CN117379574B - 一种ε-聚赖氨酸联合姜黄素为介导的光动力灭菌方法 - Google Patents
一种ε-聚赖氨酸联合姜黄素为介导的光动力灭菌方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种ε‑聚赖氨酸联合姜黄素为介导的光动力灭菌方法及应用，属于非热杀菌技术领域。本发明提供的ε‑聚赖氨酸联合姜黄素为介导的光动力灭菌方法包括以下步骤：将姜黄素和ε‑聚赖氨酸制备成复合光敏剂，将所述复合光敏剂喷于待灭菌物体表面，采用LED可见光进行照射，灭杀所述待灭菌物体表面的细菌；所述复合光敏剂中姜黄素的终浓度为300μM，ε‑聚赖氨酸的浓度为38mg/L。ε‑聚赖氨酸改善了水溶液中姜黄素溶解性差导致的光毒性低的问题，可解决单一疏水性光敏剂(姜黄素)光动力技术的易聚集猝灭、对革兰氏阴性菌杀灭效果不佳等问题，可大幅度提升杀菌效率。
Description
技术领域
本发明涉及非热杀菌技术领域，特别是涉及一种ε-聚赖氨酸联合姜黄素为介导的光动力灭菌方法及应用。
背景技术
致病性大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)对食品安全和生命健康造成重大威胁。杀菌是保障食品微生物安全的核心环节。光动力技术(Photodynamic technology，PDT)作为一种新型非热杀菌技术，因其操作简便、杀菌效果优异、安全可靠、绿色环保、成本低等特点而受到多领域学者的广泛关注。
光敏剂(Photosensitizer，PS)在特定波长的光源下激发后，可产生活性氧分子(ROS)或活跃的单线态氧(1O2)，进而通过氧化作用破坏核酸、蛋白质及脂质等生物分子，从而灭活微生物或细胞。姜黄素是我国允许在食品中使用的天然色素，研究表明以姜黄素为介导的光动力对金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特菌等致病菌具有明显的抑制作用。发明人前期采用以姜黄素为介导的光动力杀菌技术运用在鲜切菠萝的保鲜中，能较好地保持菠萝的色泽、营养品质，并抑制微生物的生长。然而，由于姜黄素等传统光敏剂为平面共轭结构且水溶性较差，在高浓度时容易发生密集的π-π聚集，导致荧光和光敏性能大幅降低(聚集猝灭效应)；且PDT对一些有害微生物(革兰氏阴性菌)及其生物被膜的杀灭效率不高，由于其带有负电荷的外膜，姜黄素等光敏剂并不能直接穿透革兰氏阴性细菌，即使加大光敏剂剂量、延长光照时间，杀菌效果也较差，限制其高效应用。
因此，如何克服光敏剂的聚集猝灭效应，提高其对有害微生物的灭杀效果是目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种ε-聚赖氨酸联合姜黄素为介导的光动力灭菌方法及应用，以解决上述现有技术存在的问题。ε-聚赖氨酸改善了水溶液中姜黄素溶解性差导致的光毒性低的问题，可解决单一疏水性光敏剂(姜黄素)光动力技术的易聚集猝灭、对革兰氏阴性菌杀灭效果不佳等问题，可大幅度提升杀菌效率。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供ε-聚赖氨酸在提高姜黄素溶解性能中的应用。
本发明还提供ε-聚赖氨酸在改善姜黄素聚集猝灭效应中的应用。
本发明还提供一种提高光动力灭菌效果的方法，包括将ε-聚赖氨酸与姜黄素联用，作为复合光敏剂，之后采用LED可见光照射，进行光动力杀灭细菌。
进一步地，所述细菌包括大肠杆菌。
本发明还提供一种ε-聚赖氨酸联合姜黄素为介导的光动力灭菌方法，包括以下步骤：
将姜黄素和ε-聚赖氨酸制备成复合光敏剂，将所述复合光敏剂喷于待灭菌物体表面，采用LED可见光进行照射，灭杀所述待灭菌物体表面的细菌；
所述复合光敏剂中姜黄素的浓度为300μM，ε-聚赖氨酸的浓度为38mg/L。
进一步地，所述复合光敏剂的制备方法包括将所述姜黄素和所述ε-聚赖氨酸混匀后先用无水乙醇超声溶解，再用无菌水定容。
进一步地，所述待杀菌物体表面的细菌包括大肠杆菌。
进一步地，所述待杀菌物体包括厨具和鲜切果蔬。
进一步地，所述LED可见光的波长为405nm，输出光功率密度为180-200mW/cm2。
进一步地，所述LED可见的照射时间为20～30min。
本发明公开了以下技术效果：
本发明采用姜黄素和ε-聚赖氨酸制备复合光敏剂溶液，改善了水溶液中姜黄素溶解性差导致的光毒性低的问题，ε-聚赖氨酸的氨基在溶液中带正电荷，具有促进细胞与光敏剂相互作用的潜力，可解决单一疏水性光敏剂(姜黄素)光动力技术的易聚集猝灭、对革兰氏阴性菌杀灭效果不佳等问题，且ε-聚赖氨酸的抑菌活性在光照的作用下发挥了双重光敏剂的效果，大幅度提升杀菌效率，实现了新型光动力栅栏技术在控制微生物方面的高效应用。
采用本发明的复合光敏剂溶液介导的光动力杀菌方法，可有效灭活厨具或鲜切果蔬上的大肠杆菌，处理时间短，照射剂量小，操作简便安全，适用性好、成本低廉、绿色无污染，并有一定的控制和预防效果，为维护公共卫生提供强有力的技术支持。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为Control、Cur、ε-PL以及(Cur&ε-PL)-LED组不同光动力处理后菌液中大肠杆菌的浓度；
图2为Control、(Cur&ε-PL)-LED组以及Cur-LED&ε-PL组不同光动力处理后菌液中大肠杆菌的浓度；
图3为各组在LED光照处理20min后菌液中大肠杆菌的扫描电镜图；
图4为各组不同光动力处理后菌液中ROS产生情况；
图5为采用DPBA荧光探针检测细菌对于不同处理组光敏剂摄取情况。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明实施例中用到的姜黄素粉末购自上海源叶生物科技有限公司，ε-聚赖氨酸粉末购自上海源叶生物科技有限公司。
实施例1姜黄素和ε-聚赖氨酸联用增强杀菌效果
一、试验方法
1.姜黄素粉末与ε-聚赖氨酸粉末按照质量比20：7混合研磨，从混匀的粉末中称取0.01489g，加入2mL无水乙醇，超声溶解，无菌水定容到50mL，获得复合光敏剂溶液。复合光敏剂溶液中，姜黄素的浓度为600μM，ε-聚赖氨酸的浓度为76mg/L。
2.将活化好的100μL大肠杆菌菌悬液(浓度为8logCFU/mL)与100μL复合光敏剂溶液于24孔板中混合均匀(混合溶液中姜黄素的终浓度为300μM，εε聚赖氨酸的浓度为38mg/L)，在暗处孵育15min，用波长为405nm的LED可见光源(输出光功率密度为180-200mW/cm2)分别光照10min、15min、20min、25min和30min。
将上述处理组记为(Cur&ε-PL)-LED组；
以生理盐水代替复合光敏剂溶液作为空白对照，记为Control组；
以单一姜黄素溶液(浓度为600μM)为光敏剂，记为Cur组；
以单一ε-聚赖氨酸溶液(浓度为76mg/L)为光敏剂，记为ε-PL组；
以单一姜黄素溶液(浓度为600μM)为光敏剂，将活化好的100μL大肠杆菌菌悬液(浓度为8logCFU/mL)与100μL光敏剂于24孔板中混合均匀，在暗处孵育15min，用LED光照后(光照处理同(Cur&ε-PL)-LED组)，称取0.152gε-聚赖氨酸粉末，无菌水定容到50mL，从中取2.5μL加入到光照处理后的菌悬液中，获得混合溶液，记为Cur-LED&ε-PL组(姜黄素先光照后加ε-聚赖氨酸)。
分别取100μL上述各组做种获得的菌液/混合液，梯度稀释后取100μL涂布在LB培养基上，继续培养24h,，计数菌落总数。
二、结果
1.姜黄素与ε-聚赖氨酸联用增强杀菌效果
为了探究ε-聚赖氨酸的加入是否会增强光敏剂的杀菌效果，比较了Control、Cur、ε-PL以及(Cur&ε-PL)-LED组的杀菌情况，如图1所示。由图1可知，在LED光照处理20min后，各处理组已经开始出现明显的杀菌效果，其中，(Cur&ε-PL)-LED组中，处理后的菌液中大肠杆菌的浓度最低，证明其杀菌效果最好。
2.ε-聚赖氨酸的具体联用时机对杀菌效果的影响
为了探究ε-聚赖氨酸的具体联用时机对杀菌效果的影响，比较了Control、(Cur&ε-PL)-LED组以及Cur-LED&ε-PL组的杀菌情况，如图2所示。由图2可知，与Control组相比，(Cur&ε-PL)-LED组在LED光照处理20min后就已经出现明显的杀菌效果，但Cur-LED&ε-PL组在LED光照处理20min后的杀菌效果并不明显，当LED光照处理25min后，其开始出现明显杀菌效果。与(Cur&ε-PL)-LED组相比，Cur-LED&ε-PL组的杀菌效果相对较弱。即ε-聚赖氨酸协同姜黄素经LED光照后，比姜黄素单独经LED光照后加ε-聚赖氨酸具有更强的杀菌效果。
3.不同光动力处理对大肠杆菌的影响
Control、Cur、ε-PL、(Cur&ε-PL)-LED以及Cur-LED&ε-PL组在LED光照处理20min后，收集不同光动力处理组菌液到离心管中8000r/min离心5min。弃去上清液，用2.5％戊二醛溶液使菌体重悬，4℃固定24h。再分别用30％、50％、70％、90％无水乙醇进行梯度脱水，再进行冷冻干燥，将冻干粉末喷金后进行扫描电镜观察。
大肠杆菌的扫描电镜图如图3所示，由图3可知，与Control对照组相比，单纯光照组中大肠杆菌的细胞形态无明显改变，细胞呈丰满杆状。Cur、ε-PL和Cur-LED&ε-PL组中的细胞表面出现明显的形态变形和凹陷；(Cur&ε-PL)-LED组中大肠杆菌细胞的形态学变形发生显著变化，不仅出现变形形态和皱褶凹陷，且呈现大量细胞破裂破碎的现象，菌体细胞破坏最为严重。
使用DCFH-DA荧光探针来评价大肠杆菌在LED照射光敏剂诱导下产生ROS的情况，DCFH-DA可以被细胞内ROS氧化成绿色荧光2,7-二氯荧光素(DCF)，通过测量DCF的荧光强度可以有效评估ROS的产生情况。这就说明了ROS的产生在光动力杀菌过程中起着至关重要的作用。
上述各组不同光动力处理后，菌液中ROS产生情况如图4所示，由图4可知，经过20min光照处理的实验组荧光强度高于15min光照处理的实验组。此外，(Cur&ε-PL)-LED组荧光强度最强，其次是Cur-LED&ε-PL组，从ROS生成的角度也验证了姜黄素与聚赖氨酸协同光照的光敏性。这些结果也符合图1～2中的灭菌活性结果。
综上所述，姜黄素和ε-聚赖氨酸二者同时混合光照的杀菌效果强于姜黄素单独光照结束后添加ε-聚赖氨酸的效果。ε-聚赖氨酸协同姜黄素光照20min，比姜黄素单独光照后加ε-聚赖氨酸增强杀菌效果2.93个对数(由图2数据得出)。
实施例2ε-聚赖氨酸改善姜黄素溶解性能和聚集猝灭效应
1.ε-聚赖氨酸改善姜黄素溶解性能
通过饱和溶解度法测定姜黄素及姜黄素-ε-聚赖氨酸混合光敏剂在水中的平衡溶解度。溶解性能如表1所示。
表1溶解性能对比
| 姜黄素 | 姜黄素-ε-聚赖氨酸 | |
| 溶解度(μg/mL) | 2.89±0.35 | 8.24±0.48 |
2.ε-聚赖氨酸改善姜黄素对细菌的结合
采用DPBA荧光探针检测细菌对于不同处理组光敏剂的摄取情况，且该实验表征为姜黄素与细菌的结合程度。结果如图5所示，(Cur&ε-PL)-LED组荧光强度最高，其次为Cur组。此外，ε-聚赖氨酸组荧光强度与Control对照组基本一致。这证明加入ε-聚赖氨酸增加了姜黄素对于细菌的摄取，验证了ε-聚赖氨酸的协同光敏性。
实施例3ε-聚赖氨酸联合姜黄素为介导的光动力灭菌方法实际应用
1.厨具灭菌
模拟污染大肠杆菌的厨房案板经光敏剂处理后，采用LED可见光进行照射，以实现抗菌效果。实验组采用复合光敏剂(姜黄素的终浓度为300μM，ε-聚赖氨酸的浓度为38mg/L)对厨房案板进行喷洒处理，对照组不采用任何处理(大肠杆菌菌落数约为8Log(CFU/mL)。将实验组和对照组样品避光孵育30min，然后置于距离波长为405nm的LED蓝色光源18cm处光照20min。每组设置三个平行。采用平板计数法对上述实验组和对照组的厨房案板进行菌落总数的计算(灭菌效果评价)，结果见表2。
表2灭菌效果
| 大肠杆菌菌落数 | |
| 对照组(logCFU/mL) | 8.15±0.35 |
| 实验组(logCFU/mL) | 4.07±0.13 |
2.鲜切果蔬灭菌保鲜
模拟污染大肠杆菌的鲜切菠萝和鲜切生菜经光敏剂处理后，采用LED可见光进行照射，以实现抗菌效果。实验组采用复合光敏剂(姜黄素的浓度为300μM，ε-聚赖氨酸的浓度为38mg/L)对鲜切菠萝和鲜切生菜进行喷洒处理，对照组不采用任何处理(大肠杆菌菌落数约为8Log(CFU/mL)。将实验组和对照组样品避光孵育30min，然后置于距离波长为405nm的LED蓝色光源18cm处光照20min。每组设置三个平行。采用平板计数法对上述实验组和对照组的鲜切果蔬进行菌落总数的计算(灭菌效果评价)，结果见表3。
表3灭菌效果
以上表明，采用本发明的复合光敏剂溶液介导的光动力杀菌方法，可有效灭活厨具或鲜切果蔬上的大肠杆菌，处理时间短，照射剂量小，操作简便安全，适用性好、成本低廉、绿色无污染，并有一定的控制和预防效果，为维护公共卫生提供强有力的技术支持。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (5)
1.一种ε-聚赖氨酸联合姜黄素为介导的光动力灭菌方法，其特征在于，包括以下步骤：将姜黄素和ε-聚赖氨酸制备成复合光敏剂，所述复合光敏剂的制备方法为：将姜黄素粉末与ε-聚赖氨酸粉末按照质量比20：7混合研磨，从混匀的粉末中称取0.01489g，加入2mL无水乙醇，超声溶解，无菌水定容到50mL，获得所述复合光敏剂；
将姜黄素的浓度为300μM，ε-聚赖氨酸的浓度为38mg/L的复合光敏剂喷于待灭菌物体表面，采用LED可见光进行照射，灭杀所述待灭菌物体表面的细菌。
2.根据权利要求1所述的光动力灭菌方法，其特征在于，所述待灭菌物体表面的细菌包括大肠杆菌。
3.根据权利要求1所述的光动力灭菌方法，其特征在于，所述待灭菌物体包括厨具和水果。
4.根据权利要求1所述的光动力灭菌方法，其特征在于，所述LED可见光的波长为405nm，输出光功率密度为180-200mW/cm2。
5.根据权利要求1所述的光动力灭菌方法，其特征在于，所述LED可见光的照射时间为20～30min。
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