CN117384165A

CN117384165A - 一种用于egfr蛋白靶向降解的嵌合体化合物、其制备方法及其在医药上的应用

Info

Publication number: CN117384165A
Application number: CN202310850361.4A
Authority: CN
Inventors: 贾敏强; 吴婷; 陈刚; 贺峰; 陶维康
Original assignee: Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd; Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd; Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2022-07-12
Filing date: 2023-07-12
Publication date: 2024-01-12

Abstract

本公开涉及一种用于EGFR蛋白靶向降解的嵌合体化合物、其制备方法及其在医药上的应用。具体而言，本公开涉及一种通式(I)所示的螺环类化合物、其制备方法及含有该螺环类化合物的药物组合物以及其作为治疗剂的用途，特别是作为EGFR降解剂的用途和在制备用于治疗和/或预防EGFR介导的或依赖性的疾病或病症的药物中的用途。

Description

一种用于EGFR蛋白靶向降解的嵌合体化合物、其制备方法及其在医药上的应用

技术领域

本公开属于医药领域，是关于一种新型蛋白降解靶向嵌合体(PROTAC)化合物，其制备方法，及其在医药上的应用。具体而言，本公开涉及一种通式(I)所示的螺环类化合物、其制备方法及含有该螺环类化合物的药物组合物以及其作为治疗剂的用途，特别是作为EGFR降解剂的用途和在制备用于治疗和/或预防EGFR介导的或依赖性的疾病或病症的药物中的用途。

背景技术

PROTAC(Proteolysis Targeting Chimera)是一种杂合双功能小分子化合物。其结构中含有两种不同配体:一个是泛素连接酶E3配体,另一个是与靶蛋白结合配体,两个配体之间由连接臂相连。PROTAC通过将靶蛋白和细胞内的泛素连接酶E3拉近,形成靶蛋白-PROTAC-E3三元复合物,接着E3泛素连接酶给靶蛋白标记泛素化蛋白标签,随后启动细胞内强大的泛素化—蛋白酶体系统，特异性地降解靶蛋白，进而达到抑制相应蛋白信号通路的作用(Cell Biochem Funct.2019,37,21-30)。与传统的小分子抑制剂相比,PROTAC展现出了独特的优势:1、PROTAC不需要与目标靶蛋白长时间和高强度的结合,并且降解靶蛋白过程类似于催化反应,可循环结合，降解靶蛋白。从而降低药物的系统暴露量，减少毒副作用的发生。2、靶蛋白被降解后需要重新合成才能恢复功能,因此降解靶蛋白比抑制其活性显示出更加高效、持久的抗肿瘤作用，且不易发生因靶蛋白突变而产生的耐药性。3、对于目前认为不可成药的靶点，例如转录因子，支架蛋白和调控蛋白等，PROTAC也具有治疗潜力(Cell Chem.Biol.2018,25,67-77)。

肺癌是最为常见的恶性肿瘤之一。非小细胞肺癌是最常见的肺癌类型，发病率约占肺癌总数的85％左右。表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)属于具有酪氨酸激酶活性的细胞表面受体家族。EGFR突变是最常见的非小细胞肺癌驱动基因，大约40％的中国非小细胞肺癌患者存在EGFR突变，而11-16％的西方国家病人存在EGFR突变。EGFR的突变形式大约90％是19号外显子的缺失(Del19突变)和21号外显子的L858R点突变。

多个EGFR小分子抑制剂已经被批准上市，成功应用于具有EGFR突变的非小细胞肺癌的治疗，成为晚期非小细胞肺癌病人的主要治疗手段之一。第一代EGFR酪氨酸激酶抑制剂以吉非替尼和厄洛替尼为代表是可逆结合的靶向性药物，通过与ATP竞争结合EGFR激酶的结构域，达到抑制其活化的效果。但是大多数病人在经过10-12月的治疗后，会产生耐药，大约50％的病人耐药是由于产生了T790M的二次突变。第二代EGFR酪氨酸激酶抑制剂以阿法替尼为代表是不可逆的靶向药物，但是不能够解决T790M突变耐药问题，并且由于对于野生型EGFR缺少选择性使得化合物毒性较大。第三代EGFR酪氨酸激酶抑制剂奥西替尼的出现克服了由于EGFR T790M基因突变导致的耐药，且对野生型EGFR的抑制较弱、选择性好，在临床上取得了巨大成功，但是使用9-14个月之后会产生新的耐药，研究揭示6-26％的病人产生了C797X或其它EGFR依赖的基因突变(JAMA Oncol.2018,4,1527-1534；Br JCancer.2019Oct；121(9):725-737.)。

目前在市场上尚缺少针对EGFR C797X基因突变的单独用药有效的EGFR抑制剂，因此有必要开发新的用于非小细胞肺癌的治疗手段。不同于EGFR抑制剂，利用PROTAC技术可以降解EGFR，能够更加有效地抑制EGFR信号通路，有可能成为有潜力的非小细胞肺癌治疗方法。已公开的EGFR蛋白靶向降解PROTAC化合物的专利申请包括WO2017185036A1、WO2018119441A1、WO2019121562A1、WO2019149922A1、WO2021121261A1、WO2021127561A1、WO2021039622A1、WO2022055181A1、WO2022012623A1、WO2022068849A1。

发明内容

本公开的目的在于提供一种通式(I)所示的化合物或其可药用的盐，

其中：

PTM为结合至靶蛋白或多肽的小分子化合物配体；

L为连接单元；

为单键或双键；

G¹为N或CR^A；

G²为N或CR^B；

G³为N或CR^C；

G⁴为N或CR^D；

X为N或CR；

R^A、R^B、R^C和R^D相同或不同，且各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、羟基、羟烷基、氰基、硝基、氨基、环烷基、

条件是G¹、G²、G³和G⁴不同时为N，且R^A、R^B、R^C和R^D中至少有一个选自

R选自氢原子、卤素、烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、羟基、羟烷基、氰基、硝基和氨基；

R¹、R²、R³和R⁴相同或不同，且各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、羟基、羟烷基、氰基、硝基和氨基；或者

R¹、R²与所连的碳原子一起形成羰基，或者R³、R⁴与所连的碳原子一起形成羰基；且

m和n相同或不同，且各自独立地为0、1或2。

在本公开一些实施方案中，所述的通式(I)所示的化合物或其可药用的盐，其中PTM为

其中：

表示该五元环为芳香的环或非芳香的环；

Q选自N、C(O)和CH；

环B为芳基或杂芳基；

R⁵、R^5a、R⁶和R⁷相同或不同，且各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、羟基、羟烷基、氰基、硝基、氨基、环烷基和杂环基，所述的环烷基和杂环基各自独立地任选被选自氧代基、卤素、烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、羟基、羟烷基、氰基、硝基和氨基中的一个或多个取代基所取代；

各个R⁸相同或不同，且各自独立地选自卤素、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、羟基、羟烷基、氰基、硝基和氨基；

r为0、1、2、3、4或5。

在本公开一些实施方案中，所述的通式(I)所示的化合物或其可药用的盐，其中L为J¹-J²-J³-J⁴-J⁵-J⁶，其中J¹与苯环相连，J⁶与X相连；

J¹选自炔基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，所述的环烷基、杂环基、芳基和杂芳基各自独立地任选被选自氧代基、卤素、烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、羟基、羟烷基、氰基、硝基和氨基中的一个或多个取代基所取代；

J²、J³、J⁴、J⁵和J⁶相同或不同，且各自独立地选自单键、(CR^ER^F)_s、NR^G、O、S、C(O)、S(O)₂、芳环、杂芳环、环烷基和杂环基，所述的芳环、杂芳环、环烷基和杂环基各自独立地任选被选自氧代基、卤素、烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、羟基、羟烷基、氰基、硝基和氨基中的一个或多个取代基所取代；

R^E和R^F相同或不同，且各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、羟基、羟烷基、氰基和氨基；

R^G选自氢原子、烷基、卤代烷基、羟烷基、环烷基、杂环基、环烷基烷基和杂环基烷基；且

s为1、2或3。

在本公开一些实施方案中，所述的通式(I)所示的化合物或其可药用的盐，其中J³为3至12元杂环基，所述的3至12元杂环基任选被选自氧代基、卤素、C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6卤代烷氧基、羟基、C_1-6羟烷基、氰基、硝基和氨基中的一个或多个取代基所取代；优选地，J³选自如下环：

所述的环任选被选自氧代基、卤素、C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6卤代烷氧基、羟基、C_1-6羟烷基、氰基、硝基和氨基中的一个或多个取代基所取代，其中带*的键与J⁴相连接；再优选地，J³选自/> 进一步优选地，J³为更优选地，J³为/>

在本公开一些实施方案中，所述的通式(I)所示的化合物或其可药用的盐，其中J⁴为C(O)或CH₂，优选为C(O)。

在本公开一些实施方案中，所述的通式(I)所示的化合物或其可药用的盐，其中L，即J¹-J²-J³-J⁴-J⁵-J⁶，选自以下结构：

优选为

更优选为其中带*的键与X相连接。

在本公开一些实施方案中，所述的通式(I)所示的化合物或其可药用的盐，其为通式(II)所示的化合物或其可药用的盐：

其中：

环C为含氮杂环基；

各个R⁹相同或不同，且各自独立地选自氧代基、卤素、烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、羟基、羟烷基、氰基、硝基和氨基；

p为0、1、2、3、4或5；

J²、J⁵和J⁶相同或不同，且各自独立地选自单键、(CR^ER^F)_s、NR^G、O、S、C(O)、S(O)₂、芳环、杂芳环、环烷基和杂环基，所述的芳环、杂芳环、环烷基和杂环基各自独立地任选被选自氧代基、卤素、烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、羟基、羟烷基、氰基、硝基和氨基中的一个或多个取代基所取代；

s为1、2或3；

X、G¹、G²、G³、G⁴、R¹、R²、R³、R⁴、m和n如通式(I)中所定义，/>环B、Q、R⁵、R^5a、R⁶、R⁷、R⁸和r如通式(M)中所定义。

在本公开一些实施方案中，所述的通式(M)或(II)所示的化合物或其可药用的盐，其中为双键时，R¹不存在。

在本公开一些实施方案中，所述的通式(M)或(II)所示的化合物或其可药用的盐，其中为/>优选地，/>为/>

在本公开一些实施方案中，所述的通式(I)或(II)所示的化合物或其可药用的盐，其为通式(III)所示的化合物或其可药用的盐：

其中：

X、G¹、G²、G³、G⁴、R¹、R²、R³、R⁴、m、n、环B、R⁵、R^5a、R⁶、R⁷、R⁸、r、J¹、J²、J⁵、J⁶、环C、R⁹和p如通式(II)中所定义。

在本公开一些实施方案中，所述的通式(M)、(II)或(III)所示的化合物或其可药用的盐，其中为/> 其中环B、R⁷、R⁸和r如通式(II)中所定义。

在本公开一些实施方案中，所述的通式(I)、(II)或(III)所示的化合物或其可药用的盐，其中G¹为CR^A，R^A选自且G²、G³和G⁴为CH；或G²为CR^B，R^B选自/>且G¹、G³和G⁴为CH；或G³为CR^C，R^C选自/>且G¹、G²和G⁴为CH；或G⁴为CR^D，R^D选自且G¹、G²和G³为CH。

在本公开一些实施方案中，所述的通式(I)、(II)或(III)所示的化合物或其可药用的盐，其中选自/>

在本公开一些实施方案中，所述的通式(I)、(II)或(III)所示的化合物或其可药用的盐，其中为/> 优选为/>

在本公开一些实施方案中，所述的通式(I)、(II)或(III)所示的化合物或其可药用的盐，其中X为N。

在本公开一些实施方案中，所述的通式(I)、(II)或(III)所示的化合物或其可药用的盐，其中X为N或CR，R如通式(I)中所定义；优选地，X为N或CR，R为羟基。

在本公开一些实施方案中，所述的通式(I)、(II)或(III)所示的化合物或其可药用的盐，其中R选自氢原子、卤素和羟基；优选地，R选自氢原子、F和羟基；更优选地，R为氢原子。

在本公开一些实施方案中，所述的通式(I)、(II)或(III)所示的化合物或其可药用的盐，其中R为羟基。

在本公开一些实施方案中，所述的通式(I)、(II)或(III)所示的化合物或其可药用的盐，其中R¹为氢原子或者氟原子；和/或R²为氢原子或者氟原子。

在本公开一些实施方案中，所述的通式(I)、(II)或(III)所示的化合物或其可药用的盐，其中R¹选自氢原子、卤素、C_1-6烷基和C_1-6卤代烷基；优选地，R¹为氢原子或者氟原子；更优选地，R¹为氢原子。

在本公开一些实施方案中，所述的通式(I)、(II)或(III)所示的化合物或其可药用的盐，其中R²选自氢原子、卤素、C_1-6烷基和C_1-6卤代烷基；优选地，R²为氢原子或者氟原子；更优选地，R²为氢原子。

在本公开一些实施方案中，所述的通式(I)、(II)或(III)所示的化合物或其可药用的盐，其中R³为氢原子；和/或R⁴为氢原子。

在本公开一些实施方案中，所述的通式(I)、(II)或(III)所示的化合物或其可药用的盐，其中R³选自氢原子、卤素、C_1-6烷基和C_1-6卤代烷基；优选地，R³为氢原子。

在本公开一些实施方案中，所述的通式(I)、(II)或(III)所示的化合物或其可药用的盐，其中R⁴选自氢原子、卤素、C_1-6烷基和C_1-6卤代烷基；优选地，R⁴为氢原子。

在本公开一些实施方案中，所述的通式(M)、(II)或(III)所示的化合物或其可药用的盐，其中环B为五元或六元杂芳基；优选地，环B为噻唑基；和/或r为0。

在本公开一些实施方案中，所述的通式(M)、(II)或(III)所示的化合物或其可药用的盐，其中环B为五元或六元杂芳基；优选地，环B为吡啶基或噻唑基；更优选地，环B为噻唑基。

在本公开一些实施方案中，所述的通式(M)、(II)或(III)所示的化合物或其可药用的盐，其中r为0或1；优选地r为0。

在本公开一些实施方案中，所述的通式(M)、(II)或(III)所示的化合物或其可药用的盐，其中各个R⁸相同或不同，且各自独立地选自卤素、C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6卤代烷氧基、羟基、C_1-6羟烷基、氰基和氨基；优选地，各个R⁸相同或不同，且各自独立地选自卤素、C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基。

在本公开一些实施方案中，所述的通式(M)、(II)或(III)所示的化合物或其可药用的盐，其中R⁵为卤素；和/或R^5a和R⁶均为氢原子。

在本公开一些实施方案中，所述的通式(M)、(II)或(III)所示的化合物或其可药用的盐，其中R⁵选自氢原子、卤素、C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6卤代烷氧基、羟基、C_1-6羟烷基、氰基和氨基；优选地，R⁵选自氢原子、卤素、C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基；进一步优选地，R⁵为卤素；更优选地，R⁵为F。

在本公开一些实施方案中，所述的通式(M)、(II)或(III)所示的化合物或其可药用的盐，其中R^5a选自氢原子、卤素、C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6卤代烷氧基、羟基、C_1-6羟烷基、氰基和氨基；优选地，R^5a选自氢原子、卤素、C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基；进一步优选地，R^5a为氢原子。

在本公开一些实施方案中，所述的通式(M)、(II)或(III)所示的化合物或其可药用的盐，其中R⁶选自氢原子、卤素、C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6卤代烷氧基、羟基、C_1-6羟烷基、氰基和氨基；优选地，R⁶选自氢原子、卤素、C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基；进一步优选地，R⁶为氢原子。

在本公开一些实施方案中，所述的通式(M)、(II)或(III)所示的化合物或其可药用的盐，其中R⁷选自氢原子、卤素、C_1-6烷基和C_1-6卤代烷基；优选地，R⁷为氢原子或者氟原子；更优选地，R⁷为氢原子。

在本公开一些实施方案中，所述的通式(II)或(III)所示的化合物或其可药用的盐，其中环C为优选地，环C为/>其中带*的键与C(O)相连接；和/或p为0。

在本公开一些实施方案中，所述的通式(II)或(III)所示的化合物或其可药用的盐，其中环C为3至12元杂环基；优选地，环C选自

进一步优选地，环C为/>更优选地，环C为其中带*的键与C(O)相连接。

在本公开一些实施方案中，所述的通式(II)或(III)所示的化合物或其可药用的盐，其中p为0或1；优选地，p为0。

在本公开一些实施方案中，所述的通式(I)、(II)或(III)所示的化合物或其可药用的盐，其中J¹-J²为6至10元芳基或5至10元杂芳基；优选地，J¹-J²为苯基或6元杂芳基；进一步优选地，J¹-J²为苯基或吡啶基；更优选地，J¹-J²为苯基；最优选地，J¹-J²为

在本公开一些实施方案中，所述的通式(I)、(II)或(III)所示的化合物或其可药用的盐，其中J⁵-J⁶为C_1-6亚烷基；优选地，J⁵-J⁶为CH₂。

在本公开一些实施方案中，所述的通式(II)或(III)所示的化合物或其可药用的盐，其中为/> 优选为/>其中带*的键与X相连接。在本公开一些实施方案中，所述的通式(II)或(III)所示的化合物或其可药用的盐，其中各个R⁹相同或不同，且各自独立地选自卤素、C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6卤代烷氧基、羟基、C_1-6羟烷基、氰基和氨基；优选地，各个R⁹相同或不同，且各自独立地选自卤素、C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基、氨基和羟基；更优选地，各个R⁹相同或不同，且各自独立地选自卤素、C_1-6烷基和C_1-6卤代烷基。

在本公开一些实施方案中，所述的通式(I)、(II)或(III)所示的化合物或其可药用的盐，其中m为0，且n为1；或者m为1，且n为0；或者m和n均为1。

在本公开一些实施方案中，所述的通式(I)所示的化合物或其可药用的盐，其中PTM为通式(M)；L选自其中带*的键与X相连接；/>选自 R³为氢原子；R⁴为氢原子；X为N或CR，R为羟基；R⁵为卤素；R^5a为氢原子；R⁶为氢原子；R⁷为氢原子；环B为噻唑基；r为0；且/>为/>

在本公开一些实施方案中，所述的通式(II)所示的化合物或其可药用的盐，其中选自/>

R³选自氢原子、卤素、C_1-6烷基和C_1-6卤代烷基；R⁴为氢原子；X为N；/>为/>R⁵为卤素；R^5a选自氢原子、卤素、C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基；R⁶选自氢原子、卤素、C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基；R⁷选自氢原子、卤素、C_1-6烷基和C_1-6卤代烷基；环B为五元或六元杂芳基；r为0或1；R⁸选自卤素、C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基；环C为/>p为0或1；R⁹选自卤素、C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基、氨基和羟基；J¹-J²为苯基或6元杂芳基；且J⁵-J⁶为C_1-6亚烷基。

在本公开一些实施方案中，所述的通式(III)所示的化合物或其可药用的盐，其中选自/>/> R³为氢原子；R⁴为氢原子；X为N；R⁵为卤素；R^5a为氢原子；R⁶为氢原子；R⁷为氢原子；环B为噻唑基；r为0；环C为/>p为0；J¹-J²为苯基；且J⁵-J⁶为CH₂。

在本公开一些实施方案中，所述的通式(III)所示的化合物或其可药用的盐，其中选自/> R³为氢原子；R⁴为氢原子；X为N或CR，R为羟基；R⁵为卤素；R^5a为氢原子；R⁶为氢原子；R⁷为氢原子；环B为噻唑基；r为0；环C为/>p为0；J¹-J²为苯基；且J⁵-J⁶为CH₂。

在本公开一些实施方案中，所述的通式(III)所示的化合物或其可药用的盐，其中为/>R⁵为卤素；R^5a为氢原子；R⁶为氢原子；R⁷为氢原子；环B为噻唑基；r为0；环C为/>p为0；J¹-J²为苯基；且J⁵-J⁶为CH₂。

表A本公开的典型化合物包括但不限于：

/>

进一步，本公开提供一种通式(IIA)所示的化合物或其盐：

其中：

X、G¹、G²、G³、G⁴、R¹、R²、R³、R⁴、m、n、J⁵和J⁶如通式(II)中所定义。

表B本公开的典型中间体化合物包括但不限于：

/>

本公开的另一方面涉及一种制备通式(II)所示的化合物或其可药用的盐的方法，其包括：

通式(IIA)所示的化合物或其盐与通式(IIB)所示的化合物或其盐，发生缩合反应得到通式(II)所示的化合物或其可药用的盐；

其中：

X、G¹、G²、G³、G⁴、R¹、R²、R³、R⁴、m、n、/>环B、Q、R⁵、R^5a、R⁶、R⁷、R⁸、r、环C、R⁹、p、J¹、J²、J⁵和J⁶如通式(II)中所定义。

本公开的另一方面涉及一种制备通式(III)所示的化合物或其可药用的盐的方法，其包括：

通式(IIA)所示的化合物或其盐与通式(IIIB)所示的化合物或其盐，发生缩合反应得到通式(III)所示的化合物或其可药用的盐；

其中：

X、G¹、G²、G³、G⁴、R¹、R²、R³、R⁴、m、n、环B、R⁵、R^5a、R⁶、R⁷、R⁸、r、环C、R⁹、p、J¹、J²、J⁵和J⁶如通式(III)中所定义。

本公开的另一方面涉及一种药物组合物，所述药物组合物含有本公开上述通式(I)、通式(II)、通式(III)或表A所示的化合物或其可药用的盐，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

本公开进一步涉及上述通式(I)、通式(II)、通式(III)或表A所示的化合物或其可药用的盐，或包含其的药物组合物在制备用于调节受试者体内的EGFR蛋白泛素化和降解的药物中的用途。

本公开进一步涉及上述通式(I)、通式(II)、通式(III)或表A所示的化合物或其可药用的盐，或包含其的药物组合物在制备用于治疗和/或预防由EGFR介导的或依赖性的疾病或病症的药物中的用途。

本公开进一步涉及上述通式(I)、通式(II)、通式(III)或表A所示的化合物或其可药用的盐，或包含其的药物组合物在制备用于治疗和/或预防癌症的药物中的用途；优选地，所述的癌症选自鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、食管癌、头颈癌、鼻咽癌、口腔癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、白血病、淋巴瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、黑素瘤、肉瘤、子宫内膜癌、睾丸癌和甲状腺癌；进一步优选为肺癌；更优选为非小细胞肺癌。

本公开还涉及一种调节受试者体内的EGFR蛋白泛素化和降解的方法，其包括给予所需患者治疗有效量的上述通式(I)、通式(II)、通式(III)或表A所示的化合物或其可药用的盐，或包含其的药物组合物。

本公开还涉及一种治疗和/或预防由EGFR介导的或依赖性的疾病或病症的方法，其包括给予所需患者治疗有效量的上述通式(I)、通式(II)、通式(III)或表A所示的化合物或其可药用的盐，或包含其的药物组合物。

本公开还涉及一种治疗和/或预防癌症的方法，其包括给予所需患者治疗有效量的上述通式(I)、通式(II)、通式(III)或表A所示的化合物或其可药用的盐，或包含其的药物组合物；优选地，所述的癌症选自鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、食管癌、头颈癌、鼻咽癌、口腔癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、白血病、淋巴瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、黑素瘤、肉瘤、子宫内膜癌、睾丸癌和甲状腺癌；进一步优选为肺癌；更优选为非小细胞肺癌。

本公开进一步涉及一种上述通式(I)、通式(II)、通式(III)或表A所示的化合物或其可药用的盐，或包含其的药物组合物，其用作药物。

本公开进一步涉及一种上述通式(I)、通式(II)、通式(III)或表A所示的化合物或其可药用的盐，或包含其的药物组合物，其用作调节受试者体内的EGFR蛋白泛素化和降解的药物。

本公开进一步涉及一种上述通式(I)、通式(II)、通式(III)或表A所示的化合物或其可药用的盐，或包含其的药物组合物，其用作治疗和/或预防由EGFR介导的或依赖性的疾病或病症的药物。

本公开进一步涉及上述通式(I)、通式(II)、通式(III)或表A所示的化合物或其可药用的盐，或包含其的药物组合物，其用于调节受试者体内的EGFR蛋白泛素化和降解。

本公开进一步涉及上述通式(I)、通式(II)、通式(III)或表A所示的化合物或其可药用的盐，或包含其的药物组合物，其用于治疗和/或预防由EGFR介导的或依赖性的疾病或病症。

本公开进一步涉及一种上述通式(I)、通式(II)、通式(III)或表A所示的化合物或其可药用的盐，或包含其的药物组合物，其用于治疗和/或预防癌症；优选地，所述的癌症选自鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、食管癌、头颈癌、鼻咽癌、口腔癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、白血病、淋巴瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、黑素瘤、肉瘤、子宫内膜癌、睾丸癌和甲状腺癌；进一步优选为肺癌；更优选为非小细胞肺癌。

优选地，本公开中所述的由EGFR介导的或依赖性的疾病或病症为癌症；所述的疾病或病症优选选自鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、食管癌、头颈癌、鼻咽癌、口腔癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、白血病、淋巴瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、黑素瘤、肉瘤、子宫内膜癌、睾丸癌和甲状腺癌；进一步优选为肺癌；更优选为非小细胞肺癌。

本公开所述的癌症优选为具有L858R、T790M和/或C797X突变的EGFR蛋白。

本公开所述的癌症优选为具有L858R突变的EGFR蛋白。

本公开所述的癌症优选为具有T790M突变的EGFR蛋白。

本公开所述的癌症优选为具有C797X突变的EGFR蛋白。

本公开所述的癌症优选为具有L858R和T790M突变的EGFR蛋白。

本公开所述的癌症优选为具有L858R和C797X突变的EGFR蛋白。

本公开所述的癌症优选为具有T790M和C797X突变的EGFR蛋白。

本公开所述的癌症优选为具有L858R、T790M和C797X突变的EGFR蛋白。

本公开所述的C797X突变优选为C797S突变；其中X代表包括S的任何氨基酸。

可将活性化合物制成适合于通过任何适当途径给药的形式，活性化合物优选是以单位剂量的方式，或者是以患者可以以单剂自我给药的方式。本公开化合物或组合物的单位剂量的表达方式可以是片剂、胶囊、扁囊剂、瓶装药水、药粉、颗粒剂、锭剂、栓剂、再生药粉或液体制剂。

作为一般性指导，合适的单位剂量可以是0.1～1000mg。

本公开的药物组合物除活性化合物外，可含有一种或多种辅料，所述辅料选自以下成分：填充剂(稀释剂)、粘合剂、润湿剂、崩解剂或赋形剂等。根据给药方法的不同，组合物可含有0.1至99重量％的活性化合物。

含活性成分的药物组合物可以是适用于口服的形式，例如片剂、糖锭剂、锭剂、水或油混悬液、可分散粉末或颗粒、乳液、硬或软胶囊，或糖浆剂或酏剂。可按照本领域任何已知制备药用组合物的方法制备口服组合物，此类组合物可含有一种或多种选自以下的成分：甜味剂、矫味剂、着色剂和防腐剂，以提供悦目和可口的药用制剂。片剂含有活性成分和用于混合的适宜制备片剂的无毒的可药用的赋形剂。这些赋形剂可以是惰性赋形剂、造粒剂、崩解剂、粘合剂和润滑剂。这些片剂可以不包衣或可通过掩盖药物的味道或在胃肠道中延迟崩解和吸收，因而在较长时间内提供缓释作用的已知技术将其包衣。

也可用其中活性成分与惰性固体稀释剂或其中活性成分与水溶性载体或油溶媒混合的软明胶胶囊提供口服制剂。

水混悬液含有活性物质和用于混合的适宜制备水混悬液的赋形剂。此类赋形剂是悬浮剂、分散剂或湿润剂。水混悬液也可以含有一种或多种防腐剂、一种或多种着色剂、一种或多种矫味剂和一种或多种甜味剂。

油混悬液可通过使活性成分悬浮于植物油或矿物油配制而成。油悬浮液可含有增稠剂。可加入上述的甜味剂和矫味剂，以提供可口的制剂。可通过加入抗氧化剂保存这些组合物。

本公开的药物组合物也可以是水包油乳剂的形式。油相可以是植物油、矿物油或其混合物。适宜的乳化剂可以是天然产生的磷脂，乳剂也可以含有甜味剂、矫味剂、防腐剂和抗氧剂。此类制剂也可含有缓和剂、防腐剂、着色剂和抗氧剂。

本公开的药物组合物可以是无菌注射水溶液形式。可以使用的可接受的溶媒或溶剂有水、林格氏液和等渗氯化钠溶液。无菌注射制剂可以是其中活性成分溶于油相的无菌注射水包油微乳，可通过局部大量注射将注射液或微乳注入患者的血流中。或者，最好按可保持本公开化合物恒定循环浓度的方式给予溶液和微乳。为保持这种恒定浓度，可使用连续静脉内递药装置。这种装置的实例是Deltec CADD-PLUS.TM.5400型静脉注射泵。

本公开的药物组合物可以是用于肌内和皮下给药的无菌注射水或油混悬液的形式。可按已知技术，用适宜的分散剂或湿润剂和悬浮剂配制该混悬液。无菌注射制剂也可以是在肠胃外可接受的无毒稀释剂或溶剂中制备的无菌注射溶液或混悬液。此外，可方便地用无菌固定油作为溶剂或悬浮介质。为此目的，可使用任何调和固定油。此外，脂肪酸也可以制备注射剂。

可按用于直肠给药的栓剂形式给予本公开化合物。可通过将药物与在普通温度下为固体但在直肠中为液体，因而在直肠中会溶化而释放药物的适宜的无刺激性赋形剂混合来制备这些药物组合物。

如本领域技术人员所熟知的，药物的给药剂量依赖于多种因素，包括但并非限定于以下因素：所用具体化合物的活性、患者的年龄、患者的体重、患者的健康状况、患者的行为、患者的饮食、给药时间、给药方式、排泄的速率、药物的组合、疾病的严重性等；另外，最佳的治疗方式如治疗的模式、化合物的日用量或可药用的盐的种类可以根据传统的治疗方案来验证。

术语说明

除非有相反陈述，在说明书和权利要求书中使用的术语具有下述含义。

术语“烷基”指饱和的直链或带有支链的脂肪族烃基，其具有1至20个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)碳原子(即C_1-20烷基)。所述烷基优选具有1至12个碳原子的烷基(即C_1-12烷基)，更优选具有1至6个碳原子的烷基(即C_1-6烷基)。非限制性的实例包括：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2,3-二甲基己基、2,4-二甲基己基、2,5-二甲基己基、2,2-二甲基己基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、正壬基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2,2-二乙基戊基、正癸基、3,3-二乙基己基、2,2-二乙基己基，及其各种支链异构体等。烷基可以是取代的或非取代的，当被取代时，其可以在任何可使用的连接点被取代，取代基优选选自D原子、卤素、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、环烷基氧基、杂环基氧基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个。

术语“亚烷基”指二价烷基，其中烷基如上所定义，其具有1至20个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)碳原子(即C_1-20亚烷基)。所述亚烷基优选具有1至12个碳原子的亚烷基(即C_1-12亚烷基)，更优选具有1至6个碳原子的亚烷基(即C_1-6亚烷基)。非限制性的实例包括：-CH₂-、-CH(CH₃)-、-C(CH₃)₂-、-CH₂CH₂-、-CH(CH₂CH₃)-、-CH₂CH(CH₃)-、-CH₂C(CH₃)₂-、-CH₂CH₂CH₂-、-CH₂CH₂CH₂CH₂-等。亚烷基可以是取代的或非取代的，当被取代时，其可以在任何可使用的连接点被取代，取代基优选选自D原子、卤素、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、环烷基氧基、杂环基氧基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个。

术语“烯基”指分子中含有至少一个碳碳双键的烷基，其中烷基的定义如上所述，其具有2至12个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个)碳原子(即C_2-12烯基)。所述烯基优选具有2至6个碳原子的烯基(即C_2-6烯基)。非限制性的实例包括：乙烯基、丙烯基、异丙烯基、丁烯基等。烯基可以是取代的或非取代的，当被取代时，其可以在任何可使用的连接点被取代，取代基优选选自D原子、烷氧基、卤素、卤代烷基、卤代烷氧基、环烷基氧基、杂环基氧基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个。

术语“炔基”指分子中含有至少一个碳碳三键的烷基，其中烷基的定义如上所述，其具有2至12个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个)碳原子(即C_2-12炔基)。所述炔基优选具有2至6个碳原子的炔基(即C_2-6炔基)。非限制性的实例包括：乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基等。炔基可以是取代的或非取代的，当被取代时，其可以在任何可使用的连接点被取代，取代基优选选自D原子、烷氧基、卤素、卤代烷基、卤代烷氧基、环烷基氧基、杂环基氧基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个。

术语“烷氧基”指-O-(烷基)，其中烷基的定义如上所述。非限制性的实例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基和丁氧基等。烷氧基可以是取代的或非取代的，当被取代时，其可以在任何可使用的连接点被取代，取代基优选选自D原子、卤素、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、环烷基氧基、杂环基氧基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个。

术语“环烷基”指饱和或部分不饱和的单环全碳环(即单环环烷基)或多环系统(即多环环烷基)，其具有3至20个(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)环原子(即3至20元环烷基)。所述环烷基优选具有3至12个环原子的环烷基(即3至12元环烷基)，更优选具有3至8个环原子的环烷基(即3至8元环烷基)，最优选具有3至6个环原子的环烷基(即3至6元环烷基)。

所述的单环环烷基，非限制性的实例包括：环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环己二烯基、环庚基、环庚三烯基和环辛基等。

所述的多环环烷基包括：螺环烷基、稠环烷基和桥环烷基。

术语“螺环烷基”指环之间共用一个碳原子(称螺原子)的多环系统，其环内可以含有一个或多个双键，或其环内可以含有一个或多个选自氮、氧和硫的杂原子(所述的氮可任选被氧化，即形成氮氧化物；所述的硫可任选被氧代，即形成亚砜或砜，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-)，条件是至少含有一个全碳环且连接点在该全碳环上，其具有5至20个(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)环原子(即5至20元螺环烷基)。所述螺环烷基优选具有6至14个环原子的螺环烷基(即6至14元螺环烷基)，更优选具有7至10个环原子的螺环烷基(即7至10元螺环烷基)。所述螺环烷基包括单螺环烷基和多螺环烷基(如双螺环烷基等)，优选单螺环烷基或双螺环烷基，更优选3元/4元、3元/5元、3元/6元、4元/4元、4元/5元、4元/6元、5元/3元、5元/4元、5元/5元、5元/6元、5元/7元、6元/3元、6元/4元、6元/5元、6元/6元、6元/7元、7元/5元或7元/6元单螺环烷基。非限制性的实例包括：

其连接点可在任意位置；

等。

术语“稠环烷基”指环之间共享毗邻的两个碳原子的多环系统，其为单环环烷基与一个或多个单环环烷基稠合，或者单环环烷基与杂环基、芳基或杂芳基中的一个或多个稠合，其中连接点在单环环烷基上，其环内可以含有一个或多个双键，且具有5至20个(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)环原子(即5至20元稠环烷基)。所述稠环烷基优选具有6至14个环原子的稠环烷基(即6至14元稠环烷基)，更优选具有7至10个环原子的稠环烷基(即7至10元稠环烷基)。所述稠环烷基包括双环稠环烷基和多环稠环烷基(如三环稠环烷基、四环稠环烷基等)，优选双环稠环烷基或三环稠环烷基，更优选3元/4元、3元/5元、3元/6元、4元/4元、4元/5元、4元/6元、5元/3元、5元/4元、5元/5元、5元/6元、5元/7元、6元/3元、6元/4元、6元/5元、6元/6元、6元/7元、7元/5元或7元/6元双环稠环烷基。非限制性的实例包括：

，其连接点可在任意位置；等。

术语“桥环烷基”指环之间共用两个不直接连接的碳原子的全碳多环系统，其环内可以含有一个或多个双键，且具有5至20个(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)碳原子(即5至20元桥环烷基)。所述桥环烷基优选具有6至14个碳原子的桥环烷基(即6至14元桥环烷基)，更优选具有7至10个碳原子的桥环烷基(即7至10元桥环烷基)。所述桥环烷基包括双环桥环烷基和多环桥环烷基(如三环桥环烷基、四环桥环烷基等)，优选双环桥环烷基或三环桥环烷基。非限制性的实例包括：

其连接点可在任意位置。

环烷基可以是取代的或非取代的，当被取代时，其可以在任何可使用的连接点被取代，取代基优选选自D原子、卤素、烷基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、环烷基氧基、杂环基氧基、羟基、羟烷基、氧代基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个。

术语“杂环基”指饱和或部分不饱和的单环杂环(即单环杂环基)或多环杂环系统(即多环杂环基)，其环内至少含有一个(例如1、2、3或4个)选自氮、氧和硫的杂原子(所述的氮可任选被氧化，即形成氮氧化物；所述的硫可任选被氧代，即形成亚砜或砜，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-)，且具有3至20个(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)环原子(即3至20元杂环基)。所述杂环基优选具有3至12个环原子的杂环基(即3至12元杂环基)；进一步优选具有3至8个环原子的杂环基(即3至8元杂环基)；更优选具有3至6个环原子的杂环基(即3至6元杂环基)；最优选具有5或6个环原子的杂环基(即5或6元杂环基)。

所述的单环杂环基，非限制性的实例包括：吡咯烷基、四氢吡喃基、1,2,3,6-四氢吡啶基、哌啶基、哌嗪基、氮杂环丁烷基、吗啉基、硫代吗啉基和高哌嗪基等。

所述的多环杂环基包括螺杂环基、稠杂环基和桥杂环基。

术语“螺杂环基”指环之间共用一个原子(称螺原子)的多环杂环系统，其环内可以含有一个或多个双键，且其环内至少含有一个(例如1、2、3或4个)选自氮、氧和硫的杂原子(所述的氮可任选被氧化，即形成氮氧化物；所述的硫可任选被氧代，即形成亚砜或砜，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-)，条件是至少含有一个单环杂环基且连接点在该单环杂环基上，其具有5至20个(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)环原子(即5至20元螺杂环基)。所述螺杂环基优选具有6至14个环原子的螺杂环基(即6至14元螺杂环基)，更优选具有7至11个环原子的螺杂环基(即7至11元螺杂环基)。所述螺杂环基包括单螺杂环基和多螺杂环基(如双螺杂环基等)，优选单螺杂环基或双螺杂环基，更优选3元/4元、3元/5元、3元/6元、4元/4元、4元/5元、4元/6元、5元/3元、5元/4元、5元/5元、5元/6元、5元/7元、6元/3元、6元/4元、6元/5元、6元/6元、6元/7元、7元/5元或7元/6元单螺杂环基。非限制性的实例包括：

等。

术语“稠杂环基”指环之间共享毗邻的两个原子的多环杂环系统，其环内可以含有一个或多个双键，且其环内至少含有一个(例如1、2、3或4个)选自氮、氧和硫的杂原子(所述的氮可任选被氧化，即形成氮氧化物；所述的硫可任选被氧代，即形成亚砜或砜，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-)，其为单环杂环基与一个或多个单环杂环基稠合，或者单环杂环基与环烷基、芳基或杂芳基中的一个或多个稠合，其中连接点在单环杂环基上，且具有5至20个(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)环原子(即5至20元稠杂环基)。所述稠杂环基优选具有6至14个环原子的稠杂环基(即6至14元稠杂环基)，更优选具有7至10个环原子的稠杂环基(即7至10元稠杂环基)。所述稠杂环基包括双环和多环稠杂环基(如三环稠杂环基、四环稠杂环基等)，优选双环稠杂环基或三环稠杂环基，更优选3元/4元、3元/5元、3元/6元、4元/4元、4元/5元、4元/6元、5元/3元、5元/4元、5元/5元、5元/6元、5元/7元、6元/3元、6元/4元、6元/5元、6元/6元、6元/7元、7元/5元或7元/6元双环稠杂环基。非限制性的实例包括：

等。

术语“桥杂环基”指环之间共用两个不直接连接的原子的多环杂环系统，其环内可以含有一个或多个双键，并且其环内至少含有一个(例如1、2、3或4个)选自氮、氧和硫的杂原子(所述的氮可任选被氧化，即形成氮氧化物；所述的硫可任选被氧代，即形成亚砜或砜，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-)，其具有5至20个(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)环原子(即5至20元桥杂环基)。所述桥杂环基优选具有6至14个环原子的桥杂环基(即6至14元桥杂环基)，更优选具有7至10个环原子的桥杂环基(即7至10元桥杂环基)。根据组成环的数目可以分为双环桥杂环基和多环桥杂环基(如三环桥杂环基、四环桥杂环基等)，优选双环桥杂环基或三环桥杂环基。非限制性的实例包括：

等。

杂环基可以是取代的或非取代的，当被取代时，其可以在任何可使用的连接点被取代，取代基优选选自D原子、卤素、烷基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、环烷基氧基、杂环基氧基、羟基、羟烷基、氧代基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个。

术语“芳基”指具有共轭的π电子体系的单环全碳芳环(即单环芳基)或多环芳环系统(即多环芳基)，其具有6至14个(例如6、7、8、9、10、11、12、13或14个)环原子(即6至14元芳基)。所述芳基优选具有6至10个环原子的芳基(即6至10元芳基)。所述的单环芳基，例如苯基。所述的多环芳基，非限制性的实例包括：萘基、蒽基、菲基等。所述多环芳基还包括苯基与杂环基或环烷基中的一个或多个稠合，或萘基与杂环基或环烷基中的一个或多个稠合，其中连接点在苯基或萘基上，并且在这种情况下，环原子个数继续表示多环芳环系统中的环原子个数，非限制性的实例包括：

等。

芳基可以是取代的或非取代的，当被取代时，其可以在任何可使用的连接点被取代，取代基优选选自D原子、卤素、烷基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、环烷基氧基、杂环基氧基、羟基、羟烷基、氧代基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个。

术语“杂芳基”指具有共轭的π电子体系的单环杂芳环(即单环杂芳基)或多环杂芳环系统(即多环杂芳基)，其环内至少含有一个(例如1、2、3或4个)选自氮、氧和硫的杂原子(所述的氮可任选被氧化，即形成氮氧化物；所述的硫可任选被氧代，即形成亚砜或砜，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-)，其具有5至14个(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个)环原子(即5至14元杂芳基)。所述杂芳基优选具有5至10个环原子的杂芳基(即5至10元杂芳基)，更优选具有5或6个环原子的杂芳基(即5或6元杂芳基)。

所述的单环杂芳基，非限制性的实例包括：呋喃基、噻吩基、噻唑基、异噻唑基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、噻二唑基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、呋咱基、吡咯基、N-烷基吡咯基、吡啶基、嘧啶基、吡啶酮基、N-烷基吡啶酮(如等)、吡嗪基、哒嗪基等。

所述的多环杂芳基，非限制性的实例包括：吲哚基、吲唑基、喹啉基、异喹啉基、喹喔啉基、酞嗪基、苯并咪唑基、苯并噻吩基、喹唑啉基、苯并噻唑基、咔唑基等。所述多环杂芳基还包括单环杂芳基与一个或多个芳基稠合，其中连接点在芳香环上，并且在这种情况下，环原子个数继续表示多环杂芳环系统中的环原子个数。所述多环杂芳基还包括单环杂芳基与环烷基或杂环基中的一个或多个稠合，其中连接点在单环杂芳环上，并且在这种情况下，环原子个数继续表示多环杂芳环系统中的环原子个数。非限制性的实例包括：

等。

杂芳基可以是取代的或非取代的，当被取代时，其可以在任何可使用的连接点被取代，取代基优选选自D原子、卤素、烷基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、环烷基氧基、杂环基氧基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个。

术语“环烷基烷基”指烷基被一个或多个环烷基取代，其中环烷基、烷基如上所定义。

术语“杂环基烷基”指烷基被一个或多个杂环基取代，其中杂环基、烷基如上所定义。

术语“烷氧基烷基”指烷基被一个或多个烷氧基取代，其中烷氧基、烷基如上所定义。

术语“卤代烷基”指烷基被一个或多个卤素取代，其中烷基如上所定义。

术语“卤代烷氧基”指烷氧基被一个或多个卤素取代，其中烷氧基如上所定义。

术语“羟烷基”指烷基被一个或多个羟基取代，其中烷基如上所定义。

术语“卤素”指氟、氯、溴或碘。

术语“羟基”指-OH。

术语“氨基”指-NH₂。

术语“氰基”指-CN。

术语“硝基”指-NO₂。

术语“氧代”或“氧代基”指“＝O”。

术语“羰基”指C＝O。

TBS指叔丁基二甲基硅基。

术语“泛素连接酶”是指促进泛素向特异性底物蛋白质转移、靶向底物蛋白质用于降解的蛋白质家族。例如，小脑蛋白是单独或与E2泛素结合酶组合导致泛素连接到标靶蛋白质上的赖氨酸并且随后靶向特异性蛋白质底物用于通过蛋白酶体降解的E3泛素连接酶蛋白质。因此，E3泛素连接酶单独或与E2泛素结合酶复合是泛素向标靶蛋白质转移的原因。一般来说，泛素连接酶参与聚泛素化，以便第二泛素连接到第一泛素，第三泛素连接到第二泛素，等等。聚泛素化标记蛋白质用于通过蛋白酶体降解。然而，存在一些限于单泛素化的泛素化事件，其中仅单一泛素通过泛素连接酶添加到底物分子。单泛素化蛋白质不被靶向到蛋白酶体用于降解，但可能反而在其细胞位置或功能方面改变，例如经由结合具有能够结合泛素的结构域的其它蛋白质。让事情更复杂的是，泛素上的不同赖氨酸可以由E3靶向以制备链。最常见赖氨酸是泛素链上的Lys48。这是用以制备聚泛素的赖氨酸，其由蛋白酶体识别。

术语“靶蛋白”是指具有任何生物功能或活性(包括结构、调节、激素、酶促、遗传、免疫、收缩、储存、运输和信号转导)的蛋白质和肽。在一些实施方案中，靶蛋白质包括结构蛋白质、受体、酶、细胞表面蛋白质、与细胞的集成功能相关的蛋白质，包括以下各者中涉及的蛋白质：催化活性、芳香酶活性、运动活性、螺旋酶活性、新陈代谢过程(合成代谢和分解代谢)、抗氧化活性、蛋白水解、生物合成、具有激酶活性的蛋白质、氧化还原酶活性、转移酶活性、水解酶活性、裂解酶活性、异构酶活性、连接酶活性、酶调节因子活性、信号转导因子活性、结构分子活性、结合活性(蛋白质、脂质碳水化合物)、受体活性、细胞运动性、膜融合、细胞通讯、生物过程调节、发育、细胞分化、剌激反应、行为蛋白质、细胞粘附蛋白、细胞死亡中涉及的白质、转运中涉及的蛋白质(包括蛋白质转运活性、核转运、离子转运活性、通道转运活性、载体活性)、通透酶活性、分泌活性、电子转运活性、发病原、伴随蛋白调节因子活性、核酸结合活性、转录调节因子活性、细胞外构造和生物起源活性、转译调节因子活性。所述蛋白质包括来自真核生物和原核生物的蛋白质，所述真核生物和原核生物包括微生物、病毒、真菌和寄生虫以及众多其它者，包括作为药物疗法标靶的人类、微生物、病毒、真菌和寄生虫，其它动物包括家养动物)、用于测定抗生素的标革巴的微生物和其它抗微生物药和植物和甚至病毒以及众多其它者。

本公开化合物可以存在特定的立体异构体形式。术语“立体异构体”是指结构相同但原子在空间中的排列不同的异构体。其包括顺式和反式(或Z和E)异构体、(-)-和(+)-异构体、(R)-和(S)-对映异构体、非对映异构体、(D)-和(L)-异构体、互变异构体、阻转异构体、构象异构体及其混合物(如外消旋体、非对映异构体的混合物)。本公开化合物中的取代基可以存在另外的不对称原子。所有这些立体异构体以及它们的混合物，均包括在本公开的范围内。可以通过手性合成、手性试剂或者其他常规技术制备光学活性的(-)-和(+)-异构体、(R)-和(S)-对映异构体以及(D)-和(L)-异构体。本公开某化合物的一种异构体，可以通过不对称合成或者手性助剂来制备，或者，当分子中含有碱性官能团(如氨基)或酸性官能团(如羧基)时，与适当的光学活性的酸或碱形成非对映异构体的盐，然后通过本领域所公知的常规方法进行非对映异构体拆分，得到纯的异构体。此外，对映异构体和非对映异构体的分离通常是通过色谱法完成。

本公开所述化合物的化学结构中，键表示未指定构型，即如果化学结构中存在手性异构体，键/>可以为/>或/>或者同时包含/>和/>两种构型。对于所有的碳-碳双键，即使仅命名了一个构型，Z型和E型均包括在内。

本公开的化合物可以以不同的互变异构体形式存在，并且所有这样的形式包含在本公开的范围内。术语“互变异构体”或“互变异构体形式”是指平衡存在并且容易从一种异构形式转化为另一种异构形式的结构异构体。其包括所有可能的互变异构体，即以单一异构体的形式或以所述互变异构体的任意比例的混合物的形式存在。非限制性的实例包括：酮-烯醇、亚胺-烯胺、内酰胺-内酰亚胺等。内酰胺-内酰亚胺平衡实例如下所示：

如当提及吡唑基时，应理解为包括如下两种结构中的任何一种或两种互变异构体的混合物：

所有的互变异构形式在本公开的范围内，且化合物的命名不排除任何互变异构体。

本公开的化合物包括其化合物的所有合适的同位素衍生物。术语“同位素衍生物”是指至少一个原子被具有相同原子序数但原子质量不同的原子替代的化合物。可引入到本公开化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、氯、溴和碘等的稳定和放射性的同位素，例如分别为²H(氘，D)、³H(氚，T)、¹¹C、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁷O、¹⁸O、³²p、³³p、³³S、³⁴S、³⁵S、³⁶S、¹⁸F、³⁶Cl、⁸²Br、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹²⁹I和¹³¹I等，优选氘。

相比于未氘代药物，氘代药物有降低毒副作用、增加药物稳定性、增强疗效、延长药物生物半衰期等优势。本公开的化合物的所有同位素组成的变换，无论放射性与否，都包括在本公开的范围之内。与碳原子连接的各个可用的氢原子可独立地被氘原子替换，其中氘的替换可以是部分或完全的，部分氘的替换是指至少一个氢被至少一个氘替换。

当一个位置被特别地指定为氘D时，该位置应理解为具有大于氘的天然丰度(其为0.015％)至少1000倍的丰度的氘(即至少15％的氘掺入)。示例中化合物的具有大于氘的天然丰度可以是至少1000倍的丰度的氘(即至少15％的氘掺入)、至少2000倍的丰度的氘(即至少30％的氘掺入)、至少3000倍的丰度的氘(即至少45％的氘掺入)、至少3340倍的丰度的氘(即至少50.1％的氘掺入)、至少3500倍的丰度的氘(即至少52.5％的氘掺入)、至少4000倍的丰度的氘(即至少60％的氘掺入)、至少4500倍的丰度的氘(即至少67.5％的氘掺入)、至少5000倍的丰度的氘(即至少75％的氘掺入)、至少5500倍的丰度的氘(即至少82.5％的氘掺入)、至少6000倍的丰度的氘(即至少90％的氘掺入)、至少6333.3倍的丰度的氘(即至少95％的氘掺入)、至少6466.7倍的丰度的氘(即至少97％的氘掺入)、至少6600倍的丰度的氘(即至少99％的氘掺入)、至少6633.3倍的丰度的氘(即至少99.5％的氘掺入)或更高丰度的氘。

“任选的”或“任选”是指随后所描述的事件或环境可以但不必然发生，其包括该事件或环境发生或不发生两种情形。例如“任选被卤素或者氰基取代的C_1-6烷基”包括烷基被卤素或者氰基取代的情形和烷基不被卤素或氰基取代的情形。

“取代”或“取代的”指基团中的一个或多个氢原子，优选1至6个，更优选1至3个氢原子彼此独立地被相应数目的取代基取代。本领域技术人员能够在不付出过多努力的情况下(通过实验或理论)确定可能或不可能的取代。例如，具有游离氢的氨基或羟基与具有不饱和键的碳原子(如烯)结合时可能是不稳定的。

“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其可药用的盐与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如药学上可接受的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。

“可药用的盐”是指本公开化合物的盐，可选自无机盐或有机盐。这类盐用于哺乳动物体内时具有安全性和有效性，且具有应有的生物活性。可以在化合物的最终分离和纯化过程中，或通过使合适的基团与合适的碱或酸反应来单独制备。通常用于形成药学上可接受的盐的碱包括无机碱，例如氢氧化钠和氢氧化钾，以及有机碱，例如氨。通常用于形成药学上可接受的盐的酸包括无机酸以及有机酸。

针对药物或药理学活性剂而言，术语“治疗有效量”是指足以达到或至少部分达到预期效果的药物或药剂的用量。治疗有效量的确定因人而异，取决于受体的年龄和一般情况，也取决于具体的活性物质，个案中合适的治疗有效量可以由本领域技术人员根据常规试验确定。

本文所用的术语“药学上可接受的”是指这些化合物、材料、组合物和/或剂型，在合理的医学判断范围内，适用于与患者组织接触而没有过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，具有合理的获益/风险比，并且对预期的用途是有效。

本文所使用的，单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数引用，反之亦然，除非上下文另外明确指出。

当将术语“约”应用于诸如pH、浓度、温度等的参数时，表明该参数可以变化±10％，并且有时更优选地在±5％之内。如本领域技术人员将理解的，当参数不是关键时，通常仅出于说明目的给出数字，而不是限制。

本公开化合物的合成方法

为了完成本公开的目的，本公开采用如下技术方案：

方案一

本公开通式(II)化合物或其可药用的盐的制备方法，其包括以下步骤：

通式(IIA)所示的化合物或其盐与通式(IIB)所示的化合物或其盐，在缩合剂和碱性试剂的作用下，发生缩合反应，得到通式(II)所示的化合物或其可药用的盐；

其中：

方案二

本公开通式(III)化合物或其可药用的盐的制备方法，其包括以下步骤：

通式(IIA)所示的化合物或其盐与通式(IIIB)所示的化合物或其盐，在缩合剂和碱性试剂的作用下，发生缩合反应，得到通式(III)所示的化合物或其可药用的盐；

其中：

上述合成方案中，所述的缩合剂包括但不限于1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N,N'-二环己基碳化二亚胺、N,N'-二异丙基碳二酰亚胺、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯、1-羟基苯并三唑、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲脲六氟磷酸酯、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐或六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷；优选地，所述的缩合剂为2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)。

上述合成方案中，所述碱性试剂包括有机碱类和无机碱类；所述的有机碱类包括但不限于三乙胺、N,N-二甲基乙基胺、二异丙基乙胺、正丁基锂、二异丙基氨基锂、醋酸钾、乙酸钠、乙醇钠、叔丁醇钠或叔丁醇钾；所述的无机碱类包括但不限于氢化钠、磷酸钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、氢氧化钠、氢氧化锂一水合物、氢氧化锂和氢氧化钾；优选地，所述碱性试剂为二异丙基乙胺。

上述合成方案优选在溶剂中进行，所用溶剂包括但不限于：乙二醇二甲醚、醋酸、甲醇、乙醇、乙腈、正丁醇、甲苯、四氢呋喃、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、正己烷、二甲基亚砜、1,4-二氧六环、水、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺及其混合物。

具体实施方式

以下结合实施例用于进一步描述本公开，但这些实施例并非限制着本公开的范围。

实施例

化合物的结构是通过核磁共振(NMR)或/和质谱(MS)来确定的。NMR位移(δ)以10^-6(ppm)的单位给出。NMR的测定是用Bruker AVANCE-400核磁仪或Bruker AVANCE NEO 500M，测定溶剂为氘代二甲基亚砜(DMSO-d₆)、氘代氯仿(CDCl₃)、氘代甲醇(CD₃OD)，内标为四甲基硅烷(TMS)。

MS的测定用Agilent 1200/1290DAD-6110/6120Quadrupole MS液质联用仪(生产商：Agilent，MS型号：6110/6120Quadrupole MS)。

waters ACQuity UPLC-QD/SQD(生产商：waters，MS型号：waters ACQuity QdaDetector/waters SQ Detector)

THERMO Ultimate 3000-Q Exactive(生产商：THERMO，MS型号：THERMOQExactive)

高效液相色谱法(HPLC)分析使用Agilent HPLC 1200DAD、Agilent HPLC 1200VWD和Waters HPLC e2695-2489高效液相色谱仪。

手性HPLC分析测定使用Agilent 1260DAD高效液相色谱仪。

高效液相制备使用Waters 2545-2767、Waters 2767-SQ Detecor2、Shimadzu LC-20AP和Gilson GX-281制备型色谱仪。

手性制备使用Shimadzu LC-20AP制备型色谱仪。

CombiFlash快速制备仪使用Combiflash Rf200(TELEDYNE ISCO)。

薄层层析硅胶板使用烟台黄海HSGF254或青岛GF254硅胶板，薄层色谱法(TLC)使用的硅胶板采用的规格是0.15mm～0.2mm，薄层层析分离纯化产品采用的规格是0.4mm～0.5mm。

硅胶柱色谱法一般使用烟台黄海硅胶200～300目硅胶为载体。

激酶平均抑制率及IC₅₀值的测定用NovoStar酶标仪(德国BMG公司)。

本公开的已知的起始原料可以采用或按照本领域已知的方法来合成，或可购买自ABCR GmbH&Co.KG，Acros Organics，Aldrich Chemical Company，韶远化学科技(AccelaChemBio Inc)、达瑞化学品等公司。

实施例中无特殊说明，反应均能够在氩气氛或氮气氛下进行。

氩气氛或氮气氛是指反应瓶连接一个约1L容积的氩气或氮气气球。

氢气氛是指反应瓶连接一个约1L容积的氢气气球。

加压氢化反应使用Parr 3916EKX型氢化仪和清蓝QL-500型氢气发生器或HC2-SS型氢化仪。

氢化反应通常抽真空，充入氢气，反复操作3次。

微波反应使用CEM Discover-S 908860型微波反应器。

实施例中无特殊说明，溶液是指水溶液。

实施例中无特殊说明，反应的温度为室温，为20℃～30℃。

实施例中的反应进程的监测采用薄层色谱法(TLC)，反应所使用的展开剂，纯化化合物采用的柱层析的洗脱剂体系和薄层色谱法的展开剂体系包括：A：二氯甲烷/甲醇体系，B：正己烷/乙酸乙酯体系，溶剂的体积比根据化合物的极性不同而进行调节，也可以加入少量的三乙胺和醋酸等碱性或酸性试剂进行调节。

实施例1

2-(6,7-二氢-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-1-基)-2-(6-(4-(4-(2-(5-((2,6-二氧代哌啶-3-基)氨基)-2,3-二氢螺[茚-1,4'-哌啶]-1'-基)乙酰基)哌嗪-1-基)苯基)-4-氟-1-氧代异吲哚啉-2-基)-N-(噻唑-2-基)乙酰胺1

第一步

(±)-5-溴-3-羟基-2,3-二氢螺[茚-1,4'-哌啶]-1'-羧酸叔丁酯1b

将5-溴-3-氧代-2,3-二氢螺[茚-1,4'-哌啶]-1'-羧酸叔丁酯1a(500mg,1.31mmol，采用公知的方法“Synlett 2009,15,2521-2523”制备而得)溶于甲醇和四氢呋喃的混合溶剂(20mL，V/V＝1/1)中，冰浴下加入硼氢化钠(114mg,3.01mmol)，反应30分钟。反应液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系A纯化所得残余物，得到标题化合物1b(453mg，产率：90％)。

MS m/z(ESI):326.1[M-55]。

第二步

5-溴-2,3-二氢螺[茚-1,4'-哌啶]三氟醋酸盐1c

将化合物1b(453mg,1.18mmol)溶于三氟乙酸(2mL)中，加入三乙基硅烷(2mL)，升温到40℃反应12小时。将反应液浓缩，真空干燥，得粗品标题化合物1c(368mg，产率：74％)，粗产品不经纯化直接用于下一步反应。

MS m/z(ESI):266.1[M+1]。

第三步

5-溴-2,3-二氢螺[茚-1,4'-哌啶]-1'-羧酸叔丁酯1d

将化合物1c溶于二氯甲烷(5mL)中，冰水浴下加入三乙胺(280mg，2.77mmol)和二碳酸二叔丁酯(453mg，2.08mmol)，反应2小时。反应液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系A纯化所得残余物，得到标题化合物1d(500mg，产率：99％)。

MS m/z(ESI):310.1[M-55]。

第四步

5-((二苯基甲亚基)氨基)-2,3-二氢螺[茚-1,4'-哌啶]-1'-羧酸叔丁酯1e

称取化合物1d(402mg,1.10mmol)，二苯甲酮亚胺(219mg，1.21mmol)，三(二亚苄基丙酮)二钯(50mg，0.055mmol)，1,1'-联萘-2,2'-双二苯基膦(68mg,0.11mmol)，叔丁醇钠(158mg,1.64mmol)到100mL单口瓶中。氮气置换三次，升温到90℃反应16小时。反应液经硅藻土过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系A纯化所得残余物，得到标题化合物1e(118mg，产率：23％)。

MS m/z(ESI):467.4[M+1]。

第五步

5-氨基-2,3-二氢螺[茚-1,4'-哌啶]-1'-羧酸叔丁酯1f

将化合物1e(118mg,0.25mmol)溶于四氢呋喃(4mL)中，加入0.5M稀盐酸(4mL)。反应20分钟。向反应液中加入碳酸氢钠固体，调节pH到7左右。用乙酸乙酯(15mL×2)萃取，有机相合并后，用饱和氯化钠溶液(15mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液减压浓缩除去溶剂，得到粗品标题化合物1f(70mg，产率：91％)，粗产品不经纯化直接进行下一步反应。

MS m/z(ESI):303.3[M+1]。

第六步

(±)-5-((2,6-二氧代哌啶-3-基)氨基)-2,3-二氢螺[茚-1,4'-哌啶]-1'-羧酸叔丁酯1g

将化合物1f(76mg，0.25mmol)溶于乙腈(3mL)中，加入碳酸氢钠(84mg，1.0mmol)，加入(±)-3-溴-2,6-哌啶二酮(58mg，0.3mmol，上海毕得医药)，升温到80℃反应。反应2小时，补加(±)-3-溴-2,6-哌啶二酮(58mg，0.3mmol)，反应2小时，再补加(±)-3-溴-2,6-哌啶二酮(58mg，0.3mmol)，反应12小时。反应液减压浓缩，过滤，用乙酸乙酯洗涤(15mL)，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系A纯化所得残余物，得到标题化合物1g(80mg，产率：77％)。

MS m/z(ESI):414.5[M+1]。

第七步

(±)-3-((2,3-二氢螺[茚-1,4'-哌啶]-5-基)氨基)哌啶-2,6-二酮盐酸盐1h

将化合物1g(80mg，0.19mmol)溶于二氯甲烷(2mL)中，加入4M氯化氢的1,4-二氧六环溶液(2mL)，反应1小时。将反应液浓缩，真空干燥，得到粗品标题化合物1h(66mg，产率：97％)，粗产品不经纯化直接用于下一步反应。

MS m/z(ESI):314.4[M+1]。

第八步

(±)-2-(5-((2,6-二氧代哌啶-3-基)氨基)-2,3-二氢螺[茚-1,4'-哌啶]-1'-基)乙酸叔丁酯1i

将化合物1h(66mg，0.19mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中，加入2-溴乙酸叔丁酯(48mg，0.25mmol)，加入二异丙基乙胺(122mg，0.94mmol)，反应2小时。向体系中加入水(10mL)，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和氯化钠溶液(10mL×1)洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系A纯化所得残余物，得到标题化合物1i(13mg，产率：16％)。

MS m/z(ESI):428.6[M+1]。

第九步

(±)-2-(5-((2,6-二氧代哌啶-3-基)氨基)-2,3-二氢螺[茚-1,4'-哌啶]-1'-基)乙酸1j

将化合物1i(13mg，0.03mmol)溶于二氯甲烷(1mL)中，加入三氟乙酸(0.5mL)，反应4小时。将反应液浓缩，真空干燥，得到粗品标题化合物1j(11mg，产率：97％)，粗产品不经纯化直接用于下一步反应。

MS m/z(ESI):372.2[M+1]。

第十步

2-(6,7-二氢-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-1-基)-2-(6-(4-(4-(2-(5-((2,6-二氧代哌啶-3-基)氨基)-2,3-二氢螺[茚-1,4'-哌啶]-1'-基)乙酰基)哌嗪-1-基)苯基)-4-氟-1-氧代异吲哚啉-2-

基)-N-(噻唑-2-基)乙酰胺1

将化合物1j(6mg，0.016mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中，加入2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(9mg，0.024mmol)，加入二异丙基乙胺(2.1mg，0.016mmol)。反应20分钟，加入(±)-2-(6,7-二氢-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-1-基)-2-(4-氟-1-氧代-6-(4-(哌嗪-1-基)苯基)异吲哚啉-2-基)-N-(噻唑-2-基)乙酰胺盐酸盐1k(10mg，0.017mmol，采用专利申请“WO2020002487A1”中说明书第70页的实施例16”公开的方法制备而得)，反应20分钟。反应液过滤，经高效液相制备(Waters-2545，洗脱体系：10mmol/L碳酸氢铵的水溶液和乙腈，乙腈的梯度：35％-95％，流速：30mL/min)，得到标题产物1(4个异构体混合物，1：1：1：1，3mg，产率：20％)。

MS m/z(ESI):909.1[M-1]。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ12.48(s,1H),10.75(s,1H),7.78(s,1H),7.75(d,1H),7.70(d,2H),7.60(s,1H),7.47(s,1H),7.28-7.16(m,1H),7.09(d,2H),6.88(d,1H),6.52-6.46(m,2H),6.13(s,1H),5.59(d,1H),4.82(d,1H),4.28-4.17(m,2H),4.04-3.92(m,2H),3.77(s,2H),3.63(s,2H),3.27-3.15(m,4H),2.82-2.67(m,6H),2.60-2.43(m,3H),2.20(t,2H),2.12-2.05(m,1H),2.03-1.94(m,1H),1.88(t,2H),1.85-1.80(m,1H),1.78-1.68(m,3H),1.50-1.35(m,3H)。

实施例2

2-(6,7-二氢-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-1-基)-2-(6-(4-(4-(2-(4-((2,6-二氧代哌啶-3-基)氨基)-2,3-二氢螺[茚-1,4'-哌啶]-1'-基)乙酰基)哌嗪-1-基)苯基)-4-氟-1-氧代异吲哚啉-2-基)-N-(噻唑-2-基)乙酰胺2

第一步

((4-溴-1H-茚-3-基)氧基)(叔丁基)二甲基硅烷2b

将7-溴-2,3-二氢-1H-茚-1-酮2a(3g，14.2mmol，上海毕得医药)溶于二氯甲烷(50mL)，冰水浴下加入叔丁基二甲硅基三氟甲磺酸酯(4.51g，17.06mmol)，自然升至室温反应2小时。向反应液中加入饱和氯化铵溶液(30mL)，用二氯甲烷(30mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和氯化钠溶液(30mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系A纯化所得残余物，得到标题化合物2b(4.33g，产率：94％)。

MS m/z(ESI):325.1[M+1]。

第二步

4-溴-3-((叔丁基二甲基硅基)氧基)螺[茚-1,4'-哌啶]-1'-羧酸叔丁酯2c

将化合物2b(4.33g,13.31mmol)溶于四氢呋喃(60mL)，干冰乙醇浴冷却至-78℃，氮气保护下加入双三甲基硅基胺基锂(1M,30mL)，反应30分钟。然后加入双(2-氯乙基)氨基甲酸叔丁酯(3.87g,15.98mmol，上海毕得医药)，自然升至室温反应。3小时后，向反应液中加入饱和碳酸氢钠溶液(30mL)，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，真空干燥，得到粗品标题化合物2c(6.43g,产率：97％)，粗产品不经纯化直接进行下一步反应。

MS m/z(ESI):494.1[M+1]。

第三步

4-溴-3-氧代-2,3-二氢螺[茚-1,4’-哌啶]-1’-羧酸叔丁酯2d

将化合物2c溶于二氯甲烷(40mL)中，加入四丁基氟化铵(1M,19.5mL)，反应3小时。减压浓缩除去溶剂，加入水(30mL)，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，合并有机相，用饱和氯化钠溶液(30mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系A纯化所得残余物，得到标题化合物2d(4.5g,产率：91％)。

MS m/z(ESI):324.1[M-55]。

第四步

(±)-4-溴-3-羟基-2,3-二氢螺[茚-1,4'-哌啶]-1'-羧酸叔丁酯2e

将化合物2d(1g，2.63mmol)溶于30mL四氢呋喃和甲醇(V/V＝1/1)的混合溶剂中，冰水浴下加入硼氢化钠(120mg，3.17mmol)，自然升至室温反应2小时。减压浓缩除去溶剂，向残留物中加入水(10mL)，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和氯化钠溶液(10mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液减压浓缩，真空干燥，得到粗品标题化合物2e(900mg，产率：90％)，粗产品不经纯化直接用于下一步反应。

MS m/z(ESI):326.1[M-55]。

第五步

4-溴-2,3-二氢螺[茚-1,4'-哌啶]三氟乙酸盐2f

将化合物2e(1g,2.61mmol)溶于三氟乙酸(2mL)中，加入三乙基硅烷(2mL)，升温到40℃反应16小时。减压浓缩除去溶剂，得到粗品标题化合物2f(800mg，产率：80％)，粗产品不经纯化直接用于下一步反应。

MS m/z(ESI):266.1[M+1]。

第六步

2-(4-溴-2,3-二氢螺[茚-1,4'-哌啶]-1'-基)乙酸叔丁酯2g

将化合物2f(665mg，2.50mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中，加入二异丙基乙胺(970mg，7.50mmol)和2-溴乙酸叔丁酯(731mg，3.75mmol)，反应2小时。向反应液中加入水(10mL)，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和氯化钠溶液(10mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系A纯化所得残余物，得到标题化合物2g(485mg，产率：51％)。

MS m/z(ESI):380.1[M+1]。

第七步

2-(4-((二苯基甲亚基)氨基)-2,3-二氢螺[茚-1,4'-哌啶]-1'-基)乙酸叔丁酯2h

称取化合物2g(250mg，0.66mmol)，二苯甲酮亚胺(240mg，1.32mmol)，甲磺酸(2-二环己基膦基-3,6-二甲氧基-2',4',6'-三异丙基-1,1'-联苯)(2-氨基-1,1'-联苯-2-基)钯(II)(60mg，0.066mmol，上海毕得医药)，碳酸铯(642mg，1.97mmol)到50mL单口瓶中，加入1,4-二氧六环(10mL)。氮气置换三次，升温到100℃反应16小时。反应液经硅藻土过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系A纯化所得残余物，得到标题化合物2h(210mg，产率：66％)。

MS m/z(ESI):481.3[M+1]。

第八步

2-(4-氨基-2,3-二氢螺[茚-1,4'-哌啶]-1'-基)乙酸叔丁酯2i

将化合物2h(210mg，0.44mmol)溶于四氢呋喃(5mL)中，加入稀盐酸(0.5M，7.0mL)，反应1小时。向反应液中加入饱和碳酸氢钠溶液，调节反应液pH到7左右。减压浓缩除去四氢呋喃，加入乙酸乙酯(10mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和氯化钠溶液(10mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液减压浓缩，真空干燥，得到粗品标题化合物2i(139mg，产率：99％)，粗产品不经纯化直接用于下一步反应。

MS m/z(ESI):317.4[M+1]。

第九步

(±)-2-(4-((2,6-二氧代哌啶-3-基)氨基)-2,3-二氢螺[茚-1,4'-哌啶]-1'-基)乙酸叔丁酯

2j

将化合物2i(180mg，0.57mmol)溶于6mL N,N-二甲基甲酰胺和乙腈(V/V＝1/5)的混合溶剂中，加入碳酸氢钠(191mg,2.27mmol)，(±)-3-溴-2,6-哌啶二酮(120mg,0.624mmol)。反应2小时，补加(±)-3-溴-2,6-哌啶二酮(120mg,0.624mmol)，反应2小时，补加(±)-3-溴-2,6-哌啶二酮(120mg,0.624mmol)，继续反应12小时。反应液过滤，经高效液相制备(Waters-2545，洗脱体系：10mmol/L碳酸氢铵的水溶液和乙腈，乙腈的梯度：15％-95％，流速：30mL/min)，得到标题化合物2j(5mg，产率：2％)。

MS m/z(ESI):428.2[M+1]。

第十步

(±)-2-(4-((2,6-二氧代哌啶-3-基)氨基)-2,3-二氢螺[茚-1,4'-哌啶]-1'-基)乙酸2k

将化合物2j(5mg,0.011mmol)溶于二氯甲烷(1mL)中，加入三氟乙酸(0.5mL)，反应4小时。减压浓缩除去溶剂，真空干燥，得到粗品标题化合物2k(4mg，产率：99％)，粗产品不经纯化直接用于下一步反应。

MS m/z(ESI):372.3[M+1]。

第十一步

2-(6,7-二氢-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-1-基)-2-(6-(4-(4-(2-(4-((2,6-二氧代哌啶-3-基)氨基)-2,3-二氢螺[茚-1,4'-哌啶]-1'-基)乙酰基)哌嗪-1-基)苯基)-4-氟-1-氧代异吲哚啉-2-

基)-N-(噻唑-2-基)乙酰胺2

将化合物2k(4mg，0.010mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中，加入2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(4.1mg，0.015mmol)，加入二异丙基乙胺(1.4mg，0.030mmol)。反应20分钟，加入化合物1k(6mg，0.010mmol)，反应20分钟。反应液过滤，经高效液相制备(Waters-2545，洗脱体系：10mmol/L碳酸氢铵的水溶液和乙腈，乙腈的梯度：40％-95％，流速：30mL/min)，得到标题产物2(4个异构体的混合物，1：1：1：1，2mg，产率：20％)。

MS m/z(ESI):911.2[M+1]。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ12.49(s,1H),10.82(s,1H),7.78(s,1H),7.75(d,1H),7.69(d,1H),7.60(s,1H),7.47(s,1H),7.20(s,1H),7.09(d,1H),6.97(t,1H),6.65(s,2H),6.49(d,1H),6.44(d,1H),6.13(s,1H),5.02(d,1H),4.81(d,1H),4.38-4.32(m,1H),4.22(d,1H),4.04-3.92(m,2H),3.78(s,2H),3.63(s,2H),3.28-3.16(m,4H),2.83-2.71(m,4H),2.66-2.56(m,4H),2.21(t,2H),2.13-2.06(m,1H),2.04-2.00(m,3H),1.82-1.73(m,2H),1.50-1.38(m,6H)。

实施例3

(±)-2-(6,7-二氢-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-1-基)-2-(6-(4-(4-(2-(5-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-2,3-二氢螺[茚-1,4'-哌啶]-1'-基)乙酰基)哌嗪-1-基)苯基)-4-氟-1-氧代异吲哚啉-2-基)-N-(噻唑-2-基)乙酰胺3

第一步

2-(5-溴-2,3-二氢螺[茚-1,4'-哌啶]-1'-基)乙酸叔丁酯3a

将化合物1c(314mg，0.83mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，加入二异丙基乙胺(213mg，1.65mmol)，加入2-溴乙酸叔丁酯(241mg，1.24mmol)，反应2小时。向反应液中加入水(10mL)，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和氯化钠溶液(10mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系A纯化所得残余物，得到标题化合物3a(224mg，产率：71％)。

MS m/z(ESI):324.2[M-55]。

第二步

2-(5-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-2,3-二氢螺[茚-1,4'-哌啶]-1'-基)乙酸叔丁酯3b

称取化合物3a(224mg,0.59mmol)，二氢尿嘧啶(202mg,1.77mmol，上海毕得医药)，甲磺酸(2-二环己基膦基-3,6-二甲氧基-2',4',6'-三异丙基-1,1'-联苯)(2-氨基-1,1'-联苯-2-基)钯(II)(53mg,0.058mmol)，碳酸铯(576mg,1.77mmol)到50mL单口瓶中，加入1,4-二氧六环(5mL)。氮气置换三次，升温到100℃反应6小时。硅藻土过滤，滤液减压浓缩，收集滤饼，用乙酸乙酯洗涤(0.5mL×3)，真空干燥，得到标题化合物3b(140mg，收率：57％)。

MS m/z(ESI):414.6[M+1]。

第三步

2-(5-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-2,3-二氢螺[茚-1,4'-哌啶]-1'-基)乙酸3c

将化合物3b(56mg，0.135mmol)溶于二氯甲烷(2mL)中，加入三氟乙酸(2mL)，反应4小时。减压浓缩除去溶剂，真空干燥，得到粗品标题化合物3c(48mg，收率：99％)，粗产品不经纯化直接用于下一步反应。

MS m/z(ESI):358.4[M+1]。

第四步(±)-2-(6,7-二氢-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-1-基)-2-(6-(4-(4-(2-(5-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-2,3-二氢螺[茚-1,4'-哌啶]-1'-基)乙酰基)哌嗪-1-基)苯基)-4-氟-1-氧代异吲哚啉-2-基)-N-(噻唑-2-基)乙酰胺3

将化合物3c(48mg,0.134mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，加入2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(77mg,0.203mmol)，加入二异丙基乙胺(52mg,0.402mmol)。反应20分钟后，加入化合物1k(80mg,0.135mmol)，反应20分钟。反应液过滤，经高效液相制备(Waters-2545，洗脱体系：10mmol/L碳酸氢铵的水溶液和乙腈，乙腈的梯度：35％-95％，流速：30mL/min)，得到标题产物3(外消旋体混合物，1：1，50mg，产率：41％)。

MS m/z(ESI):897.2[M+1]。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ12.20(s,1H),10.30(s,1H),7.78(s,1H),7.75(d,1H),7.70(d,2H),7.61(s,1H),7.48(d,1H),7.25(d,1H),7.20(d,1H),7.13(s,1H),7.12-7.05(m,3H),6.15(s,1H),4.80(d,1H),4.22(d,1H),4.06-3.92(m,3H),3.84-3.69(m,5H),3.63(s,2H),3.27-3.16(m,5H),2.90-2.73(m,6H),2.67(t,2H),2.24(t,2H),2.01-1.94(m,3H),1.80(t,2H),1.52-1.40(m,2H)。

实施例4

(±)-2-(6,7-二氢-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-1-基)-2-(6-(4-(4-(2-(4-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-2,3-二氢螺[茚-1,4'-哌啶]-1'-基)乙酰基)哌嗪-1-基)苯基)-4-氟-1-氧代异吲哚啉-2-基)-N-(噻唑-2-基)乙酰胺4

第一步

2-(4-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-2,3-二氢螺[茚-1,4'-哌啶]-1'-基)乙酸叔丁酯4a

称取化合物2g(75mg，0.197mmol)，二氢尿嘧啶(68mg，0.60mmol)，甲磺酸(2-二环己基膦基-3,6-二甲氧基-2',4',6'-三异丙基-1,1'-联苯)(2-氨基-1,1'-联苯-2-基)钯(II)(18mg，0.02mmol)，碳酸铯(193mg，0.59mmol)到50mL单口瓶中，加入1,4-二氧六环(5mL)。氮气置换三次，升温到100℃反应12小时。硅藻土过滤，滤液减压浓缩，残留物经高效液相制备(Waters-2545，洗脱体系：10mmol/L碳酸氢铵的水溶液和乙腈，乙腈的梯度：30％-95％，流速：30mL/min)，得到标题化合物4a(10mg，收率：12％)。

MS m/z(ESI):414.2[M+1]。

第二步

2-(4-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-2,3-二氢螺[茚-1,4'-哌啶]-1'-基)乙酸4b

将化合物4a(10mg，0.024mmol)溶于二氯甲烷(2mL)中，加入三氟乙酸(1mL)，反应4小时。减压浓缩除去溶剂，真空干燥，得到粗品标题化合物4b(8.5mg，收率：99％)，粗产品不经纯化直接用于下一步反应。

MS m/z(ESI):358.2[M+1]。

第三步(±)-2-(6,7-二氢-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-1-基)-2-(6-(4-(4-(2-(4-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-2,3-二氢螺[茚-1,4'-哌啶]-1'-基)乙酰基)哌嗪-1-基)苯基)-4-氟-1-氧代异吲哚啉-2-基)-N-(噻唑-2-基)乙酰胺4

将化合物4b(8.5mg，0.024mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中，加入2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(13.4mg，0.035mmol)，二异丙基乙胺(9.1mg，0.07mmol)。反应20分钟，加入化合物1k(14mg,0.024mmol)，反应20分钟。反应液过滤，经高效液相制备(Waters-2545，洗脱体系：10mmol/L碳酸氢铵的水溶液和乙腈，乙腈的梯度：35％-95％，流速：30mL/min)，得到标题产物4(外消旋体混合物，1：1，8mg，产率：38％)。

MS m/z(ESI):895.2[M-1]。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ12.52(s,1H),10.32(s,1H),7.78(s,1H),7.75(d,1H),7.70(d,2H),7.61(s,1H),7.48(d,1H),7.27-7.19(m,2H),7.14(d,1H),7.11-7.04(m,3H),6.15(s,1H),4.80(d,1H),4.22(d,1H),4.04-3.92(m,2H),3.76(s,2H),3.72-3.58(m,4H),3.28-3.16(m,5H),2.87-2.72(m,6H),2.68(t,2H),2.59-2.44(m,3H),2.31-2.19(m,2H),1.96(t,2H),1.82(t,2H),1.47(d,2H)。

实施例5

2-(6,7-二氢-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-1-基)-2-(6-(4-(4-(2-(5-((2,6-二氧代哌啶-3-基)氨基)-1,3-二氢螺[茚-2,4'-哌啶]-1'-基)乙酰基)哌嗪-1-基)苯基)-4-氟-1-氧代异吲哚啉-2-基)-N-(噻唑-2-基)乙酰胺5

/>

第一步

(±)-6-溴-1-羟基-1,3-二氢螺[茚-2,4'-哌啶]-1'-羧酸叔丁酯5b

将6-溴-1-氧代-1,3-二氢螺[茚-2,4'-哌啶]-1'-羧酸叔丁酯5a(500mg,1.31mmol，上海毕得医药)溶于甲醇(5mL)中，冰浴下加入硼氢化钠(74mg,1.96mmol)，反应1小时。冰浴冷却下，加水15mL，用1M稀盐酸调节pH至6左右，用乙酸乙酯(25mL×3)萃取，合并有机相，用饱和氯化钠溶液(25mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，真空干燥，得到粗产品标题化合物5b(500mg，产率：99％)，粗产品不经纯化直接用于下一步反应。

MS m/z(ESI):380.1[M-1]。

第二步

5-溴-1,3-二氢螺[茚-2,4'-哌啶]三氟乙酸盐5c

将化合物5b(495mg,1.29mmol)溶于三氟乙酸(1.51g,12.98mmol)中，滴加三乙基硅烷(1.48g,12.98mmol)，升温到40℃反应5小时。将反应液浓缩，真空干燥，得到粗品标题化合物5c(345mg，产率：100％)，粗产品不经纯化直接用于下一步反应。

MS m/z(ESI):266.1[M+1]。

第三步

5-溴-1,3-二氢螺[茚-2,4'-哌啶]-1'-羧酸叔丁酯5d

将化合物5c溶于甲醇(10mL)中，冰水浴下加入2M氢氧化钠溶液(1.3mL)和二碳酸二叔丁酯(424mg，1.94mmol)，反应16小时。用1M稀盐酸调节pH至6左右，用乙酸乙酯(25mL×3)萃取，合并有机相，用饱和氯化钠溶液(25mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩，所得残余物经硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题化合物5d(450mg，产率：95％)。

MS m/z(ESI):310.1[M-55]。

第四步

5-((二苯基甲亚基)氨基)-1,3-二氢螺[茚-2,4'-哌啶]-1'-羧酸叔丁酯5e

称取化合物5d(460mg,1.25mmol)，二苯甲酮亚胺(251mg，1.38mmol)，三(二亚苄基茚丙酮)二钯(57mg，0.062mmol)，1,1'-联萘-2,2'-双二苯膦(78mg,0.12mmol)，叔丁醇钠(181mg,1.88mmol)到100mL单口瓶中。氮气置换三次，升温到90℃反应16小时。反应液经硅藻土过滤，滤液减压浓缩，所得残余物用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题化合物5e(480mg，产率：81％)。

MS m/z(ESI):467.3[M+1]。

第五步

5-氨基-1,3-二氢螺[茚-2,4'-哌啶]-1'-羧酸叔丁酯5f

将化合物5e(550mg，1.18mmol)溶于四氢呋喃(16mL)中，加入稀盐酸(11mL，0.5M)，反应10分钟。向反应液中加入饱和碳酸氢钠溶液，调节pH到7左右。用乙酸乙酯(25mL×3)萃取，合并有机相，用饱和氯化钠溶液(15mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液减压浓缩除去溶剂，得到粗品标题化合物5f(356mg，产率：99％)，粗产品不经纯化直接进行下一步反应。

MS m/z(ESI):303.2[M+1]。

第六步

(±)-5-((2,6-二氧代哌啶-3-基)氨基)-1,3-二氢螺[茚-2,4'-哌啶]-1'-羧酸叔丁酯5g

将化合物5f(338mg,1.11mmol)溶于乙腈(15mL)中，加入碳酸氢钠(376mg,4.47mmol)，(±)-3-溴-2,6-哌啶二酮(258mg,1.34mmol)。升温到85℃反应。反应3小时，补加(±)-3-溴-2,6-哌啶二酮(58mg,0.3mmol)，反应3小时，再补加(±)-3-溴-2,6-哌啶二酮(58mg,0.3mmol)，反应16小时。反应液冷却，过滤，滤液减压浓缩，所得残余物用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系A纯化，得到标题化合物5g(400mg，86％)。

MS m/z(ESI):414.5[M+1]。

第七步

(±)-3-((1,3-二氢螺[茚-2,4'-哌啶]-5-基)氨基)哌啶-2,6-二酮盐酸盐5h

将化合物5g(60mg,0.096mmol)溶于二氯甲烷(2mL)，加入氯化氢的1,4-二氧六环溶液(0.25mL)，反应2小时。将反应液浓缩，真空干燥，得粗品标题化合物5h(34mg，产率：100％)，粗产品不经纯化直接用于下一步反应。

MS m/z(ESI):314.5[M+1]。

第八步

(±)-2-(5-((2,6-二氧代哌啶-3-基)氨基)-1,3-二氢螺[茚-2,4'-哌啶]-1'-基)乙酸叔丁酯5i

将化合物5h(36mg，0.10mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中，加入2-溴乙酸叔丁酯(27mg，0.10mmol)，二异丙基乙胺(67mg，0.52mmol)，反应2小时。向体系中加入水(10mL)，用乙酸乙酯萃取(15mL×3)，合并有机相，有机相用饱和氯化钠溶液(15mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液减压浓缩，所得残余物用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系A纯化，得到标题化合物5i(40mg，产率：90％)。MS m/z(ESI):428.6[M+1]。

第九步

(±)-2-(5-((2,6-二氧代哌啶-3-基)氨基)-1,3-二氢螺[茚-2,4'-哌啶]-1'-基)乙酸5j

将化合物5i(40mg，0.056mmol)溶于二氯甲烷(1mL)中，加入三氟乙酸(256mg，2.24mmol)，反应3小时。将反应液浓缩，真空干燥，得粗品标题化合物5j(27mg，产率：100％)，粗产品不经纯化直接用于下一步反应。

MS m/z(ESI):372.5[M+1]。

第十步

2-(6,7-二氢-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-1-基)-2-(6-(4-(4-(2-(5-((2,6-二氧代哌啶-3-基)氨基)-1,3-二氢螺[[茚-2,4'-哌啶]-1'-基)乙酰基)哌嗪-1-基)苯基)-4-氟-1-氧代异吲哚啉

-2-基)-N-(噻唑-2-基)乙酰胺5

将化合物5j(27mg，0.027mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中，加入2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(16mg，0.042mmol)，二异丙基乙胺(15mg，0.12mmol)。反应20分钟后，加入化合物1k(16mg，0.027mmol)，反应30分钟。反应液过滤，经高效液相制备(Waters-2545，洗脱体系：10mmol/L碳酸氢铵的水溶液和乙腈，乙腈的梯度：45％-95％，流速：30mL/min)，得到标题产物5(4个异构体混合物，1：1：1：1，15mg，产率：59％)。

MS m/z(ESI):911.6[M+1]。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ12.48(s,1H),10.75(s,1H),7.78(s,1H),7.75(d,1H),7.69(d,2H),7.61(s,1H),7.48(d,1H),7.26(d,1H),7.07(d,2H),6.87(d,1H),6.51(s,1H),6.43(d,1H),6.15(s,1H),5.54(d,1H),4.80(d,1H),4.27-4.17(m,2H),4.04-3.92(m,2H),3.74(s,2H),3.60(s,2H),3.30-3.24(m,2H),3.19(s,4H),2.81-2.68(m,2H),2.66-2.57(m,4H),2.50-2.34(m,6H),2.13-2.07(m,1H),2.05-1.94(m,1H),1.89-1.78(m,1H),1.60-1.51(m,4H),1.49-1.40(m,1H)。

实施例6

(±)-2-(6,7-二氢-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-1-基)-2-(6-(4-(4-(2-(5-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-2,3-二氢螺[茚-1,4'-哌啶]-1'-基)乙酰基)哌嗪-1-基)苯基)-4-氟-1-氧代异吲哚啉-2-基)-N-(噻唑-2-基)乙酰胺6

第一步

2-(5-溴-1,3-二氢螺[茚-2,4'-哌啶]-1'-基)乙酸叔丁酯6a

将化合物5c(795mg，2.09mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中，加入二异丙基乙胺(811mg，6.27mmol)，加入2-溴乙酸叔丁酯(449mg，2.30mmol)，反应2小时。向反应液中加入水(10mL)，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和氯化钠溶液(20mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，所得残余物用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系A纯化，得到标题化合物6a(500mg，收率：62％)。

MS m/z(ESI):380.1[M+1]。

第二步

2-(5-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-1,3-二氢螺[茚-2,4'-哌啶]-1'-基)乙酸叔丁酯6b

将化合物6a(220mg，0.58mmol)，二氢尿嘧啶(198mg，1.73mmol)，甲磺酸(2-二环己基膦基-3,6-二甲氧基-2',4',6'-三异丙基-1,1'-联苯)(2-氨基-1,1'-联苯-2-基)钯(II)(52mg，0.057mmol)，碳酸铯(565mg，1.73mmol)到50mL单口瓶中，加入1,4-二氧六环(5mL)。氮气置换三次，升温到100℃反应12小时。反应液经硅藻土过滤，滤液减压浓缩，所得残余物用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系A纯化，得到标题化合物6b(145mg，收率：60％)。

MS m/z(ESI):414.8[M+1]。

第三步

2-(5-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-1,3-二氢螺[茚-2,4'-哌啶]-1'-基)乙酸6c

将化合物6b(100mg，0.24mmol)溶于二氯甲烷(1mL)中，加入三氟乙酸(276mg，2.42mmol)，反应4小时。减压浓缩除去溶剂，真空干燥，得到粗品标题化合物6c(114mg，收率：100％)，粗产品不经纯化直接用于下一步反应。

MS m/z(ESI):358.3[M+1]。

第四步(±)-2-(6,7-二氢-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-1-基)-2-(6-(4-(4-(2-(5-(2,4-二氧代四氢嘧啶-1(2H)-基)-2,3-二氢螺[茚-1,4'-哌啶]-1'-基)乙酰基)哌嗪-1-基)苯基)-4-氟-1-氧代异吲哚啉-2-基)-N-(噻唑-2-基)乙酰胺6

将化合物6c(114mg，0.22mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，加入2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(125mg，0.32mmol)，二异丙基乙胺(141mg，1.09mmol)。反应20分钟后，加入化合物1k(130mg,0.22mmol)，反应30分钟。反应液过滤，经高效液相制备(Waters-2545，洗脱体系：10mmol/L碳酸氢铵的水溶液和乙腈，乙腈的梯度：35％-92％，流速：30mL/min)，得到标题产物6(外消旋体混合物，1：1，80mg，产率：40％)。

MS m/z(ESI):897.2[M+1]。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ12.50(s,1H),10.29(s,1H),7.78(s,1H),7.74(d,1H),7.69(d,2H),7.61(s,1H),7.48(d,1H),7.25(d,1H),7.17(d,1H),7.12(s,1H),7.07(d,2H),7.03(d,1H),6.15(s,1H),4.80(d,1H),4.22(d,1H),4.04-3.93(m,2H),3.79-3.68(m,4H),3.60(s,2H),3.30-3.24(m,2H),3.19(s,4H),2.82-2.63(m,8H),2.48-2.35(m,6H),1.62-1.47(m,4H)。

实施例7-1和实施例7-2

2-(6,7-二氢-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-1-基)-2-(6-(4-(4-(2-((1s,4r)-5'-((2,6-二氧代哌啶-3-基)氨基)-4-羟基-2',3'-二氢螺[环己烷-1,1'-茚]-4-基)乙酰基)哌嗪-1-基)苯基)-4-氟

-1-氧代异吲哚啉-2-基)-N-(噻唑-2-基)乙酰胺7-1

2-(6,7-二氢-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-1-基)-2-(6-(4-(4-(2-((1r,4s)-5'-((2,6-二氧代哌啶-3-基)氨基)-4-羟基-2',3'-二氢螺[环己烷-1,1'-茚]-4-基)乙酰基)哌嗪-1-基)苯基)-4-氟

-1-氧代异吲哚啉-2-基)-N-(噻唑-2-基)乙酰胺7-2

第一步

2-(5'-溴-4-羟基-2',3'-二氢螺[环己烷-1,1'-茚]-4-基)乙酸叔丁酯7b

将乙酸叔丁酯(292mg，2.5mmol，阿达玛斯试剂有限公司)溶于10mL四氢呋喃中，降温到-78℃，滴加2M的二异丙基氨基锂的四氢呋喃/正己烷溶液(1.8mL，安耐吉化学有限公司)，反应1小时。然后加入5'-溴-2',3'-二氢螺[环己烷-1,1'-茚]-4-酮7a(500mg，1.79mmol，采用公知的方法“Journal of Medicinal Chemistry,2014,57,3464-3483”制备而得)，反应1小时。加入20mL水，用乙酸乙酯(25mL×3)萃取，合并有机相，用饱和氯化钠溶液(25mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，所得残余物经硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题化合物7b(顺反异构体混合物，1：1，400mg，产率：56％)。

MS m/z(ESI):321.1[M-18-55]。

第二步

2-(5'-((二苯基甲亚基)氨基)-4-羟基-2',3'-二氢螺[环己烷-1,1'-茚]-4-基)乙酸叔丁酯7c

称取化合物7b(400mg，1.01mmol)，二苯甲酮亚胺(367mg，2.02mmol)，甲磺酸(2-二环己基膦基-3,6-二甲氧基-2',4',6'-三异丙基-1,1'-联苯)(2-氨基-1,1'-联苯-2-基)钯(II)(92mg，0.10mmol)，碳酸铯(989mg，3.04mmol)到50mL单口瓶中，加入1,4-二氧六环(10mL)。氮气置换三次，升温到100℃反应16小时。反应液经硅藻土过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化所得残余物，得到标题化合物7c(顺反异构体混合物，1：1，495mg，产率：99％)。

MS m/z(ESI):496.2[M+1]。

第三步

2-(5'-氨基-4-羟基-2',3'-二氢螺[环己烷-1,1'-茚]-4-基)乙酸叔丁酯7d

将化合物7c(495mg,1.0mmol)溶于10mL四氢呋喃中，加入0.5M的盐酸溶液(8mL)，反应30分钟。加入饱和碳酸氢钠溶液调节反应液pH到7-8之间，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，合并有机相，用饱和氯化钠溶液洗涤(20mL×2)，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化所得残余物，得到标题化合物7d(顺反异构体混合物，1：1，162mg，产率：50％)。

MS m/z(ESI):332.3[M+1]。

第四步

2-(5'-((2,6-二氧代哌啶-3-基)氨基)-4-羟基-2',3'-二氢螺[环己烷-1,1'-茚]-4-基)乙酸叔丁酯7e

将化合物7d(162mg，0.49mmol)溶于10mL乙腈中，加入碳酸氢钠(164mg，1.95mmol)，加入(±)-3-溴-哌啶-2,6-二酮(113mg，0.59mmol)，升温到80℃反应。反应2小时，补加(±)-3-溴-哌啶-2,6-二酮(113mg，0.59mmol)，反应2小时，再补加(±)-3-溴-哌啶-2,6-二酮(113mg，0.59mmol)，反应12小时。反应液减压浓缩，过滤，用乙酸乙酯洗涤(15mL)，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系A纯化所得残余物，得到标题化合物7e(四个异构体混合物，1：1：1：1，135mg，产率：62％)。

MS m/z(ESI):443.2[M+1]。

第五步

2-(5'-((2,6-二氧代哌啶-3-基)氨基)-4-羟基-2',3'-二氢螺[环己烷-1,1'-茚]-4-基)乙酸7f

将化合物7e(135mg，0.31mmol)溶于5mL二氯甲烷中，加入三氟乙酸(3mL)，反应4小时。减压除去溶剂，真空干燥，得粗品标题化合物7f(四个异构体混合物，1：1：1：1，117mg，产率：99％)，粗产品不经纯化直接用于下一步反应。MS m/z(ESI):387.4[M+1]。

第六步

2-(6,7-二氢-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-1-基)-2-(6-(4-(4-(2-((1s,4r)-5'-((2,6-二氧代哌啶-3-基)氨基)-4-羟基-2',3'-二氢螺[环己烷-1,1'-茚]-4-基)乙酰基)哌嗪-1-基)苯基)-4-氟-1-氧代异吲哚啉-2-基)-N-(噻唑-2-基)乙酰胺7-1

2-(6,7-二氢-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-1-基)-2-(6-(4-(4-(2-((1r,4s)-5'-((2,6-二氧代哌啶-3-基)氨基)-4-羟基-2',3'-二氢螺[环己烷-1,1'-茚]-4-基)乙酰基)哌嗪-1-基)苯基)-4-氟-1-氧代异吲哚啉-2-基)-N-(噻唑-2-基)乙酰胺7-2

将化合物7f(117mg，0.30mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中，加入2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(125mg，0.33mmol)，加入二异丙基乙胺(116mg，0.90mmol)。反应20分钟，加入化合物1k(178mg，0.30mmol)，反应20分钟。反应液过滤，经高效液相制备(Waters-2545，洗脱体系：10mmol/L碳酸氢铵的水溶液和乙腈，乙腈的梯度：45％-60％，流速：30mL/min)，得到标题产物(25mg、20mg)。

7-1或者7-2中保留时间较短的化合物(四个异构体混合物，1：1：1：1，25mg，产率：9％)。

分析条件：保留时间18.603分钟(Thermo U3000，色谱柱：Waters ACQUITY UPLCBEH C18，1.7μm,2.1*100mm，流动相：乙腈/5mmol/L碳酸氢铵的水溶液＝5％-95％(V/V)，柱温：40℃，时间：30分钟，流速：0.3mL/min)。

MS m/z(ESI):926.3[M+1]。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ12.52(s,1H),10.76(s,1H),7.78(s,1H),7.75(d,1H),7.69(d,2H),7.61(s,1H),7.49(d,1H),7.26(d,1H),7.07(d,2H),7.02(d,1H),6.52-6.46(m,2H),6.15(s,1H),5.58(d,1H),4.92(s,1H),4.80(d,1H),4.29-4.18(m,2H),4.05-3.92(m,2H),3.83-3.74(m,2H),3.71-3.64(m,2H),3.30-3.18(m,4H),2.81-2.66(m,6H),2.61-2.43(m,3H),2.13-2.06(m,1H),1.91-1.75(m,6H),1.67-1.50(m,4H),1.49-1.41(m,2H)。

7-2或者7-1中保留时间较长的化合物(四个异构体混合物，1：1：1：1，20mg，产率：7％)。

分析条件：保留时间18.907分钟(Thermo U3000，色谱柱：Waters ACQUITY UPLCBEH C18，1.7μm,2.1*100mm，流动相：乙腈/5mmol/L碳酸氢铵的水溶液＝5％-95％(V/V)，柱温：40℃，时间：30分钟，流速：0.3mL/min)。

MS m/z(ESI):926.3[M+1]。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ12.52(s,1H),10.75(s,1H),7.78(s,1H),7.75(d,1H),7.69(d,2H),7.61(s,1H),7.48(d,1H),7.26(d,1H),7.06(d,2H),6.85(d,1H),6.51-6.46(m,2H),6.15(s,1H),5.55(d,1H),4.80(d,1H),4.75(s,1H),4.28-4.18(m,2H),4.04-3.93(m,2H),3.75-3.63(m,4H),3.30-3.19(m,5H),2.80-2.66(m,4H),2.60-2.43(m,5H),2.13-2.06(m,1H),1.94-1.80(m,5H),1.66-1.53(m,4H),1.23-1.12(m,2H)。

实施例8-1和实施例8-2

2-(6,7-二氢-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-1-基)-2-(6-(4-(4-(2-((1s,4s)-5'-((2,6-二氧代哌啶-3-基)氨基)-4-羟基-1',3'-二氢螺[环己烷-1,2'-茚]-4-基)乙酰基)哌嗪-1-基)苯基)-4-氟-1-氧代异吲哚啉-2-基)-N-(噻唑-2-基)乙酰胺8-1

2-(6,7-二氢-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-1-基)-2-(6-(4-(4-(2-((1r,4r)-5'-((2,6-二氧代哌啶-3-基)氨基)-4-羟基-1',3'-二氢螺[环己烷-1,2'-茚]-4-基)乙酰基)哌嗪-1-基)苯基)-4-氟-1-氧代异吲哚啉-2-基)-N-(噻唑-2-基)乙酰胺8-2

/>

第一步

6'-溴螺[环己烷-1,2'-茚]-1',4(3'H)-二酮8b

将6-溴-2,3-二氢-1H-茚-1-酮8a(1g，4.74mmol，上海毕得医药)和丙烯酸甲酯(898mg，10.43mmol)溶于10mL四氢呋喃中，加入1M叔丁醇钾的四氢呋喃溶液(7.2mL，7.2mmol)，反应1小时。然后加入去离子水(20mL)和1M氢氧化钾水溶液(4.8mL)，加热回流反应12小时。待反应冷却至室温，用布氏漏斗过滤，用去离子水洗涤滤饼(15mL)，真空干燥，得粗品标题化合物8b(1.0g，产率：72％)，粗产品不经纯化直接用于下一步反应。

MS m/z(ESI):293.1[M+1]。

第二步

5'-溴-1',3'-二氢螺[环己烷-1,2'-茚]-4-基2,2,2-三氟乙酸酯8c

将化合物8b(850mg，2.90mmol)溶于6mL三氟乙酸中，加入三乙基硅烷(2.70g，23.22mmol)，反应12小时。减压除去溶剂，加入饱和碳酸氢钠溶液(15mL)，用乙酸乙酯萃取(20mL×3)，合并有机相，用饱和氯化钠溶液洗涤(25mL)，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，所得残余物用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题化合物8c(顺反式异构体混合物，1：1，1.0g，产率：91％)。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ7.88(d,1H),7.71(dd,1H),7.35(d,1H),5.11-5.04(m,1H),3.01(s,2H),2.27-2.20(m,2H),1.88(td,2H),1.75-1.65(m,2H),1.64-1.57(m,3H),1.34-1.26(m,1H)。

¹⁹F NMR(471MHz,CDCl₃)δ-75.28。

第三步

5'-溴-1',3'-二氢螺[环己烷-1,2'-茚]-4-醇8d

将化合物8c(1.0g，2.65mmol)溶于四氢呋喃和水的混合溶剂(12mL，V/V＝3/1)中，加入氢氧化钠(320mg，8.00mmol)，反应1小时。减压除去溶剂，用乙酸乙酯萃取(10mL×3)，合并有机相，用饱和氯化铵溶液洗涤(20mL)，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，所得残余物用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题化合物8d(顺反式异构体混合物，1：1，745mg，产率：99％)。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ7.30-7.26(m,1H),7.25-7.21(m,1H),7.04-6.97(m,1H),3.76-3.68(m,1H),2.81-2.66(m,4H),1.90-1.78(m,2H),1.73-1.66(m,2H),1.53-1.39(m,5H)。

第四步

5'-溴-1',3'-二氢螺[环己烷-1,2'-茚]-4-酮8e

将化合物8d(745mg，2.65mmol)溶于15mL二氯甲烷，加入戴斯-马丁试剂(2.25g，5.30mmol)，反应12小时。减压除去溶剂，加入饱和碳酸氢钠溶液(10mL)，加入硫代硫酸钠固体(3.16g,20mmol)，搅拌20分钟。用乙酸乙酯萃取(20mL×3)，合并有机相，用饱和氯化钠溶液(25mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，所得残余物用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题化合物8e(600mg，产率：81％)。

第五步

2-(5'-溴-4-羟基-1',3'-二氢螺[环己烷-1,2'-茚]-4-基)乙酸叔丁酯8f

将乙酸叔丁酯(188mg，1.61mmol)溶于5mL四氢呋喃中，降温到-78℃，滴加2M的二异丙基氨基锂的四氢呋喃/正己烷溶液(1.1mL)，反应1小时。然后加入化合物8e(300mg,1.08mmol)的四氢呋喃(3mL)溶液，反应1小时。加入20mL水，用乙酸乙酯(25mL×3)萃取，合并有机相，用饱和氯化钠溶液(25mL×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，所得残余物经硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题化合物8f(顺反式异构体混合物，1：1，370mg，产率：87％)。

MS m/z(ESI):321.1[M-18-55]。

第六步

2-(5'-((二苯基甲亚基)氨基)-4-羟基-1',3'-二氢螺[环己烷-1,2'-茚]-4-基)乙酸叔丁酯8g

称取化合物8f(370mg，0.94mmol)，二苯甲酮亚胺(339mg，1.88mmol)，甲磺酸(2-二环己基膦基-3,6-二甲氧基-2',4',6'-三异丙基-1,1'-联苯)(2-氨基-1,1'-联苯-2-基)钯(II)(85mg，0.09mmol)，碳酸铯(610mg，1.87mmol)到50mL单口瓶中，加入1,4-二氧六环(8mL)。氮气置换三次，升温到100℃反应16小时。反应液用硅藻土过滤，滤液减压浓缩，所得残余物用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题化合物8g(顺反式异构体混合物，1：1，463mg，产率：99％)。

MS m/z(ESI):496.2[M+1]。

第七步

2-(5'-氨基-4-羟基-1',3'-二氢螺[环己烷-1,2'-茚]-4-基)乙酸叔丁酯8h

将化合物8g(463mg，0.93mmol)溶于四氢呋喃(5mL)中，加入1M的盐酸溶液(2mL)，反应2小时。用饱和碳酸氢钠溶液中和反应液pH到7-8之间，用乙酸乙酯萃取(10mL×3)，合并有机相，用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，所得残余物用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化，得到标题化合物8h(顺反式异构体混合物，1：1，221mg，产率：71％)。

MS m/z(ESI):332.2[M+1]。

第八步

(±)-2-((1s,4s)-5'-((2,6-二氧代哌啶-3-基)氨基)-4-羟基-1',3'-二氢螺[环己烷-1,2'-茚]-4-基)乙酸叔丁酯8-1i

(±)-2-((1r,4r)-5'-((2,6-二氧代哌啶-3-基)氨基)-4-羟基-1',3'-二氢螺[环己烷-1,2'-茚]-4-基)乙酸叔丁酯8-2i

将化合物8h(190mg，0.57mmol)溶于15mL乙腈中，加入碳酸氢钠(241mg,2.87mmol)，加入(±)-3-溴-哌啶-2,6-二酮(132mg，0.69mmol)，升温到85℃反应。反应2小时，补加(±)-3-溴-哌啶-2,6-二酮(132mg，0.69mmol)，反应2小时，再补加(±)-3-溴-哌啶-2,6-二酮(132mg，0.69mmol)，反应48小时。反应液减压浓缩，过滤，滤液浓缩，所得残留物经高效液相制备(Waters-2545，洗脱体系：10mmol/L碳酸氢铵的水溶液和乙腈，乙腈的梯度：40％-55％，流速：30mL/min)，得到标题化合物8-1i和8-2i。

8-1i或者8-2i中保留时间较短的化合物(外消旋体，1：1，70mg，产率：28％)。MS m/z(ESI):443.2[M+1]。

分析条件：保留时间1.749分钟(Agilent 1200DAD-6120，色谱柱：HOLOWAC18，30*3mm，2.7μm；流动相：乙腈/10mmol/L碳酸氢铵的水溶液＝10％-95％(V/V)，柱温：25℃，时间：3.5分钟，流速1.5mL/min)。

8-2i或者8-1i中保留时间较长的化合物(外消旋体，1：1，70mg，产率：28％)。MS m/z(ESI):443.2[M+1]。

分析条件：保留时间1.795分钟(Agilent 1200DAD-6120，色谱柱：HOLOWAC18，30*3mm，2.7μm；流动相：乙腈/10mmol/L碳酸氢铵的水溶液＝10％-95％(V/V)，柱温：25℃，时间：3.5分钟，流速1.5mL/min)。

第九步

(±)-2-((1s,4s)-5'-((2,6-二氧代哌啶-3-基)氨基)-4-羟基-1',3'-二氢螺[环己烷-1,2'-茚]-4-基)乙酸8-1j

(±)-2-((1r,4r)-5'-((2,6-二氧代哌啶-3-基)氨基)-4-羟基-1',3'-二氢螺[环己烷-1,2'-茚]-4-基)乙酸8-2j

将化合物8-1i或者8-2i中保留时间较短的化合物(30mg，0.07mmol)溶于2mL二氯甲烷，加入4M氯化氢的1,4-二氧六环溶液(2mL)，反应8小时。减压除去溶剂，加入乙酸乙酯和正己烷(10mL，V/V＝1/1)的混合溶剂，过滤，滤饼真空干燥，得到粗品标题化合物8-1j或者8-2j(26mg，产率：83％)，粗产品不经纯化直接用于下一步反应。

使用同样的方法，由化合物8-2i或者8-1i中保留时间较长化合物(30mg，0.07mmol)经反应得到粗品标题化合物8-2j或者8-1j(26mg，产率：83％)。

MS m/z(ESI):387.2[M+1]。

第十步

将上步产物之一化合物8-1j或者8-2j(26mg，0.06mmol)和化合物1k(34mg，0.06mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，加入2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(22mg，0.06mmol)和二异丙基乙胺(44mg，0.34mmol)，反应1小时。反应液过滤，经高效液相制备(Waters-2545，洗脱体系：10mmol/L碳酸氢铵的水溶液和乙腈，乙腈的梯度：35％-92％，流速：30mL/min)，得到标题化合物8-1或者8-2。

8-1或者8-2(四个异构体混合物，1：1：1：1，8mg，产率：15％)：MS m/z(ESI):926.3[M+1]。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ12.50(s,1H),10.75(s,1H),7.78(s,1H),7.74(d,1H),7.72-7.66(m,2H),7.60(s,1H),7.48(d,1H),7.25(d,1H),7.06(d,2H),6.86(d,1H),6.51(d,1H),6.43(dd,1H),6.15(s,1H),5.52(d,1H),4.80(d,1H),4.72(s,1H),4.26-4.19(m,2H),4.04-3.93(m,2H),3.74-3.63(m,4H),3.31-3.19(m,5H),2.80-2.69(m,2H),2.65-2.61(m,2H),2.56-2.43(m,6H),2.13-2.06(m,1H),2.03-1.95(m,1H),1.88-1.76(m,1H),1.71-1.63(m,2H),1.62-1.49(m,4H),1.40-1.33(m,2H)。

将上步产物之二化合物8-2j或者8-1j(26mg，0.06mmol)和化合物1k(34mg，0.06mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，加入2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(22mg，0.06mmol)和二异丙基乙胺(44mg，0.34mmol)，反应1小时。反应液过滤，经高效液相制备(Waters-2545，洗脱体系：10mmol/L碳酸氢铵的水溶液和乙腈，乙腈的梯度：35％-92％，流速：30mL/min)，得到标题化合物8-2或者8-1。

8-2或者8-1(四个异构体混合物，1：1：1：1，12mg，产率：23％)：MS m/z(ESI):926.3[M+1]。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ12.48(s,1H),10.75(s,1H),7.78(s,1H),7.74(d,1H),7.72-7.65(m,2H),7.60(s,1H),7.48(d,1H),7.25(d,1H),7.06(d,2H),6.86(d,1H),6.50(d,1H),6.43(dd,1H),6.15(s,1H),5.51(d,1H),4.80(d,1H),4.72(s,1H),4.28-4.19(m,2H),4.04-3.93(m,2H),3.74-3.63(m,4H),3.31-3.18(m,5H),2.80-2.69(m,2H),2.63-2.57(m,4H),2.56-2.43(m,5H),2.13-2.06(m,1H),1.88-1.77(m,1H),1.72-1.63(m,2H),1.61-1.49(m,4H),1.40-1.32(m,2H)。

实施例9-1和实施例9-2

2-(6,7-二氢-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-1-基)-2-(6-(4-(6-(2-((1s,4s)-5'-((2,6-二氧代哌啶-3-基)氨基)-4-羟基-1',3'-二氢螺[环己烷-1,2'-茚]-4-基)乙酰基)-2,6-二氮杂螺[3.3]庚-2-基)苯基)-4-氟-1-氧代异吲哚啉-2-基)-N-(噻唑-2-基)乙酰胺9-1

2-(6,7-二氢-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-1-基)-2-(6-(4-(6-(2-((1r,4r)-5'-((2,6-二氧代哌啶-3-基)氨基)-4-羟基-1',3'-二氢螺[环己烷-1,2'-茚]-4-基)乙酰基)-2,6-二氮杂螺[3.3]庚-2-基)苯基)-4-氟-1-氧代异吲哚啉-2-基)-N-(噻唑-2-基)乙酰胺9-2

将实施例8中第九步产物之一化合物8-1j或者8-2j(35mg，0.09mmol)和2-(6-(4-(2,6-二氮杂螺[3.3]庚-2-基)苯基)-4-氟-1-氧代异吲哚啉-2-基)-2-(6,7-二氢-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-1-基)-N-(噻唑-2-基)乙酰胺三氟乙酸盐9a(46mg，0.09mmol，采用专利申请“WO2021127561A1”中说明书第513页的实施例47”公开的方法制备而得)溶于N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，加入2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(35mg，0.09mmol)，二异丙基乙胺(59mg，0.46mmol)，反应1小时。反应液过滤，经高效液相制备(Waters-2545，洗脱体系：10mmol/L碳酸氢铵的水溶液和乙腈，乙腈的梯度：35％-92％，流速：30mL/min)，得到标题化合物9-1或者9-2。

9-1或者9-2(四个异构体混合物，1：1：1：1，20mg，产率：28％)：MS m/z(ESI):938.2[M+1]。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ12.52(s,1H),10.76(s,1H),7.74(s,1H),7.70(d,1H),7.66-7.55(m,3H),7.48(d,1H),7.26(d,1H),6.86(d,1H),6.57-6.49(m,3H),6.43(dd,1H),6.15(s,1H),5.52(d,1H),4.79(d,1H),4.62(s,1H),4.37(s,2H),4.27-4.19(m,2H),4.07(s,2H),4.04-3.99(m,5H),2.80-2.69(m,2H),2.65-2.43(m,8H),2.18(s,2H),2.13-2.05(m,1H),2.03-1.95(m,1H),1.88-1.79(m,1H),1.71-1.54(m,4H),1.52-1.43(m,2H),1.38-1.30(m,2H)。

将实施例8中第九步产物之二化合物8-2j或者8-1j(35mg，0.09mmol)和2-(6-(4-(2,6-二氮杂螺[3.3]庚-2-基)苯基)-4-氟-1-氧代异吲哚啉-2-基)-2-(6,7-二氢-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-1-基)-N-(噻唑-2-基)乙酰胺三氟乙酸盐9a(46mg，0.09mmol，采用专利申请“WO2021127561A1”中说明书第513页的实施例47”公开的方法制备而得)溶于N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，加入2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(35mg，0.09mmol)，二异丙基乙胺(59mg，0.46mmol)，反应1小时。反应液过滤，经高效液相制备(Waters-2545，洗脱体系：10mmol/L碳酸氢铵的水溶液和乙腈，乙腈的梯度：35％-92％，流速：30mL/min)，得到标题化合物9-2或者9-1。

9-2或者9-1(四个异构体混合物，1：1：1：1，21mg，产率：29％)：MS m/z(ESI):938.2[M+1]。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ12.52(s,1H),10.75(s,1H),7.74(s,1H),7.70(d,1H),7.66-7.58(m,3H),7.48(d,1H),7.25(d,1H),6.86(d,1H),6.57-6.48(m,3H),6.43(dd,1H),6.15(s,1H),5.52(d,1H),4.79(d,1H),4.63(s,1H),4.37(s,2H),4.27-4.18(m,2H),4.07(s,2H),4.04-3.93(m,5H),2.81-2.69(m,2H),2.61-2.44(m,8H),2.17(s,2H),2.13-2.06(m,1H),2.04-1.95(m,1H),1.88-1.76(m,1H),1.71-1.63(m,2H),1.61-1.53(m,2H),1.52-1.44(m,2H),1.37-1.30(m,2H)。

实施例10

2-(6,7-二氢-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-1-基)-2-(6-(4-(4-(2-(5-((2,6-二氧代哌啶-3-基)氨基)-1,3-二氢螺[茚-2,4'-哌啶]-1'-基)-2-氧代乙基)-4-羟基哌啶-1-基)苯基)-4-氟-1-氧代异吲哚啉-2-基)-N-(噻唑-2-基)乙酰胺10

第一步

哌啶-4-酮三氟乙酸盐10b

向500mL单口瓶中加入N-叔丁氧羰基-4-哌啶酮10a(20g，100.50mmol)，用210mL二氯甲烷溶解，然后加入70mL三氟乙酸，反应4小时。反应液减压浓缩，真空干燥，向残留物中加入550mL乙酸乙酯和正庚烷(V/V＝1/1)的混合溶剂，搅拌30分钟，过滤，收集滤饼，滤饼用正庚烷洗涤(20mL)，真空干燥，得到粗产品标题化合物10b(18g,产率：91％)，粗产品不经纯化直接用于下一步反应。

第二步

1-(4-溴苯基)哌啶-4-酮10c

将化合物10b(4.25g,19.92mmol)和(4-溴苯基)硼酸(8g,39.84mmol，上海皓鸿生物科技有限公司)溶于45mL二氯甲烷，加入三乙胺(10.08g，99.59mmol)和醋酸铜(7.24g，39.84mmol)，反应4小时。反应液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化所得残余物，得到标题化合物10c(3g,产率：24％)。

MS m/z(ESI):254.0[M+1]。

第三步

1-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂戊硼烷-2-基)苯基)哌啶-4-酮10d

称取化合物10c(3g，11.81mmol)，联硼酸频那醇酯(4.80g，18.89mmol，上海皓鸿生物科技有限公司)，[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯(856.7mg，1.18mmol)和醋酸钾(3.48g，35.42mmol)到100mL单口瓶中，加入1,4-二氧六环(30mL)。氮气置换三次，升温到90℃反应16小时。向反应液中加入水(20mL)，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，合并有机相，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系B纯化所得残余物，得到标题化合物10d(1.5g,产率：42％)。

MS m/z(ESI):302.2[M+1]。

第四步

(±)-2-(6,7-二氢-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-1-基)-2-(4-氟-1-氧代-6-(4-(4-氧代哌啶-1-

基)苯基)异吲哚啉-2-基)-N-(噻唑-2-基)乙酰胺10f

将化合物10d(253mg，0.84mmol)，(±)-2-(6-溴-4-氟-1-氧代异吲哚啉-2-基)-2-(6,7-二氢-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-1-基)-N-(噻唑-2-基)乙酰胺10e(0.4g，0.84mmol，采用专利申请“WO2020002487A1”中说明书第61页的实施例10”公开的方法制备而得)，2-二-叔丁膦基-2',4',6'-三异丙基联苯(71mg，0.17mmol)，[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯(61mg，0.084mmol)和碳酸钠(223mg，2.10mmol)置于微波管中，加入12mL 1,4-二氧六环和水的混合溶剂(V/V＝5/1)，氮气置换三次，升温到100℃微波反应2小时。向反应液中加入水(10mL)，用乙酸乙酯(15mL×3)萃取，合并有机相，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，所得残余物经硅胶柱色谱法以洗脱剂体系A纯化，得到标题化合物10f(外消旋体混合物，1：1，0.64g,产率：44％)。

MS m/z(ESI):571.2[M+1]。

第五步

(±)-2-(1-(4-(2-(1-(6,7-二氢-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-1-基)-2-氧代-2-(噻唑-2-基氨基)乙基)-7-氟-3-氧代异吲哚啉-5-基)苯基)-4-羟基哌啶-4-基)乙酸叔丁酯10g

将乙酸叔丁酯(31mg，0.27mmol)溶于5mL四氢呋喃中，降温到-78℃，滴加2M的二异丙基氨基锂的四氢呋喃/正己烷溶液(0.2mL)，反应1小时。然后加入化合物10f(30mg，0.53mmol)，反应30分钟。加入5mL水，用乙酸乙酯(8mL×3)萃取，合并有机相，用饱和氯化钠溶液(15mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，所得残余物经硅胶柱色谱法以洗脱剂体系A纯化，得到标题化合物10g(外消旋体混合物，1：1，18mg，产率：50％)。

MS m/z(ESI):687.2[M+1]。

第六步

(±)-2-(1-(4-(2-(1-(6,7-二氢-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑-1-基)-2-氧代-2-(噻唑-2-基氨基)乙基)-7-氟-3-氧代异吲哚啉-5-基)苯基)-4-羟基哌啶-4-基)乙酸10h

称取化合物10g(18mg，0.026mmol)到25mL单口瓶中，加入4M氯化氢的1,4-二氧六环溶液(0.5mL)，反应4小时。将反应液浓缩，真空干燥，得到粗品标题化合物10h(外消旋体混合物，1：1，16mg，产率：97％)，粗产品不经纯化直接用于下一步反应。

MS m/z(ESI):631.3[M+1]。

第七步

将化合物10h(16mg，0.025mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，加入2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(9.6mg，0.025mmol)，二异丙基乙胺(9.8mg，0.076mmol)。反应20分钟，加入化合物5h(8.9mg,0.025mmol)，反应30分钟。反应液过滤，经高效液相制备(Waters-2545，洗脱体系：10mmol/L碳酸氢铵的水溶液和乙腈，乙腈的梯度：40％-60％，流速：30mL/min)，得到标题化合物10(四个异构体混合物，1：1：1：1，6mg，产率：26％)。

MS m/z(ESI):926.3[M+1]。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ12.48(s,1H),10.75(s,1H),7.75(s,1H),7.72(d,1H),7.64(d,2H),7.60(s,1H),7.48(d,1H),7.25(d,1H),7.03(d,2H),6.89(d,1H),6.52(s,1H),6.45(d,1H),6.14(s,1H),5.57(d,1H),5.10(s,1H),4.79(d,1H),4.30-4.17(m,3H),4.05-3.93(m,3H),3.65-3.47(m,7H),3.21-3.10(m,2H),2.81-2.60(m,8H),2.14-2.06(m,1H),2.03-1.95(m,1H),1.89-1.79(m,1H),1.73-1.61(m,4H),1.56-1.50(m,2H),1.49-1.42(m,2H)。

生物学评价

以下结合测试例进一步描述解释本公开，但这些测试例并非意味着限制本公开的范围。

测试例1、本公开化合物对BaF3/EGFR L858R-C797S细胞的增殖抑制测定

1.实验材料与仪器

BaF3/EGFR L858R-C797S(南京科佰CBP73047)

1640培养基(美仑,PWL015)

0.25％胰蛋白酶-EDTA(1×)(Gibco，25200-072)

青霉素-链霉素(Gibco，15140-122)

DPBS(1×)(Gibco，14190-144)

FBS(Gibco，10091148)

T25 Flask(TITAN,02055018)

384细胞培养板(白色不透明384孔微孔板，无菌和组织培养处理)(PE,6007680)

96孔圆底配药板(未处理)(JET BIOFIL,TCP-002-096)

CellTiter-Glo缓冲液(Promega,G756B)

CellTiter-Glo底物(Promega,G755B)

自动细胞计数仪(Countstar，IC1000)

恒温培养箱(Thermo，I160)

EnVision多模式读板仪(PerkinElmer,EnVision 2105)

2.实验方法

2.1细胞铺板(第0天)

a.显微镜下观察细胞状态。

b.将细胞轻轻混匀后，直接吸取细胞培养瓶中的细胞悬液20μL进行细胞计数，确保细胞活率大于80％。

c.根据细胞计数结果，用含10％ FBS的1640培养基稀释细胞悬液到2.5e4/mL，加入384细胞培养板中，25μL/孔。BaF3/EGFR L858R-C797S铺板密度为625个细胞/孔。

d.将细胞培养板放在37℃，5％二氧化碳的培养箱中培养过夜。

2.2加药(第1天)

a.用DMSO将每个化合物梯度稀释成10个浓度点(起始浓度3.3μM，3倍稀释；不同化合物根据IC₅₀的不同最高浓度可作相应调整)。例如，在96孔圆底配药板中，将3μL化合物依次梯度稀释至6μL DMSO中。

b.将每个化合物各浓度点按500倍稀释到相应体积1640细胞培液中。

c.向每个细胞板中25μL/孔的细胞上清中依次加入25μL上述稀释好的化合物溶液。

d.将加完药的细胞板放置在37℃，5％二氧化碳的培养箱培养。

2.3 CTG检测(第4天)

a.使用前将CellTiter-Glo缓冲液和冻干的CellTiter-Glo底物放置平衡到室温，两者混合充分混匀配制成100mL的CellTiter-Glo试剂(或将已混好的CellTiter-Glo试剂从-20℃拿出平衡到室温)。

b.将待检测的板子从培养箱中取出，平衡至室温，每孔加入25μL CellTiter-Glo试剂。

c.振荡混匀2分钟使细胞充分裂解。

d.室温放置28分钟待信号稳定后在EnVision上进行检测发光信号值(RLU)。

2.4 IC₅₀值和最大抑制率计算

a.通过下列公式计算化合物各浓度的抑制率，其中最大值(Max)为化合物各浓度点抑制增殖的最大抑制率。使用XLfit根据化合物的对数浓度和抑制率进行曲线拟合并计算IC₅₀值。

b.抑制率(％)＝100-100×(RLU_化合物-RLU_空白对照)/(RLU_溶媒对照-RLU_空白对照)

本公开化合物生物活性由上述分析所得，计算所得的IC₅₀和Max值如下表：

表1本公开化合物对BaF3/EGFR L858R-C797S细胞的增殖抑制活性

结论：本公开化合物对BaF3/EGFR L858R-C797S细胞具有明显的增殖抑制活性。

测试例2、本公开化合物对H1975/EGFR L858R-T790M-C797S细胞的增殖抑制测定

1.实验材料与仪器

H1975/EGFR L858R-T790M-C797S为内部构建的稳转细胞株Pool，在NCI-H1975细胞(ATCC CRL-5908)中通过慢病毒感染导入pCDH-CMV-T790M-C797S-L858R基因，然后通过嘌呤霉素筛选获得。

RPMI1640培养基(美仑,PWL015)

嘌呤霉素(10mg/ml)(ThermoFisher,A11138-03)

0.25％胰蛋白酶-EDTA(1×)(Gibco，25200-072)

青霉素-链霉素(Gibco，15140-122)

DPBS(1×)(Gibco，14190-144)

FBS(Gibco，10091148)

T75 Flask(TITAN,02055020)

96孔圆底配药板(未处理)(JET BIOFIL,TCP-002-096)

CellTiter-Glo缓冲液(Promega,G756B)

CellTiter-Glo底物(Promega,G755B)

自动细胞计数仪(Countstar，IC1000)

恒温培养箱(Thermo，I160)

EnVision多模式读板仪(PerkinElmer,EnVision 2105)

2.实验方法

2.1细胞铺板(第0天)

a.显微镜下观察细胞状态，确保细胞的融合度在～90％。

b.弃去细胞的上清，PBS润洗一次，倒去PBS。加入适量胰蛋白酶消化细胞，37℃静置5分钟。

c.用等体积含10％ FBS的1640培养基终止消化，收集细胞悬液。300g，离心3分钟。用适量新鲜培养基悬浮细胞。

d.取重悬的细胞悬液进行计数。

e.根据细胞计数结果，用含10％ FBS和2μg/ml嘌呤霉素的1640培养基稀释细胞悬液到2.5e4/mL，加入384细胞培养板中，25μL/孔。H1975/EGFR L858R-T790M-C797S铺板密度为625个细胞/孔。

f.将细胞培养板放在37℃，5％二氧化碳的培养箱中培养过夜。

2.2加药(第1天)

2.3 CTG检测(第4天)

c.振荡混匀2分钟使细胞充分裂解。

2.4 IC₅₀值和最大抑制率计算

a.通过下列公式计算化合物各浓度的抑制率，其中最大值(Max)为化合物各浓度点抑制增殖的最大抑制率。使用XLfit根据化合物的对数浓度和抑制率进行曲线拟合并计算IC50值。

b.抑制率(％)＝100-100*(RLU_化合物-RLU_空白对照)/(RLU_溶媒对照-RLU_空白对照)

表2本公开化合物对H1975/EGFR L858R-T790M-C797S细胞增殖抑制活性

实施例编号	IC₅₀(nM)
		1	17.3
3	17.7
		4	14.6

结论：本公开化合物对H1975/EGFR L858R-T790M-C797S细胞具有明显的增殖抑制活性。

测试例3、本公开化合物对BaF3/EGFR L858R-T790M-C797S细胞总EGFR蛋白降解的测定

2.实验材料与仪器

BaF3/EGFR L858R-T790M-C797S(康源博创,KC-0122)

1640培养基(美仑,PWL015)

青霉素-链霉素(Gibco,15140-122)

DPBS(1×)(Gibco,14190-144)

FBS(Gibco,10091148)

T75 Flask(TITAN,02055020)

96孔细胞培养板(Corning,3788)

96孔圆底配药板(未处理)(JET BIOFIL,TCP-002-096)

1.2mL 96孔深孔板(透明，无菌，方形孔，V形底)(TITAN,02089063)

Total EGFR cellular kit(PerkinElmer,64NG1PEG)

自动细胞计数仪(Countstar，IC1000)

离心机(Thermo,75004524)

恒温培养箱(Thermo，I160)

微孔板混匀仪(Thermo,88880024)

EnVision多模式读板仪(PerkinElmer,EnVision 2105)

2.实验方法

2.1细胞铺板(第1天)

a.显微镜下观察细胞状态。

b.将细胞悬液收集至15mL离心管中，300g，离心4分钟。用适量新鲜培养基悬浮细胞。

c.取重悬的细胞悬液20μL进行细胞计数，确保细胞活率大于90％。

d.根据细胞计数结果，用含10％ FBS的1640培养基稀释细胞至相应铺板密度，按照每孔10000-20000个细胞的密度将细胞接种于96孔培养板中，每孔25μL。

2.2加药(第1天)

a.化合物起始浓度为10mM，用DMSO将每个化合物5倍梯度稀释成10个浓度点。例如，在96孔圆底配药板中，将3μL化合物依次梯度稀释至12μL DMSO中。

b.将每个化合物各浓度点按167倍稀释到相应体积1640细胞培液中。

c.向每个细胞板25μL/孔的细胞悬液中依次加入5μL上述稀释好的化合物溶液。

d.将加完药的细胞板放置在37℃，5％二氧化碳的培养箱中培养6小时。

2.3收样及孵育抗体(第1天)

a.将96孔板拿出，按照Total EGFR cellular kit说明书所示每孔加入10μL(4×)*supplemented lysis buffer(1volume Blocking buffer+24volume 4×lysisbuffer)，贴好透明薄膜，盖上板盖，短暂甩板，室温震荡裂解60min(800rpm)。

b.将裂解后的液体转移16μL至384孔板中，加入4μL预混好的抗体(d2抗体：Eu抗体＝1：1预混),贴好铝箔膜，盖上板盖，室温震荡1分钟，短暂甩板，室温孵育过夜。

2.4 HTRF检测(第2天)

a.将待检测的384孔板从培养箱中取出，室温震荡1分钟，短暂甩板。

b.在EnVision上读取665nm和620nm两个不同波长的荧光发射信号值。

2.5DC₅₀值和最大降解率计算

a.通过下列公式计算化合物各浓度的总EGFR降解率。使用XLfit根据化合物的对数浓度和降解率进行曲线拟合并计算DC₅₀值。

b.计算每孔acceptor和donor发射信号的比率：Ratio＝Signal 665nm/Signal620nm×10⁴。

c.降解率(％)＝100-100*(Ratio_化合物-Ratio_空白对照)/(Ratio_溶媒对照-Ratio_空白对照)

本公开化合物总EGFR降解活性由上述分析所得，计算所得的DC₅₀如下表3：

表3本公开化合物对BaF3/EGFR LTC总EGFR蛋白降解DC₅₀值

结论：本公开化合物对BaF3/EGFR LTC总EGFR蛋白具有明显的降解活性。

测试例4、药代动力学评价

一、C57小鼠试验

1、摘要

以C57小鼠为受试动物，应用LC/MS/MS法测定了C57小鼠静脉注射(i.v.)给予实施例化合物后不同时刻血浆中的药物浓度。研究本公开化合物在C57小鼠体内的药代动力学行为，评价其药动学特征。

2、试验方案

2.1、试验药品

用8-2i或者8-1i中保留时间较长的化合物制备得到的8-2或者8-1。

2.2、试验动物

C57小鼠9只，雌性，由维通利华实验动物技术有限公司提供，生产许可证SCXK(浙)2019-0001。分别静脉注射给药。

2.3、药物配制

分别称取一定量的受试化合物，加5％DMSO+5％吐温80+90％生理盐水，配制成0.1mg/mL无色透明溶液。

2.4、给药

给药剂量为1.0mg/kg，给药体积为10mL/kg。

3、操作

于给药前及给药后5分钟，0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、11.0、24小时眼眶采血0.1mL，将血样置于含有EDTA-K2的试管中并保存在冰上直至离心。血样将在1小时内以10000rpm离心1分钟(4℃)分离血浆，并保存在-20℃下进行测试。

测定不同浓度的药物给药后，C57小鼠血浆中的待测化合物含量：取给药后各时刻的C57小鼠血浆样品20μL和250μL乙腈溶液(含喜树碱100ng/mL)，涡旋混合5分钟，并在3700rpm下离心15分钟。将90μL上清液与90μL水混合，然后注入0.5μL等份上清液进行LC-MS/MS分析。

4、药代动力学参数结果

表4、本公开化合物在C57小鼠体内的药代动力学参数

结论：本公开化合物在C57小鼠体内血药浓度高，暴露量高，清除率低，具有药代动力学优势。

Claims

1.一种通式(I)所示的化合物或其可药用的盐，

其中：

PTM为结合至靶蛋白或多肽的小分子化合物配体；

L为连接单元；

为单键或双键；

G¹为N或CR^A；

G²为N或CR^B；

G³为N或CR^C；

G⁴为N或CR^D；

X为N或CR；

m和n相同或不同，且各自独立地为0、1或2。

2.根据权利要求1所述的通式(I)所示的化合物或其可药用的盐，其中PTM为

其中：

表示该五元环为芳香的环或非芳香的环；

Q选自N、C(O)和CH；

环B为芳基或杂芳基；

r为0、1、2、3、4或5。

3.根据权利要求1或2所述的通式(I)所示的化合物或其可药用的盐，其中L为J¹-J²-J³-J⁴-J⁵-J⁶，其中J¹与苯环相连，J⁶与X相连；

s为1、2或3。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的通式(I)所示的化合物或其可药用的盐，其为通式(II)所述的化合物或其可药用的盐：

其中：

环C为含氮杂环基；

p为0、1、2、3、4或5；

X、G¹、G²、G³、G⁴、R¹、R²、R³、R⁴、m、n、/>环B、Q、R⁵、R^5a、R⁶、R⁷、R⁸、r、J¹、J²、J⁵和J⁶如权利要求3中所定义。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的通式(I)所示的化合物或其可药用的盐，其中G¹为CR^A，R^A选自且G²、G³和G⁴为CH；或G²为CR^B，R^B选自且G¹、G³和G⁴为CH；或G³为CR^C，R^C选自且G¹、G²和G⁴为CH；或G⁴为CR^D，R^D选自且G¹、G²和G³为CH。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的通式(I)所示的化合物或其可药用的盐，其中X为N或CR，R如权利要求1中所定义；优选地，X为N或CR，R为羟基。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的通式(I)所示的化合物或其可药用的盐，其中R¹为氢原子或者氟原子；和/或R²为氢原子或者氟原子。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的通式(I)所示的化合物或其可药用的盐，其中R³为氢原子；和/或R⁴为氢原子。

9.根据权利要求2至8中任一项所述的通式(I)所示的化合物或其可药用的盐，其中环B为五元或六元杂芳基；优选地，环B为噻唑基；和/或r为0。

10.根据权利要求2至9中任一项所述的通式(I)所示的化合物或其可药用的盐，其中R⁵为卤素；和/或R^5a和R⁶均为氢原子。

11.根据权利要求2至10中任一项所述的通式(I)所示的化合物或其可药用的盐，其中R⁷为氢原子或者氟原子。

12.根据权利要求4至11中任一项所述的通式(I)所示的化合物或其可药用的盐，其中环C为优选地，环C为/>其中带*的键与C(O)相连接；和/或p为0。

13.根据权利要求3至12中任一项所述的通式(I)所示的化合物或其可药用的盐，其中J¹-J²为6至10元芳基或5至10元杂芳基。

14.根据权利要求3至13中任一项所述的通式(I)所示的化合物或其可药用的盐，其中J⁵-J⁶为C_1-6亚烷基。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的通式(I)所示的化合物或其可药用的盐，其选自以下化合物：

/>

16.一种通式(IIA)所示的化合物或其盐：

其中X、G¹、G²、G³、G⁴、R¹、R²、R³、R⁴、m、n、J⁵和J⁶如权利要求3中所定义。

17.化合物，其选自以下化合物：

/>

18.一种制备根据权利要求4所述的通式(II)所示的化合物或其可药用的盐的方法，其包括：

其中：

X、G¹、G²、G³、G⁴、R¹、R²、R³、R⁴、m、n、/>环B、Q、R⁵、R^5a、R⁶、R⁷、R⁸、r、环C、R⁹、p、J¹、J²、J⁵和J⁶如权利要求4中所定义。

19.一种药物组合物，所述药物组合物含有根据权利要求1至15中任一项所述的化合物或其可药用的盐，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

20.根据权利要求1至15中任一项所述的化合物或其可药用的盐或根据权利要求19所述的药物组合物在制备用于调节EGFR蛋白泛素化和降解的药物中的用途。

21.根据权利要求1至15中任一项所述的化合物或其可药用的盐或根据权利要求19所述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防由EGFR介导的或依赖性的疾病或病症的药物中的用途。

22.根据权利要求1至15中任一项所述的化合物或其可药用的盐或根据权利要求19所述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防癌症的药物中的用途；优选地所述的癌症选自鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、食管癌、头颈癌、鼻咽癌、口腔癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、白血病、淋巴瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、黑素瘤、肉瘤、子宫内膜癌、睾丸癌和甲状腺癌；进一步优选为肺癌；更优选为非小细胞肺癌。