CN117363730A - 一种用于血液肿瘤早期筛查的捕获探针试剂盒及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于血液肿瘤早期筛查的捕获探针试剂盒及应用；所述捕获探针的序列如SEQ ID NO.37～SEQ ID NO.82所示，可以用于检测如表2所示的突变位点；捕获试剂盒中还包含快速杂交液、磁珠清洗液、洗脱液1、洗脱液2等；本发明的试剂盒不仅可兼容各种大小panel和单双链DNA的杂交捕获，捕获效率及均一性优于同类商品化产品；而且使用快速杂交液使杂交捕获时间由常规的过夜杂交缩短至30分钟，在一天内完成检测样本的DNA提取、建库、杂交捕获等步骤，获得仅包含探针靶向区域的DNA文库，测序数据可直接用于目标区域序列分析以辅助血液肿瘤的早期筛查，提高血液肿瘤诊断的精确性和检出率。

Description

一种用于血液肿瘤早期筛查的捕获探针试剂盒及应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于血液肿瘤早期筛查的捕获探针试剂盒及应用。
背景技术
长期以来，DNA测序技术一直是分子生物学相关研究中最常用的技术手段之一，从一定程度上推动了该领域的快速发展。人类基因组计划、转录组分析、微生物基因组重测序、单核苷酸的多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)分析等方面也促进了其他生物学领域的研究和发展。尽管第一代DNA测序技术以其可达1000bp的测序读长、99.999％的高准确性帮助人们完成了大量的测序工作，但其测试速度慢、成本高、通量低等方面的不足，也致使其不能得到大众化的应用。为了弥补这一缺陷，第二代DNA测序技术在科学技术的进步以及科研人员对测序技术的努力开发下应运而生。第二代DNA测序技术又称大量并行测序技术(massive parallel sequencing,MPS)、高通量测序技术(high-throughput sequencing,HTS)，以低成本、99％以上的准确度，1次可对几百、几千个样本的几十万至几百万条DNA分子同时进行快速测序分析的特点迅速崛起，大大降低了测序成本，提高了测序效率，使测序向着高通量、低成本、高安全性和商业化的方向发展，使其成为基因检测行业不可或缺的技术手段。
尽管二代测序使测序的通量大大提高并大大降低了测序成本，然而大部分人并不关心全基因组的序列，而更多关注的是与人类疾病相关的基因序列或区段。若从全基因组测序数据中找出感兴趣的区域再进行分析，无疑大大增加了分析人员的工作量。并且，使用全基因组测序而不分析全部序列，造成大量测序数据的浪费和成本的提高。因此，靶向测序应运而生。顾名思义，靶向测序就是根据感兴趣的目标区域序列设计探针，在测序前利用探针对目标区域进行杂交，将目标区域捕获下来再测序，是目前最为常用的目标区域捕获方法。探针可以固定在固相材料上，制作成捕获芯片，也可以置于液相材料中。虽然两者的捕获原理是一样的，由于固相捕获芯片的成本较高且捕获效率较低，液相捕获成为主流。随着杂交捕获技术的成熟，国内外均有杂交捕获的相关试剂产品，然而大部分产品都需要进行长时间杂交以达到较高的捕获效率，使整个二代测序实验流程时间大大延长，提高了时间成本和人工成本。现有技术专利(专利申请号：CN 114891859 A)公开的一种快速杂交捕获试剂盒尽管将杂交时间缩短至1小时，整个液相捕获流程也比较简单，但是该系统仅适用于该专利中设计的NC捕获探针，对于常规120nt的探针不能有很好的捕获效果，应用范围较窄。本发明提供一种液相杂交捕获试剂盒，使杂交捕获时间缩短至30分钟，使整体二代测序实验流程(提取-建库-杂交-上机)在一天内完成，进一步降低检测成本。同时，本发明适用于常规120nt的捕获探针，可以兼容不同大小的panel以及单、双链探针的快速杂交，应用范围更广泛。
在传统血液肿瘤治疗方法的基础上，近年来血液肿瘤在精准诊断、小分子药物和免疫治疗方面取得极大进展。但仍然存在治疗周期长、费用高、过程痛苦等不足。若能提早肿瘤发现的时间，提早进行干预治疗，可大大提高血液肿瘤的生存率。
现已有研究(Pinkal Desai,et al.Somatic mutations precede acute myeloidleukemia years before diagnosis.Nat Med.09July 2018)发现，在血液肿瘤发生的前5年即可观察到相关的基因突变。该研究调查了212名女性，这些女性在刚开始的时候是健康个体，但最终在随访期间发生了急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)。研究人员对这些病例的外周血DNA进行深度测序，并与未发生AML的年龄匹配的对照进行比较，发现IDH1，IDH2，TP53，DNMT3A，TET2和剪接体基因的突变显著增加了发生AML的可能性。在研究中，所有具有TP53突变(21名患者中的21名)和IDH1、IDH2突变(15名患者中的15名)的所有受试者最终都发生了AML。在诊断前几年存在可检测的突变表明在AML发生之前存在潜伏期，在此期间应考虑早期检测，监测和介入研究。
本发明提供一种用于血液肿瘤早期筛查的杂交捕获探针，针对发病相关基因热点突变等特异性位点进行靶向探针的设计，同时配套相应探针捕获试剂盒进行杂交捕获，最后进行靶向测序，分析检测样本的基因突变情况，评估其发生血液肿瘤的风险，提高血液肿瘤诊断的精确性。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一种杂交捕获试剂。
本发明第二方面的目的，在于提供上述杂交捕获试剂的应用
本发明第二方面的目的，在于提供一种检测试剂。
本发明第四方面的目的，在于提供一种试剂盒。
本发明第五方面的目的，在于提供上述试剂盒的应用。
本发明第六方面的目的，在于提供一种杂交捕获方法。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一方面，提供一种杂交捕获试剂；所述杂交捕获试剂包括快速杂交液、封闭剂、磁珠、磁珠清洗液、洗脱液1和洗脱液2中的至少一种。
优选地，所述封闭剂包括文库接头通用封闭序列和插入片段中重复序列封闭剂。
优选地，所述接头通用封闭序列为SEQ ID NO.83～SEQ ID NO.86中的任意一种或多种。
优选地，所述接头通用封闭序列包括LNA(锁核酸)、BNA(桥核酸)、生物素、磷酸化或C3间臂修饰，以提高核酸链之间的结合能力，减少脱靶。
优选地，所述插入片段中重复序列封闭剂为Human Cot-1 DNA。所述Human Cot-1DNA为人胎盘DNA，主要大小为50-300bp，富含重复DNA序列，比如ALu和Kpn家族成员，是由人类胎盘DNA通过在富集重复元素的条件下打断、变性和再退火制备获得，可以用于封闭人类基因组上重复序列。
优选地，所述接头通用封闭序列的浓度为130～170pmol/μL。
优选地，所述Human Cot-1 DNA的浓度为0.5～1.5μg/μL。
优选地，所述磁珠为链霉亲和素修饰的磁珠。
优选地，所述磁珠为亲水性、带负电的羧酸活化的磁珠。
优选地，所述磁珠的粒径为2～5μm。
优选地，每1mg可与650～1350pmol生物素结合。
优选地，所述快速杂交液包括氯化钠、氯化镁、Denhardt′s溶液、十二烷基硫酸钠、乙二胺四乙酸、四甲基氯化铵、硫酸葡聚糖、去离子甲酰胺、牛血清白蛋白、鲑鱼精DNA等中的一种或多种。
优选地，所述快速杂交液包括氯化镁、Denhardt′s溶液、四甲基氯化铵、去离子甲酰胺、牛血清白蛋白和鲑鱼精DNA。
优选地，所述快速杂交液中的氯化镁的终浓度为0.1～3moL/L。
更优选地，所述快速杂交液中的氯化镁的终浓度为0.1～0.5moL/L。
优选地，所述快速杂交液中的Denhardt′s溶液的终浓度为1×～10×。
更优选地，所述快速杂交液中的Denhardt′s溶液的终浓度为1×～5×。
优选地，所述快速杂交液中的四甲基氯化铵的终浓度为0.1～5moL/L。
更优选地，所述快速杂交液中的四甲基氯化铵的终浓度为0.5～2moL/L。
优选地，所述快速杂交液中的去离子甲酰胺的终浓度为0.1～50％。
更优选地，所述快速杂交液中的去离子甲酰胺的终浓度为10～30％。
优选地，所述快速杂交液中的牛血清白蛋白的终浓度为1～10％。
更优选地，所述快速杂交液中的牛血清白蛋白的终浓度为1～5％。
优选地，所述快速杂交液中的鲑鱼精DNA的终浓度为1～10mg/mL。
更优选地，所述快速杂交液中的鲑鱼精DNA的终浓度为1～5mg/mL。
优选地，所述磁珠清洗液包括氯化钠、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、乙二胺四乙酸、硫氰酸胍、吐温20、壬基酚聚氧乙烯醚、二甲基亚砜、十二烷基硫酸钠等中的一种或多种。
优选地，所述磁珠清洗液包括氯化钠、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、乙二胺四乙酸、和吐温20。
优选地，所述磁珠清洗液中的氯化钠的终浓度为0.3～5moL/L。
更优选地，所述磁珠清洗液中的氯化钠的终浓度为1～5moL/L。
优选地，所述磁珠清洗液中的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的终浓度为0.1～100mmoL/L。
更优选地，所述磁珠清洗液中的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的终浓度为5～20mmoL/L。
优选地，所述磁珠清洗液中的乙二胺四乙酸的终浓度为0.1～10mmoL/L。
更优选地，所述磁珠清洗液中的乙二胺四乙酸的终浓度为0.5～2mmoL/L。
优选地，所述磁珠清洗液中的吐温-20的终浓度为0.01～2％。
更优选地，所述磁珠清洗液中的吐温20的终浓度为0.1～1％。
优选地，所述洗脱液1包括氯化钠、柠檬酸钠、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、乙二胺四乙酸、硫氰酸胍、吐温20、壬基酚聚氧乙烯醚、二甲基亚砜、十二烷基硫酸钠中的一种或多种。
优选地，所述洗脱液1包括氯化钠、柠檬酸钠、十二烷基硫酸钠和吐温20。
优选地，所述洗脱液1中的氯化钠的终浓度为0.15～3moL/L。
更优选地，所述洗脱液1中的氯化钠的终浓度为0.15～0.5moL/L。
优选地，所述洗脱液1中的柠檬酸钠的终浓度为1～50mmoL/L。
更优选地，所述洗脱液1中的柠檬酸钠的终浓度为10～20mmoL/L。
优选地，所述洗脱液1中的十二烷基硫酸钠的终浓度为0.01～1％。
更优选地，所述洗脱液1中的十二烷基硫酸钠的终浓度为0.05～0.2％。
优选地，所述洗脱液1中的吐温-20的终浓度为0.01～1％。
更优选地，所述洗脱液1中的吐温-20的终浓度为0.01～0.1％。
所述洗脱液2包括氯化钠、柠檬酸钠、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、乙二胺四乙酸、硫氰酸胍、吐温20、壬基酚聚氧乙烯醚、二甲基亚砜、十二烷基硫酸钠中的一种或多种。
优选地，所述洗脱液2包括氯化钠、柠檬酸钠和十二烷基硫酸钠。
优选地，所述洗脱液2中的氯化钠的终浓度为0.015～0.3moL/L。
更优选地，所述洗脱液2中的氯化钠的终浓度为0.015～0.05moL/L。
优选地，所述洗脱液2中的柠檬酸钠的终浓度为0.1～5mmoL/L。
更优选地，所述洗脱液2中的柠檬酸钠的终浓度为0.1～0.2mmoL/L。
优选地，所述洗脱液2中的十二烷基硫酸钠的终浓度为0.01～1％。
更优选地，所述洗脱液2中的十二烷基硫酸钠的终浓度为0.01～0.1％。
本发明的第二方面，提供上述杂交捕获试剂在目标序列杂交捕获或者制备目标序列杂交捕获的产品中的应用。
本发明的第三方面，提供一种检测试剂，所述检测试剂用于检测如表2所示的突变位点。
优选地，所述检测试剂为探针。
优选地，所述探针序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.36或SEQ ID NO.37～SEQ IDNO.82所示。
优选地，所述SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.36所示的探针的工作浓度为6～10fmol。
优选地，所述SEQ ID NO.37～SEQ ID NO.82所示的探针的工作浓度为2～10fmol。
优选地，所述每条探针均标记生物素。
优选地，所述探针为DNA双链探针，长度为120bp。
优选地，所述探针组覆盖人类基因组的大小约6.12Kb。
本发明的第四方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒包含本发明第一方面所述的杂交捕获试剂盒/或本发明第三方面所述的检测试剂。
优选地，所述试剂盒还包括载体A，所述载体A记载有方法A1和/或方法A2和/或方法A3；
所述方法A1为用于血液肿瘤诊断的捕获文库构建方法，包括如下步骤：
S11：从待测样本中提取DNA，对DNA样本进行片段化、末端修复、加A；连接接头，获得基因组文库；
S12：预扩增基因组文库并进行纯化；
S13：利用本发明第三方面所述的探针对纯化后的基因组文库进行杂交捕获，得到杂交产物；
S14：将所述杂交产物与磁珠混合进行富集、PCR扩增和洗脱，得到用于血液肿瘤诊断的捕获文库。
优选地，步骤S3中的杂交捕获前包括：将纯化后的基因组文库、封闭剂与本发明第三方面所述的探针进行预杂交，然后加入快速杂交液进行杂交捕获。
优选地，所述洗脱包括使用洗脱液1和洗脱液2先后进行洗脱。
优选地，所述洗脱液1和洗脱液2洗脱的次数分别为2～4次。
优选地，所述洗脱时的孵育温度为60～65℃。
所述方法A2为检测血液肿瘤相关基因或相关基因突变情况的方法，包括如下步骤：
S21：取待测样本，按照所述方法A1制备捕获文库；
S22：将捕获文库进行测序，对测序结果进行分析；得到血液肿瘤相关基因或相关基因突变情况。
所述方法A3为血液肿瘤的早期筛查的方法，包括如下步骤：
S31：取待测样本，按照所述方法A1制备捕获文库；
S32：将捕获文库进行测序，对测序结果进行分析，得到血液肿瘤相关基因或相关基因突变情况；
S33：根据步骤S32分析得到的血液肿瘤相关基因或相关基因突变情况，进行血液肿瘤的早期筛查。
优选地，所述试剂盒还包括文库构建或测序所需的其他试剂。
本发明的第五方面，提供本发明第一方面所述杂交捕获试剂或本发明第三方面所述的检测试剂或本发明第四方面所述的试剂盒在以下至少一项中的应用；
(1)构建血液肿瘤相关基因捕获文库；
(2)制备构建血液肿瘤相关基因捕获文库的产品；
(3)检测血液肿瘤相关基因；
(4)制备检测血液肿瘤相关基因的产品；
(5)检测血液肿瘤相关基因位点突变情况；
(6)制备检测血液肿瘤相关基因位点突变情况的产品；
(7)制备血液肿瘤早期筛查产品。
优选地，所述血液肿瘤相关基因如表2所示；其中检出1个以内突变的样本判断为血液肿瘤低风险；检出2-10个突变的样本判断为血液肿瘤中风险；检出10个以上突变的样本判断为血液肿瘤高风险。
本发明的第六方面，提供一种杂交捕获方法，包括使用本发明第一方面所述的杂交捕获试剂捕获目标序列。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种用于血液肿瘤早期筛查的杂交捕获探针和包括捕获探针的快速杂交捕获试剂盒，探针的序列如SEQ ID NO.37～SEQ ID NO82所示，捕获试剂盒中包含快速杂交液、磁珠清洗液、洗脱液1、洗脱液2等；本发明的试剂盒不仅可兼容各种大小panel和单双链DNA的杂交捕获，而且捕获效率及均一性优于同类商品化产品；而且使用快速杂交液使杂交捕获时间由常规的过夜杂交(至少16小时)缩短至30分钟，使用磁珠清洗液、洗脱液1和洗脱液2进行洗脱即可得到上机测序的文库，在一天内完成检测样本的DNA提取、建库、杂交捕获等步骤，获得仅包含探针靶向区域的DNA文库，测序数据可直接用于目标区域序列分析以辅助血液肿瘤的早期筛查，提高血液肿瘤诊断的精确性。
本发明不仅大大缩短了实验时间，而且提供了一组用于血液肿瘤早期筛查的捕获探针组、试剂盒，为血液肿瘤患者的早诊早治提供了夯实的基础，为肿瘤的早诊早治提供可靠精确的检测手段，进一步降低血液肿瘤的发病率和死亡率，提高生存率。
附图说明
图1为AML样本与健康对照样本的基因突变情况。
图2为平铺式覆盖探针。
图3为叠瓦式覆盖探针。
图4为对比3种试剂对全外显子panel进行快速杂交的捕获效率。
图5为对比3种试剂对全外显子panel进行快速杂交的覆盖均一性。
图6为对比3种试剂对小panel进行快速杂交的捕获效率。
图7为对比3种试剂对小panel进行快速杂交的覆盖均一性。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1血液肿瘤捕获探针组的筛选和制备
根据现有研究(Pinkal Desai,et al.Somatic mutations precede acutemyeloid leukemia years before diagnosis.Nat Med.09July 2018)表明，在血液肿瘤诊断前几年就存在可检测的突变，并且这些突变与血液肿瘤的发生存在显著相关性。该研究筛选212个健康个体作为研究队列，但最终在随访期间发生了急性髓系白血病(acutemyeloid leukemia,AML)。研究人员分别在初期、一年后和三年后抽取这些病例的外周血，对其DNA进行深度测序，并与未发生AML的年龄匹配的对照进行比较，发现IDH1，IDH2，TP53，DNMT3A，TET2和剪接体基因(SRSF2、SF3B1、U2AF1)的突变显著增加了发生AML的可能性(图1)。对所有群体发生突变及AML发生的时间进行统计，如下表1所示。
表1、血液肿瘤随访研究结果
因此，如果在癌症发生前就进行这些肿瘤热点突变的检测，将发生了相应突变的个体归为风险人群，尽早做干预或治疗，或可减少血液肿瘤的发病率，提高治愈率。本发明根据该研究，整理归纳出与血液肿瘤发生最密切相关的基因热点突变共99个(表2)，这些位点可用于血液肿瘤的早期筛查。针对这些位点进行靶向捕获探针的设计，即可得到用于血液肿瘤早期筛查的panel。
表2、血液肿瘤恶变前热点突变
针对以上基因位点进行平铺式(图2)探针设计，共得到36条120bp长度的探针序列(表3)：
表3、血液肿瘤热点panel探针序列
将设计出来的探针交给探针合成公司进行探针合成，并对每一条探针的3’端进行生物素修饰，得到的探针按一定比例进行混合，分别测试不同探针浓度2fmol、4fmol、6fmol、8fmol及10fmol的捕获情况。所述测试使用商品化试剂盒Twist’s FastHybridization and Wash Kit进行杂交捕获实验，之后进行高通量测序，分析结果如表4。
表4
probe1浓度 2fmol 4fmol 6fmol 8fmol 10fmol
X10覆盖率 92.91％ 93.69％ 96.3％ 96.6％ 96.1％
X20覆盖率 89.03％ 90.11％ 93.3％ 94.1％ 92.6％
X30覆盖率 86.27％ 87.69％ 89.6％ 91.0％ 88.3％
捕获效率(Ontarget) 47.1％ 50.1％ 54.4％ 56.9％ 55.4％
以上结果显示，随着探针浓度的增加，捕获效率和覆盖均一性有所增加，其中8fmol为最适探针浓度。但是整体覆盖均一性均没有达到99％(一般来说评估一个捕获探针panel的均一性好，其覆盖率应大于99％)，因此需要对探针进行优化，以提高探针的覆盖均一性。
进一步地，对表2的基因位点进行优化设计，将这些位点的目标区域进行前后40bp的叠瓦式覆盖(图3)，以120bp的大小向下取样，每个区段至少覆盖2-3条探针。同时删除含有二级结构或高GC、高AT的探针。根据该原则进行捕获探针设计，最终得到46条120bp大小的探针序列，如表5所示。
表5、优化后的血液肿瘤热点panel探针序列
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同理，将设计出来的优化探针组交给探针合成公司进行探针合成，并对每一条探针的3’端进行生物素修饰，得到的探针按一定比例进行混合，分别测试不同探针浓度2fmol、4fmol、6fmol、8fmol及10fmol的捕获情况。所述测试使用商品化试剂盒Twist’sFast Hybridization and Wash Kit进行杂交捕获实验，之后进行高通量测序，分析结果如表6。
表6
probe2浓度 2fmol 4fmol 6fmol 8fmol 10fmol
X10覆盖率 99.61％ 99.58％ 99.64％ 99.61％ 99.65％
X20覆盖率 99.29％ 99.37％ 99.45％ 99.40％ 99.44％
X30覆盖率 98.78％ 99.09％ 99.12％ 99.08％ 99.12％
捕获效率(Ontarget) 60.1％ 65.1％ 68.4％ 68.9％ 67.4％
以上结果显示，优化后的探针组的捕获效率和覆盖均一性都大大提高，X30覆盖率在99％以上，极大的满足了对肿瘤热点突变的分析要求，考虑到经济实惠问题，最终选择6fmol的探针浓度作为本发明的捕获探针组的制备浓度。
实施例2一种捕获试剂盒快速杂交液、磁珠清洗液、洗脱液1和洗脱液2的配制
本实施例提供一种捕获试剂盒，包括表5的捕获探针、封闭剂、快速杂交液、绑定磁珠、磁珠清洗液、洗脱液1和洗脱液2。
封闭剂包括文库接头通用封闭序列和Human Cot-1 DNA。
所述文库接头通用封闭序列为以下序列的组合：
B1：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC(SEQ ID NO.83)；
B2：ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.84)；
B3：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(SEQ ID NO.85)；
B4：GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.86)。
接头通用封闭序列修饰：对B1～B4序列中C碱基进行LNA修饰，提高封闭剂与文库接头序列的结合能力，并且每条序列的3’端进行C3间臂修饰，防止后续扩增反应时出现延伸；
每条序列的使用浓度均为150pmol/μL，Human Cot-1 DNA的浓度为1μg/μL。
绑定磁珠由高纯度链霉亲和素共价偶联至超顺磁性微球制备而成，粒径大小为2.8μm，为亲水性、带负电的羧酸活化的磁珠，每1mg可与650～1350pmol生物素结合。
根据表7配方配制快速杂交液：
表7、快速杂交液配方
根据表8配制磁珠清洗液：
表8、磁珠清洗液配方
组分 终浓度
氯化钠 0.3-3moL/L
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 0.1-100mmoL/L
乙二胺四乙酸 0.1-10mmoL/L
吐温20 0.01-2％
NF-水 补足至800μL
根据表9配制洗脱液1：
表9、洗脱液1配方
组分 终浓度
氯化钠 0.15-3moL/L
柠檬酸钠 1-50mmoL/L
十二烷基硫酸钠 0.01～1％
吐温-20 0.01～1％
NF-水 补足至600μL
根据表10配制洗脱液2：
表10、洗脱液2配方
组分 终浓度
氯化钠 0.015～0.3moL/L
柠檬酸钠 0.1-5mmoL/L
十二烷基硫酸钠 0.01～1％
NF-水 补足至600μL
实施例3一种血液肿瘤靶向文库制备的检测方法
本实施例对定制的血液肿瘤标准品(菁良基因，货号：GW-OYC001)进行检测，标准品包含的突变位点如表11所示。此外，本实施例还对10例临床正常的样本进行检测，以验证本发明提供的杂交捕获试剂和探针在血液肿瘤早筛上的作用。检测方法和流程如下所述：
表11、血液肿瘤标准的位点信息
1.捕获前文库准备
备注：标准品为ctDNA，无需进行提取和片段化的步骤。
取200μL待测样本的全血，按照美基生物磁珠法血液DNA提取试剂盒(Cat:D6311)的说明书进行DNA提取操作。将得到的DNA使用Covaris打断仪进行超声片段化，使打断片段集中在200-300bp，之后进行文库构建(NGS UDIPrimers Kit for Illumina，货号QJDI096)。文库构建步骤包括末端修复与“A”尾添加、接头连接、文库扩增与纯化。
1.1末端修复与“A”尾添加
a.取出洁净的0.2mL PCR管，根据表12内容，在冰上配制末端修复及加A反应液：
表12、末端修复及加A反应液
试剂名称 体积
片段化DNA 40μL
末修与加A缓冲液 7μL
末修与加A酶 3μL
总体积 50μL
b.轻柔震荡混合均匀，瞬时离心，立即将PCR管置于提前按照表13反应程序设置好程序的PCR仪上进行反应。
表13、末端修复及加A反应程序
温度 时间
105℃ 热盖
20℃ 30min
65℃ 30min
4℃ Hold
1.2接头连接与纯化
a.向末端修复/加A的产物中，加入以下表格配制的接头连接反应体系：
表14、接头连接反应体系
试剂名称 体积
末端修复及加A纯化产物 50μL
T4链接缓冲液 35μL
T4 DNA链接酶 5μL
通用adapter(15μM) 5μL
无核酸酶水 5μL
总体积 100μL
b.使用移液器轻轻吹打或轻柔振荡混匀，并短暂离心将反应液离心至管底。
c.将上述PCR管置于PCR仪中25℃，孵育15min(无热盖)。
d.提前取出纯化磁珠室温平衡30min。
e.将100μL连接产物转移到新的1.5mL离心管中，加入0.8倍体积的纯化磁珠，用移液器轻柔吹打混匀，室温静置孵育5min。
f.孵育完成后，将离心管置于磁力架上，室温静置5min，直至溶液完全变澄清。小心吸弃上清液，保留磁珠。
g.加入200μL 80％乙醇溶液(现配现用)，室温静置30s，小心吸弃上清液。
h.重复步骤g一次。
i.尽可能将残留的乙醇吸弃，注意不要吸到磁珠。保持离心管在磁力架上，打开离心管管盖，室温晾干至磁珠看不到反光(约1-3min)。
j.加入21μL无核酸酶水重悬磁珠，室温孵育5min，将离心管置于磁力架上，待溶液完全变澄清，小心移取20μL至新的PCR管中。
1.3文库扩增与纯化
A.根据下表15所示配制文库扩增反应体系：
表15、文库扩增反应体系
试剂名称 体积
接头连接纯化产物 20μL
Index引物i5xx﹡ 2.5μL
Index引物i7xx﹡ 2.5μL
HiFi文库扩增试剂 25μL
总体积 50μL
﹡注：Index引物i5xx的序列：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC(SEQ ID NO.89)XXXXXXXXACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.90)(其中XXXXXXXX代表8bp不同碱基的组合，作为样本标签序列)；
Index引物i7xx的序列：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(SEQ ID NO.91)NNNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.92)(其中NNNNNNNN代表与Index引物i5xx标签序列不重合的8bp不同碱基的组合，与Index引物i5xx搭配成为双端唯一标签接头序列)
B.使用移液器轻轻吹打或轻柔振荡混匀，并短暂离心。
C.按下表16设置反应程序，将上述PCR管置于PCR仪中反应。
表16、文库扩增反应程序
D.提前取出纯化磁珠室温平衡30min。
E.将100μL连接产物转移到新的1.5mL离心管中，加入0.8倍体积的纯化磁珠，用移液器轻柔吹打混匀，室温静置孵育5min。
F.孵育完成后，将离心管置于磁力架上，室温静置5min，直至溶液完全变澄清。小心吸弃上清液，保留磁珠。
G.加入200μL 80％乙醇溶液(现配现用)，室温静置30s，小心吸弃上清液。
H.重复步骤G一次。
I.尽可能将残留的乙醇吸弃，注意不要吸到磁珠。保持离心管在磁力架上，打开离心管管盖，室温晾干至磁珠看不到反光(约1-3min)。
J.加入21μL无核酸酶水重悬磁珠，室温孵育5min，将离心管置于磁力架上，待溶液完全变澄清，小心移取20μL至新的PCR管中。
K.使用Qubit dsDNA HS分析试剂盒进行文库浓度检测。
2.液相杂交捕获
使用实施例2所得到的杂交捕获试剂盒进行本实验，具体操作步骤如下：
2.1提前30分钟将捕获探针组、快速杂交液、封闭剂、绑定磁珠、纯化磁珠、磁珠清洗液、洗脱液1和洗脱液2置于室温平衡。若试剂出现沉淀，可在60℃下加热溶解。
2.2在洁净PCR管中按照表17所示加入样本前文库、封闭剂和探针组，在室温或45℃下真空浓缩至干粉。
表17、预杂交文库混合体系
2.3在干粉中加入20μL快速杂交液，指尖轻弹溶解10分钟。
2.4按照表18设置PCR程序，提前将PCR仪预热至95℃，暂停：
表18、杂交捕获PCR程序
温度 时间
95℃ 5分钟
65℃ 30分钟-2小时
2.5干粉完全溶解后，将PCR管瞬时离心后置于PCR仪上，开始程序，进行杂交反应。
2.6在洁净1.5mL PCR管中加入50μL绑定磁珠。
2.7加入200μL磁珠清洗液，移液枪轻柔吹打混匀后置于磁力架上，弃上清。
2.8重复第2.7步3次后，使用200μL磁珠清洗液重悬磁珠。
2.9完成孵育后，将杂交液全部转移到磁珠重悬液中，置于旋转混匀仪上混匀30分钟。
2.10此时取600μL洗脱液2置于60℃下预热。
2.11待步骤2.9混匀完成后，瞬时离心，将离心管置于磁力架上，弃上清。
2.12加入200μL洗脱液1重悬磁珠，室温孵育5分钟后，置于磁力架上，弃上清。
2.13重复步骤2.12两次。
2.14加入200μL 60℃预热的洗脱液2重悬磁珠，60℃下孵育5分钟后，置于磁力架上，弃上清。
2.15重复步骤2.13两次；
2.16加入20μL无酶水重悬磁珠，进行下一步反应；
2.17按照表19配制post-PCR反应液，并按照表20设置PCR程序：
表19、post-PCR反应液
试剂 体积/反应
磁珠混合物(捕获产物) 20μL
2x HiFi扩增试剂 25μL
Post PCR Primers 5μL
总计 50μL
表20、post-PCR反应程序
其中Post PCR Primers的序列为：
PrimerF:AATGATACGGCGACCACCGAGATCT(SEQ ID NO.87)；
PrimerR:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(SEQ ID NO.88)。
2.18向50μL扩增产物中加入1.8倍体积(90μL)的纯化磁珠，用移液器轻柔吹打混匀，室温静置孵育5min。
2.19孵育完成后，将离心管置于磁力架上，室温静置2min，直至溶液完全变澄清，小心吸弃上清液，保留磁珠。
2.20加入200μL 80％乙醇溶液(现配现用)，室温静置30s，小心吸弃上清液。
2.21重复步骤2.19一次。
2.22尽可能将残留的乙醇吸弃，注意不要吸到磁珠。保持离心管在磁力架上，打开离心管管盖，室温晾干至磁珠看不到反光(约1-3min)。
2.23将离心管从磁力架上取下，加入21μL无核酸酶水重悬磁珠，室温孵育3-5min，将离心管置于磁力架上，待溶液完全变澄清，小心移取20μL上清液至新的1.5mL离心管中。此时即得到靶向捕获DNA文库。
2.24对捕获文库进行浓度与片段质控。得到的捕获文库浓度应≥2ng/μL，文库片段主峰应集中在300-400bp。否则重新制备捕获文库。
2.25上机测序。按照相应说明书进行高通量测序。
2.26使用生物信息分析流程分析捕获文库的测序数据，得到待测样本的基因突变情况，从而判断该样本是否有患血液肿瘤的风险。一般来说，检出1个以内突变的样本判断为血液肿瘤低风险；检出2-10个突变的样本判断为血液肿瘤中风险；检出10个以上突变的样本判断为血液肿瘤高风险。
基于本实施例检测流程，得到血液肿瘤标准品的检出情况，如表21所示，结果显示常见的突变位点均能被检出。10例临床正常样本的检出情况如表22所示，结果显示10例正常样本中检出的突变位点在0-1个，且突变位点均为临床意义未明位点，这提示10例正常样本均无患血液肿瘤的风险。
表21、标准品检出突变位点
DNMT3A,c.2723A>G IDH1,c.395G>A TET2,c.2116C>T
DNMT3A,c.2339T>C IDH2,c.418C>T TET2,c.1499T>A
DNMT3A,c.2578T>C IDH2,c.419G>A TET2,c.3788G>A
TP53,c.1009C>T TP53,c.742C>T
表22、正常样本中的突变位点
样本编号 突变位点
1 TP53,c.298C>T
2 TP53,c.5734C>T
3 未检出
4 未检出
5 未检出
6 未检出
7 未检出
8 未检出
9 TP53,c.298C>T
10 未检出
实施例4本发明与传统杂交捕获配方的对比
本实施例对比了本发明杂交捕获配方与传统杂交捕获配方的杂交捕获效果。为了达到快速杂交的目的，本实施例对杂交捕获试剂盒进行了优化调整。
本实施例对传统配方及技术专利CN111926066B公开的快速杂交方案进行了相应试剂的配置，还对本发明的杂交液和洗脱液进行优化，分别对其牛血清白蛋白和吐温-20进行优化测试；具体配方如表23所示。
表23、杂交捕获试剂配方
/>
/>
各方案的实施流程参照各自的流程，本发明实验流程参照实施例3，均进行30min的杂交，使用的探针为T公司提供的2Mb customer panel，illumina平台进行测序。
测序结果分析如下表24所示。由此可知，传统配方进行30min杂交的效果较差，捕获效率低，同时均一性也不高。技术专利CN111926066B对捕获的均一性有较高提升，但是其捕获中靶率低，不到20％。本发明进行30min杂交时，捕获效率能达到60％以上，且10x、20x、30x的覆盖率均达到99％以上，本发明的快速杂交捕获效果好。
当杂交液使用4％的牛血清白蛋白时，捕获效率最优。当洗脱液使用0.02％的吐温-20时，覆盖均一性最优。
表24、传统配方与本发明的杂交捕获效果
实施例5本发明与技术专利CN 114891859 A中的杂交捕获试剂盒的对比
本实施例对比了专利文献(专利申请号：CN 114891859 A)公开的一种快速杂交捕获试剂盒与本发明提供的杂交捕获配方的捕获效果。
专利文献中的快速杂交捕获试剂盒包括2xHyb Buffer、Enhancer、Human Cot-1、Blocker、探针(表5)、磁珠洗涤液以及3种洗脱缓冲液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。
所述2xHyb Buffer、Enhancer、Human Cot-1、Blocker和探针为杂交反应液，配方如表25。
表25
组分 反应浓度
BSA 0.1％
Ficoll 0.1％
PVP-2 0.1％
柠檬酸钠 0.03M
氯化钠 0.3M
增强剂：甲酰胺溶液 5x
Human Cot-1 1μg/μL
Blocker 100nmol
探针 6fmol
pH值 6.0-8.0
所述磁珠洗涤液的配方为：4mL乙腈加入1mL H2O。
所述洗脱缓冲液Ⅰ为：5×SSPE和1％ SDS，洗脱缓冲液Ⅱ为2×SSPE和0.1％ SDS，洗脱缓冲液Ⅲ为0.1×SSPE和0.01％ SDS。
分别使用本发明4的杂交捕获试剂盒与该专利的试剂进行杂交捕获实验，均使用本发明提供的血液肿瘤探针组以及T公司提供的2Mb customer panel，杂交时间均为1小时。
测试结果如下表26所示。可得出如下结论，使用本发明进行快速杂交捕获的效果好，对不同大小的panel均有较好的捕获效率和覆盖均一性；使用以上所述技术专利中的快速杂交捕获试剂盒进行杂交捕获效果差，可说明其试剂盒杂交捕获效果不好，或者其试剂盒不适用于常规120nt的探针的捕获。而且使用本发明的快速杂交液可以有效提高捕获效率与覆盖均一性。
表26、本发明对比技术专利CN 114891859 A的捕获效果
/>
实施例6洗脱液温度和洗脱次数的优化
为了达到最优的效果，本发明还对洗脱液部分进行优化。本实施例的实验流程参考实施例3，使用探针为本发明的血液肿瘤探针组，均进行30min的快速杂交。
进一步地，洗脱液1的洗脱液次数为1～4次，洗脱液2的洗脱次数为1～4次。测试结果如表27所示。结果说明，两个洗脱液最优的洗脱次数为洗脱液1洗3次，洗脱液2洗3次，可达到最优的覆盖均一性，使得10x、20x、30x的覆盖率均达到99％以上。
表27、洗脱液洗脱次数的结果
洗脱液1洗脱次数 2 2 2 3 3 3 4 4 4
洗脱液2洗脱次数 2 3 4 2 3 4 2 3 4
X10覆盖率 98.82％ 98.98％ 98.86％ 99.00％ 99.67％ 99.54％ 99.06％ 99.08％ 98.85％
X20覆盖率 98.13％ 98.34％ 98.23％ 98.32％ 99.33％ 98.77％ 98.82％ 98.47％ 98.16％
X30覆盖率 97.02％ 97.33％ 97.35％ 97.10％ 99.05％ 97.51％ 97.92％ 97.38％ 97.07％
捕获效率 65.62％ 65.73％ 67.63％ 68.86％ 69.37％ 69.80％ 69.64％ 68.55％ 64.23％
洗脱液1的孵育温度为室温，洗脱液2的洗脱温度为58～72℃。测试结果如表28所示。结果说明，随着洗脱液的孵育温度的升高，覆盖均一性下降，捕获效率升高，两者相互影响，互相牵制。当孵育温度为60℃时，捕获效果最优。
表28、洗脱温度梯度结果
/>
实施例7杂交捕获试剂的杂交时间测试
本发明提供一种探针捕获试剂盒，优化的杂交洗脱配方可使杂交时间大大缩短。本实施例使用本发明4的配方(后续实验均使用该试剂盒)进行不同杂交时间的测试，分别为15分钟，30分钟，1小时和2小时，洗脱条件如实施例6所述的最佳孵育温度和洗脱次数。同时使用Twist公司的快速杂交捕获试剂盒(货号：104180)进行同步测试。本实施例使用两个探针组进行测试，分别为商品化全外Panel和本发明提供的血液肿瘤探针组。Twist公司的杂交捕获实验按照说明书进行，本发明实验流程如实施例3所述。
以上所述商品化全外Panel为双链DNA探针，大小为31Mb。
测序结果如表29所示，使用本发明杂交捕获试剂盒进行快速杂交的效果好，捕获效率及覆盖均一性均优于Twist公司的快速杂交试剂盒。
使用本发明杂交捕获试剂盒进行15分钟-2小时的快速杂交效果显著优于Twist公司的快速杂交捕获试剂盒，使用本发明30分钟杂交效果较好，同样的效果，在使用Twist公司的快速杂交试剂盒时需要杂交2小时才能达到。本发明在保证捕获效果的前提下大大缩短了杂交时间。
使用本发明杂交捕获试剂盒进行30分钟杂交与进行2小时杂交的捕获效率及覆盖均一性差异不大，且显著优于进行15分钟杂交的结果。
表29、不同杂交时间的对比测试
实施例8杂交捕获试剂对捕获探针组(panel)兼容性测试
由于杂交时间的缩短与捕获探针的大小有关，捕获探针越大，需要杂交的时间越短，市面上的商品化试剂盒均仅建议大panel如全外显子组panel可缩短捕获时间。为了验证本发明提供的快速杂交捕获试剂盒可以兼容不同大小的panel进行快速杂交，本实施例分别使用全外显子组panel和本发明提供的血液肿瘤panel进行快速杂交实验，实验流程如实施例3所述。
本实施例所述全外显子组panel为单链DNA探针，大小为34Mb.
使用国外品牌twist公司快速杂交试剂盒(货号：104180)和IDT公司杂交捕获试剂盒(货号：10010351)进行同步实验，对比本发明与商品化杂交捕获试剂盒的杂交捕获效果，实验均按照说明书进行。利用本发明试剂进行30min杂交，twist公司试剂按其说明书进行2小时杂交，IDT公司试剂按其说明书进行4小时杂交。
对于全外显子组探针，使用本发明提供的快速杂交捕获试剂盒进行杂交捕获的捕获效率高达83％，略高于twist公司和IDT公司的杂交捕获试剂盒(图4)。此外，对比本发明与竞品试剂盒的覆盖均一性显示，本发明对全外显子组探针进行杂交捕获的均一性好，10X覆盖率高达99.7％，30X覆盖率仍可达99％，而竞品试剂盒的10X覆盖率为99％，而30X覆盖率仅为97％(图5)。本发明对外显子组等大panel的捕获效率及均一性均优于竞品试剂盒。同时也说明，本发明试剂可兼容单链DNA探针的快速杂交。
对于本发明提供的血液肿瘤panel一类的小panel，使用本发明提供的快速杂交捕获试剂盒进行30分钟快速杂交的捕获效率仍可高达68％，略高于twist公司和IDT公司的杂交捕获试剂盒进行2小时杂交和过夜杂交的捕获效率(图6)，本发明10X覆盖率与竞品试剂盒相差不大，30X覆盖率优于两个竞品(图7)。本发明对小panel的捕获效率及覆盖均一性效果良好。
本发明提供的快速杂交捕获试剂盒和洗脱试剂盒可兼容各种panel的杂交捕获需求，且使用本发明进行30分钟快速杂交的效果可与其他商品化试剂盒如twist公司和IDT公司的长时间杂交的效果相当。
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.一种杂交捕获试剂，所述杂交捕获试剂包括封闭剂、快速杂交液、磁珠、磁珠清洗液、洗脱液1和洗脱液2中的至少一种，所述快速杂交液包括氯化钠、氯化镁、Denhardt′s溶液、十二烷基硫酸钠、乙二胺四乙酸、四甲基氯化铵、硫酸葡聚糖、去离子甲酰胺、牛血清白蛋白、鲑鱼精DNA中的一种或多种；
优选地，所述快速杂交液包括氯化镁、Denhardt′s溶液、四甲基氯化铵、去离子甲酰胺、牛血清白蛋白和鲑鱼精DNA；
优选地，所述快速杂交液中的氯化镁的终浓度为0.1～3moL/L；
优选地，所述快速杂交液中的Denhardt′s溶液的终浓度为1×～10×；
优选地，所述快速杂交液中的四甲基氯化铵的终浓度为0.1～5moL/L；
优选地，所述快速杂交液中的去离子甲酰胺的终浓度为0.1～50％；
优选地，所述快速杂交液中的牛血清白蛋白的终浓度为1～10％；
优选地，所述快速杂交液配方中的鲑鱼精DNA的终浓度为1～10mg/mL。
2.根据权利要求1所述的杂交捕获试剂，其特征在于，所述磁珠清洗液包括氯化钠、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、乙二胺四乙酸、硫氰酸胍、吐温20、壬基酚聚氧乙烯醚、二甲基亚砜、十二烷基硫酸钠中的一种或多种；
优选地，所述磁珠清洗液包括氯化钠、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、乙二胺四乙酸、吐温20；
优选地，所述磁珠清洗液中的氯化钠的终浓度为0.3～3moL/L；
优选地，所述磁珠清洗液中的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的终浓度为0.1～100mmoL/L；
优选地，所述磁珠清洗液中的乙二胺四乙酸的终浓度为0.1～10mmoL/L；
优选地，所述磁珠清洗液配方中的吐温-20的终浓度为0.01～2％。
3.根据权利要求1所述的杂交捕获试剂，其特征在于，所述洗脱液1包括氯化钠、柠檬酸钠、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、乙二胺四乙酸、硫氰酸胍、吐温20、壬基酚聚氧乙烯醚、二甲基亚砜、十二烷基硫酸钠中的一种或多种；
优选地，所述洗脱液1包括氯化钠、柠檬酸钠、十二烷基硫酸钠和吐温20；
优选地，所述洗脱液1中的氯化钠的终浓度为0.15～3moL/L；
优选地，所述洗脱液1中的柠檬酸钠的终浓度为1～50mmoL/L；
优选地，所述洗脱液1中的十二烷基硫酸钠的终浓度为0.01～1％；
优选地，所述洗脱液1中的吐温-20的终浓度为0.01～1％。
4.根据权利要求1所述的杂交捕获试剂，其特征在于，所述洗脱液2包括氯化钠、柠檬酸钠、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、乙二胺四乙酸、硫氰酸胍、吐温20、壬基酚聚氧乙烯醚、二甲基亚砜、十二烷基硫酸钠中的一种或多种；
优选地，所述洗脱液2包括氯化钠、柠檬酸钠和十二烷基硫酸钠；
优选地，所述洗脱液2配方中的氯化钠的终浓度为0.015～0.3moL/L；
优选地，所述洗脱液2配方中的柠檬酸钠的终浓度为0.1～5mmoL/L；
优选地，所述洗脱液2配方中的十二烷基硫酸钠的终浓度为0.01～1％。
5.权利要求1～4任一项所述的杂交捕获试剂在目标序列杂交捕获或者制备目标序列杂交捕获的产品中的应用。
6.一种检测试剂，所述检测试剂用于检测如表2所示的突变位点；优选地，所述检测试剂为探针；优选地，所述探针序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.36或SEQ ID NO.37～SEQ IDNO.82所示。
7.权利要求6所述的检测试剂在以下至少一项中的应用；
(1)构建血液肿瘤相关基因捕获文库；
(2)制备构建血液肿瘤相关基因捕获文库的产品；
(3)检测血液肿瘤相关基因；
(4)制备检测血液肿瘤相关基因的产品；
(5)检测血液肿瘤相关基因位点突变情况；
(6)制备检测血液肿瘤相关基因位点突变情况的产品；
(7)制备血液肿瘤早期筛查产品；
优选地，所述血液肿瘤相关基因和/或突变位点如表2所示。
8.一种试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1～4任一项所述的杂交捕获试剂和/或权利要求6所述的检测试剂。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括载体A，所述载体A记载有方法A1和/或方法A2和/或方法A3；
所述方法A1为用于血液肿瘤诊断的捕获文库构建方法，包括如下步骤：
S11：从待测样本中提取DNA，对DNA样本进行片段化、末端修复、加A；连接接头，获得基因组文库；
S12：预扩增基因组文库并进行纯化；
S13：利用权利要求6所述的探针对纯化后的基因组文库进行杂交捕获，得到杂交产物；
S14：将所述杂交产物与磁珠混合进行富集、PCR扩增和洗脱，得到用于血液肿瘤诊断的捕获文库；
所述方法A2为检测血液肿瘤相关基因或相关基因突变情况的方法，包括如下步骤：
S21：取待测样本，按照所述方法A1制备捕获文库；
S22：将捕获文库进行测序，对测序结果进行分析；得到血液肿瘤相关基因或相关基因突变情况；
所述方法A3为血液肿瘤的早期筛查的方法，包括如下步骤：
S31：取待测样本，按照所述方法A1制备捕获文库；
S32：将捕获文库进行测序，对测序结果进行分析，得到血液肿瘤相关基因或相关基因突变情况；
S33：根据步骤S32分析得到的血液肿瘤相关基因或相关基因突变情况，进行血液肿瘤的早期筛查。
10.一种杂交捕获方法，包括使用权利要求1～4任一项所述的杂交捕获试剂捕获目标序列。
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