CN117362429A - 一种分泌抗a-fabp单克隆抗体6c11的杂交瘤细胞株及其用途 - Google Patents
一种分泌抗a-fabp单克隆抗体6c11的杂交瘤细胞株及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种分泌抗A‑FABP单克隆抗体6C11的杂交瘤细胞株及其用途。具体公开了一种分离的特异性结合A‑FABP的单克隆抗体或其抗原结合部分，所述单克隆抗体或其抗原结合部分由中国普通微生物保藏管理中心(CGMCC)，具有保藏号CGMCC No.45191的杂交瘤细胞株产生。还公开了其在检测领域的应用。本发明获得的单克隆抗体具有灵敏度高，特异性好等优点。
Description
技术领域
本发明属于免疫学领域，具体涉及分泌抗A-FABP单克隆抗体6C11的杂交瘤细胞株及其用途。
背景技术
脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(adipocyte-type fatty acid binding protein,A-FABP)是载脂蛋白家族的成员之一，分子量为14.6KD，主要表达在成熟脂肪细胞和巨噬细胞中。A-FABP蛋白主要功能是作为游离脂肪酸分子的载体，在脂肪细胞中调节脂肪的储存和分解；在巨噬细胞中调节脂质的累积和促进多种炎性因子的表达，包括MCP-1、TNF-α、IL-6、IL-1β等。A-FABP蛋白可分泌到细胞外和血液中，促进炎症反应，同时与多种代谢疾病如肥胖、糖尿病、脂代谢紊乱、非酒精性脂肪肝炎、动脉粥样硬化等发生发展密切相关。而在动物实验中，小鼠移植A-FABP基因敲除鼠骨髓已被证明可以全面改善动脉粥样硬化，并且没有代谢副作用；同时A-FABP基因突变导致A-FABP表达水平降低的小鼠，具有较低的甘油三酯水平，降低了心血管疾病的风险，并且减少肥胖引起的2型糖尿病。有关研究还阐明了A-FABP蛋白在巨噬细胞中通过JNK/c-Jun/AP-1信号轴上调多种炎症因子表达的分子机制，并证实在发生缺血性脑卒中后，血液中和脑组织中的A-FABP蛋白表达水平都上升，促进炎性因子的表达，从而加剧脑卒中后神经炎症。因此，A-FABP可作为潜在的改善代谢性疾病和相关的心脑血管疾病的治疗靶点。
鉴于A-FABP蛋白在代谢类疾病及其心脑血管并发症中的重要作用，世界上多个制药公司和科研机构研发了数以百计的A-FABP蛋白抑制剂，目前为止绝大多数为小分子化合物。这些抑制剂尽管在体内实验中表现出很高的活性和良好的特异性，在多种动物疾病模型中也显示出良好的治疗效果，但是由于化学小分子类药物在体内靶点特异性低，副作用多，尤其是心脏毒性，目前还没有一个A-FABP蛋白小分子抑制剂能够进入临床试验阶段。美国哈佛大学曾在2015年研制了一个兔和鼠嵌合单抗，但是其对A-FABP蛋白的亲和力非常低，至今未进入临床试验。
作为生物学研究领域应用最广泛的工具，抗体产品的地位毋庸置疑。而抗体的特异性和应用范围长久以来困扰着抗体产业，也是整个生物学研究领域的极大危机。抗体产品糟糕的质量会直接导致实验结果的误差，以及研究结果无法被重复和再现。研究项目的进展往往会因为抗体带来的问题停滞不前，由此造成的损失也是惊人的。据2015年的数据统计，仅在美国，平均每年就有3.5亿美元被浪费在这些无效抗体上。而在世界范围内，每年竟有8亿美元被浪费，占到了全球科研抗体总开销的50％。
发明内容
本发明涉及一种抗A-FABP单克隆抗体及其制备方法和用途。用杂交瘤技术制备抗A-FABP单克隆抗体，可以用于ELISA和免疫印迹等生物学研究实验。
本技术制备的抗A-FABP单克隆抗体特异性靶向结合人和鼠细胞的A-FABP分子，可以应用于免疫印迹，流式细胞技术、免疫组化和ELISA等实验，是研究A-FABP功能的有力工具。
本发明一个方面，提供了一种分离的特异性结合A-FABP的单克隆抗体或其抗原结合部分，所述单克隆抗体或其抗原结合部分由保藏在中国普通微生物保藏管理中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.45191的杂交瘤细胞株6C11产生。
本发明另一个方面提供一种杂交瘤细胞系杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株已于2022年6月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo.45191。
本发明另一个方面提供了一种组合物，包含前述的单克隆抗体或抗原结合部分。
本发明再一个方面提供了本发明所述的分离的抗A-FABP单克隆抗体或其抗原结合部分在检测A-FABP在样品中的存在或其表达水平中的用途，或者用于制备试剂盒或检测试剂的用途，所述试剂盒或检测试剂用于检测A-FABP在样品中的存在或其表达水平。
在本发明的技术方案中，所述样品包括但不限于，血液样品、组织样品和细胞样品。
在本发明的技术方案中，所述抗体或其抗原结合部分还可包括可检测的标记。
在本发明的技术方案中，检测A-FABP在样品中的存在或其表达水平的方法包括ELISA检测方法、Western blot检测方法、流式细胞检测方法、免疫组化检测方法。
在本发明的技术方案中，所述试剂盒包括ELISA检测试剂盒或Western blot检测试剂盒，所述检测试剂包括流式细胞检测试剂、免疫组化检测试剂。
本发明再一个方面提供了本发明所述的分离的抗A-FABP单克隆抗体或其抗原结合部分在ELISA检测中的应用。
本发明再一个方面提供了本发明所述的分离的抗A-FABP单克隆抗体或其抗原结合部分在Western blot检测中的应用。
本发明再一个方面提供了本发明所述的分离的抗A-FABP单克隆抗体或其抗原结合部分在流式细胞检测中的应用。
本发明再一个方面提供了本发明所述的分离的抗A-FABP单克隆抗体或其抗原结合部分在免疫组化检测中的应用。
本发明再一个方面提供了ELISA检测试剂盒，其包括本发明所述的分离的抗A-FABP单克隆抗体或与或其抗原结合部分。优选地，所述单克隆抗体或其抗原结合部分还可包括可检测的标记。所述试剂盒还可包含第二抗体，其特异性识别所述单克隆抗体或其抗原结合部分；所述第二抗体结合部分还可包括可检测的标记。
本发明再一个方面提供Western blot检测试剂盒，其包括本发明所述的分离的抗A-FABP单克隆抗体或其抗原结合部分。优选地，所述单克隆抗体或其抗原结合部分还可包括可检测的标记。所述试剂盒还可包含第二抗体，其特异性识别所述单克隆抗体或其抗原结合部分；所述第二抗体结合部分还可包括可检测的标记。
本发明再一个方面提供了流式细胞检测试剂，其包括本发明所述的分离的抗A-FABP单克隆抗体或其抗原结合部分。优选地，所述单克隆抗体或其抗原结合部分还可包括可检测的标记。所述细胞检测试剂还可包含第二抗体，其特异性识别所述单克隆抗体或其抗原结合部分；所述第二抗体结合部分还可包括可检测的标记。
本发明再一个方面提供了免疫组化检测试剂，其包括本发明所述的分离的抗A-FABP单克隆抗体或其抗原结合部分。优选地，所述单克隆抗体或其抗原结合部分还可包括可检测的标记。所述细胞检测试剂还可包含第二抗体，其特异性识别所述单克隆抗体或其抗原结合部分；所述第二抗体结合部分还可包括可检测的标记。
在本发明中，术语抗体的“抗原结合部分”是指全长抗体的一个或多个部分，所述部分保持结合抗体所结合的相同抗原(例如，A-FABP)的能力，与完整抗体竞争对抗原的特异性结合。通常参见，Fundamental Immunology，Ch.7(Paul，W.，ed.，第2版，Raven Press，N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗原结合部分。在一些情况下，抗原结合部分包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。
在一些情况下，抗体的抗原结合部分是单链抗体(例如，scFv)，其中VL和VH结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子(参见，例如，Bird等人，Science242：423-426(1988)和Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883(1988))。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448)。可用于本发明的其它接头包括由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8：725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31：94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56：3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293：41-56和Roovers等人(2001)，CancerImmunol.描述的那些。
在一些情况下，抗体是双抗体，即，双价抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如，Holliger P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)，和Poljak R.J.等人，Structure 2：1121-1123(1994))。
可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如C3和C16单克隆抗体)获得抗体的抗原结合部分(例如，上述抗体片段)，并且以与对于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合部分。
如本文中所使用的，术语“杂交瘤”、“杂交瘤细胞系”和“杂交瘤细胞株”可互换使用，并且当提及术语“杂交瘤”、“杂交瘤细胞系”和“杂交瘤细胞株”时，其还包括杂交瘤的亚克隆和后代细胞。
关于生物材料保藏的说明
本发明涉及下列已在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)进行保藏的生物材料：
杂交瘤细胞株6C11，其保藏号为CGMCC No.45191，保藏日期为2022年6月16日，分类命名为杂交瘤细胞株(拉丁名Mus musculus)。
有益效果
本发明提供了一种抗A-FABP的单克隆抗体的制备方法和应用，该单克隆抗体具有灵敏度高，特异性好等优点，适用于不同检测方法。本发明提供的单克隆抗体，可以广泛用于Western blot、ELISA、flowCytometry等不同手段检测A-FABP，为研究人A-FABP的功能提供了基础。
附图说明
图1为A-FABP蛋白单克隆抗体6C11特异性检验。
具体实施方式
为了使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
实施例1用人A-FABP蛋白免疫小鼠，筛选人A-FABP蛋白单克隆抗体
通过香港因诺诊断公司购买：人A-FABP蛋白(2000μg，Cat.No.41030)，蛋白纯度均>95％。
免疫雌性BALB/c小鼠(6周龄)。首次免疫使用弗氏完全佐剂进行抗原乳化，皮下6点注射，每只小鼠注射的抗原量为100μg。14天后，进行第二次免疫，使用弗氏不完全佐剂乳化抗原，皮下6点注射，每只小鼠注射的抗原量为100μg。14天后，进行第3次免疫，方法同二次免疫。14天后，对小鼠剪尾采集少量血液进行血清效价ELISA检测，选择抗体滴度最高(1:500000)的小鼠进行加强免疫，无需乳化，通过腹腔注射抗原蛋白，每只小鼠注射100μg。
第4次免疫后3～5天，处死小鼠取其脾细胞与SP2/0细胞融合，通过HAT培养基培养获得稳定的杂交瘤细胞。通过ELISA法筛选得到能分泌A-FABP抗体的杂交瘤细胞，通过有限稀释的方法进行亚克隆，筛选得到能分泌A-FABP抗体的单克隆杂交瘤细胞株6C11，通过逐级扩大培养，液氮冻存保种。单克隆杂交瘤细胞株6C11已在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)进行保藏的生物材料：杂交瘤细胞株6C11，其保藏号为CGMCC No.45191，保藏日期为2022年6月16日，分类命名为杂交瘤细胞株(拉丁名Mus musculus)。
制备和纯化腹水抗体：雌性BALB/c小鼠(8周龄)腹腔注射弗氏不完全佐剂，每只小鼠注射0.5ml，3～5天后腹腔注射处于对数生长期的杂交瘤细胞6C11，每只小鼠注射5×105个细胞(0.5ml)。10天后处死小鼠，获得腹水。5000rpm，4℃离心10min，去除沉淀，用10倍体积1×PBS溶液稀释腹水，混匀后过0.45μm滤膜。通过Protein G(Protein G Sepharose4Fast Fl ow,GE Healthcare)亲和纯化腹水，得到纯化的A-FABP抗体。
实施例2 A-FABP蛋白单克隆抗体6C11特异性检验
通过香港因诺诊断公司购买：人A-FABP蛋白(200μg，Cat.No.41030)、小鼠A-FABP蛋白(300μg，Cat.No.42030)、人E-FABP蛋白(100μg，Cat.No.41040)、小鼠E-FABP蛋白(100μg，Cat.No.41030)；通过北京义翘神州公司购买：人H-FABP蛋白(100μg，Cat.No.12476-HNAE)、小鼠H-FABP蛋白(100μg，Cat.No.51233-MNAE)，上述蛋白纯度均>95％。
通过纯化的小鼠或人A-FABP、H-FABP、E-FABP作为包被抗原，以ELISA法进一步检测的A-FABP蛋白单克隆抗体6C11特异性。发现克隆6C11与A-FABP特异性结合，但不与H-FABP或E-FABP结合。详见图1及表1。
表1.A-FABP蛋白单克隆抗体6C11特异性检验
实施例3 A-FABP蛋白单克隆抗体6C11腹水效价检测
6C11杂交瘤细胞腹膜内注射BALB/c小鼠制备腹水。腹腔注射克隆10天后，收集腹水并纯化。通过ELISA法检测抗体效价(包被抗原：A-FABP 1μg/mL)，我们发现亲和纯化的抗体6C11滴度达到1/200,000。详见表2。
表2.A-FABP蛋白单克隆抗体6C11腹水效价检验
| 1/1,000 | 1/2,000 | 1/20,000 | 1/200,000 | FT | NC | |
| 6C11 | NaN | NaN | NaN | 1.448 | 0.761 | 0.007 |
实施例4 A-FABP蛋白单克隆抗体6C11抗体效价检测
进一步使用ELISA法检测，以不同浓度的A-FABP蛋白(包被抗原：A-FABP 1μg/mL、0.5μg/mL、0.05μg/mL、0.005μg/mL、0.0005μg/mL)检测单克隆抗体6C11的敏感性。发现抗体6C11对低浓度A-FABP蛋白敏感性较高。详见表3。
表3.A-FABP蛋白单克隆抗体6C11抗体效价检测
| 1μg/mL | 0.5μg/mL | 0.05μg/mL | 0.005μg/mL | 0.0005μg/mL | NC | |
| 6C11 | 1.474 | 0.742 | 0.215 | 0.05 | 0.008 | 0.012 |
Claims (10)
1.一种分离的特异性结合A-FABP的单克隆抗体6C11或其抗原结合部分，其特征在于，所述单克隆抗体或其抗原结合部分由保藏在CGMCC，具有保藏号CGMCC No.45191的杂交瘤细胞株产生。
2.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株已于2022年6月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.45191。
3.一种检测A-FABP用的组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分。
4.权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分在检测A-FABP在样品中的存在或其表达水平中的用途；
优选地，检测A-FABP在样品中的存在或其表达水平的方法包括ELISA检测方法、Western blot检测方法、流式细胞检测方法、免疫组化检测方法。
5.权利要求1所述的单克隆抗体或抗原结合部分在用于制备检测A-FABP试剂盒或检测试剂中的用途，所述试剂盒或检测试剂用于检测A-FABP在样品中的存在或其表达水平；
优选地，所述试剂盒为ELISA检测试剂盒或Western blot检测试剂盒，所述检测试剂为流式细胞检测试剂或免疫组化检测试剂。
6.一种检测A-FABP用的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分；
优选地，所述单克隆抗体或其抗原结合部分还包括可检测的标记。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含第二抗体，其特异性识别权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分。
8.根据权利要求6-7任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为ELISA检测试剂盒或Western blot检测试剂盒。
9.一种检测试剂，其特征在于，其包括权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分；
优选地，所述单克隆抗体或其抗原结合部分还包括可检测的标记；
优选地，所述细胞检测试剂还包含第二抗体，其特异性识别所述权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分；
优选地，所述检测试剂为免疫组化检测试剂或流式细胞检测试剂。
10.一种检测A-FABP的非诊断和治疗目的的方法，其采用权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分进行；
优选地，所述检测的方法为在ELISA检测、Western blot检测、流式细胞检测、免疫组化检测。
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