CN117379529A - 用于增强阳离子大环肽的全身递送能力、耐受性和效力的组合物和方法 - Google Patents

用于增强阳离子大环肽的全身递送能力、耐受性和效力的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

本文提供了用于增强阳离子大环肽的全身递送能力、耐受性和效力的组合物和方法，其非常适合肠胃外施用。该制剂在包括丙二醇的微酸性缓冲液中提供θ‑防御素和/或θ‑防御素类似物。发明人惊讶地发现该制剂将所提供的θ‑防御素和/或θ‑防御素类似物的生物利用度相对于常规等渗盐溶液而言提高了至少10倍，并且相对于动物模型而言，该制剂显着提高了在人类受试者中的生物利用度。发明人还发现该制剂在高肽浓度下有利地表现出低粘度，同时减少了注射体积，从而允许通过简单过滤进行灭菌。

Description

用于增强阳离子大环肽的全身递送能力、耐受性和效力的组 合物和方法
相关申请
本申请是申请号为201980081658.0，发明名称为“用于增强阳离子大环肽的全身递送能力、耐受性和效力的组合物和方法”的中国申请的分案申请，该申请是PCT发明专利申请PCT/US2019/055362进入中国国家阶段的申请，国际申请日为2019年10月9日，其要求了于2018年10月9日提交的美国临时申请62/743,243的权益，其与所有其他参考的外部材料通过引用整体并入本文。在通过引用并入的参考文献中术语的定义与本文提供的术语的定义不一致或相反，或该参考文献使用的术语的定义与本文提供的术语的定义不一致或相反的情况下，适用本文提供的该术语的定义。
技术领域
本发明的领域是增强阳离子肽药物特别是大环θ-防御素和/或其类似物的全身递送能力或药理作用。
背景技术
以下描述包括用于帮助理解本发明的信息，但并不表示承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明有关，或明确或隐含引用的任何出版物是现有技术。
炎症是对病原体、组织损伤和暴露于刺激物的复杂的保护性反应，涉及血管的改变、免疫细胞的迁移以及多种化学和肽介质的释放。尽管炎症消除细胞损伤的动因并从受损组织中消除坏死细胞，但炎症反应本身却具有破坏性。例如，由自身免疫性疾病引起的慢性炎症可导致受影响组织的损伤。同样，由急性过程引起的炎症，例如病毒或细菌感染，可能会导致组织损伤和败血性休克，而当炎症延长且无法解决时，慢性炎症会加剧这种炎症。慢性炎症通常会导致组织瘢痕形成、纤维化和功能丧失。另外，伴随炎症的疼痛和肿胀可能使人衰弱，特别是当它由慢性疾病引起时。
不幸的是，目前用于治疗炎症的方法具有许多缺点。例如，传统的药物方法(例如用类固醇或非类固醇炎性药物治疗)仅提供短期缓解，并且通常以限制此类药物使用的显着副作用为代价。最近，“生物制剂”(例如，针对促炎性细胞因子的人源化单克隆抗体)已用于治疗某些以炎症为特征的慢性疾病，但是这种方法只能靶向单一的炎症机制，并可能导致免疫抑制甚至使接受治疗的人免疫功能低下。另外，基于抗体的生物制剂可能需要静脉内施用相对大量的液体，这通常需要在受过训练的医护人员的照护下通过输液进行静脉内施用。
哺乳动物防御素是含三二硫键的阳离子肽，包含三个结构不同的亚科。α-和β-防御素是线性肽，长度范围为29至约60个氨基酸，具有游离的氨基和羧基末端氨基酸。α-和β-防御素具有相似的三维拓扑结构，但是它们的二硫键不同(Selsted and Ouellette，NatImmunol 6：551-557(2005))。相反，天然存在的θ-防御素是肽主链环化的18个氨基酸的肽，其在结构和功能上均与α-和β-防御素不同。防御素作为抗微生物剂(Ericksen et al，Antimicrob Agents Chemother 49：269-275(2005))并通过调节炎症(Khine et al，Blood107：2936-2942(2006))和适应性免疫应答促进宿主防御(Chertov et al，J Biol Chem271：2935-2940(1996))。本文所有出版物的引用均与具体引用每个单独出版物或专利申请相同。当在并入的参考文献中术语的定义与本文提供的术语的定义不一致或相反，或该参考文献使用的术语的定义与本文提供的术语的定义不一致或相反时，适用本文提供的该术语的定义，而参考文献中该术语的定义不适用。
θ-防御素在东半球猴(例如，猕猴和狒狒)中表达，并且是动物中唯一已知的环状蛋白(Lehrer et al，J Biol Chem 287：27014-27019(2012))。θ-防御素的基本骨架结构是通过将两个非肽前体从头到尾拼接而成的。在猕猴中，由三个前体基因编码的九肽的交替二元剪接提供了六个θ-防御素同种型，猕猴θ-防御素RTD-1至RTD-6(SEQ ID NOs.1-6)(Tang et al，Science 286：498-502(1999)；Leonova et al，J Leukoc Biol 70：461-464(2001))。在狒狒中，交替的非肽剪接产生十个θ-防御素同种型，狒狒θ-防御素BTD-1至BTD-10(SEQ ID Nos.7-16)(Garcia et al，Infect Immun 76：5883-5891(2001))。θ-防御素在嗜中性粒细胞颗粒和这些物种的单核细胞中高水平表达。这些θ-防御素在猕猴中性粒细胞颗粒提取物的抗菌活性中起主要作用。RTD-1同种型是猕猴中最丰富的θ-防御素，约占猕猴中性粒细胞总θ-防御素含量的55％(Tongaonkar et al，J Leukoc Biol 89：283-290(2011))。
由于在这些物种中的θ-防御素基因的预编码序列中存在终止密码子突变，因此人类和其他人科动物缺乏θ-防御素(Nguyen et al，Peptides 24：1647-1654(2003))。据建议，在东半球猴中θ-防御素的表达与这些非人类灵长类动物与人的免疫和炎症反应的差异有关(Lehrer et al，J Biol Chem 287：27014-27019(2012))。
虽然最初基于广谱抗微生物特性鉴定了α-，β-和θ-防御素，但随后的研究已经揭示了它们不同而独特的免疫调节作用(Yang et al，Annu Rev Immunol 22：181-215(2004))。例如，一些α-和β-防御素对T细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞和单核细胞具有趋化性(Chertov et al，J Biol Chem 271：2935-2940(1996)；Yang et al，Science 286：525-528(1999)；Grigat et al，J Immunol 179：3958-3965(2007)；Soruri et al，Eur JImmunol 37：2474-2486(2007))，并诱导活化的树突状细胞、外周血单核细胞和上皮细胞分泌促炎细胞因子(Khine et al，107：2936-2942(2006)；Boniotto et al，AntimicrobAgents Chemother 50：1433-1441(2006)；Ito et al，Tohoku J Exp Med 227：39-48(2012)；Yin et al，Immunol 11：37(2010)；Niyonsaba et al，J Immunol 175：1776-1784(2005)；Li et al，Invest Ophthalmol Vis Sci 50：644-653(2009)；Syeda et al，J CellPhysiol 214：820-827(2008))。
与这种促炎活性相反，最近报道了θ-防御素在体外和体内均具有抗炎特性。例如，据发现RTD-1是由多种Toll样受体(TLR)激动剂刺激的人外周血白细胞的细胞因子分泌的有效抑制剂(Schaal et al，PLoS One 7，e51337(2012))。天然存在的θ-防御素同种型(RTD1-6)在降低脂多糖或大肠杆菌刺激的白细胞中的TNF方面具有不同的效力(Schaal et al，PLoS One 7，e51337(2012))。据发现，RTD-1还可以减少炎症细胞因子，包括TNF-α，IL-1β，和几种趋化因子，在SARS冠状病毒感染的小鼠模型中(Wohlford-Lenane et al，J Virol83：11385-11390(2009)，大肠杆菌腹膜炎中，和多发性败血症中(Schaal et al，PLoS One7，e51337(2012))。
最近，Selsted和Tran(美国专利申请公开号2013/0157964)表示保留θ-防御素核心结构的θ-防御素和θ-防御素类似物可有效治疗慢性炎症性疾病，例如类风湿性关节炎。然而，尚不清楚这些小环肽的哪种制剂最适合于在足够低的药物暴露下获得治疗效果以限制潜在的不良事件，包括与皮下施用后与注射部位反应有关的不良事件。
授予Jeong等人的国际专利申请公开第WO 02/064166号描述了一种在水溶液中存在表面活性剂和有机溶剂的情况下通过形成乳液然后在施用前除去有机溶剂来改善某些肽药物的药效的方法。其中在施用前除去的合适的有机溶剂为各种醇和多元醇，包括丙二醇。但是，尚不清楚这种方法是否适用于小的碱性环状肽(例如θ-防御素)。
美国专利申请公开号2006/084605(授予Engelud等人)和美国专利申请公开号2006/0287221(授予Knudsen等人)描述了各种多元醇在肽药物制剂中作为等渗剂用于肠胃外施用的用途。类似地，美国专利申请公开号2007/0010424(授予Pedersen等人)描述了使用丙二醇代替各种糖作为等渗剂以防止形成沉积物，这些沉积物会干扰各种特定肽药物在施用过程中使用的设备和针头的功能。这样的制剂可以减少固体残留物，然而除此之外，该参考文献没有记载其他任何作用，并且没有教导使用这样的化合物对由此制备的肽药物的生物利用度或药效作用有任何影响。
国际专利申请公开号WO 2016/059593(授予Sonavaria等人)描述了用于肽药物的可注射制剂，其包含高浓度的(至多99％)有机溶剂(包括多元醇)，提高了肽的稳定性。但是，注入高浓度的此类有机溶剂会带来明显的负面影响，包括疼痛和肿胀。
因此，仍然需要一种方法和组合物，能够提供防御素的药效学作用，足以达到足够的治疗效果。
发明内容
本发明的主题提供了提供θ-防御素和θ-防御素类似物的注射制剂的组合物和方法，其相对于常规的等渗盐溶液改善了生物利用度。这样的制剂还具有低粘度，允许通过过滤进行不同规模的灭菌。
本发明构思的一个实施方案是一种治疗患有慢性炎症疾病(例如类风湿性关节炎、炎症性肠病、与癌症有关的炎症、糖尿病和以慢性炎症失调或未解决的慢性炎症为特征的慢性疾病)的个体的方法，通过提供θ-防御素或θ-防御素类似物作为水溶液，所述水溶液包含θ-防御素或θ-防御素类似物和0.5％至1.5％v/v的丙二醇，其中所述水溶液的pH为5.0至7.0；和通过皮下注射向需要治疗的个体施用所述水溶液。在一些实施方案中，水溶液包含乙酸盐。所述水溶液相对于在生理盐水中包含θ-防御素或θ-防御素类似物的水溶液而言提高θ-防御素或θ-防御素类似物的药理效力或治疗效果。θ-防御素或θ-防御素类似物的药理效力相对于在生理盐水中提供的相似浓度的θ-防御素或θ-防御素类似物而言，提高至少10倍至40倍。可以以至多50mgmL-1的浓度提供θ-防御素或θ-防御素类似物。该方法中使用的θ-防御素类似物可以是环状二十肽、环状十九肽、环状十八肽、环状十七肽、环状十六肽、环状十五肽、环状十四肽、环状十三肽、环状十二肽、环状十一肽和环状十肽。在优选的实施方案中，水溶液包含1％v/v的丙二醇和20mM乙酸盐，并且该水溶液的pH为6.0。
本发明构思的另一个实施方案是一种对水性θ-防御素制剂进行灭菌的方法，通过在包含浓度至少为1mgmL-1至50mgmL-1(以上)的θ-防御素和0.5％至1.5％v/v的丙二醇的水性缓冲液中提供θ-防御素或θ-防御素类似物；和使水性缓冲液通过孔径为0.2μm以下的过滤器。水性缓冲液可以包含乙酸盐，并且所得的θ-防御素制剂的pH可以为5.0至7.0。
本发明构思的另一个实施方案是用于治疗慢性炎症疾病(例如类风湿性关节炎、炎症性肠病、与癌症有关的炎症、糖尿病和以慢性炎症失调或未解决的慢性炎症为特征的慢性疾病)的药物组合物，其包含至多50mgmL-1的θ-防御素或θ-防御素类似物和0.5％至1.5％v/v的丙二醇，并可以包含乙酸盐。药物组合物的pH可以为5.0至7.0，并且相对于不用丙二醇制备的相应药物组合物在胃肠外施用时提高了θ-防御素或θ-防御素类似物的药效学作用。θ-防御素或θ-防御素类似物的药理效力相对于在生理盐水中提供的相同浓度的θ-防御素或θ-防御素类似物而言，提高至少10倍至40倍。这种药物组合物可以被配制成皮下注射、肌内注射和/或静脉内注射。合适的θ-防御素类似物可以是环状二十肽、环状十九肽、环状十八肽、环状十七肽、环状十六肽、环状十五肽、环状十四肽、环状十三肽、环状十二肽、环状十一肽和环状十肽。在优选的实施方案中，药物组合物包含1％v/v的丙二醇和20mM乙酸盐，并且pH为6.0。
本发明构思的另一个实施方案是在包含0.5％至1.5％v/v丙二醇的水溶液中浓度为至多50mgmL-1的θ-防御素或θ-防御素类似物用于治疗慢性炎症疾病的用途(例如类风湿性关节炎、炎症性肠病、与癌症有关的炎症、糖尿病和以慢性炎症失调或未解决的慢性炎症为特征的慢性疾病)。该溶液可以包括乙酸盐。该溶液配制用于肠胃外施用，pH值为5.0至7.0，相对于不用丙二醇制备的相应量的θ-防御素或θ-防御素类似物提高了θ-防御素或θ-防御素类似物的药效学作用。θ-防御素或θ-防御素类似物的药理效力相对于在生理盐水中提供的类似浓度的θ-防御素或θ-防御素类似物而言，提高至少10倍至40倍。肠胃外施用的合适途径包括皮下注射、肌内注射和/或静脉内注射。合适的θ-防御素类似物包括环状二十肽、环状十九肽、环状十八肽、环状十七肽、环状十六肽、环状十五肽、环状十四肽、环状十三肽、环状十二肽、环状十一肽和环状十肽。在优选的实施方案中，该组合物包含1％v/v的丙二醇和20mM乙酸盐，并且pH为6.0。
本发明构思的另一个实施方案是至多50mgmL-1的θ-防御素或θ-防御素类似物和0.5％至1.5％v/v的丙二醇在制备用于治疗慢性炎症疾病(例如类风湿性关节炎、炎症性肠病、与癌症有关的炎症、糖尿病和以慢性炎症失调或未解决的慢性炎症为特征的慢性疾病)的组合物中的用途。该溶液可以包括乙酸盐。该组合物被配制用于肠胃外施用，pH可以为5.0至7.0，并且相对于不用丙二醇制备的相应量的θ-防御素或θ-防御素类似物提高了θ-防御素或θ-防御素类似物的药效学作用。θ-防御素或θ-防御素类似物的药理效力相对于在生理盐水中提供的类似浓度的θ-防御素或θ-防御素类似物而言，提高至少10倍至40倍。肠胃外施用的合适途径包括皮下注射、肌内注射和/或静脉内注射。合适的θ-防御素类似物包括环状二十肽、环状十九肽、环状十八肽、环状十七肽、环状十六肽、环状十五肽、环状十四肽、环状十三肽、环状十二肽、环状十一肽和环状十肽。在优选的实施方案中，该组合物包含1％v/v的丙二醇和20mM乙酸盐，并且pH为6.0。
以下对优选实施例的详细描述以及附图，本发明主题的各种目的、特征、方面和优点会更加易于理解。在附图中，相同的附图标记表示相同的组件。
附图说明
图1：图1显示了证明皮下注射在盐水中的RTD-1对类风湿性关节炎的动物模型的影响的典型数据。
图2：图2显示了皮下注射在含有1％(v/v)丙二醇的盐水中的RTD-1对类风湿性关节炎的动物模型的典型影响。
图3：图3显示了皮下注射在含有1％(v/v)丙二醇的盐水或含有1％(v/v)丙二醇的20mM乙酸钠中的RTD-1对类风湿性关节炎的动物模型的典型影响。
图4A和图4B：图4A和图4B分别显示针对雄性和雌性大鼠的血浆θ-防御素浓度(ng/mL)相对于时间(小时)的图，其中在研究的第1天通过皮下注射本发明构思的θ-防御素制剂。
图5A和图5B：图5A和图5B分别显示针对雄性和雌性大鼠的血浆θ-防御素浓度(ng/mL)相对于时间(小时)的图，其中在研究的第13天通过皮下注射本发明构思的θ-防御素制剂。
图6A和图6B：图6A和图6B分别显示针对雄性和雌性大鼠的血浆θ-防御素浓度(ng/mL)相对于时间(小时)的图，其中在研究的第41天通过皮下注射本发明构思的θ-防御素制剂。
图7A和图7B：图7A描绘了针对雄性和雌性大鼠的Cmaxvs.θ-防御素剂量的线性研究的结果，其中在研究的第1天通过皮下注射本发明构思的θ-防御素制剂。图7B描绘了针对雄性和雌性大鼠的Cmaxvs.θ-防御素剂量的线性研究的结果，其中在研究的第41天通过皮下注射本发明构思的θ-防御素制剂。
图8A和图8B：图8A描绘了针对雄性和雌性大鼠的AUC0-TLastvs.θ-防御素剂量的线性研究的结果，其中在研究的第1天通过皮下注射本发明构思的θ-防御素制剂。图8B描绘了针对雄性和雌性大鼠的AUC0-TLastvs.θ-防御素剂量的线性研究的结果，其中在研究的第41天通过皮下注射本发明构思的θ-防御素制剂。
图9：图9显示了在人类临床试验中随时间测量不同治疗组血浆中θ-防御素浓度(ng/mL)的典型结果，其中在该人类临床试验中，通过皮下注射本发明构思的θ-防御素制剂。
图10A和图10B：图10A显示了在人类临床试验中Cmax(ng/mL)对皮下注射的本发明构思的θ-防御素制剂的剂量(μg/kg)的典型依赖性。图10B显示了在人类临床试验中AUC0-TLast对皮下注射的本发明构思的θ-防御素制剂的剂量(μg/kg)的典型依赖性。
图11A和图11B：图11A显示了在人类临床试验中Cmax(ng/mL)对皮下注射的本发明构思的θ-防御素制剂的θ-防御素总剂量(mg)的典型依赖性。图11B显示了在人类临床试验中AUC0-TLast对皮下注射的本发明构思的θ-防御素制剂的θ-防御素总剂量(mg)的典型依赖性。
详细说明
以下讨论提供了本发明主题的许多示例实施例。尽管每个实施例代表发明元素的单个组合，但是发明主题被认为包括所公开元素的所有可能的组合。因此，如果一个实施例包括元素A、B和C，而第二实施例包括元素B和D，则本发明主题也被认为包括A、B、C或D的其他组合，即使本文没有明确披露。
本发明的主题提供了装置、系统和方法，其中发明人惊讶地发现，在弱酸性(例如pH为5至7)水溶液中0.5％至1.5％的丙二醇相对于常规中性等渗盐溶液而言，可提高肠胃外施用的θ-防御素和/或θ-防御素类似物的临床前功效至少20倍。这使得可以以相对较小的体积(例如约1mL)方便地皮下注射θ-防御素，该注射用量可有效治疗慢性炎症疾病，例如类风湿性关节炎、炎症性肠病或糖尿病，或因炎症反应失调而导致的其他人类疾病。发明人还出乎意料地发现，以这些浓度添加丙二醇可显着降低θ-防御素的浓缩溶液(例如10mgmL-1以上)的粘度，从而允许通过过滤进行简单、方便且规模可扩展的灭菌。此外，与等渗盐水用作制剂载体时所观察到的反应相比，θ-防御素的制剂显着减少了注射部位的反应。
合适的θ-防御素包括在表达这些肽的哺乳动物中发现的天然θ-防御素，并且其还可以包括一种或多种源自存在于某些灵长类物种(例如Homo sapiens)中的非翻译基因的θ-防御素。在本发明构思的一些实施方案中，一种或多种θ-防御素可以对应于在猕猴(Macaca mulatta)中发现的那些，例如RTD-1(SEQ ID NO.1)、RTD-2(SEQ ID NO.2)、RTD-3(SEQ ID NO.3)、RTD-4(SEQ ID NO.4)、RTD-5(SEQ ID NO.5)和/或RTD-6(SEQ ID NO.6)。在本发明构思的其他实施方案中，一种或多种θ-防御素可以对应于在狒狒(Papio anubis)中发现的那些，例如BTD-1(SEQ ID NO.7)、BTD-2(SEQ ID NO.8)、BTD-3(SEQ ID NO.9)、BTD-4(SEQ ID NO.10)、BTD-5(SEQ ID NO.11)和/或BTD-6(SEQ ID NO.12)、BTD-7(SEQ IDNO.13)、BTD-8(SEQ ID NO.14)、BTD-9(SEQ ID NO.15)和/或BTD-10(SEQ ID NO.16)。
在本申请中，描述θ-防御素及其用途的实施方案包括θ-防御素类似物。术语θ-防御素类似物是指与天然θ-防御素肽序列具有约40％、50％、60％、70％、80％、90％以上的序列同一性的环肽。θ-防御素类似物可以结合天然θ-防御素的一个、两个、三个以上的核心特征。示例性的核心特征包括环状结构、肽内(例如，类似物的半胱氨酸对之间)存在一个、两个、三个以上的二硫键、在生理条件下处于溶液中时具有正电荷，以及存在β折叠二级结构。这样的θ-防御素类似物可以包含10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或超过20个氨基酸，并且在一些实施方案中可以掺入非天然存在的氨基酸。θ-防御素的类似物可以包括一种或多种L-氨基酸、一种或多种D-氨基酸和/或L-和D-氨基酸的混合物。在一些实施方案中，可以在θ-防御素类似物的相邻氨基酸残基之间利用非肽键。θ-防御素类似物可以代表天然θ-防御素序列的氨基酸的一个或多个缺失或取代。这样的取代可以是保守的(例如，其中被取代的氨基酸保留天然氨基酸的电荷、疏水性、亲水性和/或空间特性)。在一些实施方案中，θ-防御素类似物可包括非肽部分的接枝或缀合，例如聚乙二醇和/或其他亲水性聚合物、细胞受体靶向部分和/或有助于加工/纯化的部分。基于RTD-1(SEQ ID NO.1)的合适的θ防御素类似物的实例有SEQ ID NO.17(RTD-1-27)，SEQ ID NO.18(RTD-1-28)和SEQ ID NO.19(RTD-1-29)。
本文提供了用于提高用于治疗慢性炎症疾病(例如类风湿性关节炎和/或糖尿病)的θ-防御素和/或θ-防御素类似物的药理作用的组合物和方法。这样的组合物在弱酸性水溶液(例如约pH5至7)中掺入约0.5％至约1.5％的丙二醇，并且适合以至多50mgmL-1的浓度皮下注射θ-防御素。发明人惊讶地发现，相对于在常规盐溶液和/或不含丙二醇的溶液中提供的相同或相似浓度的θ-防御素，这种制剂对施用的θ-防御素的药理作用或药效显着提高(例如，提高至少10倍)。这在以下图1、图2和图3中示出。发明人还已经发现，相对于常规生理盐水(例如，pH为7至7.5的磷酸盐缓冲盐水)中提供的相似浓度的θ-防御素，这种制剂的粘度大大降低，从而允许通过过滤灭菌。此外，与等渗盐液载体相比，要求保护的组合物显着减少了注射部位反应。
图1、图2和图3显示了通过皮下注射θ-防御素RTD-1治疗类风湿性关节炎动物模型的结果，其中θ-防御素是在常规生理盐水载体中或在含有低浓度(1％v/v)丙二醇的生理盐水中提供。通过每日皮下注射RTD-1来处理已确诊为降植烷诱发的关节炎的大鼠，其中RTD-1以指示剂量被配置在生理盐水中(图1)或含1％丙二醇的盐溶液中(图2)。生理盐水稀释剂中最低的有效RTD-1剂量为1mg/kg，最大表观作用为3mg/kg(见图1)。媒介物中包含1％的丙二醇显着降低了有效RTD-1剂量(降至0.08mg/kg，见图2)，因为0.08mg/kg(测试的最低剂量)产生了最大的抗关节炎作用，相当于在盐水中3mg/kg剂量的RTD-1(即观察到的最大作用)。当在含有1％丙二醇的缓冲(20mM乙酸钠)水性稀释剂中配制RTD-1时，可以获得等效的药理作用(图3)。申请人认为，在较低剂量的θ-防御素下可以达到类似的效果。
发明人还惊讶地发现，相对于常规生理盐水(例如，pH7至7.5的等渗磷酸盐缓冲盐水，pH7至7.5)中提供的相似浓度的θ-防御素，这种制剂大大降低了粘度，从而允许通过过滤灭菌。
发明人先前已经注意到，θ-防御素和θ-防御素类似物(例如，环十八肽和/或环四肽)在减轻慢性炎症疾病的动物模型(例如经降植烷治疗的大鼠)中的炎症方面具有显著作用。θ-防御素易溶于水溶液。在最初的研究中，θ-防御素是在常规的生理盐水溶液中制备的，很容易通过皮下注射施用，尽管在θ-防御素的浓度较高时皮下组织中也观察到了脂肪坏死，但是小鼠没有明显的全身不适。同样，在大鼠和犬类动物模型中，低浓度的θ-防御素在全身和局部上均具有良好的耐受性。然而，在较高浓度下，在生理盐水中注射θ-防御素会导致局部炎症并在注射部位发生肿胀，该肿胀依赖剂量。肿胀和炎症会持续数周。然而，相对高浓度的θ-防御素(例如约10至50mgmL-1)可能是必需的，以提供必要的θ-防御素剂量，同时保持适合人体治疗的皮下注射剂量。
在常规盐溶液中已施用θ-防御素的注射部位的显微镜研究显示，在犬和猪测试对象的注射部位处发生局部炎症和坏死变化。不希望受到理论的束缚，发明人认为，θ-防御素可能在皮下注射深度处与某些哺乳动物皮肤内发现的细胞外基质成分相互作用，导致其在该组织层内沉淀和/或形成沉淀复合物。RTD-1与全血、抗凝剂治疗后收集的血浆和血清之间相互作用的研究表明，θ-防御素与纤维蛋白原相互作用形成不溶性复合物。发明人认为，θ-防御素可能因此与细胞外基质相关的纤维蛋白原和/或纤维蛋白原样蛋白相互作用。
发明人发现使用低渗盐水，添加泊洛沙姆和使用其他常规赋形剂未能减少或消除这种由θ-防御素诱导的注射部位炎症和组织损伤。发明人惊讶地发现，低浓度的丙二醇可有效地为高浓度(例如10mgmL-1以上)的θ-防御素提供溶解性，并且还可以在易感对象皮下注射高浓度的θ-防御素时有效地减轻或防止肿胀和/或发炎。丙二醇可与水自由混溶，可以药用级无菌液体形式获得，并且通常被认为是安全的。减少和/或消除高浓度θ-防御素注射时的不良反应的丙二醇浓度的有效范围相对狭窄。在一些实施方案中，丙二醇在水中的有效浓度为约0.4％至约1.6％(v/v)。在其他实施方案中，丙二醇在水中的有效浓度为约0.5％至约1.5％(v/v)。在优选的实施方案中，丙二醇在水中的有效浓度为约1％(v/v)。
进一步的研究表明，通过使用具有弱酸性pH(例如pH约5至7)的丙二醇/水溶剂，进一步改善了结果。在优选的实施方案中，丙二醇/水溶剂的pH为约6.0，并且最终渗透压为约180至230mOsmoles。丙二醇/水溶剂的pH可以使用低摩尔浓度(例如小于约50mM)的缓冲液来维持。合适的缓冲液浓度可以例如在1mM至50mM、5mM至35mM、10mM至30mM的范围内或为约20mM。合适的缓冲物质可以是有机酸的盐，例如乙酸盐、柠檬酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、HEPES、MES等。在其他实施方案中，缓冲物质可以是具有合适的pKa的两性离子物质。在优选的实施方案中，缓冲物质是乙酸盐(例如乙酸钠)，其浓度为约20mM，并pH为约6.0。出人意料的是，发明人发现甚至使用少量(例如小于50mM)的盐水(例如NaCl)会导致皮下注射θ-防御素的不良反应。用于皮下施用的水性溶剂系统的优选实施方案可以排除NaCl和类似的盐。
发明人惊讶地发现θ-防御素可自由溶于这种酸性丙二醇/水溶剂系统，并且在对大鼠和狗皮下注射至多12.5mgmL-1浓度的RTD-1后，仅发现短暂的皮肤反应，且仅在50mgmL-1时有轻微不良反应。这支持了估计的10mgmL-1的θ-防御素浓度对于提供适合人类治疗的剂量是必要的。
如上所述，发明人出乎意料地发现，使用丙二醇/水溶剂系统，除了消除与基于盐水的制剂有关的炎症外，还相对于常规盐水显着提高了皮下注射的θ-防御素的药理效力。相对于常规盐溶液中提供的相似量，在弱酸性丙二醇/水中已建立的降植烷诱导的关节炎的临床前疗效提高至少5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍以上。例如，据发现，皮下注射在1％丙二醇+20mM醋酸盐(pH6)中以0.08mg/kg的浓度提供的RTD-1，在减轻类风湿关节炎的症状方面具有与在等渗盐水中以3mg/kg施用的RTD-1相同的作用。这表明药理作用力至少增加了37倍，但是，由于所提供的症状缓解处于等渗盐水中的θ-防御素提供的益处的上限，因此药理作用的实际增加可能大于37倍(例如大于40倍、50倍、70倍、100倍以上)。这有利地减少了适当治疗所需的θ-防御素的量。
用于注射的常规溶液的灭菌通常通过过滤进行，例如使用孔径为0.2μm以下的过滤器。然而，该过程对于蛋白质药物溶液而言是有问题的，因为对于小注射量的高蛋白质浓度而言，这样的溶液通常太粘稠而不能有效地进行无菌过滤。如本文所用，这样的粘性溶液是指这样的溶液或分散体——其中内部流动阻力高以至于难以或不可能进行过滤(例如，所需压力超过过滤膜的破裂压力)。这种粘性溶液的粘度可以至多105厘泊(cp)以上。在一个实施方案中，这种粘性溶液的粘度为至少约90至约95cp。在另一个实施方案中，这种粘性溶液的粘度为至少约40cp。在又一个实施方案中，这种粘性溶液的粘度至少高于水的粘度(即，高于约1.0cP)。
在研究过程中，发明人发现，尽管θ-防御素是高度可溶的，但是随着蛋白质浓度的增加，水溶液会变得非常粘稠。在实践中，常规的2％w/v以上的θ-防御素的盐溶液太粘，以致不能通过合理和/或可制造的规模进行过滤灭菌。在丙二醇/水溶剂中制备的类似溶液在高的θ-防御素浓度下(例如2％w/v，5％w/v，10％w/v以上)具有低粘度。这允许使用常规过滤，通过孔径为约0.2μm以下的介质对这类制剂进行简单且规模可扩展的灭菌。
本发明构思的实施方案包括通过皮下注射药物组合物来治疗与慢性炎症有关的病症的方法，所述药物组合物在含有0.5％至1.5％的丙二醇的酸性水溶液中包含一种或多种θ-防御素。合适的病症包括类风湿性关节炎、炎症性肠病、糖尿病和其他由于炎症反应异常而引起的病症。药物组合物可以包括单一种类的θ-防御素或两种以上的θ-防御素。可以以约0.1mL至约2.5mL、约0.25mL至约2mL、0.5mL至约1.5mL或约1mL的体积皮下施用药物组合物。药物组合物中的θ-防御素的浓度或θ-防御素的种类的总浓度可以在约1mgmL-1至约50mgmL-1的范围内，并且优选为约12.5mgmL-1以下。可以调节θ-防御素的浓度和/或注射体积以提供约0.001mg/kg至约3mg/kg、约0.01至约1mg/kg或约0.08mg/kg的剂量。
在一些实施方案中，除了一种或多种θ-防御素和/或θ-防御素类似物和丙二醇之外，药物组合物还可包含其他治疗化合物。例如，药物组合物可以包含一种或多种具有抗炎作用的类固醇、非类固醇抗炎药、针对促炎性细胞因子的抗体或抗体片段，和/或一种或多种止痛化合物。
θ-防御素的此类制剂可以使用任何合适的时间表来施用。可以根据需要建立或维持的所需治疗效果，以每周一次、每周两次、每周三次、隔日、每天、每12小时、每8小时或每6小时一次的频率进行皮下注射。治疗的时长可以在大约1周、大约2周、大约4周、大约8周、大约12周、大约16周、大约20周、大约6个月、大约12个月、大约18个月、大约24个月或24个月以上的范围内，以建立或维持所需的治疗效果。在一些实施方案中，为了使症状缓解或部分缓解，在治疗的初始阶段使用的θ-防御素剂量可以更高和/或更频繁，然后降低θ-防御素的剂量和/或施用频率，以维持症状缓解。
实施例
大鼠的药代动力学研究
如上所述，将θ-防御素RTD-1配制在含有丙二醇的弱酸性缓冲液中，并皮下施用于雄性和雌性Sprague-Dawley大鼠，随后测定血浆的θ-防御素水平。大鼠接受1-4mg/kg的剂量。剂量体积保持恒定在0.32mL/kg；因此，θ-防御素的浓度范围为3.125至12.5mg/mL。每周三剂，共六周。示例性结果示于表1(提供雄性大鼠的结果)和表2(提供雌性大鼠的结果)。
表1和后续表格使用以下缩写词：
AUC0-TLast从时间0(前剂量)到最后一个可测量浓度时间点的血浆浓度vs.时间曲线下的面积
CLast 测量的高于定量限的最后血浆浓度
Cmax 最大血浆浓度
MRTLast 直到测量分析物血浆浓度的最后一个时间点的平均停留时间
TLast 测量高于定量限的最后血浆浓度的时间
Tmax 最大浓度的时间。
1在前剂量至24小时后剂量之间的采血时间确定表观Cmax和Tmax值。在12到24小时之间没有采血。在第41天，在24小时采血时间点出现高剂量组的最高平均血浆浓度，这表明有可能在12至24小时之间达到Tmax。
1在前剂量至24小时后剂量之间的采血时间确定表观Cmax和Tmax值。在12到24小时之间没有采血。在第41天，在24小时采血时间点出现高剂量组的最高平均血浆浓度，这表明有可能在12至24小时之间达到Tmax。
表3、表4和表5显示了分别在分别接受1mg/kg，2mg/kg和4mg/kg的雄性大鼠中血浆中θ-防御素的浓度(ng/mL)的动力学研究的典型结果。表6、表7和表8显示了在雌性大鼠中进行的类似研究的典型结果。图4A和图4B分别显示了在该研究的第1天，雄性和雌性大鼠的血浆θ-防御素浓度(ng/mL)相对于时间(小时)的图。图5A和图5B分别显示了在该研究的第13天，雄性和雌性大鼠的血浆θ-防御素浓度(ng/mL)相对于时间(小时)的图。图6A和图6B分别显示了在该研究的第41天，雄性和雌性大鼠的血浆θ-防御素浓度(ng/mL)相对于时间(小时)的图。
BLOQ-低于定量限，<10ng/mL；N代表报告RTD-1浓度高于定量限的大鼠数量。
值表示为N＝3的平均值±SD，N＝2的平均值±范围。
N/A-不适用。
BLOQ-低于定量限，<10ng/mL；N代表报告RTD-1浓度高于定量限的大鼠数量。
值表示为N＝3的平均值±SD，N＝2的平均值±范围。
对于N＝3，粗体值与第1天明显不同；配对比较，p<0.05t检验。
N/A-不适用。
BLOQ-低于定量限，<10ng/mL；N代表报告RTD-1浓度高于定量限的大鼠数量。
值表示为N＝3的平均值±SD，N＝2的平均值±范围。
对于N＝3，粗体值与第1天明显不同；配对比较，p<0.05t检验。
N/A-不适用。
BLOQ-低于定量限，<10ng/mL；N代表报告RTD-1浓度高于定量限的大鼠数量。
值表示为N＝3的平均值±SD，N＝2的平均值±范围。
N/A-不适用。
BLOQ-低于定量限，<10ng/mL；N代表报告RTD-1浓度高于定量限的大鼠数量。
值表示为N＝3的平均值±SD，N＝2的平均值±范围。
对于N＝3，粗体值与第1天明显不同；配对比较，p<0.05t检验。
N/A-不适用。
BLOQ-低于定量限，<10ng/mL；N代表报告RTD-1浓度高于定量限的大鼠数量。
值表示为N＝3的平均值±SD，N＝2的平均值±范围。
对于N＝3，粗体值与第1天明显不同；配对比较，p<0.05t检验。
N/A-不适用。
表9示出了关于雄性和雌性大鼠的关于Cmax和AUC0-TLast的剂量比的典型结果。
如图7A描述了在第1天雄性和雌性大鼠的Cmaxvs.θ-防御素剂量的线性研究结果。图7B描绘了在第41天雄性和雌性大鼠的Cmaxvs.θ-防御素剂量的线性研究结果。图8A描绘了在第1天雄性和雌性大鼠的AUC0-TLastvs.θ-防御素剂量的线性研究结果。图8B描绘了在第41天雄性和雌性大鼠的AUC0-TLastvs.θ-防御素剂量的线性研究结果。
人体临床试验
如上所述，θ-防御素RTD-1配制在含有丙二醇的温和酸性缓冲液中，并皮下施用给年龄在23至73岁之间的男性和女性受试者，随后测定血浆的θ-防御素水平。通过皮下注射，受试者接受了20μg/kg、40μg/kg、80μg/kg、160μg/kg或325μg/kg的θ-防御素。应当理解，这些剂量相对地比上述动物研究中所使用的剂量小得多。接受20至80μg/kg的受试者在单个部位接受施用剂量。接受较大剂量的受试者在两个部位之间分散接受剂量。如图9显示了不同治疗组随时间测量血浆中θ-防御素浓度(ng/mL)的典型结果。如图所示，相对于大鼠，人体皮下注射的生物利用度显着增加。相对于皮下注射RTD-1的犬和猪动物模型，人类受试者的结果也得到类似的改善。Cmax(ng/mL)对RTD-1剂量(μg/kg)的相关性示于图10A。AUC0-TLast对RTD-1剂量(μg/kg)的相关性的相似研究的结果示于图10B。Cmax(ng/mL)对所施用的总RTD-1(mg)的相关性示于图11A中。AUC0-TLast对所施用的总RTD-1(mg)的相关性的相似研究的结果示于图10B中。AUC0-TLast和Cmax都是θ-防御素剂量的近似线性函数。值得注意的是，与试验动物相比，人体中要达到相似的血浆浓度所需的θ-防御素剂量要低得多。发明人预期，使用θ-防御素的类似物将观察到相似或改善的结果。
对于本领域的技术人员而言应该显而易见的是，在不背离本文的发明构思的前提下，除了已经描述的修改之外，还可能有更多的修改。因此，本发明的主题不受所附权利要求的限制。此外，在解释说明书和权利要求书时，应以与上下文一致的尽可能广泛的方式解释所有术语。特别地，术语“包括”和“包含”应被解释为以非排他性的方式指代元件、组件或步骤，表示所引用的元件、组件或步骤可以存在、利用或与其他未明确引用的元件、组件或步骤组合。在说明书、权利要求书中提到选自A、B、C…和N中的至少一种，该文本应解释为仅需要组中的一个元素，而不是A加N或B加N等。

Claims (9)

1.一种用于降低θ-防御素组合物的粘度的含有丙二醇的制剂，其特征在于，所述制剂包括：
θ-防御素或θ-防御素类似物，其在包含0.5％至1.5％v/v丙二醇的水溶液中的浓度至多为50mgmL-1，其中丙二醇的浓度使得药物组合物具有至多105厘泊的粘度，
其中所述药物组合物的pH为6.0至7.0，并被配制为用于肠胃外施用，以及
其中所述θ-防御素类似物包括具有θ-防御素核心结构的环状二十肽、环状十九肽、环状十八肽、环状十七肽、环状十六肽、环状十五肽、环状十四肽、环状十三肽、环状十二肽、环状十一肽和环状十肽。
2.一种用于提高θ-防御素组合物治疗慢性炎症的药效的含有丙二醇的制剂，其特征在于，所述θ-防御素组合物的丙二醇浓度使得0.08mg/kg剂量的θ-防御素或θ-防御素类似物的药效提高至相当于3mg/kg剂量的θ-防御素或θ-防御素类似物在生理盐水溶液中的药效。
3.根据权利要求2所述的制剂，其特征在于，所述慢性炎症选自类风湿性关节炎、炎症性肠病、与癌症有关的炎症、糖尿病和以慢性炎症失调或未解决的慢性炎症为特征的慢性疾病。
4.根据权利要求1或2所述的制剂，其特征在于，所述制剂被配制为用于肠胃外施用。
5.根据权利要求4所述的制剂，其特征在于，所述肠胃外施用选自皮下注射、肌内注射或静脉内注射。
6.根据权利要求1或2所述的制剂，其特征在于，所述药物组合物包含1％v/v的丙二醇和20mM乙酸盐，并且所述药物组合物的pH为6.0。
7.一种对含有θ-防御素或θ-防御素类似物的水性制剂进行灭菌的方法，其特征在于，所述方法包括：
在包含浓度至少为1mgmL-1的θ-防御素或θ-防御素类似物和浓度为0.5％至1.5％v/v的丙二醇的水性缓冲液中提供θ-防御素或θ-防御素类似物作为溶液；以及
使所述水性缓冲液通过孔径为0.2μm以下的过滤器，其中将溶液的粘度保持在105厘泊或更小使其通过过滤器，并且
其中所述θ-防御素类似物包括具有θ-防御素核心结构的环状二十肽、环状十九肽、环状十八肽、环状十七肽、环状十六肽、环状十五肽、环状十四肽、环状十三肽。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，θ-防御素水性制剂的pH值为6.0至7.0。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述θ-防御素或θ-防御素类似物的最大浓度为50mgmL-1。
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