CN117338780A - 帕罗西汀在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种帕罗西汀或其药用盐在制备抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤选自结直肠癌。本发明还公开了一种帕罗西汀或其药用盐与CTLA4抗体联用在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明首次发现盐酸帕罗西汀能通过降低结肠细胞上PD‑L1的表达，发挥免疫抗肿瘤作用。本发明在细胞水平上验证PAR降低PD‑L1的表达水平，在细胞水平上验证PAR能增强T细胞的体外杀伤能力，动物水平上验证PAR及PAR与CTLA4抗体联用的免疫杀伤能力。

Description

帕罗西汀在制备抗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体地说，涉及一种帕罗西汀在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
盐酸帕罗西汀(Paroxetine hydrochloride，PAR)为抗抑郁药，通过选择性抑制5-HT的再摄取，增加突触间隙5-HT浓度，从而增强中枢5-HT能神经功能，发挥抗抑郁作用。目前通过盐酸帕罗西汀抗肿瘤的研究鲜有报道。
PD-1(programmed cell death protein 1，程序性死亡受体1)是一种重要的免疫抑制分子，为免疫球蛋白超家族。其最初是从凋亡的小鼠T细胞杂交瘤2B4.11克隆出来。以PD-1为靶点的免疫调节对抗肿瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等均有重要的意义。其配体PD-L1也可作为靶点，相应的抗体也可以起到相同的作用。PD-1及其配体PD-L1的结合可抑制T细胞活化而引起自身免疫功能的下调。阻断PD-1/PD-L1可以重新激活细胞毒性T细胞对肿瘤的杀伤作用，是一种重要的肿瘤免疫治疗方式。PD-1/PD-L1免疫疗法，能够治疗多种类型的肿瘤疾病，有效改善患者的总生存期给肿瘤治疗带来划时代的变革。但在临床实践过程中发现，PD-1/PD-L1疗法虽然卓有成效，但个体差异却很大，部分患者获得了显著的效果，还有部分患者无效。并且肿瘤细胞中PD-L1表达可能影响PD-1/PD-L1相关免疫检查点治疗的临床药效。如果从转录调控途径降低肿瘤细胞膜上PD-L1的表达，从根本上阻断PD-L1与PD-1的结合，可以给病人减少副作用，即靶向调控肿瘤细胞PD-L1表达的小分子有可能成为一种新的治疗方式，因此寻找能降低PD-L1表达的小分子将成为免疫治疗过程中的新方案。
近年来，免疫治疗由于其良好的抗肿瘤效果而在临床应用中得到快速发展和更多关注，这进一步为CRC提供了动力。与传统治疗相比，免疫治疗可以通过激活抗肿瘤免疫力来杀死癌细胞，并且专门针对癌细胞抗原以防止正常细胞遭受攻击。其中程序性细胞死亡蛋白1是激活T细胞表达和介导免疫抑制的最重要的受体，而程序性细胞死亡配体1(PD-L1)参与了程序性细胞死亡1(PD-1)，导致T细胞凋亡或无功能。因此，PD-1/PD-L1抑制剂可以阻止T细胞凋亡和功能障碍，进一步增强T细胞的活化。抗肿瘤免疫过程主要包括免疫消除、免疫平衡和免疫逃逸。PD-1和PD-L1是一对重要的免疫检查点(ICs)，它们在免疫系统中起到制动器的作用，在肿瘤免疫逃逸过程中发挥关键作用。PD-1和PD-L1结合后，肿瘤细胞利用T细胞受体的识别，进一步抑制免疫并逃避免疫监视。2002年，首次报道了PD-1通路介导肿瘤免疫的证据，即PD-L1的过表达会削弱T细胞的溶解活性，从而显著促进肿瘤的发生和侵袭。有趣的是，通过应用针对PD-L1的单克隆抗体，这种效应可以被逆转。PD-L1在许多肿瘤细胞表面高度表达。它还能诱导免疫细胞(尤其是T辅助淋巴细胞，即Th细胞)分泌免疫抑制因子，并进一步抑制抗肿瘤免疫的杀伤效应。抗PD-1/PD-L1治疗可以与PD-1和PD-L1相应地结合，进一步阻止T细胞表面的PD-1与肿瘤细胞表面的PD-L1结合。这种功能可以逆转肿瘤细胞对免疫系统的抑制作用，并恢复抗肿瘤免疫。高表达的PD-L1与靶向PD-1/PD-L1的治疗的反应增强有关，然而目前仅有少数患者因此获益。PD-1/PD-L1免疫治疗药也有各种副作用和不良反应。随着PD-1/PD-L1免疫治疗药在临床应用的时间越来越长，这类抗癌药的副作用和不良反应也越来越明确。PD-1抗癌药的免疫副作用，可分为两大类，一是常见副作用，二是罕见副作用。常见的副作用有4种：1、皮肤毒性是最常见的免疫相关副作用，1/3患者都会遇到，但绝大多数都比较轻微，容易管理。其中斑丘疹和瘙痒较多，而苔藓病、湿疹、牛皮癣之类也可能发生。2、消化道毒性也是很常见的免疫治疗产生的副作用，20％左右患者会遇到，其中腹泻最常见。3、肝毒性也是比较经典的免疫副作用，一般在治疗开始后6-14周出现。临床表现为转氨酶显著升高，大部分患者还会发烧，发生率大约5％。4、肺毒性最常见的是肺炎，单独用PD-1药物的时候，发生率不高，严重副作用比例不到1％。但随着更复杂的治疗，尤其是各种组合疗法使用，肺炎发生率在逐步增加。而PD-1抗癌药罕见的副作用主要有心血管毒性、血液毒性、肾脏毒性、神经毒性、眼毒性、骨骼肌肉毒性等。
发明内容
本发明的目的是提供一种帕罗西汀或其药用盐在制备抗肿瘤药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一方面，提供了一种帕罗西汀或其药用盐在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述肿瘤选自结直肠癌。
所述药用盐是帕罗西汀与下列酸形成的酸加成盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、乳酸、柠檬酸、磷酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、萘磺酸、酒石酸、丙酮酸、乙酸、马来酸或琥珀酸、富马酸、水杨酸、苯基乙酸或杏仁酸。
本发明的第二方面，提供了一种帕罗西汀或其药用盐作为PD-L1抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述肿瘤选自结直肠癌。
本发明中，帕罗西汀或其药用盐作为PD-L1抑制剂促进癌细胞中PD-L1的溶酶体降解，激活T细胞免疫，发挥抗癌作用，目前未有相关报道。正常状况下，PD-1/PD-L1抑制性共刺激信号的主要作用是：防止T细胞不受控制地过度活化攻击正常细胞。而肿瘤细胞表面表达高水平的PD-L1通过与T细胞表面的PD-1结合，抑制T细胞功能和促进T细胞衰竭，使肿瘤细胞逃避T细胞免疫攻击。本发明中的帕罗西汀或其药用盐是作为PD-L1抑制剂阻止肿瘤细胞免疫逃逸，其作用原理与PD-1抗体和PD-L1抗体是一致的，但CTLA4通过与抗原细胞表面的受体结合，终止免疫反应。CTLA4抗体则通过抑制CTLA-4分子使T细胞大量增殖、攻击肿瘤细胞。因此，选择CTLA4抗体与帕罗西汀或其药用盐联合应用。
本发明的第三方面，提供了一种帕罗西汀或其药用盐与CTLA4抗体联用在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述肿瘤选自结直肠癌。
本发明的第四方面，提供了一种药物制剂，所述药物制剂是由帕罗西汀或其药用盐与CTLA4抗体联用制成。
由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：
本发明首次发现盐酸帕罗西汀能通过降低结肠细胞上PD-L1的表达，发挥免疫抗肿瘤作用。本发明在细胞水平上验证PAR降低PD-L1的表达水平，在细胞水平上验证PAR能增强T细胞的体外杀伤能力，动物水平上验证PAR及PAR与CTLA4抗体联用的免疫杀伤能力。
本发明首次发现，PAR除了抗抑郁作用外还具有免疫抗肿瘤作用；PAR对正常细胞没有毒性；PAR可以降低肿瘤细胞PD-L1的表达；PAR能增强T细胞杀伤肿瘤细胞的能力；PAR与CTLA4抗体联用能发挥更好的抗肿瘤作用。
本发明首次发现PAR能通过降低肿瘤细胞PD-L1发挥抗肿瘤活性，且PAR与CTLA4抗体联用发挥了更好的抗肿瘤作用，并且对正常上皮细胞及动物上展现出极小的毒性，可以在临床上作为组合药物抗肿瘤使用，并通过使用发现对结直肠癌细胞处理后，能使T细胞对肿瘤细胞具有显著的杀伤效果，因此PAR与抗体联用有望成为肿瘤治疗的新的有效手段。
为了研究了PAR与CTLA4抗体联合是否具有协同抗肿瘤作用，本发明在C57BL/6J(雌)的小鼠皮下接种MC38，使用玉米油、PAR(20mg/kg)、anti-PD-1(100ug/只)、anti-CTLA4(100ug/只)及PAR联合anti-CTLA4的方式对小鼠进行治疗。结果显示，与单独使用PAR或单独使用anti-CTLA4相比，PAR和anti-CTLA4联合治疗后，肿瘤的生长速率和体积进一步改善。
附图说明
图1是RKO和MC38细胞用CCK8试剂盒检测细胞活力的结果示意图。
图2是RKO和MC38细胞用EDU试剂盒检测细胞增殖的效果示意图。
图3是PAR降低RKO和MC38细胞上PD-L1表达的示意图。
图4是流式细胞术检测结肠癌细胞膜上PD-L1的表达的示意图。
图5是免疫荧光检测PAR对癌细胞膜上PD-L1的下调作用结果示意图。
图6是结晶紫染色法测定PAR增强T细胞的体外杀伤作用结果示意图。
图7为对照组、PAR(10和20mg/kg)在C57荷瘤小鼠上的抗肿瘤效果示意图。
图8为对照组和PAR(20mg/kg)在荷瘤裸鼠上的抗肿瘤效果示意图。
图9为PAR与CTLA4抗体联合使用在C57小鼠上的抗肿瘤效果示意图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1
PAR体外对结直肠癌细胞增殖作用的研究
1.1实验材料：
结直肠细胞株及其培养：人结直肠癌细胞RKO及鼠结直肠癌细胞MC38均购自中科院生化细胞研究所。细胞分别培养于含10％胎牛血清(Biological Industries)的MEM和DMEM(MeilunBio)培养基中，在37℃、5％CO2条件下培养。化合物PAR购自MCE公司(货号：HY-B0492)；CCK8购自日本同仁(货号：CK04)；EdU(C0071S)试剂盒及DMSO(ST1276)等均为碧云天公司产品。
1.2实验方法
化合物PAR对上述肿瘤细胞株的细胞毒性通过CCK8和EdU法测得。CCK8和EdU方法具体步骤如下：
1.样品制备：将化合物溶解于二甲亚砜中，得到浓度为10μM的溶液；
2.细胞经胰酶消化并洗涤后悬浮于含10％胎牛血清的MEM培养基中，经台盼蓝染色排除法计活细胞数，并调节细胞悬浮液密度至1×105个/mL；。
3.在平底96孔板中，每孔加入100微升细胞，每孔中细胞总数为5×103。而平底12孔板中，每孔1毫升细胞，每孔中细胞总数为2.5×105，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养过夜；
4.每孔加入5微升以细胞生长培养基稀释的样品，使反应终浓度分别为1、5和10μM。将相应量的DMSO加入不加药的细胞中作为对照，不加药物及DMSO的含细胞孔作为背景。
每点作三个平行测试；
5.将加药细胞在37℃、5％CO2细胞培养箱中保温24小时，之后分别进行CCK8和EdU检测；
6.CCK8检测：每孔中加入10μl CCK8溶液，继续在培养箱中保温2小时，之后在450nm的波长下用用酶标仪检测，通过如下公式计算细胞活力：细胞活力(％)＝(测量值-空白值)/(对照值-空白值)×100％。
7.EdU检测：每孔中加入10μl EdU溶液，继续在培养箱中保温2小时，生成的绿色荧光在488nm的波长下用高内涵拍照，通过ImageJ软件统计绿色荧光的强弱并计算对各肿瘤细胞的增殖作用的影响。
1.3实验结果
1.3.1CCK8检测结直肠癌细胞活力
RKO和MC38细胞经PAR处理24小时后，加入CCK8检测细胞结肠癌细胞的活力，结果如图1所示，图1是RKO和MC38细胞用CCK8试剂盒检测细胞活力的结果示意图。PAR在1μM、5μM和10μM时对结直肠癌细胞处理24小时后，CCK8结果显示PAR对结直肠癌细胞(RKO和MC38)的活力几乎没有影响。PAR对RKO细胞几乎没有毒性，对MC38细胞有轻微毒性，但不影响后续免疫实验的进行。提示PAR抗结直肠癌不是直接通过杀伤作用实现。
1.3.2EDU检测结直肠癌细胞的毒性
经EdU剂盒处理后，增殖的细胞在荧光显微镜下呈现非常明亮的绿色荧光，如果药物对细胞有抑制作用，荧光会减弱。结果如图2所示，图2是RKO和MC38细胞用EDU试剂盒检测细胞增殖的效果示意图。EdU(10μM)孵育2小时对照组有明亮的绿色荧光，且PAR在5μM、10μM和20μM时对结直肠癌细胞处理24小时后，绿色荧光无显著变化，说明PAR对结直肠癌细胞(RKO和MC38)几乎没有毒性。各个浓度的PAR对RKO和MC38显示的荧光没有明显的差异，提示其分别对结直肠癌细胞(RKO和MC38)没有明显的毒性。本发明选取结肠癌细胞(RKO和MC38)为例，对PAR通过降低肿瘤细胞PD-L1的表达进而达到抗肿瘤活性作进一步说明。
实施例2
PAR降低结肠癌细胞PD-L1作用研究
2.1实验材料：
结直肠细胞株及其培养：人结直肠癌细胞RKO及鼠结直肠癌细胞MC38均购自中科院生化细胞研究所。细胞分别于含10％胎牛血清(Biological Industries)的RPMI-MEM(MeilunBio)及DMEM(MeilunBio)培养基中，在37℃、5％CO2条件下培养。PD-L1抗体购自Abcam公司，货号ab203103；BCA试剂盒购自碧云天公司(P0009)。
2.2实验方法
2.2.1蛋白质免疫印迹实验
将生长状态良好，密度在80％以上的RKO和MC38细胞用于进行铺板。将5×105细胞/孔混悬液铺到六孔板中，每孔混悬液体积为2mL。将铺好细胞的六孔板放于37℃培养箱中进行培养。培养至细胞完全贴壁后，PAR按1、5、10μM进行给药。并继续培养24h后，终止培养用于实验。
将收集的细胞用冷PBS洗涤2次，待PBS残留除尽后，结合不同培养板及实际细胞数量级加入相应量的加有PMSF的裂解缓冲液，在冰上孵育15min，于4℃离心机上12000rpm离心15min，轻轻吸取上清，转移至新预冷的离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀。并用BCA法进行蛋白定量，蛋白变性一般使用5×SDS凝胶还原型加样缓冲液(5×LoadingBuffer)，与样本1：4混合后在95℃下金属浴锅中孵育10min，待其冷却后将样品放于-20℃保存。
制备好的蛋白样品根据蛋白分子量的大小，选择相应的蛋白胶进行电泳实验，开始时，用80V电压进行样品浓缩，待样品完全跑出浓缩胶，且marker上的分子量完全分开后，把电压调至120V，当所需要的目的蛋白分开后，停止电泳并用甲醇预处理的PVDF膜进行转模，在冰浴中，300mA恒流2h。待转膜结束后，用5％脱脂牛奶溶液室温封闭1h，之后用TBST溶液洗涤三次，每次5min。用相应的一抗(PD-L1)在4℃冰箱孵育18h。一抗孵育结束后用TBST洗涤三次，之后再用相应的二抗室温孵育1h，最后将膜用TBST洗涤三次，用仪器检测相应的蛋白条带。
2.3实验结果
PAR按1μM、2μM、5μM和10μM处理RKO和MC38细胞24h，结果显示PAR能以浓度依赖性方式降低PD-L1的表达。结果如图3所示，图3是PAR降低RKO和MC38细胞上PD-L1表达的示意图。PAR在1μM、2μM、5μM和10μM时能剂量依赖性的降低结直肠癌细胞(RKO和MC38)中的PD-L1的表达。
实施例3
流式细胞术检测PAR对癌细胞膜上PD-L1的下调作用
3.1实验材料：
人结直肠细胞株及其培养：结直肠癌细胞HCT116、MC38及RKO等细胞均购自中科院生化细胞研究所。细胞于含10％胎牛血清(Biological Industries)的MEM(MeilunBio)培养基中，在37℃、5％CO2条件下培养。所用的流式抗体购自Biolegend，包括鼠源PD-L1抗体和人源PD-L1抗体，货号分别为124307和329706。
3.2实验方法
3.2.1流式细胞术检测肿瘤细胞膜表明PD-L1丰度
将处于生长对数期的癌细胞以2.5×105个/mL的密度接种于6孔板中，每孔2mL，放入细胞培养箱孵育过夜，吸去培养液，加入PAR处理24h，随后去掉培养基，用EP管收集用胰酶消化的细胞，在离心机中1200rpm，4℃离心3min，去上清，用预冷的PBS洗涤细胞2次，再在4℃下以1200rpm的转速离心3min。去上清，每管中加入100μL经PBS稀释的PE anti-humanCD274抗体或PE anti-mouse CD274抗体于4℃孵育30min。孵育结束后，加400μL的PBS洗涤，1200rpm，4℃离心3min。去上清，加入500μL PBS重悬细胞并转移至流式管中，再在流式细胞仪中进行检测。
3.3实验结果
由于Western Blot结果表示的是化合物对胞浆和膜上PD-L1总蛋白的影响，而免疫检查点抑制剂通过阻断PD-1和PD-L1结合发挥作用，主要通过膜上受体起作用，所以只有PAR能降低膜上蛋白才能用于免疫治疗，本发明用流式方法检测了PAR作用RKO、MC38和HCT116细胞后，细胞膜上PD-L1的表达，结果如图4所示，图4是流式细胞术检测结肠癌细胞膜上PD-L1的表达的示意图。PAR呈浓度依赖性(1μM、5μM、15μM和20μM)降低结肠癌细胞细胞膜上PD-L1的表达。
实施例4
免疫荧光检测PAR对癌细胞膜上PD-L1的下调作用
4.1实验材料：
结直肠细胞株及其培养：人结直肠癌细胞DLD1及鼠结直肠癌细胞MC38均购自中科院生化细胞研究所。细胞分别于含10％胎牛血清(Biological Industries)的RPMI1640和DMEM(MeilunBio)培养基中，在37℃、5％CO2条件下培养；免疫荧光anti-PD-L1抗体购买自Proteintech公司(货号：66248-1-Ig)。
4.2实验方法
4.2.1免疫荧光检测癌细胞膜上PD-L1的表达
1.细胞培养及洗涤：将状态良好的癌细胞以2.5×105个细胞每孔的密度接种于12孔板中，每孔1mL，放入细胞培养基中至细胞完全贴壁，加入PAR处理24h，去上清，PBS洗3遍；
2.固定与封闭：用4％多聚甲醛溶液在培养板中固定细胞15min，去除固定液，PBS洗3次，每次5min，向12孔板的样品孔中加入5％BSA封闭1h，PBS洗2遍；
3.一抗孵育：加入稀释后的PD-L1一抗，4℃过夜孵育；
4.清洗：用TBST洗3遍，每次5分钟；
5.二抗孵育：最后加入红色荧光抗体在室温下避光孵育1h，拍照前加入DAPI染色10min；
6.清洗：去除二抗工作液，用缓冲液TBST洗涤3次，每次5分钟；
7.激光共聚焦拍照后分析结果。
4.3实验结果
免疫荧光中红色的强弱代表细胞膜上PD-L1表达的高低，荧光越强表明PD-L1的表达越高，荧光越弱则表明PD-L1的表达越弱。结果如图5所示，图5是免疫荧光检测PAR对癌细胞膜上PD-L1的下调作用结果示意图。免疫荧光结果显示，PAR处理结直肠癌细胞后，免疫荧光染色的红色可以呈现PD-L1的表达。PAR处理后，红色荧光丰度呈剂量依赖性(5μM、10μM、15μM和20μM)的减弱，表明PAR呈浓度依赖性降低结肠癌细胞细胞膜上PD-L1的表达。
实施例5
PAR在体外增强T细胞对结肠癌细胞RKO的杀伤作用的研究
5.1实验材料：
人结直肠细胞株及其培养：结直肠癌细胞RKO购自中科院生化细胞研究所。细胞于含10％胎牛血清(Biological Industries)的MEM培养基(购自MeilunBio)中，在37℃、5％CO2条件下培养；NK-92细胞购自ATCC，细胞培养与专门的NK细胞培养基中(上海旭和生物，货号：s-22)。结晶紫溶液购自碧云天(货号：C0121)。
5.2实验方法
化合物PAR对上述肿瘤细胞株的体外杀伤通过NK-92法测得，具体步骤如下：
1.样品制备：将化合物PAR溶解于二甲亚砜中，得到浓度为10μM的溶液；
2.细胞经胰酶消化并洗涤后悬浮于含10％胎牛血清的MEM培养基中，经胎盘蓝染色排除法计活细胞数，并调节细胞悬浮液密度至1×105个细胞/mL；
3.在平底12孔板中，每孔加入100微升细胞，每孔中细胞总数为3×104个。于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养过夜；
4.每孔加入5微升以细胞生长培养基稀释的样品，使反应终浓度分别为1、5和10μM；将相应量的DMSO加入不加药的细胞中作为对照，不加药物及DMSO的含细胞孔作为背景，每点作三个平行测试；
5.将加药细胞在37℃、5％CO2细胞培养箱中保温24小时；
6.按1:0.5加入NK-92细胞，培养适量时间，期间注意观察杀伤情况，以免太过；
7.去上清，PBS清洗3遍，4％多聚甲醛固定细胞。之后再用PBS清洗3遍，加入结晶紫染色30min，最后用PBS洗去多余的结晶紫；
8.拍照收集数据，并通过ImageJ软件统计结晶紫的强弱做出统计分析。
5.3实验结果
为了研究PAR在T细胞介导的肿瘤细胞杀伤中的作用，将RKO细胞与活化的NK-92细胞共培养，用结晶紫染色法测定存活的肿瘤细胞来评价PAR的抗肿瘤作用。结果如图6所示，图6是结晶紫染色法测定PAR增强T细胞的体外杀伤作用结果示意图。PAR处理结直肠癌细胞24h后，首先下调结直肠癌细胞中PD-L1的表达，之后检测T细胞的杀伤能力。结果显示PAR处理结直肠癌细胞后增强T(NK92)细胞对结直肠癌细胞RKO的杀伤作用。与对照组相比，PAR处理显著降低了RKO细胞的存活率，并诱导了细胞的凋亡。这些结果表明，PAR通过下调结肠癌细胞中PD-L1的表达增强T细胞对癌细胞的细胞毒性，并且在5μM、10μM和20μM时成浓度依赖性。
实施例6
PAR在体内的抗肿瘤作用
6.1实验材料：
肿瘤株：小鼠结直肠癌细胞(MC38)购自中科院生化细胞研究所。细胞于含10％胎牛血清(Biological Industries)的DMEM(MeilunBio)培养基中，在37℃、5％CO2条件下培养并传代。
动物：C57BL/6J小鼠(雌)购自上海吉辉实验动物饲养有限公司，合格证号：(20220009004717)。
其他试剂：化合物Paroxetine hydrochloride(货号HY-B0492)购自MedChemExpress(MCE)；DMSO(批号：20030415)为上海化学试剂公司产品；玉米油(金太阳粮油有限公司)。
样品：PAR用10％玉米油剂量的DMSO和玉米油溶解。
6.2实验方法
将结肠癌细胞MC38接种于6-8周龄雌性C57BL/6J小鼠(1×106cell/只)建立皮下瘤模型。肿瘤体积达到50mm3后，将小鼠分为3组：(1)对照组；(2)低PAR(10mg/kg)组；(3)高PAR(20mg/kg)组。每一天测量一次小鼠肿瘤的体积。肿瘤体积计算公式为：肿瘤体积(mm3)＝(长)×(宽)2×1/2。给药18天后处死小鼠，解剖肿瘤。
6.3实验结果
结果如图7所示，图7为对照组、PAR(10和20mg/kg)在C57荷瘤小鼠上的抗肿瘤效果示意图。20mg/kg的抗肿瘤效果最好。其中，A是3组分别治疗后，小鼠实际肿瘤的照片示意图。B是对照组及各个治疗组肿瘤体积曲线示意图。C是对照组及各个治疗组肿瘤重量示意图。D是对照组及各个治疗组小鼠体重变化示意图。从图中可以看出，A中PAR(20mg/kg)在C57荷瘤小鼠上的抗肿瘤效果最好。图7中B所示，PAR治疗对接种MC38肿瘤的小鼠生长显示出显著的抑制作用，并伴随浓度依赖性，PAR的给药浓度在20mg/kg时抗肿瘤效果最好。PAR给药频率给每天一次，共给药18天，给药方式为灌胃给药。通过对肿瘤的体外观察(图7中A所示)和肿瘤重量(图7中C所示)的比较，进一步证实：PAR的给药浓度在20mg/kg时抗肿瘤效果最好。由图7中D所示结果表明，PAR化合物对小鼠体重几乎没有影响，提示PAR对小鼠没有明显的毒性作用。
实施例7
PAR在裸鼠体内抗肿瘤作用
7.1实验材料：
肿瘤株：鼠结直肠癌细胞(MC38)购自中科院生化细胞研究所。细胞于含10％胎牛血清(Biological Industrie)的DMEM(MeilunBio)培养基中，在37℃、5％CO2条件下培养并传代。
动物：裸鼠(雌)购自上海吉辉实验动物饲养有限公司，合格证号：(20220009007529)。
其他试剂：化合物Paroxetine hydrochloride(货号HY-B0492)购自MedChemExpress(MCE)；DMSO(批号：20030415)为上海化学试剂公司产品；玉米油(金太阳粮油有限公司)。
样品：PAR用10％玉米油剂量的DMSO和玉米油溶解。
7.2实验方法
将结肠癌细胞MC38接种于6-8周龄雌性裸鼠(8×105细胞/只)的腋下，建立皮下瘤模型，待肿瘤体积约50mm3，随机分对照组和给药组PAR(20mg/kg)。持续12天，每天灌胃给药，每隔一天测一次小鼠肿瘤的体积和体重。肿瘤体积计算公式为：肿瘤体积(mm3)＝(长)×(宽)2×1/2。
7.3实验结果
为进一步证实PAR抗肿瘤作用是通过免疫途径发挥作用，本实验通过免疫缺陷鼠实验来验证PAR是否具有抗肿瘤作用。有趣的是，在T细胞缺陷的裸鼠中，由图8可知，两组肿瘤体积大小都没有显著性差异，即PAR对MC38荷瘤小鼠的肿瘤抑制作用消失了，这表明PAR的抗肿瘤作用可以归因于其激活体内T细胞免疫。因此可以得出在没有T细胞的裸鼠体内，PAR是不具有抗肿瘤的效果。
结果如图8所示，图8为对照组和PAR(20mg/kg)在荷瘤裸鼠上的抗肿瘤效果示意图。A是对照组及各个治疗组肿瘤的大小示意图，结果显示PAR的抗肿瘤作用具浓度依赖性。B是各个组的肿瘤生长曲线示意图，结果显示PAR以浓度依赖性方式抑制肿瘤的增长。C是各个组肿瘤重量统计示意图，结果显示，随着PAR给药浓度的增加，肿瘤的重量越小；D是不同组别的小鼠体重变化示意图，结果表明，PAR对小鼠的体重无明显影响。
实施例8
PAR与CTLA4抗体联合使用产生协同抗肿瘤作用
8.1实验材料：
肿瘤株：小鼠结直肠癌细胞(MC38)购自中科院生化细胞研究所。细胞于含10％胎牛血清(Biological Industries)的DMEM(MeilunBio)培养基中，在37℃、5％CO2条件下培养并传代。
动物：C57BL/6J小鼠(雌)购自上海吉辉实验动物饲养有限公司，合格证号：(20220009008655)。
其他试剂：化合物Paroxetine hydrochloride(货号HY-B0492)购自MedChemExpress(MCE)；anti-mouse-PD-1抗体(Invivogen，货号：BE0146)；anti-mouse-CTLA4抗体(Invivogen，货号：BP0032)；DMSO(批号：20030415)为上海化学试剂公司产品；玉米油(金太阳粮油有限公司)。
样品：PAR用10％玉米油剂量的DMSO和玉米油溶解。
8.2实验方法
将结肠癌细胞MC38接种于6-8周龄的雌性C57BL/6J小鼠(每只接种8×105个细胞)建立皮下瘤模型。肿瘤体积达到50mm3后，将小鼠分为5组：(1)对照组；(2)anti-PD-1组(100μg/只)；(3)anti-CTLA4组(100μg/只)；(4)PAR组(20mg/kg)；(5)PAR(20mg/kg)+anti-CTLA4组(100μg/只)。给药天数为16天，PAR通过灌胃给药，抗体则每隔五天腹腔注射一次，共注射三次抗体，每次腹腔注射100μg，每隔一天测一次小鼠肿瘤的体积和体重。肿瘤体积计算公式为：肿瘤体积(mm3)＝(长)×(宽)2×1/2。并在给药16天后处死小鼠，解剖肿瘤。
8.3实验结果
由于将PD-1抗体与CTLA4抗体联合使用后的不良反应较大，小分子药物与CTLA4抗体联合成为一种癌症免疫治疗策略，旨在增强免疫系统对肿瘤的攻击效果。结果显示，anti-PD-1组、anti-CTLA4组和PAR组的治疗效果相当，anti-CTLA4+PAR组与单独PAR组有显著性差异(图9中A-C所示)，说明PAR与anti-CTLA4有协同抗癌作用。
结果如图9所示，图9为PAR与CTLA4抗体联合使用在C57小鼠上的抗肿瘤效果示意图。A是对照组及各个治疗组肿瘤的大小示意图，结果表明PAR与CTLA4抗体联用的抗肿瘤效果最好。B是各个组的肿瘤生长曲线示意图，结果表明PAR与CTLA4抗体联用对肿瘤的生长抑制作用最明显。C是各个组肿瘤重量统计示意图，结果表明PAR与CTLA4抗体联用的肿瘤重量最轻。D是各个组小鼠体重变化示意图，结果表明PAR与CTLA4抗体联用对小鼠体重存在一定影响。由以上结果可以得出，PAR与CTLA4抗体协同抑制结直肠癌细胞的增殖，促进抗肿瘤作用，为临床上结直肠癌的治疗提供了新的备选方案。
本发明通过蛋白免疫印迹、流式细胞术和免疫荧光实验，确定PAR不仅能降低胞内PD-L1的表达也能降低膜上的表达，这些结果表明，PAR有望能成为免疫治疗中降低PD-L1的候选化合物。PD-1/PD-L1的免疫抑制作用依赖于细胞表面的膜受体，因此，PAR可能会有解除免疫抑制的作用。通过体内与体外实验，发现PAR既可以在体外提高免疫杀伤作用，也可以在荷瘤小鼠上提高T细胞杀伤肿瘤细胞的能力。由于PAR只对免疫功能正常的小鼠起作用，对T细胞缺陷型裸鼠没有肿瘤抑制作用，因此，PAR可能是通过下调肿瘤细胞中PD-L1的表达增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。另外，动物实验结果显示，anti-PD-1组、anti-CTLA4组和PAR组在小鼠体内的治疗效果相当，而anti-CTLA4+PAR组与单独PAR组有显著性差异，说明PAR与anti-CTLA4有协同作用，PAR与抗体联用更能达到肿瘤的治疗效果。
本发明具有以下优点：
首先，虽然PD-1/L1单抗在临床治疗各种肿瘤方面均取得了相当大的进展。部分肿瘤患者的生存期显著延长，有些患者甚至完全缓解，但PD-1/L1单抗在肿瘤应答率等方面仍有不足。大多数的病人对于PD-1/L1单抗的响应值较低，而且不同的肿瘤对于PD-1/L1单抗的响应差别很大。其原因可能在于过于复杂的肿瘤微环境，有研究显示：在肿瘤组织中，血管渗漏性强、胶原蛋白固化、透明质酸增多等情况都将影响以PD-1/L1单抗为代表的大分子药物在组织中的穿透与分布。尤其是实体瘤，PD-1/L1单抗穿透能力差，能够起效的部分可能仅仅限于紧邻血管的部分癌细胞，导致肿瘤治疗的客观缓解率(ORR)偏低。相较于分子量超过14万Da的PD-1/L1抗体，小分子抑制剂在这方面就体现出了先天的优势。
其次，PD-1/L1单抗的免疫原性问题也很突出，生物大分子进入人体内后容易引发细胞因子风暴，出现强烈的免疫反应，并产生多种严重不良反应。而PD-L1小分子抑制剂由于分子量较小，免疫原性可以忽略不记。
再次，成本、依从性以及可及性的问题。单克隆抗体制备困难，储存和运输不便并由此造成了其成本高昂。另外，目前PD-1/L1单抗的给药方式还是以静脉给药为主，每2-3周一次，患者对于治疗的依从性远不及口服的小分子靶向药物。而口服PD-L1小分子抑制剂具有运输和储存方便，稳定性好的特点。目前对于小分子靶向药与PD-1/L1单抗的联合用药研究的如火如荼，未来如果CTLA4抗体与PD-L1小分子抑制剂同时口服，会更大程度上提高患者的依从性以及生活质量。
在本发明中，重新利用已批准和上市的药物(PAR)，不仅可以降低研发新药的成本，还能大幅缩短研究周期，可以更快地使患者受益。通过一系列生物学实验，在体外验证了帕罗西汀不仅可以有效促进癌细胞内PD-L1的降解，还能增加T细胞对癌细胞的杀伤作用，通过动物实验，进一步证明了帕罗西汀对肿瘤生长的抑制作用，并且帕罗西汀还能与CTLA4抗体联用发挥协同抗癌作用，这为临床上癌症的治疗提供了新的备选方案。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

Claims (6)

1.一种帕罗西汀或其药用盐在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤选自结直肠癌。
2.根据权利要求1所述的帕罗西汀或其药用盐在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述药用盐是帕罗西汀与下列酸形成的酸加成盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、乳酸、柠檬酸、磷酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、萘磺酸、酒石酸、丙酮酸、乙酸、马来酸或琥珀酸、富马酸、水杨酸、苯基乙酸或杏仁酸。
3.一种帕罗西汀或其药用盐作为PD-L1抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
4.一种帕罗西汀或其药用盐与CTLA4抗体联用在制备抗肿瘤药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的帕罗西汀或其药用盐与CTLA4抗体联用在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤选自结直肠癌。
6.一种药物制剂，其特征在于，所述药物制剂是由帕罗西汀或其药用盐与CTLA4抗体联用制成。
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