CN117337194A - 包含与吲哚菁绿缀合的聚乙二醇的组合物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了聚乙二醇‑吲哚菁绿缀合物以及使用此类缀合物的方法，诸如诊断、组织成像、时间监测和治疗。

Description

包含与吲哚菁绿缀合的聚乙二醇的组合物及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年8月24日提交的美国临时申请号63/069,161的权益，其内容通过引用以其全文并入本文。
政府支持
本发明是在由国立卫生研究院授予的资助号R01 DK103363和资助号R01DK115986的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。
背景技术
肾是用于从体内快速清除内源性排泄物和外源性药物/毒素的主要器官。然而，用于溶质的确切消除途径在很大程度上取决于其与肾隔室的相互作用。在与肾隔室相互作用后，分子可以采用两种不同的途径，即肾小球滤过和肾小管分泌，以经由肾消除。对于一些与肾隔室相互作用极小且流体动力学直径小于6nm(或分子量小于40kDa)的分子，其可以经由肾小球滤过膜快速且被动地消除。在另一方面，一些其他分子可以通过结合近端肾小管细胞的基底外侧上的转运体而从管周毛细血管主动排泄到近端小管腔内，流入细胞并从管腔侧流出。新研发的肾可清除纳米荧光团和有机染料主要采取肾小球滤过途径，并且已用于检测肾功能障碍或改善许多癌症的荧光引导手术的正对比度。然而，据报道，它们无一越过正常肾组织而选择性地靶向原发性肾癌且以正对比度(高荧光)显示肿瘤边缘，这在荧光引导的肾部分切除术中是高度需要的，以保护肾功能并提高肾癌患者的生活质量。此外，由于正常肾实质的高血流灌注，以比附近正常肾组织更高的浓度将治疗剂(诸如用于光热疗法、光动力疗法、化疗、免疫疗法和放射疗法的试剂)和医学显像剂(诸如用于光声成像、计算机断层扫描、正电子发射断层扫描、单光子发射计算机断层扫描和磁共振成像的试剂)选择性地递送至肾癌细胞中仍然具有挑战性。鉴于超过90％的肾癌是起源于肾小管上皮细胞的肾细胞癌(RCC)，对肾可清除染料和纳米颗粒与肾小管/在肾小管内的相互作用和转运的基本了解对于设计选择性靶向RCC的新策略至关重要。
虽然近端肾小管分泌在快速清除内源性物质和外源性药物或毒素方面起重要作用，但近端肾小管也极易受到内源性细胞因子和外源性药物或毒素的影响，从而导致肾小管分泌功能受损、肾损伤，且甚至导致肾衰竭。相比于可容易以内源性血清肌酐或外源性标记物(诸如放射性标记示踪剂或荧光菊粉)估计的肾小球滤过功能，到目前为止，肾小管分泌功能只能使用很少的外源性标记物进行量化。在临床上，外源性功能标记物，诸如对氨基马尿酸盐(PAH)，经静脉内输注到患者体内。通过以“离线”比色法或色谱法分析他们的血液和尿液浓度，临床医生可以量化残余的肾小管分泌功能并制定个性化治疗计划，以最大限度地减少潜在的副作用和肾毒性。然而，“离线”分析较为耗时且无法解决急性肾损伤的紧迫临床需求。为了应对这一挑战，正在引入放射性核素，诸如99mTc-巯基乙酰基三甘氨酸(MAG3)，以实时监测肾小管分泌功能；但潜在的辐射危害和复杂的临床情况使这些放射性核素无法在家庭诊所以及医疗资源有限的乡村地区使用。随着便携或可穿戴光电学的出现，高度需要研发外源性非辐射光学标记物，以用于在早期远程评估近端肾小管分泌功能及其损伤；使得可以为医疗资源有限的偏远地区的患者及时制定预后规划和早期治疗，以预防肾衰竭。
发明内容
在一个方面，本公开提供了诊断受试者中与内流转运体或外排转运体的异常表达相关联的疾病或病症的方法，该方法包括：
向该受试者施用包含与吲哚菁绿(ICG)缀合的聚乙二醇(PEG)(“ICG-PEG缀合物”)的组合物；
确定从该受试者获得的生物学样品中该ICG-PEG缀合物的浓度；
将该ICG-PEG缀合物的该浓度与参考水平进行比较；以及
若该ICG-PEG缀合物的该浓度显著高于或低于该参考水平，则确定该受试者患有该疾病或病症。
在另一方面，本公开进一步提供了诊断与受试者中与内流转运体或外排转运体的异常表达相关联的疾病或病症的方法，该方法包括：
向该受试者施用包含ICG-PEG缀合物的组合物；
测量来自该受试者的组织中的该ICG-PEG缀合物的信号的强度；
将该强度与参考水平进行比较；以及
若该强度显著高于或低于该参考水平，则确定该受试者患有该疾病或病症。
在另一方面，本公开提供了监测受试者的肾分泌功能的方法，该方法包括：
向该受试者施用包含ICG-PEG缀合物的组合物；
确定在第一时间点从该受试者获得的第一生物学样品中该ICG-PEG缀合物的第一浓度；
确定在第二时间点从该受试者获得的第二生物学样品中该ICG-PEG缀合物的第二浓度，其中该第二时间点在该第一时间点之后；
基于该第一浓度和该第二浓度确定肾清除动力学；以及
任选地将该肾清除动力学与参考水平进行比较。
在另一方面，本公开提供了一种监测受试者的肾分泌功能的方法，该方法包括：
向该受试者施用包含ICG-PEG缀合物的组合物；
在第一时间点测量来自该受试者的组织中的该ICG-PEG缀合物的信号的第一强度；以及
在第二时间点测量来自该受试者的该组织中的该ICG-PEG缀合物的信号的第二强度。
在另一方面，本公开提供了治疗有此需要的受试者的与内流转运体或外排转运体的异常表达相关联的疾病或病症的方法，该方法包括向该受试者施用包含ICG-PEG缀合物的组合物。
在另一方面，本公开提供了一种测量受试者中内流转运体或外排转运体的表达水平的方法，该方法包括：
向该受试者施用包含ICG-PEG缀合物的组合物；
确定从该受试者获得的生物学样品中该ICG-PEG缀合物的浓度；以及
基于该ICG-PEG缀合物的该浓度确定该内流转运体或外排转运体的该表达水平。
在另一方面，本公开提供了一种测量受试者中内流转运体或外排转运体的表达水平的方法，该方法包括：
向该受试者施用包含ICG-PEG缀合物的组合物；
测量来自该受试者的组织中的该ICG-PEG缀合物的信号的强度；以及
基于该强度确定该内流转运体或外排转运体的该表达水平。
在另一方面，本公开提供了检测受试者的肝脏疾病的方法，该方法包括：
向该受试者施用包含ICG-PEG缀合物的组合物，其中该PEG具有至少100Da至小于2kDa的分子量；
确定从该受试者获得的尿液样品中该ICG-PEG缀合物的浓度；
将该ICG-PEG缀合物的该浓度与参考水平进行比较；以及
当该ICG-PEG缀合物的该浓度显著低于该参考水平时，确定该受试者患有该肝脏疾病。
附图说明
图1A是显示ICG与ICG-PEG45在化学结构、分子量(MW)、净电荷、分配系数(logD)和血清蛋白结合方面的比较的图。
图1B是一荧光图像，其显示静脉内注射ICG和ICG-PEG45的小鼠在注射后10min时的体内成像以及在静脉内注射后10min时采集的肝(Li)、肾(Kid)、心脏(He)、脾(Sp)和从膀胱收集的尿液的离体图像(Ex/Em滤光片：790/830nm)。将小鼠置于俯卧位以收集来自肝脏的信号。
图1C是显示ICG和ICG-PEG45在静脉内注射后24h时分别在尿液和粪便中的清除百分比的条形图。
图1D是显示ICG、ICG-PEG22、ICG-PEG45和ICG-PEG220在注射后24h时在粪便和尿液中的清除百分比的图。n＝3。PEG45在ICG-PEGn的肾清除方面表现为一个转折点。
图1E是一组荧光图像和曲线图，其显示静脉内注射ICG-PEG45前后的实时无创肾成像(Ex/Em滤光片：790/830nm)(i)以及注射ICG-PEG45后30min内两个肾的时间-荧光强度曲线(ii)。为了进行比较，800CW-PEG45的荧光肾动力学曲线以虚线表示。为了收集肾的信号，将小鼠以仰卧位置于成像台上。
图1F是注射800CW-PEG45和ICG-PEG45后5min和1h时在组织水平的肾小球和肾小管的一组荧光图像。G，肾小球，PT，近端肾小管。肾组织由苏木精和伊红(H&E)染色。在775/845nm处拍摄ICG-PEG45的荧光图像，而在720/790nm处拍摄800CW-PEG45的荧光图像。标量尺为20μm。
图1G是一组条形图，其显示在对照条件和经丙磺舒处理的条件下ICG-PEG45(i)和800CW-PEG45(ii)在注射后30min时的肾清除效率。n＝3。*表示基于学生t检验的统计学上的差异，P<0.05。N.S.表示基于学生检验，无显著差异，P>0.05。
图1H是PEG45缀合后ICG清除率变化的一组示意图。
图2A是经建立的原发性原位肾细胞癌(RCC)小鼠模型的示意图。
图2B是一组荧光图像，其显示植入有原位乳头状RCC的小鼠在静脉内注射ICG-PEG45后的实时无创肾成像(Ex/Em滤光片：790/830nm)。BF，明视场。小鼠左肾植入有RCC(LK：含肿瘤)，而右肾保持正常(RK：无肿瘤)。将小鼠以仰卧位置于成像台上。
图2C是显示注射ICG-PEG45后24h内两个肾位置和背景皮肤的时间-荧光强度的图。RS，右背景皮肤。LS，左背景皮肤。
图2D是显示在注射ICG-PEG45后24h时RK(不含T)和LK(含T)的清除百分比的图。值定义为[峰值-24h时的强度]/峰值]×100％。n＝3，p值是基于学生t检验计算的。
图2E是在静脉内注射ICG-PEG45后24h时具有乳头状RCC的癌性肾(LK)和不具有RCC的对侧肾(RK)的一组离体图像。
图2F是一组荧光图像，其显示在注射后24h时ICG-PEG45在乳头状RCC组织中的分布。
图2G是一组在注射ICG-PEG45后68h时具有患者来源的异种移植物(PDX)透明细胞RCC(ccRCC)的癌性肾和不具有RCC的对侧肾的离体图像以及H&E染色后组织水平的荧光成像。BF，明视场。Fl，来自ICG-PEG45的荧光。虚线表示正常肾组织与ccRCC之间的边缘。
图2H是显示ICG-PEG45、ICG和800CW-PEG45当中RCC对比指数的比较的图。Hypo，低荧光(正常肾的强度>肾癌的强度)。Iso，等荧光(正常肾的强度＝肾癌的强度)。Hyper，高荧光(正常肾的强度<肾癌的强度)。
图2I是通过总结所研究的探针显示清除途径与RCC靶向的相关性的表。
图3A是一组显示P-糖蛋白(P-gP)在正常肾近端小管细胞(HK2)和肾细胞癌细胞(529B)膜上以及在组织水平的表达水平的图像。
图3B是一组荧光图像，其显示ICG-PEG45在HK2和529B中在通过环孢菌素A(CSA)处理来抑制P-gP介导的外排之前(CSA-)和之后(CSA+)的细胞摄取荧光成像。标量尺为10μm。BF，明视场。Fl，荧光。
图3C是显示ICG-PEG45的细胞内荧光强度定量的条形图。***表示基于学生t检验的统计学上的差异并且P<0.0005。N.S.表示基于学生检验，无显著差异，P>0.05。
图3D是ICG-PEG45在正常肾近端小管细胞和RCC细胞中不同细胞外排的示意图，其为通过ICG-PEG45进行的RCC高荧光对比的来源。
图4A是显示RCC可能迁移至脑、骨和肺的示意图。
图4B是一组关于携带RCC转移瘤的小鼠在注射ICG-PEG45后24h时的体内无创生物发光图像和荧光图像。BLI，生物发光图像。Fl，荧光。R，右，L，左。
图4C是一组在注射ICG-PEG45后24h时靠近脊柱的肿瘤和脑的离体图像。BLI，生物发光图像。Fl，荧光。
图4D是一组注射ICG-PEG45后24h时上肢和下肢的离体图像。BLI，生物发光图像。Fl，荧光。
图4E是一组关于携带RCC转移肿瘤的其他小鼠在注射ICG-PEG45后24h时的体内无创图像(左)以及下肢(有和没有肌肉)的离体FL图像和彩色图像(没有肌肉)(右)。
图4F是显示注射ICG-PEG45后24h时的照片以及H&E病理图像。上肢图像见于图29。
图5A是显示正常肾和具有由10mg/kg顺铂诱发的肾小管损伤的患病肾中的肌酸酐水平的图。
图5B是显示正常肾和具有由10mg/kg顺铂诱发的肾小管损伤的患病肾中的PAH水平的图。
图5C是证实在10mg/kg顺铂剂量下的肾小管损伤的tunnel TUNEL测定图像。
图5D是证实在10mg/kg顺铂剂量下的肾小管损伤的KIM-1免疫染色图像。
图6是显示ICG-PEG45在正常小鼠和分别由10mg/kg和20mg/kg剂量的顺铂诱发的患病小鼠中的肾清除效率的图。观察到肾清除率显著降低。
图7A是在左肾上具有原位RCC异种移植物的小鼠在静脉内注射ICG-PE45-DOTA(200μL，40μM)后24h时的无创体内图像。小鼠左肾植入有经荧光素酶表达载体转染的乳头状RCC细胞系(ACHN)，而右肾保持正常。在腹膜内注射荧光素酶底物后10min时，在左肾上检测到强烈的生物发光信号，这表明RCC的生长。生物发光图像与明视场图像重叠，以显示左肾上生物发光信号的位置。
图7B是同一只小鼠的近红外荧光图像，其表明ICG-PE45-DOTA可以特异性地积聚于具有原发性RCC的左肾中，但可以从正常的右肾中清除(Ex/Em滤光片：760/845nm)。
图8A是纵向切成两半的左右肾的生物发光图像。
图8B是图8A中所示肾的照片。
图8C是图8A中所示肾的近红外荧光图像。荧光信号指示，ICG-PE45-DOTA可以特异性靶向恶性肾组织(Ex/Em滤光片：760/845nm)。
图9是携带MCF-7肿瘤的小鼠在分别注射ICG和ICG-PEG45后的一组实时体内图像。Ex/Em：790/830nm。肿瘤部位由箭头或三角形指出。
图10A是一组图像，其显示在4h孵育后在MCF-7细胞中ICG和ICG-PEG45的位置。细胞核由赫斯特(Hoechst)染色。BF，明视场。比例尺为20μm。
图10B是显示在12h孵育时间情况下MCF-7细胞对ICG和ICG-PEG45的摄取效率的条形图。PEG45与ICG的缀合使其细胞摄取效率降低了约10倍。
图11A是携带三阴性4T1肿瘤的小鼠在注射ICG-PEG45后的一组实时体内图像。BF，明视场。肿瘤部位由箭头或三角形指出。
图11B是显示携带4T1肿瘤的小鼠中关于ICG-PEG45的肿瘤对比指数的图。肿瘤对比指数是通过肿瘤部位的强度相对于背景组织的强度的比率来计算的。虚线表示对比指数阈值(CI＝2.5)。ICG-PEG45的CI在3h时达到2.5。
图11C是ICG-PEG45在肿瘤部位(4T1)和背景组织中的时间-荧光曲线。计算了ICG-PEG45在肿瘤部位和背景组织部位的衰变半衰期。T，肿瘤部位，B，背景组织。
图11D显示了ICG-PEG45在注射后24h时在肿瘤组织中的分布。肿瘤组织经H&E染色。在EX775/EM845 nm处拍摄荧光图像。标量尺为20μm。
图12A和12B是苏木精和伊红(H&E)染色的肾切片，显示由手术切口引起的局部肾小管损伤位于肾皮质中。扩张的肾小管和免疫细胞的间质浸润由星号标记。
图12C和12D是ICG-PEG(PEG的MW＝5000)在肾切片中分布的近红外荧光成像。红色信号，ICG荧光。细胞核由DAPI染成蓝色。
图13是显示ICG-PEG45的合成的示意图。
图14是一组关于ICG和ICG-PEG45的UV-可见光吸收光谱和荧光光谱。
图15显示了通过琼脂糖凝胶电泳进行的血清蛋白结合测试。ICG与ICG-PEG45的血清蛋白结合测试通过10％胎牛血清(FBS)中的琼脂糖凝胶电泳在37℃水浴下持续30min来进行。考马斯亮蓝250(CBB)用于对FBS进行染色。插入了关于经CBB染色的蛋白质的彩色图片。ICG会完全结合蛋白质，而PEG45分子的缀合会降低其蛋白质结合亲和力。
图16是一组关于ICG-PEG22和ICG-PEG220的UV-可见光吸收光谱和荧光光谱。
图17是一组ICG-PEG22和ICG-PEG220在注射后10min内的实时体内图像以及所采集的器官的离体图像。在静脉内注射后10min时肝(Li)、肾(Kid)、心脏(He)、脾(Sp)和从膀胱收集的尿液(Ex/Em滤光片：790/830nm)。
图18A显示了通过ICG-PEG22和ICG-PEG220在10％胎牛血清(FBS)中在37℃水浴下持续30min的琼脂糖凝胶电泳进行的血清蛋白结合测试。考马斯亮蓝250(CBB)用于对FBS进行染色。插入了关于经CBB染色的蛋白质的彩色图片。
图18B是一组显示ICG、ICG-PEG22、ICG-PEG45和ICG-PEG220在水中和在100％胎牛血清(FBS)中(相同染料浓度)的荧光强度的图像。
图18C是显示ICG、ICG-PEG22、ICG-PEG45和ICG-PEG220在FBS中的总强度相对于在水中的总强度的比率的曲线。该比率随着PEG分子量的增加而降低，这表明ICG的蛋白质结合随着缀合的PEG分子的分子量增加而逐渐降低。
图19A是一组在静脉内注射4μM ICG-PEG45后1min、10min和30min时的明视场(BF)图像和荧光图像。在注射剂量为4μM情况下的关于ICG-PEG45的肾成像。该浓度是正文中用于ICG-PEG45肾成像的剂量的10倍低。去除背面的皮肤以清楚地监测来自肾的荧光信号。
图19B是显示右肾和左肾随时间推移的动力学的图。LK，左肾。RK，右肾。在注射剂量为4μM情况下的关于ICG-PEG45的肾成像。该浓度是正文中用于ICG-PEG45肾成像的剂量的10倍低。去除背面的皮肤以清楚地监测来自肾的荧光信号。
图20A是一组在注射ICG-PEG45后的实时无创肾图像。
图20B是显示右肾(RK)、左肾(LK)和皮肤随时间推移的动力学曲线的图。
图21是一组显示ICG-PEG45在静脉内注射后(p.i.)10min时在肾小球和肾小管中的分布的图像。BF，明视场。Fl，荧光。比例尺为20μm。G，肾小球，PT，近端肾小管，L，管腔。
图22A是显示ICG-PEG45在注射后5min时在管周毛细血管、肾小管管腔和肾小球中的信号强度的图。
图22B是显示ICG-PEG45在注射后1h时在管周毛细血管、肾小管管腔和肾小球中的信号强度的图。p值是基于学生t检验计算的。
图23是显示丙磺舒对FITC-菊粉的肾清除效率的影响的条形图。n＝3。N.S.意指基于学生t检验，无显著差异，P>0.05。
图24A是一组在注射ICG后24h时具有RCC和不具有RCC的肾的离体荧光图像。BF，明视场。Fl，荧光。RCC，肾细胞癌。
图24B是一组在注射800CW-PEG45后24h时具有RCC和不具有RCC的肾的离体荧光图像。BF，明视场。Fl，荧光。RCC，肾细胞癌。
图25是一组关于在静脉内注射ICG-Au25后24h时的离体RCC。RCC，肾细胞癌。BF，明视场。Fl，荧光。
图26A是一组关于ICG-PEG45在HK2和529B中在tariquidar处理前后的细胞摄取荧光图像。标量尺为20μm。BF，明视场。Fl，荧光。
图26B是显示ICG-PEG45的荧光强度定量的条形图。***表示基于学生t检验的统计学上的差异并且P<0.0005。N.S.表示基于学生检验，无显著差异，P>0.05。
图27显示小鼠在注射ICG-PEG45后24h时具有肿瘤的关节与正常关节的对比指数。对比指数(CI)是通过第1部分相对于第2部分的强度计算的(在图中圈出)。
图28是一组关于ICG-PEG45在静脉内注射后24h时肾细胞癌肺转移的离体荧光图像。
图29是一组关于小鼠在注射ICG-PEG45后24h时的荷瘤上肢的离体图像和彩色图像以及H&E病理图像。
图30A是显示在顺铂/生理盐水处理后4天时的BUN水平的图。
图30B是显示在顺铂/生理盐水处理后4天时的血清肌酸酐水平的图。
图30C是显示在顺铂/生理盐水处理后4天时的尿KIM-1和肌酸酐比率的图。
图30D是一组关于经免疫荧光染色的肾组织的图像，其证实了在经10mg/kg和20mg/kg顺铂处理的小鼠肾上的上调的KIM-1表达。
图30E是一组显示末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色的肾组织的图像，其证实了在经10mg/kg和20mg/kg顺铂处理的小鼠肾中存在凋亡细胞。比例尺：40μm。
图31是一组经高碘酸-希夫氏(Periodic acid–Schiff；PAS)染色的肾组织的代表性图像，其显示经10mg/kg和20mg/kg顺铂处理的小鼠中的完整肾小球形态。比例尺：20μm。
图32是一组经H&E染色的肾组织的代表性图像，其显示经20mg/kg顺铂处理的小鼠中的肾小管坏死(由白色三角形指出)和蛋白管型的形成(由白色箭头指出)。比例尺：50μm。
图33是一组经高碘酸-希夫式(PAS)染色的肾组织的代表性图像，其显示在经20mg/kg顺铂处理的小鼠中蛋白管型的形成(由白色箭头指出)。比例尺：50μm。
图34A是一组在注射ICG-PEG45后30min时的膀胱荧光图像，证明了经10mg/kg顺铂处理的小鼠中的尿清除受阻。
图34B是一组在注射IRDye-PEG45后30min时的膀胱荧光图像，指示在经10mg/kg顺铂处理的小鼠中的快速尿清除。
图34C是显示正常小鼠和经10mg/kg顺铂处理的小鼠中ICG-PEG45和IRDye-PEG45的肾清除效率的图。
图34D是显示静脉内注射后30min时离体肾荧光强度的条形图。
图34E是显示静脉内注射后30min时ICG-PEG45和IRDye-PEG45的血液积聚的条形图。
图34F是一组在注射ICG-PEG45后30min时肾冰冻切片的荧光图像。
图34G是显示静脉内注射后30min时ICG-PEG45的量化肾内分布的图。比例尺：40μm。
具体实施方式
吲哚菁绿(ICG)是一种经临床批准的近红外(NIR)发射荧光团并已成功应用于乳腺癌、肝癌、脑癌的荧光引导手术。然而，数百个临床案例研究表明，在针对肾癌的肾部分切除术中引入ICG并没有在降低阳性切缘率方面产生显著改善，这是因为由于ICG的肝胆清除速度快且与肾癌组织的相互作用有限而无法对肾癌进行高荧光成像。事实上，ICG只是暂时(<15min)滞留在正常肾实质中并点亮正常肾实质，然后经由肝脏被迅速消除。此外，ICG的绿色在切除肿瘤块时会在正常肾组织中“逸出”，这使得在手术期间难以区分肿瘤边缘。ICG在肾癌成像中的这些局限性提出了一个问题，即是否可以定制ICG以经由肾小管消除而选择性地靶向肾癌。
本公开经由聚乙二醇化提供肾小管可分泌型ICG。通过使ICG与PEG缀合，发现聚乙二醇化能够使ICG几乎仅经由肾小管分泌途径快速且主动地消除进入尿液中。聚乙二醇化阻止ICG被肝脏吸收，同时增强其与近端肾小管细胞的转运体的相互作用并允许ICG在基底外侧上的有机阴离子转运体(“进入”近端肾小管细胞)和P-糖蛋白(P-gP)外排转运体(从近端肾小管细胞中“排出”)的协助下从管周毛细血管转运至近端肾小管管腔。由于P-gP外排转运体在肾癌细胞膜上的表达水平远低于正常近端肾小管细胞，因此ICG-PEG缀合物被有效地从正常肾组织中清除，同时滞留在肾癌组织中。相比之下，经由肝脏或肾小球消除的ICG由于其与近端肾小管的转运体的相互作用有限，因此无法选择性地越过正常肾组织而靶向肾癌。不限于原发性肾癌，ICG-PEG缀合物还可以高特异性以荧光方式检测肾外的骨、脑和肺转移。
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与所主张的主题所属领域中技术人员通常理解的相同含义。如果本文中的术语存在多种定义，则以本章节中的定义为准。在提及URL或其他此类标识符或地址的情况下，应了解此类标识符可能会发生变化并且互联网上的特定信息可能会变化不定，但可以通过搜索互联网找到等同信息。对其的引用证明了此类信息的可用性和公开传播。
应当理解，前面的一般描述和以下详细描述仅是示范性和说明性的，而非对所主张的任何主题的限制。在本申请中，除非另外特别说明，否则单数的使用包含复数。必须注意，如在说明书和所附权利要求中所使用，单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包括复数指示物，除非上下文另外清楚地指示。在本申请中，除非另外说明，否则“或者”的使用是指“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及诸如“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(included)”的其他形式的使用不是限制性的。
本文中使用的章节标题仅出于组织目的，而不应被解释为对所描述的主题进行限制。在本申请中引用的所有文件或文件的部分，包括但不限于专利、专利申请、论文、书籍、手册和专著，均特此出于任何目的通过引用以其全文明确地并入。
关于标准化学术语的定义可见于参考书中，包括Carey和Sundberg“AdvancedOrganic Chemistry第4版”A卷(2000)和B卷(2001),Plenum Press,New York。除非另有指示，否则采用本领域技术范围内的质谱、NMR、HPLC、蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。除非提供具体定义，否则与本文所描述的分析化学、合成有机化学以及医药和药物化学相关所采用的命名法以及其中的实验室程序和技术是本领域中已知的那些。标准技术可用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者治疗。标准技术可用于重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质转染)。反应和纯化技术可以例如使用制造商规格的试剂盒或如本领域中通常实现的或如本文所描述的那样进行。前述技术和程序可一般根据本领域中熟知的常规方法并且如在整个本说明书中引用和讨论的各种一般的和更具体的参考文献中所描述的那样进行。
应当理解，本文描述的方法和组合物不限于本文描述的特定方法学、方案、细胞系、构建体和试剂，并且因此可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本文描述的方法和组合物的范围，该范围将仅由所附权利要求书来限定。
本文提及的所有出版物和专利均通过引用以其全文并入本文，以用于描述和公开例如出版物中描述的构建体和方法，其可能与本文所描述的方法、组合物和化合物结合使用。本文讨论的出版物仅仅是为了它们在本申请的提交日期之前的公开内容而提供。本文中的任何内容都不应解释为承认本文描述的发明人无权因先前的发明或出于任何其他原因而提前进行此类公开。
“烷基”基团是指脂肪族烃基团。烷基部分可以是“饱和烷基”基团，这意指其不含任何烯烃或炔烃部分。烷基部分也可以是“不饱和烷基”部分，这意指其含有至少一个烯烃或炔烃部分。“烯烃”部分是指具有至少一个碳-碳双键的基团，而“炔烃”部分是指具有至少一个碳-碳三键的基团。烷基部分，无论是饱和的还是不饱和的，可以是支链的、直链的或环状的。视结构而定，烷基基团可以是单基或双基(即亚烷基基团)。烷基基团也可以是具有1至6个碳原子的“低碳烷基”。
如本文所用，C1-Cx包括但不限于C1-C2、C1-C3、C1-C4、C1-C5、C1-C6、C2-C3、C2-C4、C2-C5、C2-C6、C3-C4、C3-C5、C3-C6、C4-C5、C4-C6和C5-C6。
“烷基”部分可具有1至10个碳原子(无论何时出现在本文中，诸如“1至10”的数字范围是指给定范围内的每个整数；例如，“1至10个碳原子”意指烷基基团可具有1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等，最多且包括10个碳原子，尽管本定义还涵盖了未指定数值范围的术语“烷基”的出现)。本文所描述的化合物中的烷基基团可指定为“C1-C4烷基”或类似名称。仅举例，“C1-C4烷基”指示烷基链中存在一至四个碳原子，即烷基链选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。因此C1-C4烷基包括C1-C2烷基和C1-C3烷基。烷基基团可以是经取代或未经取代的。典型的烷基基团包括但决不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、乙烯基、丙烯基、丁烯基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。
如本文所用，术语“非环状烷基”是指非环状的烷基(即，含有至少一个碳原子的直链或支链)。非环状烷基可以是完全饱和的或可以含有非环状烯烃和/或炔烃。非环状烷基可以任选地经取代。
术语“烯基”是指一种类型的烷基基团，其中烷基基团的前两个原子形成并非芳香族基团的一部分的双键。也就是说，烯基基团以原子–C(R)＝C(R)-R开始，其中R是指烯基基团的其余部分，其可以相同或不同。烯基部分可以是支链、直链或环状的(在这种情况下，其也被称为“环烯基”基团)。视结构而定，烯基基团可以是单基或双基(即，亚烯基基团)。烯基基团可以任选地经取代。烯基基团的非限制性实例包括–CH＝CH2、-C(CH3)＝CH2、-CH＝CHCH3、–C(CH3)＝CHCH3。亚烯基基团包括但不限于–CH＝CH–、–C(CH3)＝CH–、–CH＝CHCH2–、–CH＝CHCH2CH2–和–C(CH3)＝CHCH2–。烯基基团可具有2至10个碳。烯基基团也可以是具有2至6个碳原子的“低碳烯基”。
术语“炔基”是指一种类型的烷基基团，其中烷基基团的前两个原子形成三键。也就是说，炔基基团以原子–C≡C-R开始，其中R是指炔基基团的其余部分，其可以相同或不同。炔基部分中的“R”部分可以是支链、直链或环状的。视结构而定，炔基基团可以是单基或双基(即亚炔基基团)。炔基基团可以任选地经取代。炔基基团的非限制性实例包括但不限于–C≡CH、-C≡CCH3、–C≡CCH2CH3、–C≡C–和–C≡CCH2–。炔基基团可具有2至10个碳原子。炔基基团也可以是具有2至6个碳原子的“低碳炔基”。
“烷氧基”基团是指(烷基)O-基团，其中烷基如本文所定义。
“羟烷基”是指经至少一个羟基取代的如本文所定义的烷基自由基。羟烷基的非限制性实例包括但不限于羟甲基、2-羟乙基、2-羟丙基、3-羟丙基、1-(羟甲基)-2-甲基丙基、2-羟丁基、3-羟丁基、4-羟丁基、2,3-二羟丙基、1-(羟甲基)-2-羟乙基、2,3-二羟丁基、3,4-二羟丁基和2-(羟甲基)-3-羟丙基。
“烷氧基烷基”是指经如本文所定义的烷氧基取代的如本文所定义的烷基自由基。
“烯氧基”基团是指(烯基)O-基团，其中烯基如本文所定义。
术语“烷基胺”是指–N(烷基)xHy基团，其中x和y选自x＝1、y＝1以及x＝2、y＝0。当x＝2时，烷基基团与它们所连接的N原子一起可以任选地形成环状环系统。
“烷氨基烷基”是指经如本文所定义的烷基胺取代的如本文所定义的烷基自由基。
“酰胺”是具有式-C(O)NHR或-NHC(O)R的化学部分，其中R选自烷基、环烷基、芳基、杂芳基(经由环碳键合)和杂脂环族(经由环碳键合)。酰胺部分可以在氨基酸或肽分子与本文所描述的化合物之间形成键联，从而形成前药。本文所描述的化合物上的任何胺或羧基侧链均可经酰胺化。制备此类酰胺的程序和特定基团是本领域中技术人员已知的，并且可以容易地在参考来源中找到，诸如Greene和Wuts,Protective Groups in OrganicSynthesis,第3版,John Wiley&Sons,New York,NY,1999，其通过引用以其全文并入本文。
术语“酯”是指具有式-COOR的化学部分，其中R选自烷基、环烷基、芳基、杂芳基(经由环碳键合)和杂脂环族(经由环碳键合)。本文所描述的化合物上的任何羟基或羧基侧链均可经酯化。制备此类酯的程序和特定基团是本领域中技术人员已知的，并且可以容易地在参考来源中找到，诸如Greene和Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,第3版,John Wiley&Sons,New York,NY,1999，其通过引用以其全文并入本文。
如本文所用，术语“环”是指任何共价闭合结构。环包括例如碳环(例如芳基和环烷基)、杂环(例如杂芳基和非芳香族杂环)、芳香族化合物(例如芳基和杂芳基)和非芳香族化合物(例如环烷基和非芳香族杂环)。环可以任选地经取代。环可以是单环或多环的。
如本文所用，术语“环系统”是指一个环或多于一个环。
术语“元环”可以包括任何环状结构。术语“元”意指指示构成环的骨架原子的数目。因此，例如，环己基、吡啶、吡喃和噻喃是6元环，而环戊基、吡咯、呋喃和噻吩是5元环。
术语“稠合”是指其中两个环或更多个环共享一个或多个键的结构。
术语“碳环状”或“碳环”是指一种环，其中形成该环的原子中的每一个都是碳原子。碳环包括芳基和环烷基。因此，该术语将碳环与杂环(“杂环状”)区分开来，其中环主链含有至少一个不同于碳的原子(即杂原子)。杂环包括杂芳基和杂环烷基。碳环和杂环可以任选地经取代。
术语“芳香族”是指π具有含有4n+2π个电子的离域电子系统的平面环，其中n是整数。芳香族环可由五个、六个、七个、八个、九个或超过九个原子形成。芳香族化合物可以任选地经取代。术语“芳香族”包括碳环芳基(例如苯基)和杂环芳基(或“杂芳基”或“杂芳香族”)基团(例如吡啶)两者。该术语包括单环或稠环多环(即共享相邻碳原子对的环)基团。
如本文所用，术语“芳基”是指芳香族环，其中形成该环的原子中的每一个都是碳原子。芳香环可由五个、六个、七个、八个、九个或超过九个碳原子形成。芳基基团可以任选地经取代。芳基基团的实例包括但不限于苯基、萘基、菲基、蒽基、芴基和茚基。视结构而定，芳基基团可以是单基或双基(即亚芳基基团)。
“芳氧基”基团是指(芳基)O-基团，其中芳基如本文所定义。
“芳烷基”意指经芳基基团取代的如本文所定义的烷基自由基。非限制性芳烷基基团包括苄基、苯乙基等。
“芳烯基”意指经如本文所定义的芳基基团取代的如本文所定义的烯基基团。
术语“环烷基”是指仅含有碳和氢的单环或多环自由基，并且可以是饱和的、部分不饱和的或完全不饱和的。环烷基基团包括具有3至10个环原子的基团。环烷基基团的说明性实例包括以下部分：
等。视结构而定，环烷基基团可以是单基或双基(例如亚环烷基基团)。环烷基基团也可以是具有3至8个碳原子的“低碳环烷基”。
“环烷基烷基”意指经环烷基基团取代的如本文所定义的烷基自由基。非限制性环烷基烷基基团包括环丙基甲基、环丁基甲基、环戊基甲基、环己基甲基等。
术语“杂环”是指含有一至四个各自选自O、S和N的杂原子的杂芳香族和杂脂环族基团，其中每个杂环基团在其环系统中具有4至10个原子，并且其条件是所述基团的环不含两个相邻的O或S原子。在本文中，每当指示杂环(例如，C1-C6杂环)中的碳原子数目时，环中必须存在至少一个其他原子(杂原子)。诸如“C1-C6杂环”的名称仅指环中的碳原子数目，而不是指环中的原子总数目。应当理解，杂环可以在环中具有额外的杂原子。诸如“4-6元杂环”的名称是指环(即四元、五元或六元环，其中至少一个原子是碳原子，至少一个原子是杂原子，并且其余两个至四个原子是碳原子或杂原子)中含有的原子总数目。在具有两个或更多个杂原子的杂环中，这两个或更多个杂原子可以彼此相同或不同。杂环可以任选地经取代。可以在杂原子处或经由碳原子与杂环结合。非芳香族杂环基团包括在其环系统中仅具有4个原子的基团，但芳香族杂环基团在其环系统中必须具有至少5个原子。杂环基团包括苯并稠环系统。4元杂环基团的实例是氮杂环丁基(衍生自氮杂环丁烷)。5元杂环基团的实例是噻唑基。6元杂环基的实例是吡啶基，并且10元杂环基团的实例是喹啉基。非芳香族杂环基团的实例是吡咯烷基、四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、四氢吡喃基、二氢吡喃基、四氢噻喃基、N-哌啶基、吗啉基、硫代吗啉基、噻恶烷基、哌嗪基、氮杂环丁基、氧杂环丁基、硫杂环丁基、高哌啶基、氧杂环庚烷基、硫杂环庚烷基、氧氮杂卓基、二氮杂卓基、硫氮杂卓基、1,2,3,6-四氢吡啶基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、吲哚啉基、2H-吡喃基、4H-吡喃基、二恶烷基、1,3-二氧戊环基、吡唑啉基、二噻烷基、二噻戊环基、二氢吡喃基、二氢噻吩基、二氢呋喃基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、3-氮杂双环[3.1.0]己基、3-氮杂双环[4.1.0]庚基、3H-吲哚基和喹嗪基。芳香族杂环基团的实例是吡啶基、咪唑基、嘧啶基、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异恶唑基、噻唑基、恶唑基、异噻唑基、吡咯基、喹啉基、异喹啉基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、噌啉基、吲唑基、吲哚嗪基、酞嗪基、哒嗪基、三嗪基、异吲哚基、蝶啶基、嘌呤基、恶二唑基、噻二唑基、呋吖基、苯并呋吖基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并恶唑基、喹唑啉基、喹喔啉基、萘啶基和呋喃并吡啶基。上述基团，如衍生自以上所列的基团，在可能的情况下可以是C-附接的或N-附接的。例如，衍生自吡咯的基团可以是吡咯-1-基(N-附接的)或吡咯-3-基(C-附接的)。此外，衍生自咪唑的基团可以是咪唑-1-基或咪唑-3-基(均为N-附接的)或咪唑-2-基、咪唑-4-基或咪唑-5-基(全部为C-附接的)。杂环基团包括苯并稠环系统和经一个或两个氧代(＝O)部分(诸如吡咯烷-2-酮)取代的环系统。视结构而定，杂环基团可以是单基或双基(即，杂环烯基团)。
术语“杂芳基”或可替代地“杂芳香族”是指包括一个或多个选自氮、氧和硫的环杂原子的芳基基团。含N-的“杂芳香族”或“杂芳基”部分是指其中环的骨架原子中的至少一个是氮原子的芳香族基团。杂芳基基团的说明性实例包括以下部分：
等。视结构而定，杂芳基基团可以是单基或双基(即亚杂芳基基团)。
如本文所用，术语“非芳香族杂环”、“杂环烷基”或“杂脂环族”是指一种非芳香族环，其中形成该环的一个或多个原子是杂原子。“非芳香族杂环”或“杂环烷基”基团是指包括至少一个选自氮、氧和硫的杂原子的环烷基基团。这些自由基可以与芳基或杂芳基稠合。杂环烷基环可由三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或超过九个原子形成。杂环烷基环可以任选地经取代。在某些实施例中，非芳香族杂环含有一个或多个羰基或硫代羰基基团，诸如例如含氧和含硫基团。杂环烷基的实例包括但不限于内酰胺、内酯、环状酰亚胺、环状硫代酰亚胺、环状氨基甲酸酯、四氢噻喃、4H-吡喃、四氢吡喃、哌啶、1,3-二恶英、1,3-二恶烷、1,4-二恶英、1,4-二恶烷、哌嗪、1,3-氧硫杂环已烷、1,4-氧硫杂环己二烯、1,4-氧硫杂环已烷、四氢-1,4-噻嗪、2H-1,2-恶嗪、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、巴比妥酸、硫代巴比妥酸、二氧代哌嗪、乙内酰脲、二氢尿嘧啶、吗啉、三恶烷、六氢-1,3,5-三嗪、四氢噻吩、四氢呋喃、吡咯啉、吡咯烷、吡咯烷酮、吡咯烷二酮(pyrrolidione)、吡唑啉、吡唑烷、咪唑啉、咪唑烷、1,3-二氧杂环戊烯、1,3-二氧戊环、1,3-二硫杂环戊烯、1,3-二噻戊环、异恶唑啉、异恶唑烷、恶唑啉、恶唑烷、恶唑烷酮、噻唑啉、噻唑烷和1,3-恶噻戊环。杂环烷基基团(也称为非芳香族杂环)的说明性实例包括：
等。术语杂脂环还包括糖类的所有环形式，包括但不限于单糖、二糖和寡糖。视结构而定，杂环烷基基团可以是单基或双基(即亚杂环烷基基团)。
术语“卤代”或替代地“卤素”或“卤化物”意指氟、氯、溴和碘。
术语“卤代烷基”、“卤代烯基”、“卤代炔基”和“卤代烷氧基”包括其中至少一个氢经卤素原子替换的烷基、烯基、炔基和烷氧基结构。在其中两个或更多个氢原子经卤素原子替换的某些实施例中，卤素原子彼此完全相同。在其中两个或更多个氢原子经卤素原子替换的其他实施例中，卤素原子彼此不完全相同。
如本文所用，术语“氟烷基”是指其中至少一个氢经氟原子替换的烷基基团。氟烷基基团的实例包括但不限于-CF3、–CH2CF3、–CF2CF3、–CH2CH2CF3等。
如本文所用，术语“杂烷基”、“杂烯基”和“杂炔基”包括任选地经取代的烷基、烯基和炔基自由基，其中一个或多个骨架链原子是杂原子，例如氧、氮、硫、硅、磷或其组合。(一个或多个)杂原子可以置于杂烷基基团的任何内部位置或杂烷基基团附接到分子的其余部分的位置处。实例包括但不限于-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3和–CH＝CH-N(CH3)-CH3。另外，至多两个杂原子可以是连续的，诸如例如-CH2-NH-OCH3和–CH2-O-Si(CH3)3。
术语“杂原子”是指除碳或氢以外的原子。杂原子通常独立地选自氧、硫、氮、硅和磷，但不限于这些原子。在其中存在两个或更多个杂原子的实施例中，两个或更多个杂原子可全部彼此相同，或两个或更多个杂原子中的一些或全部可各自不同于彼此。
术语“键”或“单键”是指两个原子或两个部分(当通过键连接的原子被视为较大子结构的一部分时)之间的化学键。
术语“部分”是指分子的特定片段或官能团。化学部分通常是嵌入或附加到分子中的公认化学实体。
“硫代烷氧基”或“烷硫基”基团是指-S-烷基基团。
“烷硫基烷基”基团是指经-S-烷基基团取代的烷基基团。
如本文所用，术语“O-羧基”或“酰氧基”是指式RC(＝O)O-的基团。
“羧基”意指-C(O)OH自由基。
如本文所用，术语“乙酰基”是指式-C(＝O)CH3的基团。
“酰基”是指基团-C(O)R。
如本文所用，术语“氰基”是指式-CN的基团。
如本文所用，单独出现且没有数字标号的取代基“R”是指选自烷基、环烷基、芳基、杂芳基(经由环碳键合)和非芳香族杂环(经由环碳键合)的取代基。
术语“任选地经取代的”或“经取代的”意指所提及的基团可以经一个或多个单独且独立地选自以下的额外基团取代：烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环族、羟基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、烷基亚砜、芳基亚砜、烷基砜、芳基砜、氰基、卤基、酰基、硝基、卤代烷基、氟烷基、氨基(包括单取代和二取代的氨基基团)以及其受保护的衍生物。举例来说，任选的取代基可以是LsRs，其中每个Ls独立地选自键、-O-、-C(＝O)-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NH-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、S(＝O)2NH-、-NHS(＝O)2、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-(经取代或未经取代的C1-C6烷基)或-(经取代或未经取代的C2-C6烯基)；并且每个Rs独立地选自H、(经取代或未经取代的C1-C4烷基)、(经取代或未经取代的C3-C6环烷基)、杂芳基或杂烷基。可以形成上述取代基的保护性衍生物的保护基团是本领域中技术人员已知的并且可见于参考文献，诸如Greene和Wuts，见上文。
如本文所用，关于配制物、组合物或成分的术语“可接受”或“药学上可接受”意指对接受治疗的受试者的总体健康状况没有持久的有害影响，或者不消除化合物的生物活性或特性，并且相对无毒。
如本文所用，术语“受试者”是指人或非人动物。术语“受试者”因此包括哺乳动物，诸如人、灵长类动物、家畜动物(包括牛、猪等)、伴侣动物(例如，犬科动物、猫科动物等)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。
“治疗”病症或患者是指采取步骤以获得有益或期望的结果，包括临床结果。如本文所用，并且如本领域所熟知的，“治疗”是用于获得有益或期望的结果(包括临床结果)的方法。有益的或期望的临床结果可以包括但不限于缓解或改善一种或多种症状或病症、减轻疾病程度，稳定(即不恶化)疾病状态、预防疾病传播、延迟或减缓疾病进展、改善或减轻疾病状态，以及缓解(部分或全部)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”也可以指与未接受治疗的预期存活相比延长存活。
药物或药剂的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是当施用于受试者时将具有预期治疗效果的药物或药剂的量。通过施用一个剂量不一定会产生完全的治疗效果，并且可以仅在施用一系列剂量后才会产生。因此，治疗有效量可以在一次或多次给药中施用。受试者所需的精确有效量将取决于例如受试者的体型、健康状况和年龄，以及待治疗的病症(诸如疼痛，例如神经病性疼痛)的性质和程度。技术人员可以通过常规实验容易地确定对于给定情况的有效量。
如本文所用，术语“约”意指与所述参考值相似的值的范围。在某些实施例中，术语“约”是指落入所述参考值的10％或更小(例如，10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％)的值的范围。
如本文所用，术语“显著”意指至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％。
如本文所用，术语“ICG-PEG缀合物”是指包含PEG和ICG的组合物，其中PEG与ICG缀合。在一些实施例中，组合物包含与PEG或ICG缀合的二级部分。
如本文所用，术语“生化可活化剂”是指可以选择性地与生物分子、酶或离子反应的试剂。
ICG-PEG缀合物
在一个方面，本公开提供ICG-PEG缀合物。
在某些实施例中，ICG-PEG缀合物具有式I：
或其药学上可接受的盐，其中：
L1独立地是任选经取代的亚烷基、卤代亚烷基、亚烯基或亚炔基；
A独立地为-C(O)NH(CH2CH2O)n-、-C(O)O(CH2CH2O)n-、-C(O)S(CH2CH2O)n-、
-NHC(O)CH2O(CH2CH2O)n-、-OC(O)CH2O(CH2CH2O)n-或
-SC(O)CH2O(CH2CH2O)n-，其中(CH2CH2O)-末端连接至B；
n为选自约10至约1000的整数；并且
B独立地为H或任选经取代的烷基。
在某些实施例中，L1为未经取代的C1-6亚烷基或C1-6卤代亚烷基。
在某些实施例中，B为H或未经取代的C1-6烷基。
在某些实施例中，B为经一个或多个-OH、-NH2、-SH或-COOH取代的C1-6烷基。
在某些实施例中，B为-CH2CH2OH、-CH2CH2NH2、-CH2CH2SH、-CH2CH2C(O)OH或-CH2C(O)OH。
在某些实施例中，ICG-PEG缀合物具有下式
或其药学上可接受的盐。
在某些实施例中，n为至少约10、至少约14、至少约18、至少约22、至少约26、至少约30、至少约34、至少约38或至少约42。在某些实施例中，n不超过约1000、不超过约950、不超过约900、不超过约850、不超过约800、不超过约750、不超过约700、不超过约650、不超过约600、不超过约550、不超过约500、不超过约450或不超过约400。
上文提及的n的范围的组合也是可能的(例如，至少约10至不超过900，至少约22至不超过约700)，包括其间的所有值和范围。
在某些实施例中，n为选自约22至约220的整数。在某些实施例中，n为选自约22至约44的整数。在某些实施例中，n为选自约43至约107，例如约43至约90、约43至约85、约43至约80、约43至约75、约43至约70、约43至约65、约43至约60或约43至约55的整数。
在某些实施例中，n为42、43、44、45、46、47、48、49或50。在某些实施例中，n为22。在某些实施例中，n为220。
在某些实施例中，PEG具有约2000Da至约5000Da，例如约2000Da至约4500Da、约2000Da至约4000Da、约2000Da至约3500Da或约2000Da至约3000Da的分子量。
在某些实施例中，ICG-PEG缀合物呈纳米颗粒的形式。在某些实施例中，纳米颗粒具有约0.5nm至约12nm，例如约0.5nm至约10nm、约0.5nm至约8nm、约0.5nm至约6nm、约1nm至约12nm、约1nm至约10nm、约1nm至约8nm或约1nm至约6nm的平均直径。
在某些实施例中，ICG-PEG缀合物进一步包含与PEG或ICG缀合的二级部分。在某些实施例中，二级部分为显像剂、生化可活化剂或治疗剂。
在另一方面，本公开提供了一种包含ICG-PEG缀合物和药学上可接受的载剂的药物组合物。
如本文所用的短语“药学上可接受的载剂”意指药学上可接受的材料、组合物或媒剂，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或囊封材料。每种载剂在与配制物的其它成分相容且对患者无害的意义上必须是“可接受的”。可充当药学上可接受的载剂的材料的一些实例包括：(1)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素以及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)粉状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)赋形剂，如可可脂和栓剂蜡类；(9)油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；(10)二醇，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)藻酸；(16)无热原的水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲溶液；以及(21)药物调配物中所用的其它无毒可相容物质。
药物组合物(制剂)可以通过多种施用途径中的任何一种向受试者施用，这些施用途径包括例如口服(例如，在水性或非水性溶液或混悬液中的浸液(drench)、片剂、胶囊剂(包括分散性胶囊剂(sprinkle capsule)和明胶胶囊剂)、大丸剂、粉剂、颗粒剂、施用于舌头的糊剂)；经由口腔粘膜吸收(例如，舌下)；皮下；经皮(例如作为施加至皮肤上的贴剂)；和局部(例如，作为施加至皮肤上的乳膏、软膏或喷雾剂)。该化合物也可以经配制以用于吸入。在某些实施例中，化合物可以简单地溶解或悬浮于无菌水中。合适的施用途径和适用于其的组合物的细节可见于，例如，美国专利第6,110,973号、第5,763,493号、第5,731,000号、第5,541,231号、第5,427,798号、第5,358,970号和第4,172,896号以及其中引用的专利中。
配制物可以方便地以单位剂型呈现并且可以通过制药业领域中熟知的任何方法来制备。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将取决于所治疗的宿主、特定的施用模式而变化。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常将是产生治疗效果的化合物的量。通常，在100％中，该量将在活性成分的约1％至约99％，优选地约5％至约70％，最优选地约10％至约30％的范围内。
适于口服施用的配制物可以呈胶囊剂(包括分散性胶囊剂和明胶胶囊剂)、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂(使用调味基质，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)、亲液胶体(lyophile)、粉剂、颗粒剂的形式；或作为水性或非水性液体中的溶液或悬浮液；或作为水包油或油包水液体乳剂；或作为酏剂或糖浆；或作为软锭剂(使用惰性基质，诸如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶)；和/或作为漱口剂等，各自含有预定量的本发明化合物作为活性成分。组合物或化合物也可以作为大丸剂、药糖剂或糊剂施用。
使用ICG-PEG缀合物的方法
本文所描述的ICG-PEG缀合物可用于多种应用，包括但不限于诊断和治疗应用。
在一个方面，本文所描述的ICG-PEG缀合物可用于测量受试者中内流转运体或外排转运体的表达水平。在一些实施例中，ICG-PEG缀合物可用于鉴别在性别、年龄等方面存在差异的健康人中内流转运体或外排转运体表达的差异。这可以为个性化医疗提供有用的信息。
因此，本公开提供了一种测量受试者中内流转运体或外排转运体的表达水平的方法，该方法包括：(a)向受试者施用ICG-PEG缀合物；(b)确定从受试者获得的生物学样品中ICG-PEG缀合物的浓度；以及(c)基于ICG-PEG缀合物的浓度确定内流转运体或外排转运体的表达水平。
本公开还提供了一种测量受试者中内流转运体或外排转运体的表达水平的方法，该方法包括：(a)向受试者施用ICG-PEG缀合物；(b)测量来自受试者的组织中的ICG-PEG缀合物的信号的强度；以及(c)基于强度确定内流转运体或外排转运体的表达水平。
在某些实施例中，表达水平为绝对表达水平。在某些实施例中，表达水平为相对表达水平。例如，表达水平可以相对于具有不同性别和/或年龄的人群中的表达水平。
在一个方面，本文所描述的ICG-PEG缀合物可用作诊断应用的标记物，这些诊断应用包括但不限于监测内流转运体活性、监测外排转运体活性、监测肾分泌功能、监测肝功能以及诊断或检测与内流转运体或外排转运体的异常表达相关联的疾病或病症。在某些实施例中，本文所描述的ICG-PEG缀合物可用作外源性标记物，例如，用于血液或尿液样品。
因此，本公开提供了一种诊断受试者中与内流转运体或外排转运体的异常表达相关联的疾病或病症的方法，该方法包括：(a)向受试者施用ICG-PEG缀合物；(b)确定从受试者获得的生物学样品中ICG-PEG缀合物的浓度；(c)将ICG-PEG缀合物的浓度与第一参考水平进行比较；以及(d)若ICG-PEG缀合物的浓度显著高于或低于第一参考水平，则确定受试者患有该疾病或病症。
内流转运体的异常表达可能意味着与正常组织中的表达水平相比，内流转运体的上调或下调。外排转运体的异常表达可能意味着与正常组织中的表达水平相比，外排转运体的上调或下调。
在某些实施例中，第一参考水平是从健康受试者获得的相应生物学样品中ICG-PEG缀合物的浓度。在某些实施例中，健康受试者具有与受试者相同的性别和/或相似的年龄。
本公开还提供了一种监测受试者的肾分泌功能的方法，该方法包括：(a)向受试者施用ICG-PEG缀合物；(b)确定在第一时间点从受试者获得的第一生物学样品中ICG-PEG缀合物的第一浓度；(c)确定在第二时间点从受试者获得的第二生物学样品中ICG-PEG缀合物的第二浓度，其中第二时间点在第一时间点之后；(d)基于第一浓度和第二浓度确定肾清除动力学；以及(e)任选地将肾清除动力学与第二参考水平进行比较。
在某些实施例中，第一时间点可以在施用ICG-PEG缀合物之后的至少约1分钟、至少约30分钟、至少约一小时、至少约90分钟或至少约两小时。在某些实施例中，第二时间点可以在第一时间点之后的至少约5分钟、至少约30分钟、至少约一小时、至少约90分钟、至少约两小时或更长时间。为了确定肾清除动力学，可以使用超过两个时间点(例如，三个、四个或五个时间点)。
在某些实施例中，该方法进一步包括：若肾清除动力学显著高于或低于第二参考水平，则确定受试者具有异常肾分泌功能。
在某些实施例中，第二参考水平是健康受试者的肾清除动力学。在某些实施例中，健康受试者具有与受试者相同的性别和/或相似的年龄。
在某些实施例中，生物学样品可以为血液、血浆、血清、尿液、组织活检切片、细胞、多个细胞、粪便物或唾液。在某些实施例中，生物学样品为血液样品。在某些实施例中，生物学样品为尿液样品。
不希望受理论的束缚，由于PEG分子量小于2kDa的ICG-PEG缀合物可经由肝和肾两者消除，肝损伤将减慢其经由肝脏途径的消除，但会增加其肾清除。因此，某些ICG-PEG缀合物可用于检测肝脏疾病。本公开提供了一种检测受试者的肝脏疾病的方法，该方法包括：(a)向受试者施用ICG-PEG缀合物，其中PEG具有小于2kDa的分子量；(b)确定从受试者获得的尿液样品中ICG-PEG缀合物的浓度；(c)将ICG-PEG缀合物的浓度与第三参考水平进行比较；以及(d)当ICG-PEG缀合物的浓度显著低于第三参考水平时，确定受试者患有肝脏疾病。在某些实施例中，PEG分子量在约100Da与约2kDa之间的ICG-PEG缀合物可经由肝和肾两者消除。因此，在某些实施例中，用于检测肝脏疾病的缀合物中的PEG具有至少约100Da至小于约2kDa，例如在约100Da与约1800Da之间、在约100Da与约1600Da之间、在约100Da与约1400Da之间、在约100Da与约1200Da之间、在约100Da与约1000Da之间、在约100Da与约800Da之间、在约100Da与约600Da之间、在约200Da与约1800Da之间、在约200Da与约1600Da之间、在约200Da与约1400Da之间、在约200Da与约1200Da之间、在约200Da与约1000Da之间、在约200Da与约800Da之间或在约200Da与约600Da之间的分子量。
在某些实施例中，第三参考水平是从健康受试者获得的尿液样品中ICG-PEG缀合物的浓度。在某些实施例中，健康受试者具有与受试者相同的性别和/或相似的年龄。
在另一方面，本文所描述的ICG-PEG缀合物可用作显像剂，其被配置为产生具有可测量强度的信号。通过测量在将ICG-PEG缀合物施用于受试者后来自该缀合物的信号的强度，此允许技术人员/医生鉴别患病组织、监测内流转运体活性、监测外排转运体活性或检测与内流转运体或外排转运体的异常表达相关联的疾病或病症。
在某些实施例中，测量来自组织中的ICG-PEG缀合物的信号的强度仅仅测量强度而没有空间信息。
在某些实施例中，测量来自组织中的ICG-PEG缀合物的信号的强度包括对组织进行成像以便产生组织中ICG-PEG的强度和空间信息。在某些实施例中，ICG-PEG缀合物可用作正像造影剂。
因此，本公开提供了一种监测受试者的肾分泌功能的方法，该方法包括：(a)向受试者施用ICG-PEG缀合物；(b)在第一时间点测量来自受试者的组织中的ICG-PEG缀合物的信号的第一强度；以及(c)在第二时间点测量来自受试者的组织中的ICG-PEG缀合物的信号的第二强度。因此，该方法可以允许对肾分泌功能进行时间监测。
在某些实施例中，监测肾分泌功能的方法进一步包括将第二强度与第一强度进行比较，并且若第二强度显著高于或低于第一强度，则确定肾分泌功能异常或恶化。
在某些实施例中，监测肾分泌功能的方法进一步包括基于第一强度和第二强度确定肾清除动力学；以及(e)任选地将肾清除动力学与第二参考水平进行比较，如上文所讨论。
在某些实施例中，第一时间点可以在施用ICG-PEG缀合物之后的至少约1分钟、至少约30分钟、至少约一小时、至少约90分钟或至少约两小时。在某些实施例中，第二时间点可以在第一时间点之后的至少约5分钟、至少约30分钟、至少约一小时、至少约90分钟、至少约两小时或更长时间。监测肾分泌功能的方法可以使用超过两个时间点(例如三个、四个或五个时间点)来确定强度动力学。每个时间点可以与其之前的时间点相隔至少约5分钟、至少约30分钟、至少约一小时、至少约90分钟、至少约两小时或更长时间。
在某些实施例中，按需要的频率测量强度，例如，每三小时、每2.5小时、每两小时、每1.5小时、每小时、每30分钟、每20分钟、每10分钟或每5分钟进行测量。
在某些实施例中，按需要的时长进行测量，例如，在几小时至几周内，例如，约6小时、约12小时、约18小时、约24小时、约两天、约四天、约八天或约16天。
在某些实施例中，监测肾分泌功能的方法进一步包括：若肾清除动力学显著高于或低于第二参考水平，则确定受试者具有异常肾分泌功能。肾分泌功能异常可随后用于诊断与内流转运体或外排转运体的异常表达相关联的疾病或病症。
本公开还提供了一种诊断受试者中与内流转运体或外排转运体的异常表达相关联的疾病或病症的方法，该方法包括：(a)向受试者施用ICG-PEG缀合物；(b)测量来自受试者的组织中的ICG-PEG缀合物的信号的强度；(c)将强度与第四参考水平进行比较；以及(d)若强度明显高于或低于第四参考水平，则确定受试者患有该疾病或病症。
在某些实施例中，测量强度包括对组织进行成像，其提供至少约1.5的对比指数。在某些实施例中，第四参考水平是来自受试者或健康受试者的相应正常组织中的ICG-PEG的信号的强度。在某些实施例中，健康受试者具有与受试者相同的性别和/或相似的年龄。
在某些实施例中，该强度显著高于或低于第四参考水平，这是由于与附近的正常组织或正常状态相比上调或下调的转运体所致。
测量强度可以利用荧光成像、光声成像、计算机断层扫描(CT)、正电子发射断层扫描(PET)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)或磁共振成像(MRI)。组织可以为血液、身体部位或其一部分、器官或其一部分或诸如肿瘤的患病组织。例如，器官可以为肾或膀胱。可以有创方式(即在从受试者获得的生物学样品上)或无创方式测量强度。关于无创测量，多种装置可用于测量来自ICG-PEG缀合物的信号的强度。例如，可以使用透皮光学装置(例如指夹式血氧计)。在某些实施例中，便携式透皮光学装置用于测量来自ICG-PEG缀合物的信号的强度。
视用于测量信号的方法而定，信号可以为光学信号(例如荧光)、超声信号、放射性信号(例如X射线信号或γ射线信号)或无线电波。
测量强度可以提供关于组织的时间和/或空间信息。
在又一方面，本公开提供了一种治疗有此需要的受试者的与内流转运体或外排转运体的异常表达相关联的疾病或病症的方法，该方法包括向受试者施用ICG-PEG缀合物。
视ICG-PEG缀合物的组成而定，治疗方法可以有所不同。例如，已知ICG是光热转换剂或光动力剂，因此在施用ICG-PEG缀合物后，可以将电磁辐射施加到受试者上以经由光热或光动力疗法来治疗该疾病或病症。
在上述方面中任一者的某些实施例中，内流转运体包括但不限于有机阴离子转运体家族(OAT，诸如OAT1、OAT2、OAT3和OAT4)、有机阴离子转运多肽(OATP，诸如OATP4A1和OATP4C1)、有机阳离子转运体家族(OCT，诸如OCT2、OCT3)、平衡型核苷转运体1和2(ENT1和ENT2)和有机溶质转运体α和β(OSTα和OSTβ)。
在上述方面中任一者的某些实施例中，外排转运体包括但不限于P-糖蛋白(P-gP；也称为多药耐药蛋白1(MDR1))、多药耐药蛋白2和4(MRP2和MRP4)、有机阳离子转运体(OCT，诸如新颖OCT(OCTN)1、OCTN2、多药和毒素排出蛋白(MATE)1和MATE肾特异性2)、有机阴离子转运多肽家族(OATP)、乳腺癌耐药蛋白(BCRP)和有机阴离子转运体4(OAT4)。
其他内流/外排转运体：肽转运体、PDZ结构域、1型钠/磷酸盐共转运体(NPT1)、URAT1、BSP/胆红素结合蛋白(BBBP)。
在上述方面中任一者的某些实施例中，受试者具有以下项的上调或下调表达：P-糖蛋白(P-gp)、多药耐药蛋白2(MRP2)、MRP4、有机阳离子转运体(OCT)、有机阴离子转运体(OAT)、有机阴离子转运多肽(OATP)、乳腺癌耐药蛋白(BCRP)或有机阴离子转运体4(OAT4)、平衡型核苷转运体1(ENT1)、ENT2、有机溶质转运体α(OSTα)或OSTβ。
在上述方面中任一者的某些实施例中，与内流转运体或外排转运体的异常表达相关联的疾病或病症为肾小管分泌功能障碍或肾小管损伤。
在上述方面中任一者的某些实施例中，肾小管分泌功能障碍或肾小管损伤为近端肾小管分泌功能障碍或近端肾小管损伤。
在上述方面中任一者的某些实施例中，肾小管分泌功能障碍或肾小管损伤与选自以下项的肾脏疾病或病症相关联：急性肾损伤、慢性肾损伤、肾癌、狼疮肾炎、糖尿病诱发性肾损伤、多囊肾病、败血症、肾炎、肾移植排斥以及由其他组织和器官中的疾病诸如癌症和肝脏疾病引起的肾功能障碍或肾损伤。
在上述方面中任一者的某些实施例中，与内流转运体或外排转运体的异常表达相关联的疾病或病症为肾癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、骨癌或结肠癌，或它们在其他器官或正常组织中的转移。
在某些实施例中，肾癌为肾细胞癌或肾嗜酸细胞瘤，或它们在其他器官或正常组织中的转移。
在某些实施例中，肾癌为肾细胞癌。在某些实施例中，肾细胞癌为透明细胞肾细胞癌(ccRCC)或乳头状RCC(pRCC)。
在某些实施例中，乳腺癌为三阴性乳腺癌，或其在其他器官或正常组织中的转移。在某些实施例中，三阴性乳腺癌为4T1或MCF-7三阴性乳腺癌。
在上述方面中任一者的某些实施例中，ICG-PEG缀合物经静脉内、腹膜内、皮下或动脉内施用。在上述方面中任一者的某些实施例中，ICG-PEG缀合物经静脉内施用。
实例
为了可以更充分地理解本文描述的发明，阐述以下实例。本申请中描述的实例经提供以说明本文所提供的化合物、药物组合物和方法，并且不应以任何方式解释为限制其范围。
实验程序：
材料和设备
自Sigma-Aldrich(美国)购得平均分子量为1100Da、2100Da、3500Da、5000Da和10100Da的PEG样品。分别自Intrace Medical(瑞士)和LI-COR购得ICG-NHS和IRDye800CW-NHS。通过Virian 50Bio UV-可见光分光光度计测量吸收光谱。通过PTI QuantaMasterTM30荧光分光光度计(Birmingham,NJ)获取荧光光谱。使用Carestream In-vivo FX Pro成像系统记录体内荧光图像。使用Olympus IX-71倒置荧光显微镜结合Photon Max 512CCD相机(Princeton Instruments)获得培养细胞和组织切片的光学图像。通过Bio-Rad Mini-SubCell GT系统进行琼脂糖凝胶电泳。根据德克萨斯大学系统机构动物护理和使用委员会(University of Texas System Institutional Animal Care and Use Committee)的指导方针进行动物研究。自Envigo购得BALB/c小鼠(BALB/cAnNCr，品系代码047)，6-8周龄，体重20-25g。同样自Envigo购得裸鼠(Athymic NCr-nu/nu，品系代码069)，6-8周龄，体重20-25g。将所有这些小鼠随机分配并安置在标准环境条件(23±1℃、50±5％湿度和12/12h光/暗循环)下，可自由饮水并获取标准实验室食物。
ICG-PEG缀合物的合成
将400μL于超纯水中的10mM PEG分子加入到400μL于DMSO中的400μM ICG-NHS中，并将混合物涡旋3h。接着用葡聚糖凝胶柱从未缀合的ICG和PEG分子中纯化出ICG-PEG缀合物，其中流动相为超纯水。ICG、ICG-PEG22、ICG-PEG45和ICG-PEG220在葡聚糖凝胶柱和琼脂糖凝胶中的不同迁移率均证明了ICG-PEG缀合物的成功合成。IRDye800CW-PEG45的合成方式与ICG-PEG45的合成方式类似，并且先前已报道了详细的程序。
血清蛋白结合测试
为了测试PEG缀合是否会影响ICG的蛋白质结合，将游离ICG、ICG-PEG22、ICG-PEG45和ICG-PEG220与磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)或补充有10％(v/v)胎牛血清(FBS)的PBS在37℃孵育30min。为了鉴别出无色蛋白质条带，将FBS孵育的ICG和ICG-PEGn由10％(v/v)考马斯亮蓝250(CBB 250)染色。使用2％琼脂糖凝胶电泳分析所有这些样品。除了凝胶电泳之外，ICG和ICG-PEGn的蛋白质结合也通过量化其在水中和在100％ FBS(相同浓度，但不同溶剂)中的荧光强度来测试，如图18A-18C中所示。通过Carestream In-vivo FX Pro成像系统在790nm/830nm下拍摄荧光图像。
利用ICG-PEG缀合物和离体图像对身体进行无创荧光成像
使去除毛发的BALB/c小鼠(约25g/小鼠)在3％异氟醚麻醉下俯卧于CarestreamIn-vivo FX Pro成像系统的成像台上，并且接着以200μL 40μM ICG或ICG-PEG缀合物进行静脉内注射，之后开始连续时序成像收集持续10min。荧光成像参数设置如下：EX760/EM830nm；10秒曝光时间；2×2像素组合。在注射后10min时，采集肝、肾、心脏、脾和膀胱中的尿液，并在EX790/EM830 nm、10秒曝光下进行成像。
尿液和粪便中ICG-PEG缀合物的清除效率
以40μM浓度和200μL注射体积，向BALB/c小鼠分别静脉内注射ICG(n＝3)、ICG-PEG缀合物(每种缀合物n＝3)，并接着置于代谢笼中。在注射后24h时收集ICG、ICG-PEG22、ICG-PEG45和ICG-PEG220的分离的小鼠尿液和粪便。接着，基于荧光对尿液和粪便进行量化，并以对照尿液和对照粪便建立缀合物的每条标准曲线。
使用ICG-PEG45对肾进行无创荧光成像
使用3％异氟醚麻醉去除毛发的BALB/c小鼠，并将充满PBS的导管插入尾静脉。将带有尾静脉导管的小鼠以仰卧位放置于Carestream In-vivo FX Pro成像系统的成像台上，使其背部朝向激发光和CCD相机。向稳定呼吸频率为每15秒10-14次的小鼠注射ICG-PEG45的PBS溶液(200μL，40μM)，并接着随后针对ICG-PEG45在EX790/EM830 nm下进行连续时序成像(10秒曝光)收集。
利用光学显微镜的肾切片成像
将BALB/c小鼠在静脉内施用200μL 400μM ICG-PEG45后5min、10min和1h时处死。而且，将其他BALB/c小鼠在静脉内施用200μL 400μM 800CW-PEG45后5min和1h时处死。接着收集肾并立即固定于10％中性缓冲福尔马林中，随后进行标准脱水和石蜡包埋。接着将包埋的组织切成4μm切片并进行H&E染色。将最终的切片在Olympus IX-71荧光显微镜下观察。用于ICG-PEG45的滤光片为EX775/EM845和二向色镜810nm。用于800CWPEG45的滤光片为EX747/EM780LP和二向色镜776nm。
丙磺舒抑制研究
将BALB/c小鼠通过腹膜内注射200mg/kg丙磺舒进行预处理，并将对照组通过PBS进行处理。在30min后，将ICG-PEG45、800CW-PEG45和FITC-菊粉分别静脉内注射到对照组小鼠和经丙磺舒处理的小鼠中，每组n＝3。将小鼠在每15秒7-8次的稳定呼吸频率下在3％异氟醚下麻醉30min。在30min后，从膀胱收集尿液并通过荧光量化。
RCC和RCC转移模型的建立
原位模型(即海绵模型)：通过进行单侧肾移植来建立原位模型[2]。简而言之，使用6-8周龄的NOD/SCID小鼠通过1.0-cm的背部切口进行手术。用毛细管将与 (Ethicon,Somerville,NJ)混合的细胞悬浮液(1-2×106个细胞)植入左肾的被膜下空间。使用/>Spectrum(PerkinElmer,Waltham,MA)通过生物发光成像监测肿瘤生长。PDX(患者来源的异种移植物)模型使用来自UT Southwestern Kidney Cancer和SPORE项目的冷冻RCC-PDX组织样品(20-30mm3)。如先前所描述，将组织以手术方式植入至6-8周龄的雄性NOD/SCID小鼠的左肾中。通过将RCC细胞经由尾静脉而静脉内注射至6-8周龄的雄性NOD/SCID小鼠中来建立转移性肿瘤模型。通过生物发光成像监测肿瘤。所有实验程序均经机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)批准。当准备好上述肿瘤时，将40μM 200μL ICG-PEG45静脉内注射至小鼠中。在注射ICG-PEG45后24h时(原位模型)、68h时(PDX)收集正常右肾和具有RCC的左肾并进行成像。在注射ICG-PEG45后24h时收集转移性肿瘤并进行成像。
使用ICG-PEG45对植入RCC的肾进行无创荧光成像
使用3％异氟醚麻醉去除毛发的植入RCC的NOD/SCID小鼠，并将充满PBS的导管插入尾静脉。将带有尾静脉导管的小鼠以仰卧位放置于Carestream In-vivo FX Pro成像系统的成像台上，使其背部朝向激发光和CCD相机。在EX790/EM830 nm(10秒曝光)下在注射ICG-PEG45(200μL，40μM)后30min、1h、3h、5h、12h和24h时对小鼠进行成像。
离体RCC荧光成像
将植入原位乳头状RCC的NOD/SCID小鼠在静脉内注射ICGPEG45后24h时(PDXccRCC，68h)处死。收集植入RCC的左肾和正常右肾两者并切成两半以用于EX790/EM830 nm下的离体荧光成像。接着将植入RCC的左侧肾立即固定于10％中性缓冲福尔马林中，随后进行标准脱水和石蜡包埋。接着将包埋的组织切成4μm切片并进行H&E染色。将最终的切片在Olympus IX-71荧光显微镜下观察。用于ICG-PEG45的滤光片为EX775/EM845和二向色镜810nm。
通过蛋白质印迹法测量P-gP表达
使用放射免疫沉淀测定缓冲液(RIPA缓冲液，150mM NaCl、1％ Triton X-100、50mM Tris pH 8.0、0.5％脱氧胆酸钠和0.1％十二烷基硫酸钠，含有1％蛋白酶抑制剂混合物[Roche,Indianapolis,IN])裂解乳头状肾细胞癌细胞(529B)、正常近端肾小管细胞(HK2)、正常肾组织和RCC组织(ACHN肿瘤)，并将来自每个样品的相同量(30μg)的蛋白质在4％-12％梯度的Bolt凝胶(Life Technologies)上进行电泳，接着电印到硝酸纤维素膜上。将膜与5％脱脂奶粉(w/v)孵育1h，并接着在含有0.1％ Tween-20的PBS中洗涤。接着将膜与经设计的一级单克隆抗体(MA1-26528，Invitrogen，Carlsbad，CA)和与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的相应二级抗体在室温下孵育1h。使用Western Bright Quantum HPRSubstrate Kit(Advansta,Menlo Park,CA)，利用fluorChem数字成像系统(AlphaInnotech,San Leandro,CA)检测靶蛋白(P-gP)。对于细胞水平下P-gP表达的测量，肌动蛋白用作内部上样对照，并且对于组织水平下P-gP表达的测量，GAPDH用作内部上样对照。
抑制剂处理前后HK2和529B对ICG-PEG45的细胞摄取
将乳头状肾细胞癌细胞(529B)、正常肾近端小管细胞(HK2)(1ⅹ105)接种于培养皿(n＝3)中，并使其贴壁且生长24h。将这些细胞与25μM ICG-PEG45在具有或不具有20μM环孢菌素A(Adipogen Life Sciences(San Diego,CA))或10μM Tariquidar(MedChemexpress(Monmouth Junction,NJ))的情况下在细胞孵育箱中孵育1小时。加入相同体积的DMSO作为对照。在1h孵育后，将细胞用冰冷的HEPES缓冲溶液洗涤3次，并用1mL HEPES缓冲溶液维持以用于成像。使用具有激发为710nm、发射为830nm的ICG通道的荧光显微镜对细胞进行进一步成像。曝光时间设置如下：明视场为0.01s；荧光成像为5s。对于每个培养皿，从4个随机区域拍摄4张图像。使用ImageJ量化每个细胞内ICG的平均强度。重复实验3次，结果相似。
统计分析
误差条报告为平均值±s.d.通过学生t检验的分析来比较组间差异。P值<0.05视为在统计学上显著。N.S.意味着无显著差异，p值>0.05。进行实验的研究人员并未被设盲。
实例1.PEG45改变ICG的清除
很容易经由ICG的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯与PEG45(MW，2100Da)分子的氨基之间的反应合成ICG-PEG45(图13)。将未反应的ICG和PEG45基于其疏水性和大小的差异，经由基于葡聚糖凝胶的凝胶过滤来去除。ICG-PEG45表现出与游离ICG相同的吸收和光致发光特性(图14)，这允许对其在肾中的输送和肿瘤靶向进行原位荧光监测。虽然已知ICG可强烈结合蛋白质，但PEG45分子的缀合显著降低了ICG对血清蛋白的亲和力(图15)，这是因为与游离ICG的疏水性(logD＝0.68，图1A)相比，ICG-PEG45的疏水性显著降低(logD＝-1.17)。由于强烈的血清蛋白结合，游离ICG在静脉内注射后迅速输送到肝中，从而导致肾中的积聚很少并且尿液中检测不到信号(图1B)。相比之下，PEG45的缀合将消除ICG的器官从肝转变为肾(图1B)。
为了量化具有或不具有PEG45缀合的ICG的清除途径方面的差异，分别收集了静脉内注射ICG和ICG-PEG45的小鼠在24小时内的粪便和尿液。如图1C中所示，在粪便中发现了85.3％ ID(注射剂量百分比)的游离ICG，其是ICG-PEG45(2.9％ ID)的29.8倍，而在尿液中检测不到游离ICG，并在注射后24h内在尿液中发现了92.9％ ID的ICG-PEG45。结合体内成像和离体清除研究表明，PEG45的缀合几乎完全将消除ICG的途径从肝清除转变为肾清除。
除了PEG45(MW，2100Da)之外，PEG22(MW，1100Da)和PEG220(MW，10100Da)也分别与ICG缀合。ICG-PEG22和ICG-PEG220保留了与游离ICG相同的吸收和光致发光特性(图16)，并使我们能够对体内输送和离体组织分布进行荧光成像(图17)。通过量化粪便和尿液中的ICG量，发现了肝胆清除和肾清除中两种独特的MW依赖性标度律(图1D)。第一，粪便中ICG的量会随着PEG分子量的增加而减少，这与其对血清蛋白的MW依赖性抗性强相关(图18A、18B和18C)。第二，ICG-PEG22(28.9％ID)和ICG-PEG220(44.9％ID)的肾清除效率均低于ICG-PEG45的肾清除效率，清楚地表明PEG45在调整ICG的肾清除方面的有用性。
实例2.ICG-PEG45的肾小管分泌
为了解ICG-PEG45如何经由肾消除，我们首先使用体内荧光成像来以无创方式监测ICG-PEG45的肾清除动力学。有趣的是，肾中ICG-PEG45的荧光信号在静脉内注射后(p.i.)约5min时迅速达到其最大值，并在30min时间段内保持平稳(图1E)。这种现象不同于对于肾小球滤过的聚乙二醇化有机染料的观察结果，这些聚乙二醇化有机染料诸如IRDye800CW-PEG45(800CW-PEG45)，其中来自肾的荧光信号在静脉内注射后约2min时达到峰值，随后在30min内快速衰减(图1E中的虚线)。在静脉内注射后30min内仍然观察到肾中ICG-PEG45信号的这种平稳状态，即使当注射剂量减少10倍也是如此(图19A和19B)，这表明ICG-PEG45的消除在早期阶段迅速达到平衡，并且消除动力学由肾隔室主动控制。在一小时后，肾中ICG-PEG45的平稳状态逐渐消失，并且随后进入下降阶段(图20A和20B)，这与ICG-PEG45最终经由肾进入尿液而消除的情况一致。
为了揭示ICG-PEG45的独特时间依赖性肾荧光曲线的起源，在静脉内注射后5min、10min和1h时，采集来自静脉内注射ICG-PEG45的小鼠的肾，并接着用荧光显微镜成像研究肾中的分布。在静脉内注射后5min(图1F，右侧)和10min(图21)时，ICG-PEG45的荧光信号主要位于管周毛细血管，分别是肾小球和近端肾小管的荧光信号的约4.5倍和约8.5倍(图22A)。相比之下，800CW-PEG45(图1F左侧)在5min时主要位于肾小球和近端肾小管的管腔侧，这是由于快速肾小球滤过及其快速肾清除导致在静脉内注射后1h时来自肾的信号非常弱所致。明显地，在静脉内注射后1h时，近端肾小管的ICG-管腔侧的管周空间信号变得更容易区分(图1F和图22B)。ICG-PEG45与800CW-PEG45不同的肾分布表明不同的肾消除途径，并且ICG-PEG45可以经由从管周毛细血管(PTC)转运进入肾小管间质(TI)并最终到达近端肾小管腔而直接被清除到尿液中(即肾小管分泌的过程)。
为了进一步证实在分子水平下ICG-PEG45的活跃肾小管分泌机制，用丙磺舒(一种有机阴离子转运体抑制剂)处理小鼠以抑制肾基底外侧摄取过程而不改变肾小球滤过(图23)。作为对照，还在相同的丙磺舒处理下研究了800CW-PEG45。如图1G中所示，在静脉内注射后30min时，丙磺舒的施用显著降低了ICG-PEG45的肾清除效率，但并不影响800CW-PEG45的清除，这表明有机阴离子转运体依赖性活跃肾小管分泌参与ICG-PEG45的肾转运。800CW-PEG45与ICG-PEG45之间的肾消除途径的差异与母体分子的固有特性密切相关，这是因为游离800CW与身体没有特异性相互作用并经由肾小球被快速过滤，而游离ICG已知与多种有机阴离子转运体结合。在PEG45缀合后观察到的肾小管分泌ICG表明，PEG45增强了ICG对近端肾小管细胞的基底外侧上有机阴离子转运体的亲和力(图1H)，同时降低了其对参与肝胆清除的转运体的亲和力。
实例3.用ICG-PEG45对原发性肾癌进行超荧光成像
ICG-PEG45的新颖肾小管分泌途径使得能够研究起源于肾小管的肾细胞癌是否可以通过与近端小管具有强烈相互作用的分子进行靶向。首先建立乳头状RCC(pRCC)的原位异种移植模型，其是一种通过被动靶向剂(诸如ICG)和主动靶向剂(诸如111In-DOTA-吉妥昔单抗(girentuximab)-IRDye800CW)都难以靶向的RCC类型，这是由于其碳酸酐酶IX(CAIX)的表达较低。将乳头状RCC 529B细胞(表达的荧光素酶)以手术方式植入小鼠左肾的被膜下空间，并且使右肾的肾功能保持正常(图2A)。当RCC肿瘤发展到可以通过生物发光成像在左肾中可靠地检测到的大小时，将ICG-PEG45静脉内注射至小鼠中，并且接着进行无创体内荧光成像。如图2B和2C中所示，最初(在约1-5小时内)从对侧右肾观察到的荧光强度高于来自具有pRCC的左肾的荧光强度，这是因为ICG-PEG45经由正常功能化的右肾而快速转运。随着ICG-PEG45经由右侧正常肾逐渐消除，随着时间的推移，从具有pRCC的左肾观察到的荧光强度变得高于对侧肾。还对24h时的肾峰值强度的清除百分比(定义为[峰值-24h时的强度]/峰值]×100％)进行量化，并发现左pRCC肾的值为29.86±3.12％，其是对侧肾的值(65.15±5.09％)的2.18倍低(图2D)，这表明与正常肾相比，pRCC肾中ICG-PEG45的滞留时间较长。这两个肾在注射后24h时的离体荧光成像(图2E)进一步证实，ICG-PEG45在pRCC肾中的延长滞留特定发生在肿瘤区域：ICG-PEG45在癌性肾组织中的荧光强度高于在正常对侧肾中的荧光强度，这清楚地表明ICG-PEG45能够以高荧光方式点亮pRCC癌性组织并还能区分肿瘤与正常组织的边界。通过使用荧光显微镜进一步定位ICG-PEG45在pRCC组织中的分布(图2F)，观察到ICG-PEG45被肾癌细胞摄取，这清楚地表明ICG-PEG45可以选择性地靶向肾癌细胞。不限于pRCC，ICG-PEG45还在患者来源的异种移植物(PDX)模型中以高荧光方式点亮透明细胞RCC(ccRCC)，并成功区分肿瘤与正常组织的边界(图2G)，这表明ICG-PEG45在检测多种类型的RCC中的普遍适用性。
作为对照，还研究了游离ICG(经由肝胆清除而清除)和800CW-PEG45(经由肾小球滤过而清除)的肾癌靶向作用，其二者均不能到达近端肾小管的基底外侧。如图24A和24B中所示，其两者均未能以高荧光方式点亮肾中的RCC，并且对于ICG和800CW-PEG45，肿瘤区域的对比指数分别为0.95和0.33(低荧光)，这是ICG-PEG45的1.59倍和4.58倍低(图2H)。此外，ICG还缀合到肾可清除的谷胱甘肽包被的Au25簇上以增强其在肾中的肾小球滤过，但我们发现其仍然无法选择性地越过正常肾组织而靶向原发性肾癌(图25)。这进一步证实，ICG的肾癌靶向强烈依赖于其在肾中的消除途径(图2I)，且肾小管分泌途径允许ICG经由近端肾小管的基底外侧靶向癌性肾小管细胞。
实例4.ICG-PEG45在正常肾细胞和癌性肾细胞中的不同外排转运动力学
基于肾小管分泌的机制，分子从近端肾小管细胞到近端肾小管管腔中的细胞外排是由位于近端肾小管细胞顶端膜上的外排转运体决定的，这些外排转运体起到泵的作用以消除外源性物质以及决定细胞内药物的积聚。众所周知，P-糖蛋白(P-gP)外排转运体参与肾小管分泌中许多有机分子的转运。通过使用蛋白质印迹法量化正常近端肾小管细胞(HK2)、乳头状肾癌细胞(529B)上的P-gP表达水平以及其在正常肾组织和乳头状肾癌组织(ACHN肿瘤)上的表达水平(图3A)，我们发现肾癌组织中P-gP外排转运体的表达在细胞水平和组织水平下均显著低于正常近端肾小管细胞和正常肾组织，这与所报道的文献一致。因此，我们假设ICG-PEG45在肾癌组织中的长期滞留可能与其P-gP外排转运体的低表达密切相关。
为了验证我们的假设并揭示ICG-PEG45在分子水平下对肾癌的选择性靶向作用，我们研究了在P-gP抑制剂处理前后ICG-PEG45在正常人近端肾小管细胞(HK2)和肾癌细胞(529B，乳头状RCC细胞系)中的体外细胞滞留。在与ICG-PEG45在37℃孵育1h后，用冷HEPES缓冲液洗涤正常细胞和癌细胞以去除培养基中的游离ICG-PEG45，并使用荧光显微镜量化两种细胞的荧光强度。如图3B中所示，ICG-PEG45被两种细胞系有效摄取；但乳头状RCC细胞的平均发射强度是HK2细胞的平均发射强度的约1.52倍(图3C)。一旦我们用P-gP抑制剂环孢菌素A(CSA)处理了细胞(图3B和3C)，我们发现CSA处理增加了正常HK2细胞中ICG-PEG45的强度，但没有显著影响RCC细胞系(529B)中ICG-PEG45的强度，这证实了P-gP外排转运体确实参与了正常近端肾小管细胞ICG-PEG45的分泌。此外，这一发现还表明，与正常肾小管细胞相比，由于缺乏P-gP外排转运体，肾癌细胞中ICG-PEG45的外排受到损害。此外，当外排被CSA处理抑制时，正常肾小管细胞HK2和529B肾癌细胞的荧光强度未显示出显著差异，这指示正常肾细胞和癌性肾细胞对ICG-PEG45的摄取效率相当。因此，在未经CSA处理的情况下，正常肾与癌性肾之间观察到的荧光强度差异是由于ICG-PEG45的外排动力学的差异所致。为了进一步证实P-gP转运体在介导ICG-PEG45的细胞内积聚中的作用，将另一种特异性P-gP抑制剂tariquidar也在相同条件下施加到HK2和529B细胞，并观察到与CSA处理相同的结果(图26A和26B)。这些发现证实，由P-gP外排转运体控制的正常肾与癌组织之间ICG-PEG45的外排动力学差异是其在肾肿瘤中选择性滞留的原因(图3D)。这一发现不仅说明了ICG-PEG45在分子水平下高荧光检测肾细胞癌的有用性，而且还通过利用正常组织和癌组织中显像剂的细胞外排的固有差异来为癌症检测和靶向提供一种新策略，其不同于传统的被动靶向机制以及配体-受体介导的主动靶向策略，后一策略经由增强探针对癌症受体的亲和力已广泛用于癌症检测。
实例5.ICG-PEG45以高特异性选择性地检测RCC转移
不限于原发性RCC，我们还发现，ICG-PEG45在小鼠模型中成功检测到其他器官(诸如脑、骨和肺)中的RCC转移(图4A)。如图4B中所示，脊柱和脑附近的转移性肿瘤利用生物发光得到证实，并且脊柱中的肿瘤可以经由ICG-PEG45的荧光进行无创检测。尽管由于颅骨的原因，无法通过ICG-PEG45的荧光来无创地观察到脑中的转移瘤，但离体荧光成像(图4C)清楚地表明ICG-PEG45具有靶向RCC在脑中的转移瘤的能力。更重要的是，四肢骨骼中的极小肿瘤结节，其无法利用生物发光检测(图4D)但能通过H&E病理图像证实(图4F)，也能很容易地通过ICG-PEG45的荧光检测到(图4D和图4E)，其中对比指数为2.28±0.13，是没有肿瘤的正常关节的约2倍(图27)。除了脑和骨骼中的RCC转移外，其在肺部的转移瘤也可以经荧光成像(图28)。这些结果清楚地表明，低MW PEG45赋予ICG以正对比和高特异性检测RCC转移的功能。
实例6.利用ICG-PEG45对肾小管分泌功能障碍和肾小管损伤的早期诊断。
已知近端肾小管功能障碍会显著增加许多肾消除药物的健康风险；因此，FDA监管指南建议评估肾小管分泌功能以针对个体患者进行个性化治疗。然而，早期的肾小管功能障碍很难用目前基于小分子的肾小管功能标记物检测到。与可以用诸如KIM-1的内源性损伤标记物检测到的肾小管损伤不同，肾小管功能障碍反映了分泌功能的下降，而这不能用诸如KIM-1的损伤标记物来估计。在当前的临床实践中，肾小管分泌功能利用诸如对氨基马尿酸盐(PAH)的外源性功能标记物进行监测。通过以“离线”比色法或色谱法分析个体患者的血液和尿液浓度，临床医生可以在制定个性化治疗方案之前量化残余的肾小管分泌功能。然而，由于PAH是小分子并且通过转运体经由肾小管极为有效地消除，因此PAH的肾分泌对肾小管损伤的早期并不敏感，除非肾小管损伤进展到更严重的阶段。使用众所周知的肾疾病模型，以顺铂诱发的肾小管损伤为例，其中发现OAT转运体(OAT1和OAT2和OCT2)表达因损伤而下调，我们发现，在由10mg/kg体重的顺铂诱发的轻度肾小管损伤的小鼠中，PAH清除率和血清肌酸酐水平变化不大，即使已使用肾小管细胞死亡和肾损伤标记物(KIM-1)上调的免疫染色在组织水平下验证了肾小管损伤(图5A至5D)。如图6中所示，这些初步研究表明，在由10mg/kg剂量的顺铂诱发的肾小管损伤中，ICG-PEG45的肾清除率降低为超过3.1倍低，并且在20mg/kg的顺铂剂量下进一步降低为9.6倍低，这清楚地表明ICG-PEG45在检测顺铂诱发的肾小管功能障碍方面比PAH和肌酸酐更敏感。因此，ICG-PEG45可充当血液或尿液标记物以用于肾小管功能障碍和肾小管损伤的早期诊断。
实例7.ICG-PEG45充当活性靶向配体以用于有效地将其他显像剂和治疗药物递送至肾细胞癌(RCC)。
作为实例，我们使ICG-PEG45与1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)缀合。DOTA是一种临床上使用的螯合剂，其可与钆形成络合物以应用为MRI造影剂，或与诸如64Cu和68Ga的放射性同位素形成络合物以用于正电子发射断层扫描(PET)。PET已成为在对大多数癌症分期、检测其复发和转移以及监测其治疗功效方面的最重要的成像方式之一。然而，在注射最常用的PET剂[18F]氟脱氧葡萄糖(FDG)后，并不能用PET准确诊断RCC，这主要是因为FDG从肾的生理排泄降低了恶性肾组织与正常肾组织之间的对比度。为了证明ICG-PEG45-DOTA的RCC靶向作用，我们首先建立了原位RCC异种移植小鼠模型。将经荧光素酶表达载体转染的乳头状RCC细胞系(ACHN)以手术方式植入小鼠左肾的被膜下空间且右肾保持肾功能正常。当RCC肿瘤发展到可以通过生物发光成像在左肾中可靠地检测到的大小时，我们将ICG-PEG45-DOTA静脉内注射到小鼠中且接着在注射ICG-PEG45-DOTA(200μL，40μM)后24h时进行无创体内荧光成像。如图7A中所示，在左肾上检测到强烈的生物发光信号，表明RCC的生长。在注射ICG-PEG45-DOTA后24h时，同一只小鼠的近红外荧光图像表明ICG-PE45-DOTA可以特异性地积聚于具有RCC的左肾中，但可以从正常的右肾中清除(图7B)。这两个肾的离体成像(图8A-8C)进一步证实了ICG-PEG45-DOTA在左肾中的延长滞留特定发生在肿瘤区域中。恶性肾组织可以通过生物发光成像来验证并且肿瘤呈白色(图8A和图8B)。有趣的是，ICG-PEG45-DOTA在恶性组织中的荧光强度高于左肾和右肾正常肾组织中的荧光强度(图8C)。这些结果清楚地表明，ICG-PEG45可以用作活性靶向配体，一旦ICG-PEG45与试剂缀合，就可以将其他显像剂和治疗药物有效地递送至RCC。
实例8.ICG-PEG45以高特异性选择性地靶向和检测乳腺癌。
由于OATP1A2过表达，用ICG-PEG45也可以选择性地靶向MCF-7三阴性乳腺肿瘤；因此在荷瘤小鼠中观察到ICG-PEG45在MCF-7肿瘤中的选择性积聚。通过对ICG和ICG-PEG45在皮下异种移植物中的MCF-7肿瘤实时成像方面进行头对头比较(图9)，发现ICG-PEG45不仅能够以高于4的对比指数使肿瘤可视化，而且即使ICG-PEG45的细胞摄取效率是游离ICG的近10倍低，也能保持该高成像对比度至少4天(图10A-10B)，这表明在PEG45缀合后ICG的肿瘤靶向主要由其体内转运而非其细胞相互作用决定。
不限于使MCF-7肿瘤模型可视化，ICG-PEG45还可以容易地检测三阴性4T1乳腺癌。如图11A和图11B中所示，4T1乳腺肿瘤的成像对比度可以保持高于6的对比指数至少4天和2.5对比指数超过6天。此类对于肿瘤的高荧光对比指数从根本上源于两个独特的原因，涉及ICG-PEG45在肿瘤内的转运和相互作用。第一个原因是ICG-PEG45在背景组织中的清除比其在肿瘤中的清除快得多。如图11C中所示，ICG-PEG45在肿瘤中的衰变半衰期为98.36±20.02h，其是在背景组织中的衰变半衰期(47.03±6.81h)的约2倍。第二个原因是发现ICG-PEG45很容易被肿瘤中的细胞吸收(图11D)，这减缓了其从肿瘤微环境中的清除。ICG-PEG45在肿瘤微环境和背景组织中独特的体内转运和相互作用是其高成像对比度持续长时间段的原因。
实例9.ICG-PEG选择性地靶向并检测受损的肾小管。
使小鼠接受肾皮质的手术创伤，其诱发了肾小管损伤。在术后2周时，将ICG-PEG(MW：5000Da)静脉内注射到这只小鼠中，并在ICG-PEG注射后4天时收集肾。将肾固定、处理并包埋在石蜡中。为了鉴定ICG-PEG的肾内分布，将肾的两个连续切片分别用苏木精和伊红(H&E，用于病理分析)染色并用DAPI(用于细胞核染色和荧光成像)染色。图12A显示了经H&E染色的肾切片的整个横截面。可以清楚地观察到扩张的肾小管和免疫细胞的间质浸润(在图12B中由星号标记)，这表明肾小管损伤由手术切口引起。图12C和12D显示了ICG图像(以红色显示)和DAPI图像(以蓝色显示，细胞核染色)的叠加。有趣的是，ICG-PEG(PEG的MW＝5000)选择性地积聚在受损的肾小管细胞内(图12C和12D)，而正常肾小管细胞具有非常弱的近红外荧光。
实例10.IRDye 800CW缀合的PEG45未能在血尿素氮(BUN)和肌酸酐(两种常规肾功能生物标记物)升高之前的早期阶段中检测到近端肾小管损伤。
比较研究已表明，IRDye800CW-PEG45经由肾小球快速且被动地过滤到近端肾小管腔内，而ICG-PEG45则通过近端肾小管的有机阴离子转运体(OAT)和P-糖蛋白(P-gp)转运体直接从血流中主动分泌到近端肾小管的腔内而不通过正常肾中的肾小球。为了深入了解这两种染料标记的PEG纳米粒子如何在极早期肾小管损伤的患病肾中进行肾转运，我们以10mg/kg体重的剂量使用顺铂(一种众所周知的肾毒性抗癌药物)诱发非常轻微的肾小管损伤但不会损伤肾小球。如图30A和30B中所示，在腹膜内注射10mg/kg顺铂后4天时，诸如血尿素氮(BUN)和血清肌酸酐(sCr)的常规肾功能生物标记物的水平与接受生理盐水注射的正常小鼠的水平保持相当。肾的病理学分析显示在腹膜内注射10mg/kg顺铂后4天时肾小球没有损伤(图31)。另一方面，肾小管损伤最灵敏的生物标记物之一，即尿液中的肾损伤分子-1(KIM-1)，实际上在使用尿肌酸酐归一化后显示出显著增加(KIM-1/肌酸酐比率；图30C)。尿液KIM-1/肌酸酐比率的增加也与近端肾小管上KIM-1蛋白表达显著增加的观察结果一致(图30D)。肾组织和尿液中KIM-1水平的升高均是因为肾小管细胞凋亡上调了KIM-1表达。额外的TUNEL测定(末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)dUTP缺口末端标记测定)也表明细胞凋亡参与顺铂诱发的肾小管损伤(图30E)。一旦顺铂剂量增加到20mg/kg，近端肾小管受损更严重(图32)。不仅KIM-1/肌酸酐比率以及BUN和肌酸酐水平进一步增加(图30A-30C)，还观察到由死细胞诱导的蛋白管型(图33)，这已知会引起肾小管阻塞。
为了揭示ICG-PEG45和IRDye800CW-PEG45在早期肾小管损伤的肾中的转运方面的潜在差异，我们将它们静脉内注射到正常小鼠和具有由剂量最初为10mg/kg顺铂诱导的肾小管损伤的小鼠中。通过量化在注射后30min时尿液中两种纳米荧光团的量，我们发现，ICG-PEG45的肾清除效率从18.1±2.5％ID降低到5.8±1.9％ID(％ID＝注射剂量的百分比)，与在正常小鼠中相比，在患病小鼠中减少为约3.1倍低(图34A和34C)，而从IRDye800CW-PEG45观察到在30-min肾清除率方面几乎没有差异(64.6±0.9％ID和66.2±5.6％ID)(图34B和34C)。为了解ICG-PEG45的肾清除率降低的原因，我们在正常小鼠和顺铂处理的小鼠中在静脉内注射后30min时测量了ICG-PEG45的血液积聚。假设血容量为小鼠体重的7％，ICG-PEG45在正常小鼠和患病小鼠的血液中的积聚分别量化为24.6±2.6％ID和38.4±1.0％ID，这表明另外14％ID的ICG-PEG45滞留在接受10mg/kg顺铂的小鼠的血液中(图34D)。该发现与ICG-PEG45的肾清除率从正常小鼠到顺铂处理的小鼠的降低(12％ID)一致。此外，分别在静脉内注射IRDye800CW-PEG45和ICG-PEG45后30min时的正常小鼠和患病小鼠的离体肾图像未显示肾荧光强度的显著差异(图34E)。此外，对从静脉内注射ICG-PEG45的小鼠中收集的正常肾和受损肾的冷冻组织切片的荧光成像显示细胞质和管腔的强度相当，表明ICG-PEG45在由近端肾小管细胞吸收后仍然成功地从肾小管中分泌出来(图34F-34G)。结合所有结果表明，顺铂诱发的此极早期近端肾小管损伤显著减少了细胞对血液中ICG-PEG45的摄取，从而导致ICG-PEG45的血液浓度增加和肾清除率降低。相比之下，在腹膜内注射10mg/kg顺铂后4天时，肾小球过滤的IRDye800CW-PEG45在小鼠的肾清除率或血液滞留方面几乎未显示差异(图34C-34D)。
总之，在由10mg/kg剂量的顺铂(在腹膜内注射后第4天时)诱发的极早期肾小管损伤阶段时，在仅观察到轻微的肾小管损伤但没有肾小球损伤以及血尿素氮(BUN)和肌酸酐升高的情况下，与正常小鼠相比，ICG-PEG45的肾清除率降低了近3.1倍，而其血液滞留增加了约1.6倍。然而，在近端肾小管损伤的此同一早期阶段时，肾小球过滤的IRDye800CW-PEG45在肾清除率或血液滞留方面几乎未显示出差异。
通过引用并入
本文提及的所有出版物和专利通过引用整体并入本文，如同每个单独的出版物或专利被具体地和单独地指明通过引用并入。在冲突的情况下，以本申请(包含本文中的任何定义)为准。
等同物
虽然已经讨论了本发明的具体实施例，但是上述说明是说明性的而不是限制性的。在阅读本说明书和以下权利要求书后，本发明的许多变化对于本领域技术人员将变得显而易见。本发明的全部范围应当通过参考权利要求以及其等同物的全部范围和说明书以及这些变化来确定。

Claims (34)

1.一种诊断受试者中与内流转运体或外排转运体的异常表达相关联的疾病或病症的方法，其包括：
向所述受试者施用包含与吲哚菁绿(ICG)缀合的聚乙二醇(PEG)(“ICG-PEG缀合物”)的组合物；
确定从所述受试者获得的生物学样品中所述ICG-PEG缀合物的浓度；
将所述ICG-PEG缀合物的所述浓度与参考水平进行比较；以及
若所述ICG-PEG缀合物的所述浓度显著高于或低于所述参考水平，则确定所述受试者患有所述疾病或病症。
2.一种诊断受试者中与内流转运体或外排转运体的异常表达相关联的疾病或病症的方法，其包括：
向所述受试者施用包含与吲哚菁绿(ICG)缀合的聚乙二醇(PEG)(“ICG-PEG缀合物”)的组合物；
测量来自所述受试者的组织中的所述ICG-PEG缀合物的信号的强度；
将所述强度与参考水平进行比较；以及
若所述强度显著高于或低于所述参考水平，则确定所述受试者患有所述疾病或病症。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述ICG-PEG缀合物提供至少1.5的对比指数。
4.一种监测受试者的肾分泌功能的方法，其包括：
向所述受试者施用包含与吲哚菁绿(ICG)缀合的聚乙二醇(PEG)(“ICG-PEG缀合物”)的组合物；
确定在第一时间点从所述受试者获得的第一生物学样品中所述ICG-PEG缀合物的第一浓度；
确定在第二时间点从所述受试者获得的第二生物学样品中所述ICG-PEG缀合物的第二浓度，其中所述第二时间点在所述第一时间点之后；
基于所述第一浓度和所述第二浓度确定肾清除动力学；以及
任选地将所述肾清除动力学与参考水平进行比较。
5.一种监测受试者的肾分泌功能的方法，其包括：
向所述受试者施用包含与吲哚菁绿(ICG)缀合的聚乙二醇(PEG)(“ICG-PEG缀合物”)的组合物；
在第一时间点测量来自所述受试者的组织中的所述ICG-PEG缀合物的信号的第一强度；以及
在第二时间点测量来自所述受试者的所述组织中的所述ICG-PEG缀合物的信号的第二强度。
6.一种治疗有此需要的受试者的与内流转运体或外排转运体的异常表达相关联的疾病或病症的方法，其包括向所述受试者施用包含与吲哚菁绿(ICG)缀合的聚乙二醇(PEG)(“ICG-PEG缀合物”)的组合物。
7.一种检测受试者的肝脏疾病的方法，其包括：
向所述受试者施用包含与吲哚菁绿(ICG)缀合的聚乙二醇(PEG)(“ICG-PEG缀合物”)的组合物，其中所述PEG具有至少100Da至小于2kDa的分子量；
确定从所述受试者获得的尿液样品中所述ICG-PEG缀合物的浓度；
将所述ICG-PEG缀合物的所述浓度与参考水平进行比较；以及当所述ICG-PEG缀合物的所述浓度显著低于所述参考水平时，确定所述受试者患有所述肝脏疾病。
8.一种测量受试者中内流转运体或外排转运体的表达水平的方法，其包括：
向所述受试者施用包含与吲哚菁绿(ICG)缀合的聚乙二醇(PEG)(“ICG-PEG缀合物”)的组合物；
确定从所述受试者获得的生物学样品中所述ICG-PEG缀合物的浓度；以及
基于所述ICG-PEG缀合物的所述浓度确定所述内流转运体或外排转运体的所述表达水平。
9.一种测量受试者中内流转运体或外排转运体的表达水平的方法，其包括：
向所述受试者施用包含与吲哚菁绿(ICG)缀合的聚乙二醇(PEG)(“ICG-PEG缀合物”)的组合物；
测量来自所述受试者的组织中的所述ICG-PEG缀合物的信号的强度；以及
基于所述强度确定所述内流转运体或外排转运体的所述表达水平。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述受试者具有以下项的上调或下调表达：P-糖蛋白(P-gP)、多药耐药蛋白2(MRP2)、MRP4、有机阳离子转运体(OCT)、有机阴离子转运体(OAT)、有机阴离子转运多肽(OATP)、乳腺癌耐药蛋白(BCRP)或有机阴离子转运体4(OAT4)、平衡型核苷转运体1(ENT1)、ENT2、有机溶质转运体α(OSTα)或OSTβ。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症为肾小管分泌功能障碍或肾小管损伤。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述肾小管分泌功能障碍或肾小管损伤为近端肾小管分泌功能障碍或近端肾小管损伤。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述肾小管分泌功能障碍或肾小管损伤与选自以下项的肾脏疾病或病症相关联：急性肾损伤、慢性肾损伤、肾癌、狼疮肾炎、糖尿病诱发性肾损伤、多囊肾病、败血症、肾炎、肾移植排斥以及由其他组织和器官中的疾病诸如癌症和肝脏疾病引起的肾功能障碍或肾损伤。
14.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症为肾癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、骨癌或结肠癌。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述肾癌为肾细胞癌或肾嗜酸细胞瘤。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述肾癌为肾细胞癌。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述肾细胞癌为透明细胞肾细胞癌(ccRCC)或乳头状RCC(pRCC)。
18.根据权利要求14所述的方法，其中所述疾病或病症为乳腺癌，并且其中所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述生物学样品为血液或尿液样品。
20.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述生物学样品为尿液样品。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述ICG-PEG缀合物具有式I：
或其药学上可接受的盐，其中：
L1独立地是任选经取代的亚烷基、卤代亚烷基、亚烯基或亚炔基；
A独立地为-C(O)NH(CH2CH2O)n-、-C(O)O(CH2CH2O)n-、-C(O)S(CH2CH2O)n-、
-NHC(O)CH2O(CH2CH2O)n-、-OC(O)CH2O(CH2CH2O)n-或-SC(O)CH2O(CH2CH2O)n-，其中(CH2CH2O)-末端连接至B；
n为选自约10至约1000的整数；并且
B独立地为H或任选经取代的烷基。
22.根据权利要求21所述的方法，其中L1为未经取代的C1-6亚烷基或C1-6卤代亚烷基。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其中B为H或未经取代的C1-6烷基。
24.根据权利要求21或22所述的方法，其中B为经一个或多个-OH、-NH2、-SH或-COOH取代的C1-6烷基。
25.根据权利要求23或24所述的方法，其中B为-CH2CH2OH、-CH2CH2NH2、-CH2CH2SH、-CH2CH2C(O)OH或-CH2C(O)OH。
26.根据权利要求21所述的方法，其中所述ICG-PEG缀合物具有下式
或其药学上可接受的盐。
27.根据权利要求21至26中任一项所述的方法，其中n为选自约22至约220的整数。
28.根据权利要求21至26中任一项所述的方法，其中n为约45。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述缀合物呈纳米颗粒的形式。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述纳米颗粒具有约0.5nm至约12nm的平均直径。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述组合物经静脉内、腹膜内、皮下或动脉内施用。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的方法，其中所述ICG-PEG缀合物进一步与显像剂、生化可活化剂或治疗剂缀合。
33.一种包含吲哚菁(ICG)、聚乙二醇(PEG)和二级部分的组合物，其中ICG和所述二级部分各自独立地与PEG缀合。
34.根据权利要求33所述的组合物，其中所述二级部分为显像剂、生化可活化剂或治疗剂。
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