CN117338831A - 一种低毒的雷公藤提取物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种低毒的雷公藤提取物及其制备方法与应用,属于医药技术领域。本发明首次提供了一种低毒高效的雷公藤提取物的制备方法,包括如下步骤:将雷公藤属植物乙酸乙酯提取物,减压浓缩得浸膏;将浸膏复溶后进行化学法、酶法或仿生法处理,取滤液调pH至3.5以下,采用聚酰胺柱色谱纯化,取纯化水洗脱液并浓缩,得低毒高效的雷公藤提取物。本发明制备方法简单,经本发明制备方法制备所得的雷公藤提取物活性成分清楚,有效部位明确,抗类风湿性关节炎无明显毒性且药效显著,治疗类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的效果明显优于现有雷公藤制剂,且与现有雷公藤制剂相比无明显毒性。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,尤其涉及一种低毒的雷公藤提取物及其制备方法与应用。
背景技术
类风湿性关节炎是一种主要表现为骨和软骨损伤,涉及多基因、多因素、复杂性的系统性自身免疫性疾病,严重者可导致残疾。相对于免疫抑制剂的巨大市场潜力,抗类风湿性关节炎小分子化学药物的选择存在明显的局限性。FDA近年批准新药中,小分子药物依然占据着绝对优势,但是随着分子类型和分子骨架结构多样性的发现受限,新分子实体小分子创新药物逐年降低。天然产物及其代谢物具有分子结构的多样性,且经过自然选择与进化,其结构的多样性对其用于疾病防御和治疗有着天然的优势,一直是小分子化学药物新药研发的重要来源。
雷公藤属(Tripterygium)植物主要包括雷公藤(Tripterygium wilfordiiHook.f.)、东北雷公藤(Tripterygium regelii Sprague et Takeda)和昆明山海棠(Tripterygium hypoglaucum(Levl.)Hutch)三个物种,在自身免疫性疾病中的用药历史可追溯千年。雷公藤味辛、苦,性寒,有毒,其确切的抗炎、免疫抑制等药理活性,广泛应用于类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的治疗,目前上市中药制剂有42种,临床应用广泛。雷公藤属植物化学成分主要包含倍半萜生物碱类、二萜类及三萜类等成分。其中雷公藤总生物碱含量约0.07-0.29%,该类成分在免疫抑制作用方面具有重要作用。雷公藤倍半萜类生物碱结构特征为一种二氢呋喃型倍半萜,已报道结构主要包含wilfordate/evoninate、hydroxy-wilfordate/evoninate和iso-wilfordate/evoninate三种类型。雷公藤倍半萜生物碱是一类含氧量较高的倍半萜类化合物,结构特征为含有特殊的大环双内酯骨架结构,是由2-(羧烷基)烟酸(2-(carboxyalkyl)nicotinic acid)和多羟基-二氢-贝塔-琼香呋喃倍半萜(polyoxygenated dihydro-beita-agarofuran sesquiterpenoid)两部分组成的内酯。其中倍半萜部分的羟基通常由各种有机酸进行酯化,包括乙酸、苯甲酸、呋喃酸、烟酸和脂肪酸等形成不同类型生物碱;2-(羧烷基)烟酸部分主要来源于炔酸、维生素酸、羟基维生素酸或其同系物,同时2-(羧烷基)烟酸部分的差异即是大环双内酯骨架结构存在差异的核心,也是雷公藤生物碱化学成分结构多样性的核心。
有研究显示,雷公藤的根中存在丰富的3-羧基-α-甲基-2-吡啶丁酸和3-羧基-α-羟基-α-甲基-2-吡啶丁酸,并由BEROZA教授分别命名为wilfordic acid和Hydroxywilfordic acid,两类结构wilfordic acid和Hydroxy wilfordic acid为典型的iVA-NA,区别在于烟酸结构中2号位被不同的异戊酸基结构取代,然而在过去的70年中,关于wilfordic acid和hydroxy wilfordic acid整体研究相对较少,且暂无系统的化学及药理学相关研究。
虽然雷公藤属植物天然活性成分在类风湿性关节炎等自身免疫性疾病中的治疗作用明确,但因活性成分具有潜在的毒副作用、极窄的治疗窗、较差的溶解性、较低的生物利用度而极大地限制其临床应用,所以,本领域亟需提供一种治疗类风湿性关节炎等自身免疫性疾病疗效好、毒性低的雷公藤属植物提取物。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种低毒高效的、能够用于治疗类风湿性关节炎等自身免疫性疾病且疗效显著的雷公藤提取物及其制备方法与应用。
为了实现上述发明目的,本发明提供了以下技术方案:
本发明提供了一种低毒的雷公藤提取物的制备方法,包括如下步骤:将雷公藤属植物乙酸乙酯提取物,减压浓缩得浸膏;将浸膏复溶后进行化学法、酶法或仿生法处理,取滤液调pH至3.5以下,采用聚酰胺柱色谱纯化,收集洗脱液并浓缩,得低毒的雷公藤提取物;所述化学法为添加氢氧化钙并保持pH至11以上;所述酶法为添加酯酶;所述仿生法为添加鼠肠道内容物。
优选的,所述氢氧化钙的添加量按照浸膏重量计为每克浸膏添加0.18-3.6g。
优选的,所述酯酶的添加量按照浸膏重量计为每克浸膏添加1000-100000U。
优选的,所述鼠肠道内容物包括SD大鼠肠道内容物、C57小鼠肠道内容物或昆明小鼠肠道内容物。
优选的,所述鼠肠道内容物的添加量按照浸膏重量计为每克浸膏添加0.5-20ml。
优选的,采用聚酰胺柱色谱纯化时,上样流速为0.1-10倍柱体积/小时,0.5-10倍柱体积纯化水洗脱,洗脱流速为0.1-10倍柱体积/小时,于上样开始收集纯化水洗脱液。
本发明还提供了一种上述制备方法制备所得的雷公藤提取物。
优选的,所述雷公藤提取物包括烟酸、异烟酸、2-(3-羧基丁基)烟酸、4-(3-羧基丁基)烟酸、2-(3-羧基-3-羟基丁基)烟酸、4-(3-羧基-3-羟基丁基)烟酸、2-(3-羧基-2-丁基)烟酸、4-(3-羧基-2-丁基)烟酸、2-(3-羧基-3-羟基-2-丁基)烟酸和4-(3-羧基-3-羟基-2-丁基)烟酸中的一种以上。
本发明还提供了一种上述制备方法或上述雷公藤提取物在制备防治类风湿性关节炎产品中的应用。
本发明还提供了一种防治类风湿性关节炎的药物,所述药物的活性成分包括上述的雷公藤提取物。
本发明的有益效果:
本发明首次提出了一种低毒高效的雷公藤提取物的制备方法,方法简单,经本发明制备方法制备所得的雷公藤提取物活性成分清楚,有效部位明确,抗类风湿性关节炎无明显毒性且药效显著,治疗类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的效果明显优于现有雷公藤制剂,且与现有雷公藤制剂相比无明显毒性。
附图说明
图1为实施例1雷公藤提取物特征图谱;
图2为雷公藤提取物指标性成分化学结构图;
图3为实施例2雷公藤提取物高分辨质谱提取离子流图谱;
图4为实施例3雷公藤提取物高分辨质谱提取离子流图谱;
图5为不同组别对SD大鼠CIA模型关节足肿胀缓解作用结果,其中A为关节指数评分结果,B为关节肿胀度结果;
图6为不同组别对SD大鼠CIA模型关节变形缓解作用X光照片;
图7为2-(3-羧基丁基)烟酸成分药代动力学AUC曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种低毒高效的雷公藤提取物的制备方法,包括如下步骤:将雷公藤属植物乙酸乙酯提取物,减压浓缩得浸膏;将浸膏复溶后进行化学法、酶法或仿生法处理,取滤液调pH至3.5以下,采用聚酰胺柱色谱纯化,收集洗脱液并浓缩,得低毒高效的雷公藤提取物;所述化学法为添加氢氧化钙并保持pH至11以上;所述酶法为添加酯酶;所述仿生法为添加鼠肠道内容物。
在本发明中,“雷公藤提取物”是指在提取物中雷公藤生物碱类成分的化合物是提取物中组成结构上占主要的和发挥主要治疗作用的化学成分,提取物中虽然还可能含有来源于同一种植物的其他成分,但这些其他成分在提取物中通常不是能够有效发挥治疗作用的化学成分,这是由于其含量低于发挥治疗有效作用的阈值或者其本身就不具有所期望的治疗有效作用等。“有效部位”是指从单一种植物中提取的一类或数类成份组成的成分相对明确的提取物,也可以称为有效组分或者是有效中间体(《中药新药质量研究技术指导原则(试行),2021年1月》)。
在本发明中,所述雷公藤属植物优选的包括雷公藤、东北雷公藤和昆明山海棠,本发明对于雷公藤属植物的具体来源没有特殊限定。在本发明中,所述雷公藤属植物乙酸乙酯提取物优选的为采用乙酸乙酯渗漉后所得的雷公藤属植物乙酸乙酯提取物,或进行乙酸乙酯回流提取后所得的雷公藤属植物乙酸乙酯提取物,或进行乙酸乙酯超声提取后所得的雷公藤属植物乙酸乙酯提取物。在本发明中,采用乙酸乙酯渗漉法制备雷公藤属植物乙酸乙酯提取物时,优选的将雷公藤属植物粉碎后再采用乙酸乙酯渗漉,所述乙酸乙酯的用量优选的为雷公藤属植物重量的5-15倍,更优选为10倍,所述雷公藤属植物原料的取材部位优选的为植物的根、根皮、根芯茎或/和叶。所述减压浓缩的条件优选的为58℃减压浓缩至密度1.1-1.7,将浸膏复溶所用的溶剂优选的包括水、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、二氯甲烷、三氯甲烷、乙醚或四氢呋喃,复溶溶剂所用的量优选为每克浸膏10-100ml,更优选为50ml。
在本发明中,所述化学法反应优选的为添加氢氧化钙进行反应,所述氢氧化钙的添加量按照浸膏重量计优选为每克浸膏添加0.18-3.6g,更优选的为0.72g,所述反应的温度优选为25-100℃,更优选的为80℃,所述反应的时间优选为0.5-12小时,更优选的为4小时,所述反应优选为搅拌反应。
在本发明中,所述酶法反应优选的为添加酯酶反应,所述酯酶的添加量按照浸膏重量计优选为每克浸膏添加1000-100000U,更优选的为10000U,所述酯酶优选为猪肝脏来源,酯酶反应的温度优选为35-39℃,更优选为37℃,反应的时间优选为0.5-12h,更优选为4h。
在本发明中,所述仿生法优选的为添加鼠肠道内容物,所述鼠肠道内容物为将大鼠麻醉后解剖,取结肠部位内容物。所述鼠肠道内容物优选的包括SD大鼠肠道内容物、C57小鼠肠道内容物或昆明小鼠肠道内容物,所述鼠肠道内容物的添加量按照浸膏重量计优选为每克浸膏添加0.5-20ml,更优选的为10ml。在本发明中,加入鼠肠道内容物后,优选的还需加入灭菌培养基,所述灭菌培养基为EE肉汤培养基,所述灭菌培养基的添加量按照浸膏重量计优选为每克浸膏添加10-200ml,更优选的为100ml。所述仿生法反应的温度优选为25-39℃,更优选的为37℃,反应的时间优选为0.5-48h,更优选的为12h。
反应结束后,调节滤液pH的溶剂优选为5%硫酸溶液。在本发明中,所述聚酰胺柱优选的为80-100目聚酰胺柱,所述聚酰胺的用量优选为上样体积的五分之一,进行聚酰胺柱色谱纯化时,上样流速优选为0.1-10倍柱体积/小时,更优选为0.5倍柱体积/小时,0.5-10倍柱体积纯化水洗脱,更优选为2倍柱体积纯化水洗脱,洗脱流速优选为0.1-10倍柱体积/小时,更优选为0.5柱体积/小时。在本发明中,于上样开始收集纯化水洗脱液,洗脱液浓缩的条件优选的为65℃减压浓缩。
本发明还提供了一种上述制备方法制备所得的雷公藤提取物。在本发明中,所述雷公藤生物碱提取物优选的包括烟酸、异烟酸、2-(3-羧基丁基)烟酸、4-(3-羧基丁基)烟酸、2-(3-羧基-3-羟基丁基)烟酸、4-(3-羧基-3-羟基丁基)烟酸、2-(3-羧基-2-丁基)烟酸、4-(3-羧基-2-丁基)烟酸、2-(3-羧基-3-羟基-2-丁基)烟酸和4-(3-羧基-3-羟基-2-丁基)烟酸中的一种以上,更优选的包括上述所有。
本发明还提供了一种上述制备方法或上述雷公藤提取物在制备防治类风湿性关节炎产品中的应用。在本发明中,所述产品的种类优选的包括药物。
本发明还提供了一种防治类风湿性关节炎的药物,所述药物的活性成分包括上述的雷公藤提取物。
在本发明所述药物中,优选的以上述雷公藤提取物作为唯一活性成分。所述药物优选的还包括药物辅料,所述药物辅料优选的包括:填充剂、稀释剂、载体、赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、矫味剂、表面活性剂、着色剂、包衣剂、抛射剂或稳定剂。在本发明中,所述药物的剂型优选的包括片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、气雾剂、滴剂或贴剂。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
下述实施例中,如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1
原药材采购于云南德昌,并经重庆市中药研究院瞿显友研究员鉴定为昆明山海棠(Tripterygium hypoglaucum(Levl.)Hutch)。取昆明山海棠去根皮的根,粉碎后过10号标准药典筛,10倍量乙酸乙酯渗漉,待渗漉完全,58℃减压浓缩至密度1.1,得雷公藤乙酸乙酯提取物浸膏;取浸膏无水乙醇复溶,无水乙醇用量为每50ml/g浸膏,加0.72g/100ml氢氧化钙溶液搅拌均匀,并保持pH至11以上,氢氧化钙溶液的用量为每100ml/g浸膏,80℃搅拌4小时,过滤,滤液加5%硫酸溶液调pH至3,过聚酰胺柱色谱纯化,聚酰胺粒度80-100目,聚酰胺用量为上样体积的五分之一用量,上样流速0.5倍柱体积/小时,2倍柱体积纯化水洗脱,洗脱流速为0.5倍柱体积/小时,于上样开始收集纯化水洗脱液并于65℃减压浓缩;浓缩物即为精制纯化得到的雷公藤提取物。
将得到的雷公藤提取物进行HPLC进样分析(条件):使用岛津HPLC系统的紫外检测器和AQ-C18色谱柱(4.6mm×150mm,5μm)。流动相为乙腈(A)和0.1%甲酸溶液(B),梯度洗脱(0–40min,5%-5%A;40–43min,5%–90%A;43–55min,90%–90%A;55–58min,90%–5%A;58–80min,5%–5%A),流速1.0mL/min,柱温30℃,进样量10μL,紫外检测波长262nm,结果如图1所示。
制备色谱分离与纯化,制备色谱采用BUCHI步琦Pure中压快速色谱纯化系统,色谱条件为:AQ-C18色谱柱(20mm×250mm,10μm)。流动相为甲醇(A)和0.2%甲酸溶液(B)(比例:5-95,),等度洗脱,流速10.0mL/min,柱温30℃,紫外检测波长262nm。分离获得的化合物包括烟酸、异烟酸、2-(3-羧基丁基)烟酸(2-(3-carboxybutyl)nicotinic acid)、4-(3-羧基丁基)烟酸(4-(3-carboxybutyl)nicotinic acid)、2-(3-羧基-3-羟基丁基)烟酸(2-(3-carboxy-3-hydroxybutyl)nicotinic acid)、4-(3-羧基-3-羟基丁基)烟酸(4-(3-carboxy-3-hydroxybutyl)nicotinic acid)、2-(3-羧基-2-丁基)烟酸(2-(3-carboxybutan-2-yl)nicotinic acid)、4-(3-羧基-2-丁基)烟酸(4-(3-carboxybutan-2-yl)nicotinic acid)、2-(3-羧基-3-羟基-2-丁基)烟酸(2-(3-carboxy-3-hydroxybutan-2-yl)nicotinic acid)和4-(3-羧基-3-羟基-2-丁基)烟酸(4-(3-carboxy-3-hydroxybutan-2-yl)nicotinic acid)成分,结果见图2。
实施例2
取昆明山海棠(同实施例1)去根皮的根,粉碎后过10号标准药典筛,10倍量乙酸乙酯渗漉,待渗漉完全,58℃减压浓缩至密度1.7,减压浓缩后得雷公藤乙酸乙酯提取物浸膏;取浸膏无水乙醇复溶,无水乙醇用量为每50ml/g浸膏,加酯酶(Sigma,46058-50MG-F)孵育,酯酶加入量为10000U/g浸膏,37℃反应4小时,过滤,滤液加5%硫酸溶液调pH至3,过聚酰胺柱色谱纯化,聚酰胺粒度80-100目,聚酰胺用量为上样体积的五分之一用量,上样流速0.5倍柱体积/小时,2倍柱体积纯化水洗脱,洗脱流速为0.5倍柱体积/小时,于上样开始收集纯化水洗脱液并于65℃减压浓缩;浓缩物即为精制纯化得到的雷公藤提取物。
雷公藤提取物样品甲醇稀释,12000rpm离心10min,过0.22μm滤膜过滤后,经Q-TOF/MS(AB SCIEX 4600高分辨质谱系统)分析,采用ESI-Production-IDA采集模式进行数据采集并获得高分辨质谱提取离子流图谱,结果如图3所示。
实施例3
取昆明山海棠(同实施例1)去根皮的根,粉碎后过10号标准药典筛,10倍量乙酸乙酯渗漉,待渗漉完全,58℃减压浓缩至密度1.5,减压浓缩后得雷公藤乙酸乙酯提取物浸膏;取浸膏无水乙醇复溶,无水乙醇用量为每50ml/g浸膏,加SD大鼠肠道内容物孵育(SD大鼠麻醉后解剖,取结肠部位内容物)。大鼠肠道内容物加入量为10ml/g浸膏,加入灭菌培养基(EE肉汤)100ml/g浸膏,37℃反应4小时,过滤,滤液加5%硫酸溶液调pH至3,过聚酰胺柱色谱纯化,聚酰胺粒度80-100目,聚酰胺用量为上样体积的五分之一用量,上样流速0.5倍柱体积/小时,2倍柱体积纯化水洗脱,洗脱流速为0.5倍柱体积/小时,从上样开始收集纯化水洗脱液并于65℃减压浓缩;浓缩物即为精制纯化得到的雷公藤提取物。
雷公藤提取物样品甲醇稀释,12000rpm离心10min,过0.22μm滤膜过滤后,经Q-TOF/MS(AB SCIEX 4600高分辨质谱系统)分析,采用ESI-Production-IDA采集模式进行数据采集并获得高分辨质谱提取离子流图谱,结果如图4所示。
实施例4
实施例1所得雷公藤提取物对SD大鼠CIA模型足肿胀缓解作用
CIA诱导的SD大鼠类风湿关节炎模型:取胶原蛋白(鸡)20.9mg溶解于0.1mol/L冰醋酸溶液5.225mL中,置于4℃冰箱内过夜,即得4mg/mL胶原蛋白(鸡)溶液。再取78.5mg灭活的BCG干粉,置于无菌的研钵中,加入4.107mL完全弗氏佐剂充分研磨、混匀,置于细胞超声波内设置频率10%,超声时间2s,暂停5s,重复超声操作,直到BCG变成小颗粒状,基本均匀,置于75℃水浴条件下2h,制成20mg/mL的弗氏完全佐剂。取4mg/mL CCII胶原浴液(3.3mL)与等体积20mg/mL的FCA(3.3mL)于超声波细胞粉碎机10%频率混合、乳化,制成2mg/mL的胶原蛋白+10mg/mL FCA的混合乳化剂,乳化过程保持胶原冰冷(提前准备好冰袋或碎冰)。初次免疫:注射:大鼠右后足趾皮内注射混合乳化剂0.1mL/只。加强免疫:注射:大鼠右后足趾注射混合乳化剂0.1mL/只。定期采用肿胀度测定仪测定CIA诱导的SD类风湿关节炎大鼠的足容积。
将未进行造模的小鼠作为正常对照组,选择造模型成功的大鼠随机分为三组,分别记为模型组(CIV组)、甲氨蝶呤组(CIV+甲氨蝶呤组)和雷公藤提取物组(CIV+iVA-NA组),其中iVA-NA给药剂量为3.75g生药/kg,灌胃,每日一次,连续给药42天。甲氨蝶呤给药剂量:第一阶段:2.4mg/kg体重,腹腔注射,每周3次,连续12天,大鼠死亡3只;第二阶段:停药7天;第三阶段:1.2mg/kg体重,腹腔注射,给药1次间隔2天,连续23天,治疗周期为42天。正常对照组、模型对照组给予相应体积的0.5%CMC-Na溶液,给药体积为1mL/100g体重。
给药开始前和给药结束后统计各组关节指数评分和关节肿胀度。
关节指数评分:给药前(第0天)和给药第7、14、21、42天根据大鼠前后肢踝关节、趾关节红肿程度及受影响关节指数进行评分。0分:正常;1分:1个关节红肿;2分:2个及2个以上关节红肿;3分:踝关节以下足掌严重红肿;4分:包括踝关节在内的全部足爪红肿且不能负重。四肢分别进行评分,累计总和即为关节指数。
关节肿胀度:采用肿胀度测定仪测定大鼠足容积,并记录大鼠足容积值,关节肿胀度以关节肿胀百分率表示,关节肿胀百分率=(给药后大鼠足容积-造模前大鼠足容积)/造模前大鼠足容积×100%。关节肿胀百分率大于10%即为模型构建成功。
结果如图5所示。
给药结束后各组动物进行X光拍照,结果见图6。给药后模型组大鼠关节变形明显改善,结果可见,本发明制备所得的雷公藤提取物对类风湿性关节炎具有显著治疗效果。
实施例5
2-(3-羧基丁基)烟酸成分的药代动力学分析
取SD大鼠,全雄,分为3组,每组3只,即高剂量组、中剂量组、低剂量组。将配制好的供试品溶液按12(高剂量组、高浓度组)、6(中剂量组、中浓度组)、3(低剂量组、低浓度组)mg·Kg-1单次灌胃给予,给药前采集空白血样,灌胃后于0.5、1、1.5、2、3、6、8、24h前臂头静脉采血,约取1.5ml全血置于入肝素钠抗凝管中,3000r·min-1离心10min,分离血浆,再分为两管(一管取50μL,剩余血浆放置于另一管,备用),-80℃冷冻保存备用。精密吸取50μL混合空白血浆于1.5mLEP管中,精密加入水20μL,涡旋混匀30s后加入甲醇-乙腈(1:1,v/v)溶液400μL,涡旋混匀2min,12000rpm离心15min,取上清400μL于EP管中。处理后样品采用LC-MS-MS仪器进行血浆样品目标成分定量分析,血浆样品含量测定结果通过DAS3.0药代动力学软件进行药代动力学参数检测,结果如表1和图7所示,结果显示,相应给药剂量范围内,2-(3-羧基丁基)烟酸给药剂量与AUC参数呈明显正相关性。
表1药代动力学参数
注:L01,L02,L03为低剂量组,M01,M02,M03为中剂量组,H01,H02,H03为高剂量组。
实施例6
雷公藤提取物急性毒性试验
样品制备按实施例1所示方法制备,获得提取物按照单次给药毒性试验进行。6周龄KM小鼠,全雄,18-22g。试验动物提供单位为北京维通利华实验动物技术有限公司(生产许可证号:SCXK(京)2016-0006),实验动物合格证号:No.110011210100421925,质量检测单位为北京维通利华实验动物技术有限公司。试验动物SPF环境饲养(重庆市南岸区黄桷垭南山路34号,SYXK(渝)2022-0005),温度:20.5~24.5℃,湿度:41~69%,实验设施检测由重庆市实验动物质量检测中心检测,符合GB 14925-2010标准普通环境要求。动物购入后,动物管理部按订购标准验收动物,对验收合格的动物采用耳标在动物左耳进行唯一标记,同时进入检疫及适应性饲养,动物检疫及适应性饲养7天。试验动物使用SPF大小鼠维持饲料(批号21043213,北京科澳协力饲料有限公司)饲养,每日供应充足,由大鼠自由摄取,饲料生产许可证号:SCXK(京)2019-0003,饲料成分检测由生产厂家提供饲料成分检测报告,符合GB 14924.3-2010、GB/T 18823-2010、GB/T14924.2-2001、GB/T14924.1-2001标准要求。饲养饮用水为纯化水,瓶装,每日更换水瓶,由大鼠自由摄取,水质检测经重庆市南岸区疾病预防控制中心检测,符合GB 5749-2006标准要求。采用单次给药毒性试验进行雷公藤药材不同提取部位急性毒性试验,以预实验引起受试动物全部死亡的剂量为最高剂量,分别设置不同剂量范围,以14天为最长观察期限,通过急性经口毒性试验和LD50的测定可评价受试物的毒性。
结果显示,实施例1所得雷公藤提取物在500g生药Kg的给药剂量下未表现出毒性作用,通过查阅文献比较,火把花根药材临床推荐用量1.5-3g(火把花根-四川省中药材标准(2010年版)),雷公藤药材临床推荐用量6-12g(雷公藤-山东省中药材标准(2022年公示)),前期研究结果显示,火把花根灌胃给药的LD50为136.38g生药/kg,其95%的可信限为123.06~152.51g生药/kg,本发明雷公藤提取物用量远远大于临床推荐剂量时仍未表现明显毒性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种低毒的雷公藤提取物的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:将雷公藤属植物乙酸乙酯提取物,减压浓缩得浸膏;将浸膏复溶后进行化学法、酶法或仿生法处理,取滤液调pH至3.5以下,采用聚酰胺柱色谱纯化,收集洗脱液并浓缩,得低毒的雷公藤提取物;所述化学法为添加氢氧化钙并保持pH至11以上;所述酶法为添加酯酶;所述仿生法为添加鼠肠道内容物。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述氢氧化钙的添加量按照浸膏重量计为每克浸膏添加0.18-3.6g。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述酯酶的添加量按照浸膏重量计为每克浸膏添加1000-100000U。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述鼠肠道内容物包括SD大鼠肠道内容物、C57小鼠肠道内容物或昆明小鼠肠道内容物。
5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述鼠肠道内容物的添加量按照浸膏重量计为每克浸膏添加0.5-20ml。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,采用聚酰胺柱色谱纯化时,上样流速为0.1-10倍柱体积/小时,0.5-10倍柱体积纯化水洗脱,洗脱流速为0.1-10倍柱体积/小时,于上样开始收集纯化水洗脱液。
7.权利要求1-6任意一项所述制备方法制备所得的雷公藤提取物。
8.根据权利要求7所述的雷公藤提取物,其特征在于,所述雷公藤提取物包括烟酸、异烟酸、2-(3-羧基丁基)烟酸、4-(3-羧基丁基)烟酸、2-(3-羧基-3-羟基丁基)烟酸、4-(3-羧基-3-羟基丁基)烟酸、2-(3-羧基-2-丁基)烟酸、4-(3-羧基-2-丁基)烟酸、2-(3-羧基-3-羟基-2-丁基)烟酸和4-(3-羧基-3-羟基-2-丁基)烟酸中的一种以上。
9.权利要求1-6任意一项所述制备方法或权利要求7-8任意一项所述雷公藤提取物在制备防治类风湿性关节炎产品中的应用。
10.一种防治类风湿性关节炎的药物,其特征在于,所述药物的活性成分包括权利要求7或8所述的雷公藤提取物。
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