CN117384931A - 一种GSK-3β抑制剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种GSK‑3β抑制剂的制备方法。一种GSK‑3β抑制剂的制备方法，步骤如下：步骤一、关键合成酶的合成和表达载体的构建；步骤二、关键合成酶的表达；步骤三、酶促反应体系的搭建；步骤四、产物的分离，完成即得到GSK‑3β抑制剂。本发明具有以下有益效果：1、本方法以廉价且生物亲和性良好的L‑色氨酸和3‑氨基‑L‑苯丙氨酸为底物，规避了现有方法中毒性化学品作为底物的参与，提高原子利用率、减小化学污染和可能引入的毒副作用。2、较大幅度提升了GSK‑3β抑制剂CP21R7的产率。
Description
技术领域
本发明属于生物治疗领域，具体涉及一种GSK-3β抑制剂的制备方法。
背景技术
糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）是一种在哺乳动物体内广泛存在的具有严格进化保守性的丝氨酸/苏氨酸激酶，能够参与包括糖代谢、细胞信号、细胞增殖、细胞分化、细胞周期、胚胎发育、细胞凋亡、胰岛素应答以及多种组织器官调节因子在内的多种生理过程，并且在癌症、糖尿病、阿尔兹海默症和炎症等多种病理过程中发挥关键作用。
在DNA损伤、缺氧等多种情况下，GSK-3β能够诱发细胞凋亡，然而对于肿瘤而言GSK-3β的作用是多重的。例如，GSK-3β在卵巢癌、前列腺癌等癌症病理过程中可以通过抑制性激素受体发挥抑制癌细胞增长的作用；而GSK-3β同样能够促进胰腺癌细胞、结肠癌细胞的存活，起到促进疾病进程的作用。因此，科研工作者们正在对以GSK-3β为靶点的疾病通路展开深入的研究工作，以期在多种疾病的治疗领域带来突破。
CP21R7是目前实验室中应用最为广泛的GSK-3β抑制剂之一，广泛应用于GSK-3β或PKC等通路相关领域的研究工作之中。同时，CP21R7还能诱导激活Wnt信号通路，可用作干细胞激活剂，诱导干细胞分化。CP21R7对GSK-3β具有很强的选择性抑制作用，IC50约为1.8nM。与已经开发的许多可逆抑制剂相比，GSK-3β的共价抑制剂显著缺乏，因此CP21R7的作用便更加凸显。
目前主要通过化学合成制备CP21R7，具体反应路线如下：
但是上述CP21R7的反应路线存在以下不足之处：1.反应中间体稳定性差，导致整体产率不高（通常低于40%）；2.反应原料和反应副产物容易造成化学污染，化学残留影响CP21R7在后续生物科研领域应用过程中的结果准确性。
发明内容
发明目的：针对上述的合成CP21R7的现有技术存在的合成产率不高、存在化学污染和残留等问题，本发明公开了一种GSK-3β抑制剂的制备方法。
本发明改造了放线菌Chromobacterium violaceum的血红素依赖性氧化酶，得到了一种关键合成酶CV1218，并利用PmLAAD蛋白和MarC蛋白与关键合成酶合作制备CP21R7，以解决目前CP21R7制备方法中存在的合成产率不高、存在化学污染和残留等问题。
技术方案：一种GSK-3β抑制剂的制备方法，步骤如下：
步骤一、关键合成酶的合成和表达载体的构建
（11）对放线菌Chromobacterium violaceum的血红素依赖性氧化酶进行结构改造得到关键合成酶CV1218，关键合成酶CV1218的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
（12）利用Gibson拼接克隆技术，将关键合成酶CV1218的基因片段克隆到载体pMCSG10中得到表达载体pMCSG10-CV1218，将基因片段PmLAAD克隆到载体pET28a(+)中得到表达载体pET28a(+)-PmLAAD，将基因片段MarC克隆到载体pET26b中得到表达载体pET26b-MarC，其中：
基因片段PmLAAD的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
基因片段MarC的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
（13）将构建好的表达载体pET28a(+)-PmLAAD、表达载体pMCSG10-CV1218、表达载体pET26b-MarC分别转化到感受态细胞BL21(DE3)中得到菌种溶液，分别于-80℃保存；
步骤二、关键合成酶的表达
（21）制备PmLAAD蛋白粗制裂解液；
（22）制备CV1218蛋白粗制裂解液；
（23）制备MarC蛋白粗制裂解液；
步骤三、酶促反应体系的搭建
（31）向反应容器中依次加入下列物质：
（32）混匀后，震荡反应6-8h，震荡反应全程保持反应容器为敞口状态；
（33）分别向反应容器中加入600mL MarC蛋白粗制裂解液、2.1gα-酮戊二酸、1.32g抗坏血酸、适量的硫酸亚铁，使得硫酸亚铁在菌液中的浓度为0.1mM，混匀后，继续震荡反应2h得到反应液；
步骤四、产物的分离
将步骤三得到的反应液进行后处理，完成后即得到GSK-3β抑制剂。
进一步地，步骤（21）的具体步骤如下：
（211）取10μL的pET28a(+)-PmLAAD菌种溶液，加入到5mL的LB液体培养基中，37℃、200rpm震荡过夜培养，得到pET28a(+)-PmLAAD种子液，其中：
LB液体培养基中含卡那霉素，其浓度为50μg/mL；
（212）将步骤（211）得到的pET28a(+)-PmLAAD种子液全部加入到含1L的LB液体培养基的试验容器中，然后在摇床内以37℃、200rpm震荡培养，至菌液中含PmLAAD表达载体的菌液浓度OD600=1.1-1.3为止，随后将试验容器取出并置于冰浴中30min，其中：
LB液体培养基中含卡那霉素，其浓度为50μg/mL；
（213）向经过步骤（212）处理的菌液中加入适量的IPTG，使得IPTG在菌液中的浓度为0.1mM，混匀后放入摇床内以18℃、200rpm诱导培养16h；
（214）将经过步骤（213）诱导完毕的菌液倒入离心杯，4000g离心15min，弃上清液，沉淀表面用ddH2O清洗，随后加入30mL上样缓冲液将沉淀菌体重悬至无明显菌块得到菌体重悬液，其中：
所述上样缓冲液的pH值为8.0；
所述上样缓冲液包括：100mM Tris-HCl、300mM NaCl、5mM咪唑、10%v/v甘油，余量为水；
（215）利用超生破碎仪将步骤（214）得到的菌体重悬液破碎，得到破碎后的菌液，其中：
变幅杆直径为6mm；
破碎程序为：能量40%，超声循环工作时间2s、暂停时间4s，工作总时间30min；
（216）将破碎后的菌液以10000g低温离心15min，取上清液，即得到PmLAAD蛋白粗制裂解液。
进一步地，步骤（22）的具体步骤如下：
（221）取10μL的pMCSG10-CV1218菌种溶液，加入到5mL的LB液体培养基中，37℃、200rpm震荡过夜培养，得到pET26b-CV1218种子液，其中：
LB液体培养基中含氨苄青霉素，其浓度为50μg/mL；
（222）将步骤（221）得到的pMCSG10-CV1218种子液加入到含1L的LB液体培养基的试验容器中，在摇床内以37℃、200rpm震荡培养至含CV1218表达载体的菌液浓度OD600=0.7-0.9为止，随后将试验容器并置于冰浴中30min，其中：
LB液体培养基中含氨苄青霉素，其浓度为50μg/mL；
（223）向经过步骤（222）处理的菌液中分别加入适量的硫酸亚铁铵、5-氨基乙酰丙酸、IPTG，使得硫酸亚铁铵在菌液中的浓度为40μM，5-氨基乙酰丙酸在菌液中的浓度为0.25mM，IPTG在菌液中的浓度为0.1mM，然后混匀后放入摇床内以18℃、200rpm诱导培养16h；
（224）将经过步骤（223）诱导完毕的菌液倒入离心杯，4000g离心15min，弃上清液，沉淀表面用ddH2O清洗，随后加入30mL上样缓冲液将沉淀菌体重悬至无明显菌块得到菌体重悬液，其中：
所述上样缓冲液的pH值为8.0；
所述上样缓冲液包括：100mM Tris-HCl、300mM NaCl、15mM咪唑、10%v/v甘油，余量为水；
（225）利用超生破碎仪将步骤（224）得到的菌体重悬液破碎，其中：
变幅杆直径为6mm；
破碎程序为：能量40%，超声循环工作时间2s、暂停时间4s，工作总时间30min；
（226）将破碎后的菌液以10000g低温离心15min，取上清液，即得到CV1218蛋白粗制裂解液。
进一步地，步骤（23）的具体步骤如下：
（231）取10μL的pET26b-MarC菌种溶液，加入到5mL的LB液体培养基中，37℃、200rpm震荡过夜培养，得到pET26b-MarC种子液，其中：
LB液体培养基中含卡那霉素，其浓度为50μg/mL；
（232）将步骤（231）得到的pET26b-MarC种子液加入到含1L的LB液体培养基的试验容器中，在摇床内以37℃、200rpm震荡培养至含MarC表达载体的菌液浓度OD600=0.9-1.1为止，随后将试验容器取出并置于冰浴中30min，其中：
LB液体培养基中含卡那霉素，其浓度为50μg/mL；
（233）向经过步骤（232）处理的菌液中分别加入硫酸亚铁铵、5-氨基乙酰丙酸、IPTG，使得硫酸亚铁铵在菌液中的浓度为40μM，5-氨基乙酰丙酸在菌液中的浓度为0.25mM，IPTG在菌液中的浓度为0.1mM，然后混匀后放入摇床内以18℃、200rpm诱导培养16h；
（234）将经过步骤（233）诱导完毕的菌液倒入离心杯，4000g离心15min，弃上清液，沉淀表面用ddH2O清洗，随后加入30mL上样缓冲液将沉淀菌体重悬至无明显菌块得到菌体重悬液，其中：
所述上样缓冲液的pH值为8.0；
所述上样缓冲液包括：100mM Tris-HCl、300mM NaCl、15mM咪唑、10%v/v甘油，余量为水；
（235）利用超生破碎仪将菌体重悬液破碎，其中：
变幅杆直径为6mm；
破碎程序为：能量40%，超声循环工作时间2s、暂停时间4s，工作总时间30min；
（236）将破碎后的菌液以10000g低温离心15min，取上清液即得到MarC蛋白粗制裂解液。
进一步地，步骤（31）中所述NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液的浓度为1M，pH值为8.0；
所述(NH4)2SO4储备液的浓度为2M。
进一步地，步骤（4）中的后处理的具体步骤如下：
将步骤三得到的反应液用1N稀盐酸调节至pH=1，然后向其中加入1L乙酸乙酯萃取至少三次，乳化层使用硅藻土过滤后分液，合并有机相并使用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到粗产物，然后将粗产物使用硅胶柱色谱进行纯化，DCM/MeOH=18:1条件下洗脱得到橙红色产物即得到GSK-3β抑制剂。
有益效果：本发明具有以下有益效果：
1、本方法以廉价且生物亲和性良好的L-色氨酸和3-氨基-L-苯丙氨酸为底物，规避了现有方法中毒性化学品作为底物的参与，提高原子利用率、减小化学污染和可能引入的毒副作用;
2、较大幅度提升了GSK-3β抑制剂CP21R7的产率。
附图说明
图1为表达载体pMCSG10-CV1218的质粒图谱。
图2为表达载体pET28a(+)-PmLAAD的质粒图谱。
图3为表达载体pET26b-MarC的质粒图谱。
图4为实施例1制备的产物的HPLC图谱。
图5为实施例1制备的产物的1H NMR图谱。
图6为实施例1制备的产物的13C NMR图谱。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式详细说明。
本发明所公开的“范围”以下限和上限的形式来限定，给定范围是通过选定一个下限和一个上限进行限定的，选定的下限和上限限定了特别范围的边界。这种方式进行限定的范围可以是包括端值或不包括端值的，并且可以进行任意地组合，即任何下限可以与任何上限组合形成一个范围。例如，如果针对特定参数列出了10-50的范围，理解为10-40和20-50的范围也是预料到的。此外，如果列出的最小范围值1和2，和如果列出了最大范围值3，4和5，则下面的范围可全部预料到：1-3、1-4、1-5、2-3、2-4和2-5。在本申请中，除非有其他说明，数值的范围“a-b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“0-5”表示本文中已经全部列出了“0-5”之间的全部实数，“0-5”只是这些数值组合的缩略表示。
如果没有特别的说明，本申请的所有实施方式以及可选实施方式可以相互组合形成新的技术方案。
如果没有特别的说明，本申请的所有技术特征以及可选技术特征可以相互组合形成新的技术方案。
如果没有特别的说明，本申请的所有步骤可以顺序进行，也可以随机进行，优选是顺序进行的。例如，所述方法包括步骤(a)和(b)，表示所述方法可包括顺序进行的步骤(a)和(b)，也可以包括顺序进行的步骤(b)和(a)。例如，所述提到所述方法还可包括步骤(c)，表示步骤(c)可以任意顺序加入到所述方法，例如，所述方法可以包括步骤(a)、(b)和(c)，也可包括步骤(a)、(c)和(b)，也可以包括步骤(c)、(a)和(b)等。
如果没有特别的说明，本申请所提到的“包括”和“包含”表示开放式，也可以是封闭式。例如，所述“包括”和“包含”可以表示还可以包括或包含没有列出的其他组分，也可以仅包括或包含列出的组分。
如果没有特别的说明，则反应在常温、常压的条件进行。
如果没有特别的说明，则所有份数或百分数均为重量份或重量百分数。
在本发明中，所用物质均为已知物质，可以购得或通过已知的方法合成。
在本发明中，所用装置或设备均为所述领域已知的常规装置或设备，均可购得。
本发明的合成路线如下：
。
一种GSK-3β抑制剂的制备方法，步骤如下：
步骤一、关键合成酶的合成和表达载体的构建
（11）对放线菌Chromobacterium violaceum的血红素依赖性氧化酶进行结构改造得到关键合成酶CV1218，关键合成酶CV1218的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
SEQ ID NO.1（CV1218）：
ARIESKAQLAAELRKAVDLELSVMLQYLYAAYSIPNYAQGQQRVRDGAWTAEQLQLACGSGDRRRDGGIRAALLEIAHEEMIHYLVVNNLLMALGEPFYAGVPLMGEAARQAFGLDTEFALEPFSESTLARFVRLEWPHFIPAPGKSIADCYAAIRQAFLDLPDLFGGEAGKRGGEHHLFLNELTNRAHPGYQLEVFDRDSALFGIAFVTDQGEGGALDSPHYEHSHFQRLREMSARIMAQSAPFEPALPALRNPVLDESPGCQRVADGRARALMALYQGVYELMFAMMAQHFAVKPLGSLRRSRLMNAAIDLMTGLLRPLSCALMNLPSGIAGRTAGPPLPGPVDTRSYDDYALGCRMLARRCERLLEQASMLEPGWLPDAQMELLDFYRRQMLDLACGKLSREA
（12）利用Gibson拼接克隆技术，将关键合成酶CV1218的基因片段克隆到载体pMCSG10中得到表达载体pMCSG10-CV1218，将基因片段PmLAAD克隆到载体pET28a(+)中得到表达载体pET28a(+)-PmLAAD，将基因片段MarC克隆到载体pET26b中得到表达载体pET26b-MarC，其中：
基因片段PmLAAD的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
基因片段MarC的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
SEQ ID NO.2（PmLAAD）：
MNISRRKLLLGVGAAGVLAGGAALVPMVRRDGKFVEAKSRASFVEGTQGALPKEADVVIIGAGIQGIMTAINLAERGMSVTILEKGQIAGEQSGRAYSQIISYQTSPEIFPLHHYGKILWRGMNEKIGADTSYRTQGRVEALADEKALDKAQAWIKTAKEAAGFDTPLNTRIIKGEELSNRLVGAQTPWTVAAFEEDSGSVDPETGTPALARYAKQIGVKIYTNCAVRGIETAGGKISDVVSEKGAIKTSQVVLAGGIWSRLFMGNMGIDIPTLNVYLSQQRVSGVPGAPRGNVHLPNGIHFREQADGTYAVAPRIFTSSIVKDSFLLGPKFMHLLGGGELPLEFSIGEDLFNSFKMPTSWNLDEKTPFEQFRVATATQNTQHLDAVFQRMKTEFPVFEKSEVVERWGAVVSPTFDELPIISEVKEYPGLVINTATVWGMTEGPAAGEVTADIVMGKKPVIDPTPFSLDRFKK
SEQ ID NO.3（MarC）：
MLSAEDNKLLTEVAADTRMGQLLRRYWHPIAASSQLDDKHPTRLVHLLGEKLVLYKDKQGRLGLIDERCPHRRASMLYGIPEQEGLRCSYHGWLFNNAGRCLAQPYEQMEDPCSNFKDHVRIKSYPVRELGGLVFAYLGPAPAPELPAWDLLVTENLHRDIGFAVVPCNWLQIMENAADPVHAEWLHGHFANYVWERLGKPERIKPFPTHKKIGFDLSEYGIIKRRVLEGETEEHENWKFGHSLVFPNLQKGGGLQWRVPMDETRTLHVWYYTYTPAEGTVVPKDAPIPVFDVPVPALDEHGHPRWDVLDFTAGQDMVMWYTQGAVAERWKETLGRSDRGVIMYRNLLKANLEKLARGEEPMNVFRDPAKAAFIQLDTEESSGRRLYSDRARQYGPSSSNGPGGGATKYSPVLNLHKGAETVSAKEVMPETALPAAPPAARKETA
（13）将构建好的表达载体pET28a(+)-PmLAAD、表达载体pMCSG10-CV1218、表达载体pET26b-MarC分别转化到感受态细胞BL21(DE3)中得到菌种溶液，分别于-80℃保存；
步骤二、关键合成酶的表达
（21）制备PmLAAD蛋白粗制裂解液；
（22）制备CV1218蛋白粗制裂解液；
（23）制备MarC蛋白粗制裂解液；
步骤三、酶促反应体系的搭建
（31）向反应容器中依次加入下列物质：
（32）混匀后，震荡反应6-8h，震荡反应全程保持反应容器为敞口状态；
（33）分别向反应容器中加入600mL MarC蛋白粗制裂解液、2.1gα-酮戊二酸、1.32g抗坏血酸、适量的硫酸亚铁，使得硫酸亚铁在菌液中的浓度为0.1mM，混匀后，继续震荡反应2h得到反应液；
步骤四、产物的分离
将步骤三得到的反应液进行后处理，完成后即得到GSK-3β抑制剂CP21R7。
进一步地，步骤（21）的具体步骤如下：
（211）取10μL的pET28a(+)-PmLAAD菌种溶液，加入到5mL的LB液体培养基中，37℃、200rpm震荡过夜培养，得到pET28a(+)-PmLAAD种子液，其中：
LB液体培养基中含卡那霉素，其浓度为50μg/mL；
（212）将步骤（211）得到的pET28a(+)-PmLAAD种子液全部加入到含1L的LB液体培养基的试验容器中，然后在摇床内以37℃、200rpm震荡培养，至菌液中含PmLAAD表达载体的菌液浓度OD600=1.1-1.3为止，随后将试验容器取出并置于冰浴中30min，其中：
LB液体培养基中含卡那霉素，其浓度为50μg/mL；
（213）向经过步骤（212）处理的菌液中加入适量的IPTG，使得IPTG在菌液中的浓度为0.1mM，混匀后放入摇床内以18℃、200rpm诱导培养16h；
（214）将经过步骤（213）诱导完毕的菌液倒入离心杯，4000g离心15min，弃上清液，沉淀表面用ddH2O清洗，随后加入30mL上样缓冲液将沉淀菌体重悬至无明显菌块得到菌体重悬液，其中：
所述上样缓冲液的pH值为8.0；
所述上样缓冲液包括：100mM Tris-HCl、300mM NaCl、5mM咪唑、10%v/v甘油，余量为水；
（215）利用超生破碎仪将步骤（214）得到的菌体重悬液破碎，得到破碎后的菌液，其中：
变幅杆直径为6mm；
破碎程序为：能量40%，超声循环工作时间2s、暂停时间4s，工作总时间30min；
（216）将破碎后的菌液以10000g低温离心15min，取上清液，即得到PmLAAD蛋白粗制裂解液。
进一步地，步骤（22）的具体步骤如下：
（221）取10μL的pMCSG10-CV1218菌种溶液，加入到5mL的LB液体培养基中，37℃、200rpm震荡过夜培养，得到pET26b-CV1218种子液，其中：
LB液体培养基中含氨苄青霉素，其浓度为50μg/mL；
（222）将步骤（221）得到的pMCSG10-CV1218种子液加入到含1L的LB液体培养基的试验容器中，在摇床内以37℃、200rpm震荡培养至含CV1218表达载体的菌液浓度OD600=0.7-0.9为止，随后将试验容器并置于冰浴中30min，其中：
LB液体培养基中含氨苄青霉素，其浓度为50μg/mL；
（223）向经过步骤（222）处理的菌液中分别加入适量的硫酸亚铁铵、5-氨基乙酰丙酸、IPTG，使得硫酸亚铁铵在菌液中的浓度为40μM，5-氨基乙酰丙酸在菌液中的浓度为0.25mM，IPTG在菌液中的浓度为0.1mM，然后混匀后放入摇床内以18℃、200rpm诱导培养16h；
（224）将经过步骤（223）诱导完毕的菌液倒入离心杯，4000g离心15min，弃上清液，沉淀表面用ddH2O清洗，随后加入30mL上样缓冲液将沉淀菌体重悬至无明显菌块得到菌体重悬液，其中：
所述上样缓冲液的pH值为8.0；
所述上样缓冲液包括：100mM Tris-HCl、300mM NaCl、15mM咪唑、10%v/v甘油，余量为水；
（225）利用超生破碎仪将步骤（224）得到的菌体重悬液破碎，其中：
变幅杆直径为6mm；
破碎程序为：能量40%，超声循环工作时间2s、暂停时间4s，工作总时间30min；
（226）将破碎后的菌液以10000g低温离心15min，取上清液，即得到CV1218蛋白粗制裂解液。
进一步地，步骤（23）的具体步骤如下：
（231）取10μL的pET26b-MarC菌种溶液，加入到5mL的LB液体培养基中，37℃、200rpm震荡过夜培养，得到pET26b-MarC种子液，其中：
LB液体培养基中含卡那霉素，其浓度为50μg/mL；
（232）将步骤（231）得到的pET26b-MarC种子液加入到含1L的LB液体培养基的试验容器中，在摇床内以37℃、200rpm震荡培养至含MarC表达载体的菌液浓度OD600=0.9-1.1为止，随后将试验容器取出并置于冰浴中30min，其中：
LB液体培养基中含卡那霉素，其浓度为50μg/mL；
（233）向经过步骤（232）处理的菌液中分别加入硫酸亚铁铵、5-氨基乙酰丙酸、IPTG，使得硫酸亚铁铵在菌液中的浓度为40μM，5-氨基乙酰丙酸在菌液中的浓度为0.25mM，IPTG在菌液中的浓度为0.1mM，然后混匀后放入摇床内以18℃、200rpm诱导培养16h；
（234）将经过步骤（233）诱导完毕的菌液倒入离心杯，4000g离心15min，弃上清液，沉淀表面用ddH2O清洗，随后加入30mL上样缓冲液将沉淀菌体重悬至无明显菌块得到菌体重悬液，其中：
所述上样缓冲液的pH值为8.0；
所述上样缓冲液包括：100mM Tris-HCl、300mM NaCl、15mM咪唑、10%v/v甘油，余量为水；
（235）利用超生破碎仪将菌体重悬液破碎，其中：
变幅杆直径为6mm；
破碎程序为：能量40%，超声循环工作时间2s、暂停时间4s，工作总时间30min；
（236）将破碎后的菌液以10000g低温离心15min，取上清液即得到MarC蛋白粗制裂解液。
进一步地，步骤（31）中所述NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液的浓度为1M，pH值为8.0；
所述(NH4)2SO4储备液的浓度为2M。
进一步地，步骤（4）中的后处理的具体步骤如下：
将步骤三得到的反应液用1N稀盐酸调节至pH=1，然后向其中加入1L乙酸乙酯萃取至少三次，乳化层使用硅藻土过滤后分液，合并有机相并使用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到粗产物，然后将粗产物使用硅胶柱色谱进行纯化，DCM/MeOH=18:1条件下洗脱得到橙红色产物即得到GSK-3β抑制剂CP21R7。
实施例1
一种GSK-3β抑制剂的制备方法，步骤如下：
步骤一、关键合成酶的合成和表达载体的构建
（11）对放线菌Chromobacterium violaceum的血红素依赖性氧化酶进行结构改造得到关键合成酶CV1218，关键合成酶CV1218的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
（12）利用Gibson拼接克隆技术，将关键合成酶CV1218的基因片段克隆到载体pMCSG10中得到表达载体pMCSG10-CV1218，将基因片段PmLAAD克隆到载体pET28a(+)中得到表达载体pET28a(+)-PmLAAD，将基因片段MarC克隆到载体pET26b中得到表达载体pET26b-MarC，其中：
基因片段PmLAAD的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
基因片段MarC的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
（13）将构建好的表达载体pET28a(+)-PmLAAD、表达载体pMCSG10-CV1218、表达载体pET26b-MarC分别转化到感受态细胞BL21(DE3)中得到菌种溶液，分别于-80℃保存；
步骤二、关键合成酶的表达
（21）制备PmLAAD蛋白粗制裂解液；
（22）制备CV1218蛋白粗制裂解液；
（23）制备MarC蛋白粗制裂解液；
步骤三、酶促反应体系的搭建
（31）向反应容器中依次加入下列物质：
（32）混匀后，震荡反应7h，震荡反应全程保持反应容器为敞口状态；
（33）分别向反应容器中加入600mL MarC蛋白粗制裂解液、2.1gα-酮戊二酸、1.32g抗坏血酸、适量的硫酸亚铁，使得硫酸亚铁在菌液中的浓度为0.1mM，混匀后，继续震荡反应2h得到反应液；
步骤四、产物的分离
将步骤三得到的反应液进行后处理，完成后即得到GSK-3β抑制剂CP21R7。产物质量为1.2g，产率为65.45%。
进一步地，步骤（21）的具体步骤如下：
（211）取10μL的pET28a(+)-PmLAAD菌种溶液，加入到5mL的LB液体培养基中，37℃、200rpm震荡过夜培养，得到pET28a(+)-PmLAAD种子液，其中：
LB液体培养基中含卡那霉素，其浓度为50μg/mL；
（212）将步骤（211）得到的pET28a(+)-PmLAAD种子液全部加入到含1L的LB液体培养基的试验容器中，然后在摇床内以37℃、200rpm震荡培养，至菌液中含PmLAAD表达载体的菌液浓度OD600=1.2为止，随后将试验容器取出并置于冰浴中30min，其中：
LB液体培养基中含卡那霉素，其浓度为50μg/mL；
（213）向经过步骤（212）处理的菌液中加入适量的IPTG，使得IPTG在菌液中的浓度为0.1mM，混匀后放入摇床内以18℃、200rpm诱导培养16h；
（214）将经过步骤（213）诱导完毕的菌液倒入离心杯，4000g离心15min，弃上清液，沉淀表面用ddH2O清洗，随后加入30mL上样缓冲液将沉淀菌体重悬至无明显菌块得到菌体重悬液，其中：
所述上样缓冲液的pH值为8.0；
所述上样缓冲液包括：100mM Tris-HCl、300mM NaCl、5mM咪唑、10%v/v甘油，余量为水；
（215）利用超生破碎仪将步骤（214）得到的菌体重悬液破碎，得到破碎后的菌液，其中：
变幅杆直径为6mm；
破碎程序为：能量40%，超声循环工作时间2s、暂停时间4s，工作总时间30min；
（216）将破碎后的菌液以10000g低温离心15min，取上清液，即得到PmLAAD蛋白粗制裂解液。
进一步地，步骤（22）的具体步骤如下：
（221）取10μL的pMCSG10-CV1218菌种溶液，加入到5mL的LB液体培养基中，37℃、200rpm震荡过夜培养，得到pET26b-CV1218种子液，其中：
LB液体培养基中含氨苄青霉素，其浓度为50μg/mL；
（222）将步骤（221）得到的pMCSG10-CV1218种子液加入到含1L的LB液体培养基的试验容器中，在摇床内以37℃、200rpm震荡培养至含CV1218表达载体的菌液浓度OD600=0.8为止，随后将试验容器并置于冰浴中30min，其中：
LB液体培养基中含氨苄青霉素，其浓度为50μg/mL；
（223）向经过步骤（222）处理的菌液中分别加入适量的硫酸亚铁铵、5-氨基乙酰丙酸、IPTG，使得硫酸亚铁铵在菌液中的浓度为40μM，5-氨基乙酰丙酸在菌液中的浓度为0.25mM，IPTG在菌液中的浓度为0.1mM，然后混匀后放入摇床内以18℃、200rpm诱导培养16h；
（224）将经过步骤（223）诱导完毕的菌液倒入离心杯，4000g离心15min，弃上清液，沉淀表面用ddH2O清洗，随后加入30mL上样缓冲液将沉淀菌体重悬至无明显菌块得到菌体重悬液，其中：
所述上样缓冲液的pH值为8.0；
所述上样缓冲液包括：100mM Tris-HCl、300mM NaCl、15mM咪唑、10%v/v甘油，余量为水；
（225）利用超生破碎仪将步骤（224）得到的菌体重悬液破碎，其中：
变幅杆直径为6mm；
破碎程序为：能量40%，超声循环工作时间2s、暂停时间4s，工作总时间30min；
（226）将破碎后的菌液以10000g低温离心15min，取上清液，即得到CV1218蛋白粗制裂解液。
进一步地，步骤（23）的具体步骤如下：
（231）取10μL的pET26b-MarC菌种溶液，加入到5mL的LB液体培养基中，37℃、200rpm震荡过夜培养，得到pET26b-MarC种子液，其中：
LB液体培养基中含卡那霉素，其浓度为50μg/mL；
（232）将步骤（231）得到的pET26b-MarC种子液加入到含1L的LB液体培养基的试验容器中，在摇床内以37℃、200rpm震荡培养至含MarC表达载体的菌液浓度OD600=1为止，随后将试验容器取出并置于冰浴中30min，其中：
LB液体培养基中含卡那霉素，其浓度为50μg/mL；
（233）向经过步骤（232）处理的菌液中分别加入硫酸亚铁铵、5-氨基乙酰丙酸、IPTG，使得硫酸亚铁铵在菌液中的浓度为40μM，5-氨基乙酰丙酸在菌液中的浓度为0.25mM，IPTG在菌液中的浓度为0.1mM，然后混匀后放入摇床内以18℃、200rpm诱导培养16h；
（234）将经过步骤（233）诱导完毕的菌液倒入离心杯，4000g离心15min，弃上清液，沉淀表面用ddH2O清洗，随后加入30mL上样缓冲液将沉淀菌体重悬至无明显菌块得到菌体重悬液，其中：
所述上样缓冲液的pH值为8.0；
所述上样缓冲液包括：100mM Tris-HCl、300mM NaCl、15mM咪唑、10%v/v甘油，余量为水；
（235）利用超生破碎仪将菌体重悬液破碎，其中：
变幅杆直径为6mm；
破碎程序为：能量40%，超声循环工作时间2s、暂停时间4s，工作总时间30min；
（236）将破碎后的菌液以10000g低温离心15min，取上清液即得到MarC蛋白粗制裂解液。
进一步地，步骤（31）中所述NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液的浓度为1M，pH值为8.0；
所述(NH4)2SO4储备液的浓度为2M。
进一步地，步骤（4）中的后处理的具体步骤如下：
将步骤三得到的反应液用1N稀盐酸调节至pH=1，然后向其中加入1L乙酸乙酯萃取至少三次，乳化层使用硅藻土过滤后分液，合并有机相并使用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到粗产物，然后将粗产物使用硅胶柱色谱进行纯化，DCM/MeOH=18:1条件下洗脱得到橙红色产物即得到GSK-3β抑制剂CP21R7。
实施例2
与实施例1大致相同，区别仅仅在于：
1、步骤（32）的震荡反应的时间为6h；
2、步骤（212）中至菌液中含PmLAAD表达载体的菌液浓度OD600=1.1为止；
3、步骤（222）中至含CV1218表达载体的菌液浓度OD600=0.7为止；
4、步骤（232）中至含MarC表达载体的菌液浓度OD600=0.9为止。
实施例2得到的产物质量为1.18g，产率为64.36%。
实施例3
与实施例1大致相同，区别仅仅在于：
1、步骤（32）的震荡反应的时间为8h；
2、步骤（212）中至菌液中含PmLAAD表达载体的菌液浓度OD600=1.3为止；
3、步骤（222）中至含CV1218表达载体的菌液浓度OD600=0.9为止；
4、步骤（232）中至含MarC表达载体的菌液浓度OD600=1.1为止。
实施例3得到的产物质量为1.22g，产率为66.54%。
性能表征：
1、将实施例1制备的产物进行HPLC检测，其结果如图4所示。从图4可以看出实施例1制备的产物纯度较高，几乎无其它杂质残留。
2、将实施例1制备的产物进行核磁分析图谱，其结果如图5和图6所示。从图5和图6可以看出实施例1制备的产物与其标准核磁共振谱图对照显示信号化学位移、耦合常数等参数一致，表明产物的分子结构与CP21R7相同，且具有较高的纯度。
3、利用小鼠GSK-3β试剂盒活性检测试剂盒（Mouse GSK-3β ELISA Kit）测定了实施例1制备的CP21R7对小鼠GSK-3β的IC50值。反应体系中加入的CP21R7终浓度分别为0.1nM、0.2nM、0.5nM、1nM、2nM、5nM和10nM，利用ELISA方法测定并计算CP21R7对小鼠GSK-3β的的IC50值为1.63nM。
上面对本发明的实施方式做了详细说明。但是本发明并不限于上述实施方式，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。
Claims (6)
1.一种GSK-3β抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤如下：
步骤一、关键合成酶的合成和表达载体的构建
（11）对放线菌Chromobacterium violaceum的血红素依赖性氧化酶进行结构改造得到关键合成酶CV1218，关键合成酶CV1218的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
（12）利用Gibson拼接克隆技术，将关键合成酶CV1218的基因片段克隆到载体pMCSG10中得到表达载体pMCSG10-CV1218，将基因片段PmLAAD克隆到载体pET28a(+)中得到表达载体pET28a(+)-PmLAAD，将基因片段MarC克隆到载体pET26b中得到表达载体pET26b-MarC，其中：
基因片段PmLAAD的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
基因片段MarC的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
（13）将构建好的表达载体pET28a(+)-PmLAAD、表达载体pMCSG10-CV1218、表达载体pET26b-MarC分别转化到感受态细胞BL21(DE3)中得到菌种溶液，分别于-80℃保存；
步骤二、关键合成酶的表达
（21）制备PmLAAD蛋白粗制裂解液；
（22）制备CV1218蛋白粗制裂解液；
（23）制备MarC蛋白粗制裂解液；
步骤三、酶促反应体系的搭建
（31）向反应容器中依次加入下列物质：
;
（32）混匀后，震荡反应6-8h，震荡反应全程保持反应容器为敞口状态；
（33）分别向反应容器中加入600mL MarC蛋白粗制裂解液、2.1gα-酮戊二酸、1.32g抗坏血酸、适量的硫酸亚铁，使得硫酸亚铁在菌液中的浓度为0.1mM，混匀后，继续震荡反应2h得到反应液；
步骤四、产物的分离
将步骤三得到的反应液进行后处理，完成后即得到GSK-3β抑制剂。
2.如权利要求1所述的一种GSK-3β抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤（21）的具体步骤如下：
（211）取10μL的pET28a(+)-PmLAAD菌种溶液，加入到5mL的LB液体培养基中，37℃、200rpm震荡过夜培养，得到pET28a(+)-PmLAAD种子液，其中：
LB液体培养基中含卡那霉素，其浓度为50μg/mL；
（212）将步骤（211）得到的pET28a(+)-PmLAAD种子液全部加入到含1L的LB液体培养基的试验容器中，然后在摇床内以37℃、200rpm震荡培养，至菌液中含PmLAAD表达载体的菌液浓度OD600=1.1-1.3为止，随后将试验容器取出并置于冰浴中30min，其中：
LB液体培养基中含卡那霉素，其浓度为50μg/mL；
（213）向经过步骤（212）处理的菌液中加入适量的IPTG，使得IPTG在菌液中的浓度为0.1mM，混匀后放入摇床内以18℃、200rpm诱导培养16h；
（214）将经过步骤（213）诱导完毕的菌液倒入离心杯，4000g离心15min，弃上清液，沉淀表面用ddH2O清洗，随后加入30mL上样缓冲液将沉淀菌体重悬至无明显菌块得到菌体重悬液，其中：
所述上样缓冲液的pH值为8.0；
所述上样缓冲液包括：100mM Tris-HCl、300mM NaCl、5mM咪唑、10%v/v甘油，余量为水；
（215）利用超生破碎仪将步骤（214）得到的菌体重悬液破碎，得到破碎后的菌液，其中：
变幅杆直径为6mm；
破碎程序为：能量40%，超声循环工作时间2s、暂停时间4s，工作总时间30min；
（216）将破碎后的菌液以10000g低温离心15min，取上清液，即得到PmLAAD蛋白粗制裂解液。
3.如权利要求1所述的一种GSK-3β抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤（22）的具体步骤如下：
（221）取10μL的pMCSG10-CV1218菌种溶液，加入到5mL的LB液体培养基中，37℃、200rpm震荡过夜培养，得到pET26b-CV1218种子液，其中：
LB液体培养基中含氨苄青霉素，其浓度为50μg/mL；
（222）将步骤（221）得到的pMCSG10-CV1218种子液加入到含1L的LB液体培养基的试验容器中，在摇床内以37℃、200rpm震荡培养至含CV1218表达载体的菌液浓度OD600=0.7-0.9为止，随后将试验容器并置于冰浴中30min，其中：
LB液体培养基中含氨苄青霉素，其浓度为50μg/mL；
（223）向经过步骤（222）处理的菌液中分别加入适量的硫酸亚铁铵、5-氨基乙酰丙酸、IPTG，使得硫酸亚铁铵在菌液中的浓度为40μM，5-氨基乙酰丙酸在菌液中的浓度为0.25mM，IPTG在菌液中的浓度为0.1mM，然后混匀后放入摇床内以18℃、200rpm诱导培养16h；
（224）将经过步骤（223）诱导完毕的菌液倒入离心杯，4000g离心15min，弃上清液，沉淀表面用ddH2O清洗，随后加入30mL上样缓冲液将沉淀菌体重悬至无明显菌块得到菌体重悬液，其中：
所述上样缓冲液的pH值为8.0；
所述上样缓冲液包括：100mM Tris-HCl、300mM NaCl、15mM咪唑、10%v/v甘油，余量为水；
（225）利用超生破碎仪将步骤（224）得到的菌体重悬液破碎，其中：
变幅杆直径为6mm；
破碎程序为：能量40%，超声循环工作时间2s、暂停时间4s，工作总时间30min；
（226）将破碎后的菌液以10000g低温离心15min，取上清液，即得到CV1218蛋白粗制裂解液。
4.如权利要求1所述的一种GSK-3β抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤（23）的具体步骤如下：
（231）取10μL的pET26b-MarC菌种溶液，加入到5mL的LB液体培养基中，37℃、200rpm震荡过夜培养，得到pET26b-MarC种子液，其中：
LB液体培养基中含卡那霉素，其浓度为50μg/mL；
（232）将步骤（231）得到的pET26b-MarC种子液加入到含1L的LB液体培养基的试验容器中，在摇床内以37℃、200rpm震荡培养至含MarC表达载体的菌液浓度OD600=0.9-1.1为止，随后将试验容器取出并置于冰浴中30min，其中：
LB液体培养基中含卡那霉素，其浓度为50μg/mL；
（233）向经过步骤（232）处理的菌液中分别加入硫酸亚铁铵、5-氨基乙酰丙酸、IPTG，使得硫酸亚铁铵在菌液中的浓度为40μM，5-氨基乙酰丙酸在菌液中的浓度为0.25mM，IPTG在菌液中的浓度为0.1mM，然后混匀后放入摇床内以18℃、200rpm诱导培养16h；
（234）将经过步骤（233）诱导完毕的菌液倒入离心杯，4000g离心15min，弃上清液，沉淀表面用ddH2O清洗，随后加入30mL上样缓冲液将沉淀菌体重悬至无明显菌块得到菌体重悬液，其中：
所述上样缓冲液的pH值为8.0；
所述上样缓冲液包括：100mM Tris-HCl、300mM NaCl、15mM咪唑、10%v/v甘油，余量为水；
（235）利用超生破碎仪将菌体重悬液破碎，其中：
变幅杆直径为6mm；
破碎程序为：能量40%，超声循环工作时间2s、暂停时间4s，工作总时间30min；
（236）将破碎后的菌液以10000g低温离心15min，取上清液即得到MarC蛋白粗制裂解液。
5.如权利要求1所述的一种GSK-3β抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤（31）中所述NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液的浓度为1M，pH值为8.0；
所述(NH4)2SO4储备液的浓度为2M。
6.如权利要求1所述的一种GSK-3β抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤（4）中的后处理的具体步骤如下：
将步骤三得到的反应液用1N稀盐酸调节至pH=1，然后向其中加入1L乙酸乙酯萃取至少三次，乳化层使用硅藻土过滤后分液，合并有机相并使用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到粗产物，然后将粗产物使用硅胶柱色谱进行纯化，DCM/MeOH=18:1条件下洗脱得到橙红色产物即得到GSK-3β抑制剂。
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| GR01 | Patent grant | ||
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