の植物である。第２の親植物と異なる属に分類されるアブラナ科植物であれば特に限定されないが、アブラナ属植物であることが好ましく、特に、ケール、ブロッコリー、キャベツ、コールラビ、カリフラワー等の比較的多量のグルコラファニンを含む植物とすることが好ましい。好ましくは、ブラシカ・オレラセアである。このようなグルコラファニンを高含有するブラシカ・オレラセアは、例えば、特許文献１に記載される方法で取得してもよい。
　本発明の作出方法において、「第２の親植物」は、機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子を含む、第１の親植物と異なる属に分類されるアブラナ科植物である。第１の親植物と異なる属に分類されるアブラナ科植物であれば特に限定されないが、ダイコン属植物であることが好ましい。好ましくは、ラファナス・サティバスである。
　前記第２の親植物において、機能欠損型グルコラファサチン合成酵素（ｇｒｓ１）遺伝子は、ホモ型として含まれていてもよく、ヘテロ型として含まれていてもよい。ｇｒｓ１遺伝子を含む第２の親植物を選別する手法としては、例えば、特許文献４に記載の手法を用いることができる。具体的には、サンプルの植物から抽出したＤＮＡを鋳型として、ＧＲＳ１遺伝子を特異的に増幅するプライマーセット及びｇｒｓ１遺伝子を特異的に増幅するプライマーセットを用いたＰＣＲ法を使用することができる。
　ｇｒｓ１遺伝子を含む第２の親植物は、他殖交配により作出した多数の後代系統から、突然変異体を上記手法により選別して使用してもよいが、野生型のＧＲＳ１遺伝子を改変してその機能を欠損又は低下させたものを使用してもよい。ＧＲＳ１遺伝子を改変する手法としては、公知の手法をいずれも使用することができる。例えば、トランスポゾン、レトロトランスポゾン、植物ウイルス等を介した挿入配列導入を伴う変異導入を挙げることができる。また、種子に対する放射線照射処理、重イオンビーム処理、変異源物質を含む溶液での処理等の突然変異処理を挙げることができる。
　前記第２の親植物に含まれる、前記ｇｒｓ１遺伝子は、ＧＲＳ１の機能が欠損される構造であれば特にその構造は限定されないが、下記（ａ）及び／又は（ｂ）の塩基配列を含むことが好ましい。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を構成するエクソン内に、コードタンパク質における２オキソグルタル酸－鉄（ＩＩ）依存性オキシゲナーゼドメインの全部又は一部の欠失を伴う塩基配列；
（ｂ）配列番号２若しくは３に記載の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列。
　ｇｒｓ１遺伝子は、配列番号１に記載のアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を構成するエクソン内に、コードタンパク質における２オキソグルタル酸－鉄（ＩＩ）依存性オキシゲナーゼドメインの全部又は一部の欠失を伴う塩基配列を含むことが好ましい。及び／あるいは、配列番号２若しくは３に記載の塩基配列と７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上又は９５％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むことが好ましい。
　第２の親植物として、ｇｒｓ１遺伝子をヘテロ型で保有する植物を使用する場合、属間雑種植物のうち半分が機能欠損型となる。この場合、本発明の作出方法は、機能欠損型の植物を選別する工程を含むことが好ましい。機能欠損型の植物を選別する手法としては、例えば、特許文献４に記載の手法を用いることができる。具体的には、サンプルの植物から抽出したＤＮＡを鋳型として、ＧＲＳ１遺伝子を特異的に増幅するプライマーセット及びｇｒｓ１遺伝子を特異的に増幅するプライマーセットを用いたＰＣＲ法を使用することができる。
　本発明の作出方法においては、第１の親植物と第２の親植物とは異なる属に分類され、交雑により属間雑種植物が得られる。ここで、交雑は、特に限定されず、品種改良などにおいて通常用いられている交雑技術を使用することができる。また、交雑により得られた植物については、さらに数世代に亘って自殖交配を行ったり、数世代に亘って戻し交配を行ったり、自殖交配と戻し交配を適宜繰り返したりしてもよい。
　本発明の作出方法は、二倍体を作出する方法であってもよいが、三倍体又は四倍体の異質倍数体を作出する方法としてもよい。
　本発明の作出方法に使用される親植物等の詳細な条件、作出された植物の詳細な性状等は、本項に特に記載のない限り、また、特に矛盾のない限り、「１．アブラナ属植物及びダイコン属植物の属間雑種植物」の項に記載した条件、性状等と同様である。
３．アブラナ科植物を生産する方法
　本発明のアブラナ科植物を生産する方法（以下、「本発明の生産方法」とも称する）は、「１．アブラナ属植物及びダイコン属植物の属間雑種植物」の項に記載した、本発明の植物を栽培する工程を含む、ことを特徴とする。本発明の生産方法によれば、グルコラファニンを高含有する植物を取得することが可能である。
　本発明の生産方法で生産される植物は、アブラナ属植物とダイコン属植物との属間雑種植物である。好ましくは、本発明の生産方法で生産される植物は、食用植物又は飼料用植物であり、より好ましくは食用の野菜である。好ましくは、本発明の生産方法で生産される植物は、ブラシカ・オレラセアとラファナス・サティバスの雑種、すなわちラファノブラシカである。上記の好適な形態によると、ヒト又は動物（例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、サル、フェレット等の哺乳動物、ニワトリ等の鳥類）が多量のラファノブラシカを摂取可能な植物を取得することが可能である。
　本発明の生産方法で栽培される植物は、アブラナ属植物とダイコン属植物とを交雑させて得られたＦ１世代の属間雑種植物であってもよいが、Ｆ１世代を自殖して得られたＦ２世代であってもよく、さらにＦ２世代以降に自殖を繰り返して得られた属間雑種植物であってもよい。あるいは、Ｆ２世代以降に戻し交配を行って得られた属間雑種植物であってもよい。
４．食品
　本発明の食品は、「１．アブラナ属植物及びダイコン属植物の属間雑種植物」の項に記載した、本発明の植物を原材料とする、ことを特徴とする。本明細書において「食品」とは、ヒトに摂取させるのに適した形態の物質又は組成物を指す。本発明の食品は、野菜としての植物そのものであってもよく、野菜を使用した料理であってもよい。また、例えば、前記植物を加工した液体（飲料）、粉末、顆粒等であってもよい。あるいは、前記植物から抽出・精製されたグルコラファニンを含む飲料、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤等の栄養補助食品（サプリメント）等であってもよい。
５．アブラナ科植物のグルコラファニンを高含有させる方法
　本発明のアブラナ科植物のグルコラファニンを高含有させる方法（以下、「本発明の高含有化方法」とも称する）は、第１の親植物としてグルコラファニンを５ｍｇ／１００ｇＦＷ以上含有するアブラナ科植物を準備する第１工程、第２の親植物として、グルコラファサチン合成酵素の機能が欠損又は低下した、第１の親植物とは異なる属のアブラナ科植物を準備する第２工程、及び前記第１の親植物と前記第２の親植物とを交雑する第３工程、を含む、ことを特徴とする。
　本発明の高含有化方法において、第１工程は、第１の親植物としてグルコラファニンを５ｍｇ／１００ｇＦＷ以上、好ましくは１０ｍｇ／１００ＦＷ以上含有するアブラナ科植物を準備する工程である。ここで、「第１の親植物」は、第２の親植物と異なる属に分類されるアブラナ科植物であれば特に限定されないが、アブラナ属植物であることが好ましく、特に、ケール、ブロッコリー、キャベツ、コールラビ、カリフラワー等の比較的多量のグルコラファニンを含む植物とすることが好ましい。好ましくは、ブラシカ・オレラセアである。
　グルコラファニンを５ｍｇ／１００ｇＦＷ以上含む植物を作出する手法は、特に限定されないが、例えば、特許文献１に記載される手法としてもよい。あるいは、例えば、以下の手法をとり得る。アブラナ属植物について、他殖交配によって多数の後代系統を作出する。得られた後代系統のうち、高濃度のグルコラファニンを含有するものを１株または複数株選別して、自殖交配又は他殖交配を行い、必要に応じて交配を繰り返し、グルコラファニンを高含有するアブラナ属植物の系統を得る。
　本発明の高含有化方法において、第２工程は、第２の親植物として、グルコラファサチン合成酵素の機能が欠損又は低下した、第１の親植物とは異なる属のアブラナ科植物を準備する工程である。ここで、「第２の親植物」は、第１の親植物と異なる属に分類されるアブラナ科植物であれば特に限定されないが、ダイコン属植物であることが好ましい。好ましくは、ラファナス・サティバスである。
　前記第２の親植物は、グルコラファサチン合成酵素（ＧＲＳ１）の機能が欠損又は低下した植物である。より具体的には、機能欠損型グルコラファサチン合成酵素（ｇｒｓ１）遺伝子を含む植物である。ｇｒｓ１遺伝子は、ホモ型として含まれていてもよく、ヘテロ型として含まれていてもよい。ｇｒｓ１遺伝子を含む第２の親植物を選別する手法としては、例えば、特許文献４に記載の手法を用いることができる。具体的には、サンプルの植物から抽出したＤＮＡを鋳型として、ＧＲＳ１遺伝子を特異的に増幅するプライマーセット及びｇｒｓ１遺伝子を特異的に増幅するプライマーセットを用いたＰＣＲ法を使用することができる。
　ｇｒｓ１遺伝子を含む第２の親植物は、他殖交配により作出した多数の後代系統から、突然変異体を上記手法により選別して使用してもよいが、野生型のＧＲＳ１遺伝子を改変してその機能を欠損又は低下させたものを使用してもよい。ＧＲＳ１遺伝子を改変する手法としては、公知の手法をいずれも使用することができる。例えば、トランスポゾン、レトロトランスポゾン、植物ウイルス等を介した挿入配列導入を伴う変異導入を挙げることができる。また、種子に対する放射線照射処理、重イオンビーム処理、変異源物質を含む溶液での処理等の突然変異処理を挙げることができる。
　本発明の高含有化方法の第３工程は、前記第１の親植物と前記第２の親植物とを交雑する工程である。交雑は、特に限定されず、品種改良などにおいて通常用いられている交雑技術を使用することができる。また、交雑により得られた植物については、さらに数世代に亘って自殖交配を行ったり、数世代に亘って戻し交配を行ったり、自殖交配と戻し交配を適宜繰り返したりしてもよい。
　本発明の高含有化方法は、上記の工程を備えることによって、アブラナ科植物のグルコラファニンを高含有させることができる。本発明の高含有化方法を経て得られたアブラナ科植物は、好ましくは、２０ｍｇ／１００ｇＦＷ以上、３０ｍｇ／１００ｇＦＷ以上、５０ｍｇ／１００ｇＦＷ以上、１００ｍｇ／１００ｇＦＷ以上、又は１５０ｍｇ／１００ｇＦＷ以上のグルコラファニンを含有する。
　本発明の高含有化方法に使用される親植物等の詳細な条件、作出された植物の詳細な性状等は、本項に特に記載のない限り、また、特に矛盾のない限り、「１．アブラナ属植物及びダイコン属植物の属間雑種植物」及び「２．アブラナ科植物の作出方法」の項に記載した条件、性状等と同様である。
　以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］属間雑種植物（ラファノブラシカ）の作出
　以下の手順でダイコン属植物とアブラナ科植物との属間雑種植物を作出した。アブラナ科植物として、グルコラファニンを含有するケール系統「ＫＫ－４５」を使用した。ダイコン属植物として、市販のダイコン品種「西町理想」を使用した。西町理想は、ＧＲＳ１遺伝子を機能型、機能欠損型でヘテロ保有する個体が品種内に混在することが知られる（特許文献４参照）。予め西町理想のＤＮＡマーカー検定を行い、ヘテロ保有する個体（以降、「ＡＫＯ」とも称する)を苗段階で選抜し、４株（ＡＫＯ１０３、ＡＫＯ１０８、ＡＫＯ１１０及びＡＫＯ１１８）を種子親として交雑に供試した。使用した各品種、系統及び作出した属間雑種は、表１に示す通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　西町理想のＤＮＡマーカー検定及び各交雑後代のＤＮＡマーカー検定は、以下の手順で実施した。西町理想の葉からＤＮＡを抽出し、表２に示す３つのプライマーからなるプライマーセットを用いてＰＣＲ反応を行った。３９２ｂｐのＤＮＡ増幅が観察された場合に「機能欠損型」遺伝子が、２２２ｂｐのＤＮＡ増幅が観察された場合に「機能型」遺伝子が存在するものと判定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　西町理想において、３９２ｂｐと２２２ｂｐの両方のＤＮＡ増幅が認められた個体を「ヘテロ型」、２２２ｂｐのＤＮＡ増幅のみが認められた個体を「野生型」と判定した。各交雑後代のＤＮＡマーカー検定を以下の手順で実施した。交雑後代において、機能型ＧＲＳ１遺伝子を保有する個体を「機能型」交雑後代、機能欠損型ＧＲＳ１（ｇｒｓ１）遺伝子を保有する個体を「機能欠損型」交雑後代と判定した。
［実施例２］葉に含まれる各種グルコシノレート含有量の測定
　グルコシノレート含有量の分析に用いるサンプルは、以下の手順で調製した。圃場より葉長２０ｃｍの本葉を１株につき３枚採取した。各葉から葉身の先端１０ｃｍを採取し、葉の中央を走る葉脈を取り除いた。４～５日間凍結乾燥（ＬＡＢＣＯＮＣＯ社製　凍結乾燥機）させ、乾燥サンプルを破砕した（安井機械社製　マルチビーズショッカー）。０．１ｇの乾燥粉末を精秤し、８０％メタノールを５ｍＬ添加し、室温で３０分間振とう攪拌した。３０００ｒｐｍで１０分遠心分離した上清をグルコシノレート抽出物とした。ＤＥＡＥセファロースカラムにグルコシノレート抽出物を吸着させ、酸性スルファターゼにより脱硫化した（２５℃　１８時間）。脱硫化したグルコシノレートをイオン交換水で溶出しデスルホ-グルコシノレート溶液とした。デスルホ-グルコシノレート溶液を下記の条件でＨＰＬＣに供し、ＵＶ検出波長２２９ｎｍでクロマトグラムを得た。
　・使用機器：LC-20A, Shimadzu Corp., Japan
　・カラムの種類：COSMOSIL 5C18-II, 150 x 4.6 mm, Nacalai-Tesque Inc., Japan
　・移動相溶媒組成：20%アセトニトリル
　・サンプル注入量：20μl
　・流速：1.5 mL/min
　・カラム温度：30℃
　予め濃度既知の各グルコシノレート標品を同条件でＨＰＬＣに供した結果に基づいて、サンプルにおける各グルコシノレート（グルコラファニン、グルコラフェニン、グルコエルシン、グルコラファサチン）の含有量を算出した。交雑組合せごとの各グルコシノレートの測定結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　全ての交雑組合せ内で、機能欠損型を保有する集団のグルコラファニン含有量の平均が、機能型を保有する集団より高かった。機能欠損型／機能型のグルコラファニン含有量の比は１．９７～２．５６倍の範囲であった。機能欠損型の個体はグルコラフェニンとグルコラファサチンの含有が認められないか又はごく僅かであった。これらの結果から、ラファノブラシカにおいてＧＲＳ１遺伝子の発現を抑えることで、グルコエルシンの多くがグルコラファニンに代謝され、グルコラファニンの含有量が高まることが明らかとなった。
［実施例３］根、蕾及び茎に含まれるグルコシノレート含有量の測定
　以下の手順で、グルコシノレート含有量の分析に用いる、根、蕾及び茎のサンプルを調製した。圃場より各種１０株の個体を根から掘り上げ、水洗いした。根は、茎と胚軸の境から約５ｃｍの下の位置を横断して厚さ０．５－１ｃｍの切片とした。蕾は、抽だいした各種１０株の個体から、頂花蕾を採取した。茎は、抽だいした各種１０株の個体から、蕾との境目から下の約１０ｃｍを採取した。各サンプルを４～５日間凍結乾燥させ、乾燥サンプルを破砕した。以降、実施例２と同様の手順で抽出、脱硫及びＨＰＬＣ測定を行った。各種サンプルにおける各グルコシノレートの測定結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表４に示す通り、機能欠損型の個体において、いずれの部位においても機能型個体と比較してグルコラファニン含有量の平均が高かった。また、機能欠損型個体は、グルコラフェニンとグルコラファサチンの含有が認められないか又はごく僅かであった。これらの結果から、ラファノブラシカのＧＲＳ１遺伝子の発現を抑えることで、その採取部位に限らず、グルコラファニンの含有量が高まることが明らかとなった。
［実施例４］アブラナ科野菜の種子及び葉に含まれるグルコラファニン含有量の相関
　以下の手順で、グルコラファニン含有量の分析に用いる、アブラナ科野菜の種子及び葉のサンプルを調製した。アブラナ科野菜としては、ＫＫ－４５及び市販のケール品種、計６８系統を用いた。ハウスより、各系統１株の個体について、葉長２０ｃｍの本葉を３枚採取した。各葉から葉身の先端１０ｃｍを採取し、葉の中央を走る葉脈を取り除いた。種子は、葉を採取した同株から採取し、１株あたり０．５ｇの種を使用した。各サンプルを４～５日間凍結乾燥させ、乾燥サンプルを破砕した。以降、実施例２と同様の手順で抽出、脱硫及びＨＰＬＣ測定を行った。ＨＰＬＣの測定条件は以下の通りとした。
　・使用機器：LC-20A, Shimadzu Corp., Japan
　・カラムの種類：COSMOSIL 5C18-II, 150 x 4.6 mm, Nacalai-Tesque Inc., Japan
　・移動相溶媒組成：20%アセトニトリル
　・サンプル注入量：20μl
　・流速：1.5 mL/min
　・カラム温度：30℃
　各個体の葉と種子に由来するサンプルのグルコラファニンのＨＰＬＣピーク面積（含有量）の相関を図３に示す。
　図３に示すとおり、アブラナ科野菜の葉と種子に由来するサンプルのグルコラファニンのＨＰＬＣピーク面積には相関がみられ、葉におけるグルコラファニン含有量が高い品種においては、その種子もグルコラファニン含有量が高いことが示された。これらの結果より、アブラナ科の属間雑種植物においても、葉のグルコラファニン含有量の高い個体においては、種子のグルコシノレート含有量も高いことが示唆された。
　本発明は、農業、食品製造業、医薬品製造業等において利用可能な発明である。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (19)

  1. 　アブラナ属植物及びダイコン属植物の属間雑種植物であって、グルコラフェニン含有量に対するグルコラファニン含有量の比が１．０以上である、植物。
  2. 　グルコラファニン含有量が２０ｍｇ／１００ｇ（新鮮重量）以上である、請求項１に記載の植物。
  3. 　グルコラフェニン含有量が、５０ｍｇ／１００ｇ（新鮮重量）以下である、請求項１又は２に記載の植物。
  4. 　アブラナ属植物及びダイコン属植物の属間雑種植物であって、機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子を含む植物。
  5. 　機能欠損型グルコラファサチン合成遺伝子が、下記（ａ）及び／又は（ｂ）の遺伝子である、請求項４に記載の植物：
    （ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を構成するエクソン内に、コードタンパク質における２オキソグルタル酸－鉄（ＩＩ）依存性オキシゲナーゼドメインの全部又は一部の欠失を伴う、遺伝子；
    （ｂ）配列番号２若しくは３に記載の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含む遺伝子。
  6. 　前記アブラナ属植物がブラシカ・オレラセアである、請求項１～５のいずれか一項に記載の植物。
  7. 　前記ダイコン属植物がラファナス・サティバスである、請求項１～６のいずれか一項に記載の植物。
  8. 　倍数化された染色体を有する、請求項１～７のいずれか一項に記載の植物。
  9. 　アブラナ科の属間雑種植物を作出する方法であって、
    　第１の親植物と第２の親植物とを交雑する工程と、
    　前記第１の親植物と前記第２の親植物の属間雑種植物を取得する工程と、を含み
    　前記第１の親植物と前記第２の親植物とは、アブラナ科植物であり、かつ、異なる属であり、
    　前記第１の親植物は、グルコラファニンを５ｍｇ／１００ｇ（新鮮重量）以上含み、
    　前記第２の親植物は、機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子を含む、方法。
  10. 　機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子が、下記（ａ）及び／又は（ｂ）の遺伝子である、請求項９に記載の方法：
    （ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を構成するエクソン内に、コードタンパク質における２オキソグルタル酸－鉄（II）依存性オキシゲナーゼドメインの全部又は一部の欠失を伴う、遺伝子；
    （ｂ）配列番号２若しくは３に記載の塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含む遺伝子。
  11. 　前記属間雑種植物のうち、機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子を含む属間雑種植物を選別する工程、をさらに含む、請求項９又は１０に記載の方法。
  12. 　前記第１の親植物がアブラナ属植物であり、前記第２の親植物がダイコン属植物である、請求項９～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 　前記アブラナ属植物がブラシカ・オレラセアである、請求項９～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 　前記ダイコン属植物がラファナス・サティバスである、請求項９～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 　前記属間雑種植物が、倍数化された染色体を含む、請求項９～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 　請求項１～７のいずれか一項に記載の植物を栽培する工程、を含む、アブラナ科植物を生産する方法。
  17. 　請求項１～７のいずれか一項に記載の植物を原材料とする、食品。
  18. 　アブラナ科植物のグルコラファニンを高含有させる方法であって、
    　第１の親植物としてグルコラファニンを５ｍｇ／１００ｇ（新鮮重量）以上含有するアブラナ科植物を準備する第１工程、
    　第２の親植物として、グルコラファサチン合成酵素の機能が欠損又は低下した、第１の親植物とは異なる属のアブラナ科植物を準備する第２工程、及び
    　前記第１の親植物と前記第２の親植物とを交雑する第３工程、を含む、方法。
  19. 　前記第２工程が、グルコラファサチン合成酵素遺伝子を改変して、グルコラファサチン合成酵素の機能を欠損又は低下させることを含む、請求項１８に記載の方法。
PCT/JP2022/013175 2021-04-01 2022-03-22 グルコラファニンを高含有するアブラナ科属間雑種植物及びその作出方法 WO2022210099A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2023511018A JPWO2022210099A1 (ja) 2021-04-01 2022-03-22
CN202280025948.5A CN117396066A (zh) 2021-04-01 2022-03-22 富含萝卜硫苷的十字花科属间杂种植物及其制作方法
KR1020237035164A KR20230156136A (ko) 2021-04-01 2022-03-22 글루코라파닌을 고함유하는 십자화과속간 잡종 식물 및 그 작출 방법

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021-063196 2021-04-01
JP2021063196 2021-04-01

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022210099A1 true WO2022210099A1 (ja) 2022-10-06

Family

ID=83455290

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2022/013175 WO2022210099A1 (ja) 2021-04-01 2022-03-22 グルコラファニンを高含有するアブラナ科属間雑種植物及びその作出方法

Country Status (4)

Country Link
JP (1) JPWO2022210099A1 (ja)
KR (1) KR20230156136A (ja)
CN (1) CN117396066A (ja)
WO (1) WO2022210099A1 (ja)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006211945A (ja) * 2005-02-03 2006-08-17 Ts Shokubutsu Kenkyusho:Kk 新規なアブラナ科植物及びその育成方法
JP2012110238A (ja) * 2010-11-19 2012-06-14 National Agriculture & Food Research Organization グルコラファニンを高含有するダイコン系統の作出方法
JP2016086761A (ja) * 2014-11-07 2016-05-23 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子及びその利用
JP2020162460A (ja) * 2019-03-28 2020-10-08 カゴメ株式会社 アブラナ属の野菜とダイコン属の野菜との属間雑種の生産方法、並びに、飲食品の製造方法及び飲食品

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6340784B1 (en) 1998-04-09 2002-01-22 Plant Bioscience Limited Method for selective increase of the anticarcinogenic glucosinolates in Brassica sp.
AU2013224677B2 (en) 2012-09-13 2017-05-11 Plant Bioscience Limited Brassica oleracea plants with improved nutritional value

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006211945A (ja) * 2005-02-03 2006-08-17 Ts Shokubutsu Kenkyusho:Kk 新規なアブラナ科植物及びその育成方法
JP2012110238A (ja) * 2010-11-19 2012-06-14 National Agriculture & Food Research Organization グルコラファニンを高含有するダイコン系統の作出方法
JP2016086761A (ja) * 2014-11-07 2016-05-23 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子及びその利用
JP2020162460A (ja) * 2019-03-28 2020-10-08 カゴメ株式会社 アブラナ属の野菜とダイコン属の野菜との属間雑種の生産方法、並びに、飲食品の製造方法及び飲食品

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANONYMOUS: "New leaf vegetables developed in cooperation with Nagano prefecture, Started selling "Kaleish (R)" born from kale and radish.", KAGOME NEWS RELEASE, 1 November 2019 (2019-11-01), XP055972465, Retrieved from the Internet <URL:https://www.kagome.co.jp/library/company/news/2019/img/20191101001.pdf> [retrieved on 20221018] *
ENDO, RYOTA ET AL.: "Development of a breeding method that dramatically improves the glucoraphanin content of intergeneric hybrids with functional deficiency of radish GRS1", IKUSHUGAKU KENKYU - BREEDING RESEARCH, NIHON IKUSHU GAKKAI, TOKYO, JP, vol. 23, no. Separate volume 2, 23 September 2021 (2021-09-23) - 26 September 2021 (2021-09-26), JP , pages 50, XP009539982, ISSN: 1344-7629 *
ISHIDA MASAHIKO; KAKIZAKI TOMOHIRO; MORIMITSU YASUJIRO; OHARA TAKAYOSHI; HATAKEYAMA KATSUNORI; YOSHIAKI HITOSHI; KOHORI JUNNA; NIS: "Novel glucosinolate composition lacking 4-methylthio-3-butenyl glucosinolate in Japanese white radish (Raphanus sativusL.)", THEORETICAL AND APPLIED GENETICS, SPRINGER BERLIN HEIDELBERG, BERLIN/HEIDELBERG, vol. 128, no. 10, 8 July 2015 (2015-07-08), Berlin/Heidelberg, pages 2037 - 2046, XP035547664, ISSN: 0040-5752, DOI: 10.1007/s00122-015-2564-3 *
KAKIZAKI TOMOHIRO, KITASHIBA HIROYASU, ZOU ZHONGWEI, LI FENG, FUKINO NOBUKO, OHARA TAKAYOSHI, NISHIO TAKESHI, ISHIDA MASAHIKO: "A 2-Oxoglutarate-Dependent Dioxygenase Mediates the Biosynthesis of Glucoraphasatin in Radish", PLANT PHYSIOLOGY, AMERICAN SOCIETY OF PLANT PHYSIOLOGISTS, ROCKVILLE, MD, USA, vol. 173, no. 3, 1 March 2017 (2017-03-01), Rockville, Md, USA , pages 1583 - 1593, XP055972462, ISSN: 0032-0889, DOI: 10.1104/pp.16.01814 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN117396066A (zh) 2024-01-12
KR20230156136A (ko) 2023-11-13
JPWO2022210099A1 (ja) 2022-10-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220162630A1 (en) Inbred transgenic canola line ns-b50027-4 and seeds thereof
US20220177903A1 (en) Elite event canola ns-b50027-4
Cartea et al. Basic information on vegetable Brassica crops
US20130347140A1 (en) High Rebaudioside-A Plant and Methods of Producing the Same and Uses Thereof
Tanaka et al. Multiple loss-of-function putative aminotransferase alleles contribute to low pungency and capsinoid biosynthesis in Capsicum chinense
Cvejić et al. Mutation breeding for changed oil quality in sunflower
WO2022210099A1 (ja) グルコラファニンを高含有するアブラナ科属間雑種植物及びその作出方法
Vassilevska-Ivanova et al. Utilization of related wild species (Echinacea purpurea) for genetic enhancement of cultivated sunflower (Helianthus annuus L.)
Yang et al. Multiple loss-of-function 5-O-glucosyltransferase alleles revealed in Vitis vinifera, but not in other Vitis species
Gunnaiah et al. Genetic diversity assessment and gene expression analysis of prolonged shelf-life genes in Mangalore melon (Cucumis melo ssp. agrestis var. acidulus)
Nakamura et al. Antimutagenic and anticarcinogenic properties of Kyo-yasai, heirloom vegetables in Kyoto
Cavagnaro et al. Garlic
Aakanksha et al. Genomic Designing for Nutraceuticals in Brassica juncea: Advances and Future Prospects
Singh et al. Past progress, present scenario, nutritional value and strategies to enhance yield potential of rapeseed-mustard: an overview
Koller et al. Environmental Risk Assessment Scenarios of Specific NGT Applications in Brassicaceae Oilseed Plants
Gulten et al. Molecular breeding to develop advanced lines with high oleic acid and pod yield in peanut
Çakıroğlu Metabolic and genomic profiling for taste and aroma traits in tomato (Solanum lycopersicum)
Kouam et al. Genetic diversity and relationship between wild and cultivated cowpea [(L.) Walp.] as assessed by allozyme markers
Sharma et al. 1, MK Tripathi1, Neha Gupta2, Sangeeta Singh3and RS Sikarwar. Selection of groundnut germplasm lines based on yield, nutritional, antinutritional and antioxidant parameters
US20220073941A1 (en) Herbicide-resistant camelina sativa plants, and variant camelina acetohydroxyacid synthase polypeptides
Márquez‐Lema et al. Inheritance of very high glucosinolate content in Ethiopian mustard seeds
Devi The genetics of whitefly resistance in tomato
Adarsh et al. Genetic diversity of indigenous bitter gourd (Momordica charantia L.) genotypes by morphological and molecular marker
Bineau Combining genetic association and transcriptome analyses to bring back flavor into tomato hybrid varieties
Benelli Comparison of seed yield, oil and phenotypic traits among selected parents and crosses of Niger

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22780314

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 18552246

Country of ref document: US

Ref document number: 2023511018

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 202280025948.5

Country of ref document: CN

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20237035164

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1020237035164

Country of ref document: KR

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 22780314

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1