CN117363628A - 一种柑橘CsMYB149基因及其增强柑橘溃疡病抗性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种柑橘CsMYB149基因及其增强柑橘溃疡病抗性的方法，涉及植物抗病分子育种技术领域，柑橘CsMYB149基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示核苷酸序列；方法具体包括以下步骤：(1)克隆柑橘CsMYB149基因的VIGS片段；(2)构建VIGS的表达载体；(3)VIGS载体转化柑橘，得到柑橘CsMYB149基因被沉默的VIGS植株。本发明首次克隆获得柑橘CsMYB149基因，并利用VIGS沉默降低柑橘CsMYB149的转录水平，对柑橘溃疡病抗性大大增强，溃疡病的发病程度显著降低，验证了CsMYB149在柑橘溃疡病抗感性中的功能，在柑橘抗溃疡病育种中具有重大的应用价值。

Description

一种柑橘CsMYB149基因及其增强柑橘溃疡病抗性的方法

技术领域

本发明涉及植物抗病分子育种技术领域，具体涉及一种柑橘CsMYB149基因及其增强柑橘溃疡病抗性的方法。

背景技术

柑橘溃疡病(Citrus bacterial canker，CBC)是由地毯草黄单胞杆菌柑橘亚种(Xanthomonas citri subsp.Citri，Xcc)引起的细菌性病害，严重危害当前大多数主栽柑橘品种。因此，加强对柑橘溃疡病防控研究是柑橘产业发展的迫切需求。柑橘溃疡病的传统防控手段，例如病树焚烧和农药使用等需要投入大量人力和物力，且会造成巨大环境危害。因此，柑橘溃疡病防治更多寄希望于培育抗病新种质。

分子育种由于可定向、高效培育抗病新种质，因此目前得到了快速发展和广泛应用。近年来，通过生物技术手段已获得一些抗溃疡病的柑橘资源，例如转柞蚕抗菌肽D基因的锦橙、新会橙、脐橙株系；过表达CsBZIP40的晚锦橙株系；基因定点编辑柑橘溃疡病感病基因CsLOB1启动子获得的对柑橘溃疡病抗性提高的植株等。但优质候选基因仍然匮乏，且功能和作用机制研究不深，因此，亟待有针对性地挖掘更多与柑橘溃疡病紧密相关的基因，深入解析其功能和机制，用于抗溃疡病分子育种。

MYB家族转录因子广泛存在于植物中，其成员均含有保守的DNA结合结构域，即MYB结构域。根据其相邻结构域重复序列的数量可划分为1R-、R2R3-、3R-、4R-MYB蛋白(Lipsick，1996)。在植物中，MYB转录因子参与调控植物的次生代谢、细胞分化、生物和非生物胁迫应答等(Stracke et al.，2001)。例如，拟南芥AtMYB30是超敏化反应激活子，调节活性氧信号通路，参与植物抗病调控(Raffaele et al.，2008；Mabuchi et al.，2018)；水稻0sMYBS1正向调控活性氧积累，赋予寄主稻瘟病广谱抗性(Li et al.，2017)。

虽然MYB家族转录因子调控在植物病害抗性中已有部分应用，但在柑橘溃疡病领域尚未有应用其进行抗病育种应用的相关报道。

有鉴于此，特提出本申请。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是目前的柑橘溃疡病抗性不足的问题，目的在于提供一种柑橘CsMYB149基因及其增强柑橘溃疡病抗性的方法，解决了目前的柑橘溃疡病抗性不足的问题。

本发明通过下述技术方案实现：

一方面，本申请提供一种柑橘CsMYB149基因，所述柑橘CsMYB149基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。

另一方面，本申请提供一种柑橘CsMYB149基因增强柑橘溃疡病抗性的方法，降低柑橘中CsMYB149基因的转录水平，所述柑橘CsMYB149基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。

进一步的，采用VIGS沉默的方式降低柑橘中CsMYB149基因的转录水平。

进一步的，方法包括以下步骤：

步骤1：克隆柑橘CsMYB149基因的VIGS片段；

步骤2：构建CsMYB149的VIGS载体；

步骤3：CsMYB149的VIGS载体转化柑橘，得到柑橘CsMYB149基因被沉默的VIGS植株。

进一步的，步骤1中，柑橘CsMYB149基因的VIGS片段的克隆方法为：提取柑橘总RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板用高保真酶PCR扩增得到柑橘CsMYB149基因的VIGS片段。

进一步的，VIGS片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示。

进一步的，步骤1中，PCR扩增所用的引物为CsMYB149-VIGS-F和CsMYB149-VIGS-R，CsMYB149-VIGS-F的核苷酸序列为SEQ ID NO：3；CsMYB149-VIGS-R的核苷酸序列为SEQ IDNO：4。

进一步的，步骤2中，VIGS基因片段表达载体的构建方法为：将步骤1获得的PCR产物柑橘CsMYB149基因的VIGS片段经EcoR I和Sal I酶切，回收后与相同酶切的TRV2载体连接并转化大肠杆菌感受态细胞，提取质粒，得到CsMYB149基因的VIGS载体。

进一步的，步骤3中，VIGS载体转化柑橘的方法为：将步骤2获得的VIGS载体转化农杆菌，制备含VIGS载体的农杆菌菌液，侵染柑橘无菌幼苗，经荧光观察、PCR和qRT-PCR验证后得到柑橘CsMYB149基因被沉默的VIGS植株。

进一步的，步骤3得到VIGS植株后，对VIGS植株进行柑橘溃疡病抗性评价，判定柑橘CsMYB149基因沉默能够增强柑橘溃疡病抗性。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

(1)本发明提供的一种柑橘CsMYB149基因，从柑橘感染溃疡病前后差异表达的基因中获得的一个在抗病品种中受柑橘溃疡病菌侵染表达下调、在感病品种中侵染早期上调的MYB家族转录因子CsMYB149，预测CsMYB149基因是柑橘溃疡病的一个感病基因；

(2)本发明提供的一种通过沉默柑橘CsMYB149基因增强柑橘溃疡病抗性的方法，通过构建柑橘CsMYB149基因的VIGS载体，农杆菌介导转化柑橘，得到的柑橘植株能够对溃疡病表现明显抗性，病斑面积最大降低了35.6％，病情指数最大降低了33.8％，显著减轻了溃疡病的发病程度；

(3)本发明提供的一种通过沉默柑橘CsMYB149基因增强柑橘溃疡病抗性的方法，通过柑橘CsMYB149基因VIGS沉默能够显著减轻柑橘溃疡病的发病程度，且柑橘CsMYB149基因VIGS沉默不会影响柑橘植株的表型；

(4)本发明提供的一种通过沉默柑橘CsMYB149基因增强柑橘溃疡病抗性的方法，柑橘CsMYB149基因还可以作为候选基因同多个溃疡病抗、感病基因利用VIGS沉默、RNA干扰和基因编辑等技术协同进行溃疡病抗性育种，在柑橘抗溃疡病育种中具有重大的应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明示例性实施方式的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。在附图中：

图1为本发明实施例柑橘CsMYB149的生物信息学特征图：A，柑橘CsMYB149基因的染色体定位；B，柑橘CsMYB149的基因结构；C，柑橘CsMYB149的保守结构域；

图2为本发明实施例柑橘CsMYB149的柑橘溃疡病菌诱导表达图：数据柱上的字母表示差异显著性(P<0.05)；

图3为本发明实施例利用柑橘CsMYB149基因进行VIGS沉默以提高柑橘溃疡病抗性的具体实施流程图；

图4为本发明实施例柑橘CsMYB149基因VIGS载体图：GFP，绿色荧光蛋白；RdRp，NA依赖性RNA聚合酶；CP，外壳蛋白；35S，来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；NOS，胭脂碱合成酶基因终止子；LB，左同源臂；RB，右同源臂；

图5为本发明实施例VIGS植株PCR检测图：+，阳性对照；-，阴性对照；M，分子量标准；TRV2，转空载体的植株(下同)；TRV2-CsMYB149，转CsMYB149的VIGS载体的植株(下同)；

图6为本发明实施例VIGS植株中CsMYB149表达的qRT-PCR检测图；

图7为本发明实施例VIGS植株表型图；

图8为本发明实施例VIGS植株叶片接种溃疡病菌后的发病情况；

图9为本发明实施例VIGS植株叶片接种溃疡病菌后病斑大小统计图；

图10为本发明实施例VIGS植株叶片接种溃疡病菌后病情指数统计图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

在以下描述中，为了提供对本发明的透彻理解阐述了大量特定细节。然而，对于本领域普通技术人员显而易见的是：不必采用这些特定细节来实行本发明。在其他实施例中，为了避免混淆本发明，未具体描述公知材料或方法。

在整个说明书中，对“一个实施例”、“实施例”、“一个示例”或“示例”的提及意味着：结合该实施例或示例描述的特定特征、结构或特性被包含在本发明至少一个实施例中。因此，在整个说明书的各个地方出现的短语“一个实施例”、“实施例”、“一个示例”或“示例”不一定都指同一实施例或示例。此外，可以以任何适当的组合和/或子组合将特定的特征、结构或特性组合在一个或多个实施例或示例中。此外，本领域普通技术人员应当理解，在此提供的示图都是为了说明的目的，并且示图不一定是按比例绘制的。这里使用的术语“和/或”包括一个或多个相关列出的项目的任何和所有组合。

实施例1

柑橘CsMYB149的生物信息学分析

如图1所示，柑橘CsMYB149基因位于柑橘7号染色体的1688044bp到1689675bp之间(如图1A所示)，含有3个内含子和4个外显子(如图1B所示)，编码387个氨基酸，含有MYB功能结构域(如图1C所示)。

CsMYB149基因核苷酸序列SEQ ID NO：1如下所示：

ATGCCCACACTTATATATAACGCTCTATTAGAAACTGGGGAGGAGAATTATAGCCAATTATACAGGAAGATGAAAGGAAGTACTGATCATAGTACTTCTGATCATTCTAAGAAGACAAACCATTCAAACAAAATTGGTACAAGTGATCCAAATATTTATTGCAAGTCGATAAAAGGAGAGAGTTCAAGCAACAGCTCCATTGAAGAGACTGTCAATGATCAAAACAAGGCCGCAAGTTCTGGATCTACGAGGCAGTACAATCGCTCCAAGACGCCACGGCTACGCTGGACTCCTGAGCTTCATCTTTGCTTTGTCCAAGCTGTAGAAAGACTAGGAGGACAAGACAGAGCAACACCTAAGTTGGTTCTTCAGTTTATGAACATCAAAGGCCTTAGCATCTCCCACGTGAAGAGTCATCTTCAGATGTACAGGAACAAGAAGATTGATGACCCTAATCAAGAACCAGGGCTTTTACTGGGAGGCGGCGGCGGCGGTGGCGGCGATCACCGGATTTGTAACTTCAGCCAGCTTCCCATGATTCCACATTTCAATCAAAGGAATTTTTCCACTTTAAGGTTCGATGATAAAGCTTCTTGGAGAGGGCAGAGGGATCGAAGTTATGGCCTTAATACGGGTGAAAATGCAATGTTT GATAGAGCCAAACATGGCCTTTATGCTGCAGTAGCTAAGAGACTTCTTAGCAGCCAAGATAAGAAATCACTTAAACGTGATTCCATTGAACAAGATACCAGCAAAACATATCAAACTTTTGAAGAGAGTGAGTTCTTTCAAAGATTCAAGCCAAGCAGGCCAATCTCATCAATTGAACCCAACCTCAAAACCCATGTACAGGAAAATGCAAAAGATGAAAAAAAGCCTGTGAATGACGGCAGCTCATGCGGTTGCAATAGCTGGCCATTAATGGATCAAAAATTTGGAAGCAATAAGCTGAAAAGGAAGAAGAATTGGGATTCAGAATGTGATGACCTGGATTTGAATTTATCTTTGAAAATAAAACCAAACAAAATTGATGATGATGGTCGTGATGAAGTTGAGAGTAGCTTGTGTCTTTCTCTGTCTTCATCTTCACCCTCAAAGCTAAGCAGATTGAAGAAGAAAGACAAGAAGGCGGCATCCGCAAGTACTCTGGATCTCACTTTATGA。

实施例2

柑橘CsMYB149的柑橘溃疡病诱导表达分析

为验证柑橘CsMYB149与柑橘溃疡病菌侵染之间的关系，通过在抗病品种金柑和感病品种晚锦橙中注射接种柑橘溃疡病菌，以柑橘CsMYB149特异性区域设计qRT-PCR引物CsMYB149-RT-F和CsMYB149-RT-R。

qRT-PCR反应条件：95℃3min，95℃10s；56℃10s，72℃10s，40次循环；72℃10min；利用法计算植株中CsMYB149基因的相对表达量。

引物CsMYB149-RT-F的核苷酸序列SEQ ID NO：5如下所示：

CTTCACCCTCAAAGCTAAGCAG。

引物CsMYB149-RT-R核苷酸序列SEQ ID NO：6如下所示：

AGATCCAGAGTACTTGCGGATG。

对CsMYB149受柑橘溃疡病菌侵染的诱导表达特性进行分析发现，如图2所示，晚锦橙中，CsMYB149的表达量在柑橘溃疡病菌侵染早期表达量明显上升，而金柑中，CsMYB149在柑橘溃疡病菌侵染后表达量下降。根据上述结果能够推测出CsMYB149是柑橘溃疡病的感病基因，其表达水平与溃疡病抗性呈负相关。

实施例3

利用柑橘CsMYB149沉默提高柑橘溃疡病抗性

如图3所示，本发明利用CsMYB149沉默以提高柑橘溃疡病抗性的具体实施流程包括VIGS片段克隆、载体构建、柑橘转化、阳性鉴定和抗性评价。

1.VIGS片段克隆

1)RNA提取及cDNA合成

用RNA提取试剂盒(艾德莱，CAT：RN09)提取晚锦橙的总RNA，使用RecombinantDNase I(TAKARA)反转录合成cDNA，得到CsMYB149基因的VIGS片段，其核苷酸序列SEQ IDNO：2如下所示：

AAGAATTGGGATTCAGAATGTGATGACCTGGATTTGAATTTATCTTTGAAAATAAAACCAAACAAAATTGATGATGATGGTCGTGATGAAGTTGAGAGTAGCTTGTGTCTTTCTCTGTCTTCATCTTCACCCTCAAAGCTAAGCAGATTGAAGAAGAAAGACAAGAAGGCGGCATCCGCAAGTACTCTGGATCTCACTTTATGAGTCGAC。

2)CsMYB149基因的VIGS片段扩增

1.2.1用PrimeSTAR master mix(TAKARA)试剂盒克隆CsMYB149基因的VIGS片段，长度为210bp；

1.2.2利用引物CsMYB149-VIGS-F和CsMYB149-VIGS-R进行PCR扩增；

1.2.3切含有目的片段的琼脂糖凝胶，利用DNA凝胶回收试剂盒(艾德莱)回收RNAi片段。

PCR反应条件：98℃，5min；98℃，30s，56℃，30s，72℃，1.5min，35个循环；72℃延伸10min。

引物CsMYB149-VIGS-F的核苷酸序列SEQ ID NO：3如下所示：

GAATTCAAGAATTGGGATTCA。

引物CsMYB149-VIGS-R的核苷酸序列SEQ ID NO：4如下所示：

GAGCTCGTCGACTCATA。

2.VIGS载体构建

如图4所示，将VIGS载体TRV2和CsMYB149基因的VIGS片段用EcoR I和Sac I酶切，凝胶回收，然后将两个片段连接并转化大肠杆菌感受态细胞，提取质粒，得到VIGS载体TRV2-CsMYB149；其中，GFP：绿色荧光蛋白；RdRp：NA依赖性RNA聚合酶；CP：外壳蛋白；35S：来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；NOS：胭脂碱合成酶基因终止子；LB：左同源臂；RB：右同源臂。将载体TRV2-CsMYB149通过冻融法转化农杆菌，制备含VIGS载体的农杆菌菌液。

3.VIGS载体转化

1)农杆菌活化

分别取500μL TRV1与TRV2、TRV2-CsMYB149农杆菌菌液加至50mL液体LB培养基(含卡那霉素)，于28℃，200r·min^-1培养至OD₆₀₀＝1；收集菌体，用MMA(10mM MgCl₂、10nM MES、100μM乙酰丁香酮)液体重悬，调整OD₆₀₀＝0.8；将TRV1分别与TRV2、TRV2-CsMYB149载体按照体积比1:1混匀，室温暗培养3h。

2)农杆菌侵染

将胚根长至3cm的无菌幼苗浸入农杆菌菌液，用真空泵抽真空1min；用无菌水冲洗3～5遍，插入种子培养基中室温黑暗下培养2～3d，观察若发出绿色荧光即为阳性苗，转移到土壤中培养，25℃下16h光照/8h黑暗培养，定期浇水。

4.VIGS阳性鉴定和表型观察

紫外光下显示绿色荧光的为阳性苗，随后转移至营养土培养基，一个月后，采集组织提取DNA和总RNA，利用引物对TRV1-F/R、TRV2-F/R和TRV2-F/TRV2-CsMYB149-R分别进行PCR验证，结果如图5所示：引物对TRV1-F/R、TRV2-F/R可以在TRV2和TRV2-CsMYB149植株中分别扩增得到150bp的条带；引物对TRV2-F/TRV2-CsMYB149-R在TRV2植株中无扩增条带，而在TRV2-CsMYB149植株中扩增得到376bp条带。

引物TRV1-F的核苷酸序列SEQ ID NO：7如下所示：

TTGGGTTGCTACTGATTCGACT。

引物TRV1-R的核苷酸序列SEQ ID NO：8如下所示：

CTGTAAGGACCATCATACTTCGC。

引物TRV2-F的核苷酸序列SEQ ID NO：9如下所示：

ATTCACTGGGAGATGATACGCT。

引物TRV2-R的核苷酸序列SEQ ID NO：10如下所示：

GAATCTAAGTCCACTCGTCCGT。

引物TRV2-CsMYB149-R的核苷酸序列SEQ ID NO：11如下所示：

GTCGACTCATAAAGTGAGATCCAGAG。

PCR反应条件：94℃3min，94℃30s，58℃30s，72℃30s，30次循环；72℃10min。

利用引物CsMYB149-RT-F和CsMYB149-RT-R进行qRT-PCR，验证CsMYB149是否被成功沉默。将转TRV1和TRV2空载体植株的基因表达水平设定为1，若含有目的片段载体的植株CsMYB149基因表达水平小于1，则发生了基因沉默。经过鉴定，如图6所示，CsMYB149转录水平最大下降了77.1％。

qRT-PCR反应条件：95℃3min，95℃10s；56℃10s，72℃10s，40次循环；72℃10min。

如图7所示，经过荧光观察、PCR鉴定和qRT-PCR鉴定后的阳性植株的表型同野生型比较无明显差异，表明CsMYB149的沉默未对柑橘的生长发育造成不利影响。

5.抗性评价

利用离体针刺法对VIGS植株进行溃疡病抗性评价，具体操作如下：

采集成熟叶片清洗后用75％的酒精消毒后置于超纯水中冲洗；以叶脉为中心进行针刺,用移液器点样溃疡病菌液，每针孔点样1μL(1×10⁵CFU·mL^-1)，于28℃恒温光照培养箱中培养(16h光照/8h黑暗)；叶片点菌后培养10d拍照，用Image J V1.47统计病斑大小。

根据病情指数公式计算病情指数，按照病斑面积将病情分为0-7级，以字母R表示病斑面积，0级(R≤0.5mm²)，1级(0.5mm²＜R≤1.0mm²)，2级(1.0mm²＜R≤1.5mm²)，3级(1.5mm²＜R≤2.0mm²)，4级(2.0mm²＜R≤2.5mm²)，5级(2.5mm²＜R≤3.0mm²)，6级(3.0mm²＜R≤3.5mm²)，7级(R＞3.5mm²)。根据公式计算发病程度：DI＝100×Σ【各级病斑数×相应级数值】/(病斑总数×最大级数)。

如图8-10所示，接种溃疡病菌10d后，CsMYB149的VIGS植株症状明显减轻；病斑面积最大降低了35.6％，病情指数最大降低了33.8％。因此，CsMYB149基因沉默可增强柑橘溃疡病抗性。

综上，本发明通过CsMYB149的沉默可很大程度上降低柑橘溃疡病的病斑面积，减轻溃疡病的发病程度。本发明提供的CsMYB149基因可以通过多种技术对其进行沉默，用作抗溃疡病分子育种，也可以与其他的抗病或感病基因一起，协同进行柑橘抗溃疡病分子育种，在柑橘抗溃疡病育种中具有重大的应用价值。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种柑橘CsMYB149基因，其特征在于，所述柑橘CsMYB149基因的核苷酸序列为SEQID NO：1所示。

2.一种柑橘CsMYB149基因增强柑橘溃疡病抗性的方法，其特征在于，降低柑橘中CsMYB149基因的转录水平，所述柑橘CsMYB149基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。

3.根据权利要求2所述的一种柑橘CsMYB149基因增强柑橘溃疡病抗性的方法，其特征在于，采用VIGS沉默的方式降低柑橘中CsMYB149基因的转录水平。

4.根据权利要求2所述的一种柑橘CsMYB149基因增强柑橘溃疡病抗性的方法，其特征在于，方法包括以下步骤：

步骤1：克隆柑橘CsMYB149基因的VIGS片段；

步骤2：构建CsMYB149的VIGS载体；

步骤3：CsMYB149的VIGS载体转化柑橘，得到柑橘CsMYB149基因被沉默的VIGS植株。

5.根据权利要求4所述的一种柑橘CsMYB149基因增强柑橘溃疡病抗性的方法，其特征在于，步骤1中，柑橘CsMYB149基因的VIGS片段的克隆方法为：提取柑橘总RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板用高保真酶PCR扩增得到柑橘CsMYB149基因的VIGS片段。

6.根据权利要求5所述的一种柑橘CsMYB149基因增强柑橘溃疡病抗性的方法，其特征在于，VIGS片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示。

7.根据权利要求4所述的一种柑橘CsMYB149基因增强柑橘溃疡病抗性的方法，其特征在于，步骤1中，PCR扩增所用的引物为CsMYB149-VIGS-F和CsMYB149-VIGS-R，CsMYB149-VIGS-F的核苷酸序列为SEQ ID NO：3；CsMYB149-VIGS-R的核苷酸序列为SEQ ID NO：4。

8.根据权利要求4所述的一种柑橘CsMYB149基因增强柑橘溃疡病抗性的方法，其特征在于，步骤2中，VIGS基因片段表达载体的构建方法为：将步骤1获得的PCR产物柑橘CsMYB149基因的VIGS片段经EcoR I和Sal I酶切，回收后与相同酶切的TRV2载体连接并转化大肠杆菌感受态细胞，提取质粒，得到CsMYB149基因的VIGS载体。

9.根据权利要求4所述的一种柑橘CsMYB149基因增强柑橘溃疡病抗性的方法，其特征在于，步骤3中，VIGS载体转化柑橘的方法为：将步骤2获得的VIGS载体转化农杆菌，制备含VIGS载体的农杆菌菌液，侵染柑橘无菌幼苗，经荧光观察、PCR和qRT-PCR验证后得到柑橘CsMYB149基因被沉默的VIGS植株。

10.根据权利要求4所述的一种柑橘CsMYB149基因增强柑橘溃疡病抗性的方法，其特征在于，步骤3得到VIGS植株后，对VIGS植株进行柑橘溃疡病抗性评价，判定柑橘CsMYB149基因沉默能够增强柑橘溃疡病抗性。