CN117327736A - 一种表达新型冠状病毒s蛋白的重组载体疫苗及重组病毒疫苗和应用 - Google Patents

一种表达新型冠状病毒s蛋白的重组载体疫苗及重组病毒疫苗和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种表达新型冠状病毒S蛋白的重组载体疫苗及重组病毒疫苗和应用，属于生物制品技术领域。一种表达新型冠状病毒S蛋白的重组载体，外源插入有改良型痘苗病毒安卡拉株的基因组序列或部分序列和编码原始或改良的新型冠状病毒S蛋白的基因序列；所述编码原始或改良的新型冠状病毒S蛋白的基因序列插入在改良型痘苗病毒安卡拉株的MVA069R和MVA070L基因之间。改良的新型冠状病毒S蛋白呈三聚体形式表达。本发明建立的基于MVA的表达SARS‑CoV‑2S蛋白的重组病毒疫苗，是预防SARS‑CoV‑2感染的得力措施，对于SARS‑CoV‑2的防控具有重要意义。

Description

一种表达新型冠状病毒S蛋白的重组载体疫苗及重组病毒疫 苗和应用
技术领域
本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种表达新型冠状病毒S蛋白的重组载体疫苗及重组病毒疫苗和应用。
背景技术
痘病毒(Poxvirus)是一类较大的DNA病毒，基因组约200～300kbp，主要包括痘苗病毒(Vacciniavirus，VACV)、天花病毒(Variolavirus)、牛痘病毒(Cowpox virus)和猴痘病毒(Monkeypox virus)等。1982年，痘病毒表达载体被首次提出，并迅速广泛用于疫苗开发以及众多领域的研究。痘病毒表达载体具有结构简单、能够容纳大量外源DNA和高表达水平等优点。此外，痘病毒的复制位置在位于细胞质的病毒工厂中，而非宿主的细胞核内，这大大降低了病毒DNA整合到宿主基因组中的可能性，从而阻断了对宿主基因的干扰，并降低了其致癌的可能性，这使其成为表达来自各种病原体异源抗原的理想载体系统。改良型痘苗病毒安卡拉株(Modified Vaccinia virus Ankara，MVA)是由VACV作为母毒株，在CEF细胞中连续传代500次以上得到的。经过传代致弱后的MVA仅可以在禽类细胞中复制，而无法在人类等大多数哺乳动物细胞中完成病毒复制，因此MVA作为理想的疫苗载体，被广泛应用于针对各种人类及哺乳动物疫病的疫苗创制，包括流感病毒疫苗、非洲猪瘟病毒疫苗、口蹄疫病毒疫苗和蓝舌病病毒疫苗等人用和兽用疫苗都在研发中或已获批准，具有非常广阔的应用前景。因此，MVA是真核生物基因或外源病毒基因表达的理想载体和疫苗载体。
然而重组载体疫苗的免疫性高低，与插入外源基因编码的蛋白的自身构象有关之外，还与外源基因编码的蛋白的表达量有直接关系。然而，目前还未有关于改良型痘苗病毒安卡拉株提高外源基因表达水平的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种表达新型冠状病毒S蛋白的重组载体疫苗，通过优化外源基因的插入位点，从而提高外源基因编码的蛋白的表达，从而提高疫苗免疫效果。
本发明提供了一种表达新型冠状病毒S蛋白的重组载体，外源插入有编码原始或改良的新型冠状病毒S蛋白的基因序列和改良型痘苗病毒安卡拉株的基因组序列或MVA069R与MVA070L的基因序列；
所述编码原始或改良的新型冠状病毒S蛋白的基因序列插入在改良型痘苗病毒安卡拉株的MVA069R和MVA070L基因之间。
优选的，所述改良的新型冠状病毒S蛋白的基因序列如SEQ ID NO:2所示。
优选的，所述重组载体为Prk5-S；
所述Prk5-S的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明提供了一种表达新型冠状病毒S蛋白的重组病毒，由所述重组载体包装得到。
本发明提供了所述表达新型冠状病毒S蛋白的重组病毒的制备方法，包括以下步骤：
用改良型痘苗病毒安卡拉株感染细胞，得到感染的细胞；
将所述重组载体转染至所述感染的细胞中，培养收集病毒，得到表达新型冠状病毒S蛋白的重组病毒。
优选的，所述细胞包括DF-1细胞。
优选的，在所述感染后2h进行重组载体的转染。
本发明提供了所述重组病毒在制备防治新型冠状病毒感染的疫苗中的应用。
本发明提供了一种防治新型冠状病毒感染的疫苗，包括所述重组病毒和佐剂。
本发明提供了一种表达新型冠状病毒S蛋白的重组载体，外源插入有编码原始或改良的新型冠状病毒S蛋白的基因序列和改良型痘苗病毒安卡拉株的基因组序列或MVA069R与MVA070L的基因序列；所述编码原始或改良的新型冠状病毒S蛋白的基因序列插入在改良型痘苗病毒安卡拉株的MVA069R和MVA070L基因之间。本发明通过优化插入改良型痘苗病毒安卡拉株的基因位置能够避免MVA载体病毒生长速度受到插入基因的干扰。实验证明，本法通过将编码新型冠状病毒S蛋白的基因序列插入在改良型痘苗病毒安卡拉株的MVA069R和MVA070L基因之间，比插入在传统的III基因缺失位点能够产生更高滴度的MVA载体病毒，为了作为疫苗毒更好地大量生产和扩繁提供了基础。
进一步的，本发明还限定了改良的新型冠状病毒S蛋白的基因序列。本发明在SARS-CoV-2S蛋白编码序列的基础上进行了如下改造，将S蛋白胞内域和跨膜区替换为I型胶原蛋白α1链C端前肽，使S蛋白形成三聚体，具有更好的免疫原性，同时突变了S蛋白的Furin裂解位点(RRAR682-685GSAS)以及七肽重复序列1/中心螺旋顶端(KV986-987PP)，保证了S蛋白表达后不裂解为S1和S2蛋白，从而保证了S蛋白的原始构象，有利于抗原表位的暴露；此外对编码基因进行密码子优化，保证了外源基因在病毒中的表达水平。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的重组质粒Prk5-S及鉴定所需PCR引物示意图；
图2为本发明实施例1提供的对重组病毒rMVA-S的PCR鉴定结果；
图3为本发明实施例1提供的对重组病毒rMVA-S感染细胞后S蛋白表达的WesternBlotting鉴定结果；
图4为本发明实施例2提供的重组病毒rMVA-S的病毒粒子形态；
图5为本发明实施例2提供的重组病毒rMVA-S的生长曲线；
图6为本发明实施例2提供的重组病毒rMVA-S的热稳定性；
图7为本发明实施例3提供的小鼠免疫后血清中S蛋白特异性IgG和IgA的ELISA检测结果；
图8为本发明实施例3提供的小鼠免疫后血清中S蛋白中和抗体的假病毒中和试验结果；
图9为本发明实施例3提供的小鼠高剂量免疫后体重变化曲线及存活率；
图10为本发明实施例4提供的小鼠免疫后攻毒SARS-CoV-2，小鼠的体重变化及存活率。
具体实施方式
本发明提供了一种表达新型冠状病毒S蛋白的重组载体，外源插入有编码原始或改良的新型冠状病毒S蛋白的基因序列和改良型痘苗病毒安卡拉株的基因组序列或MVA069R与MVA070L的基因序列；所述编码原始或改良的新型冠状病毒S蛋白的基因序列插入在改良型痘苗病毒安卡拉株的MVA069R和MVA070L基因之间。
在本发明中，首先优化了编码新型冠状病毒S蛋白的基因序列在改良型痘苗病毒安卡拉株基因中的插入位置，将编码新型冠状病毒S蛋白的基因序列插入在MVA069R和MVA070L基因之间有利于提高目标基因的表达水平。实验表明，将编码新型冠状病毒S蛋白的基因序列插入在MVA069R和MVA070L基因之间比插入在传统的III基因缺失位点，能够避免MVA载体病毒生长速度受到插入基因的干扰，比插入在传统的III基因缺失位点能够产生更高滴度的MVA载体病毒，为了作为疫苗毒更好地大量生产和扩繁提供了基础。
在本发明中，为了进一步提升免疫原的免疫特性，对目标抗原进行了改造。所述改良的新型冠状病毒S蛋白的基因序列优选如SEQ ID NO:2所示。改造后的新型冠状病毒S蛋白呈三聚体形式存在，并且S蛋白维持裂解前形态，从而可以诱导更强的免疫反应。
在本发明中，当重组载体中包含部分改良型痘苗病毒安卡拉株的部分基因序列时，所述重组载体优选为Prk5-S；所述Prk5-S的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:3所示。所述Prk5-S的外源基因部分包括痘苗病毒P11启动子、eGFP、H5启动子、S蛋白及MVA同源臂(069R，070L)。为了验证Prk5-S重组载体是否成功构建，根据MVA同源臂的序列设计上下游引物(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)进行PCR扩增验证。
本发明提供了一种表达新型冠状病毒S蛋白的重组病毒，由所述重组载体包装得到。所述重组病毒表达新型冠状病毒S蛋白三聚体。
本发明提供了所述表达新型冠状病毒S蛋白的重组病毒的制备方法，包括以下步骤：
用改良型痘苗病毒安卡拉株感染细胞，得到感染的细胞；
将所述重组载体转染至所述感染的细胞中，培养收集病毒，得到表达新型冠状病毒S蛋白的重组病毒。
在本发明中，所述细胞优选包括DF-1细胞。在所述感染后优选2h进行重组载体的转染。本发明对所述转染的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的转染方法即可。
在本发明中，对收集的病毒进行改造的S蛋白的验证。所述验证方法采用PCR和Westernblotting完成。
在本发明中，为了验证编码新型冠状病毒S蛋白的基因序列的插入对病毒生物学特性的影响，分别开展了病毒粒子形态观察、生长曲线评估、遗传稳定性和热稳定性检测，结果表明，与MVA病毒粒子相比，表达新型冠状病毒S蛋白并不会影响病毒粒子的形态发生任何变化。同时重组病毒rMVA-S和野生型病毒MVA相比，在DF-1上均可以感染和复制，但在哺乳动物细胞上均不能正常感染和复制，表明rMVA-S可以正常扩繁生产，且在哺乳动物体内具有良好的安全性。传代50代后，rMVA-S重组SARS-CoV-2S蛋白的区域并未发生突变，说明具有良好的遗传稳定性。重组病毒rMVA-S具有良好的热稳定性，在室温放置14天仍具有较高的活性。
在本发明中，为了验证重组病毒的免疫性，开展了免疫动物实验，结果表明，重组病毒免疫小鼠后，血清中S蛋白特异性IgG和IgA有显著提高，而阴性对照血清(PBS)及病毒载体对照血清(MVA)中均未检出S蛋白特异性IgG和IgA。中和实验结果表明，阴性对照血清(PBS)及病毒载体对照血清(MVA)中均未检出中和抗体，而重组病毒rMVA-S免疫的小鼠血清中能够检出中和抗体，且二次免疫后中和抗体的水平高于初次免疫。此外，本发明还进行了安全性评估实验，小鼠体重在免疫后有所下降，但很快恢复，且rMVA-S与MVA组相比没有显著差异，整个实验过程中并未有小鼠死亡，表明重组病毒rMVA-S在小鼠上具有良好的安全性。攻毒实验结果表明，该重组病毒具有完全的保护力。
本发明提供了所述重组病毒在制备防治新型冠状病毒感染的疫苗中的应用。
本发明对所述疫苗的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的疫苗的制备方法即可。
本发明提供了一种防治新型冠状病毒感染的疫苗，包括所述重组病毒和佐剂。
在本发明中，所述重组病毒的终浓度优选为109～1010PFU/ml，更优选为1010PFU/ml。
下面结合实施例对本发明提供的一种表达新型冠状病毒S蛋白的重组载体疫苗及重组病毒疫苗和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种表达SARS-CoV-2S蛋白的重组痘苗病毒rMVA-S的构建方法
1、方法
1.1、重组质粒Prk5-S的构建
将SARS-CoV-2S蛋白的编码序列(SEQ ID NO:1)进行改造，将S蛋白胞内域和跨膜区替换为I型胶原蛋白α1链C端前肽，并且突变了S蛋白的Furin裂解位点(RRAR682-685GSAS)以及七肽重复序列1/中心螺旋顶端(KV986-987PP)，并进行密码子优化后，得到改造后的编码SARS-CoV-2S蛋白的基因序列(SEQ ID NO:2)，将其以及作为筛选基因的eGFP核苷酸序列导入带有MVA同源臂(069R，070L)的重组载体中，得到重组质粒Prk5-S(SEQ IDNO:3)。构建的重组质粒Prk5-S主要包括痘苗病毒P11启动子、eGFP、H5启动子、S蛋白及MVA同源臂(069R，070L)，谱图见图1。
1.2、重组病毒rMVA-S的构建方法
1.2.1、病毒包装
DF-1细胞(5×105)接种在六孔板含DMEM培养基中，培养过夜，细胞生长平铺60％-70％时，将MVA感染细胞；2h后转染重组质粒Prk5-S；培养4h后，更换成新鲜培养基继续48h，收取细胞冻融三次，获得病毒悬液。
1.2.2、重组病毒的纯化和鉴定
DF-1细胞(1×106)接种在六孔板含DMEM培养基中，培养过夜，细胞生长平铺80％～90％时，将收取的病毒悬液10倍梯度稀释感染DF-1细胞。2h后，PBS洗一遍，换成含2.5％血清，0.5％甲基纤维素(CMC)的DMEM培养基。三天后，挑取绿色荧光噬斑，并重复上述方法进行多轮筛选，利用Prk5-S中同源臂设计特异性引物S-F(SEQ ID NO:4，TTTGGATATTCTATGGCGTACAAAGGAATA)和S-R(SEQ ID NO:5，CATTTTTTGCTAGTGGTAATTCCATAGATG)，然后进行PCR鉴定，直至得到纯净的重组病毒。PCR反应体系如下：
2×phanta max mastermix：25μL
引物F(10μM)：2μL
引物R(10μM)：2μL
模板DNA：30ng
ddH2O补充至50μL。
PCR反应程序如下：
预变性95℃3min；变性95℃15sec，退火56℃15sec，延伸72℃6min，35cycles；彻底延伸72℃5min。
将获得的纯净的重组病毒和野生型病毒样品提取病毒基因组DNA，提取方法按照DNA提取试剂盒说明书进行。将提取的野生型、重组型病毒基因组进行PCR鉴定，扩增引物同上，野生型和重组型病毒经过PCR扩增后分别可以得到长度为804bp和6011bp的产物。同时，将PCR产物进行测序。
然后，将获得的重组病毒感染DF-1细胞，24h后裂解细胞，通过Western blotting检测SARS-CoV-2S蛋白的表达。
2、结果
2.1、重组质粒Prk5-S的构建
将SARS-CoV-2S蛋白编码序列进行改造，将S蛋白胞内域和跨膜区替换为I型胶原蛋白α1链C端前肽，并且突变了S蛋白的Furin裂解位点(RRAR682-685GSAS)以及七肽重复序列1/中心螺旋顶端(KV986-987PP)，并进行密码子优化后，将其以及作为筛选基因的eGFP核苷酸序列导入带有MVA同源臂(069R，070L)的重组载体中，得到重组质粒Prk5-S。构建的重组质粒Prk5-S主要包括痘苗病毒P11启动子、eGFP、H5启动子、S蛋白及MVA同源臂(069R，070L)。
2.2、重组病毒rMVA-S的筛选、纯化和鉴定
通过在DF-1细胞中感染MVA，转染重组质粒Prk5-S，48h后收获重组病毒悬液。然后在DF-1细胞中利用病毒绿色荧光噬斑形成实验进行筛选。挑取绿色荧光噬斑，并重复上述方法进行多轮筛选，最终获得纯净的重组病毒。将纯净的重组病毒按照DNA提取试剂盒说明书提取病毒DNA，然后利用PCR扩增验证(如图1、图2所示)。同时，将PCR产物进行测序，确证重组病毒在MVA069R和MVA070F之间准确插入了S的编码基因。证实获得了重组病毒rMVA-S。然后，将获得的重组病毒感染DF-1细胞，24h后裂解细胞，通过Western blotting检测，结果显示重组病毒感染细胞后SARS-CoV-2S蛋白能够成功表达(如图3所示)。
实施例2
表达SARS-CoV-2S蛋白的重组病毒rMVA-S的生物学特性评价
1、方法
1.1、重组病毒rMVA-S的病毒粒子形态观察
DF-1细胞(1×106)接种在六孔板含DMEM培养基中，培养过夜，细胞生长平铺80％-90％时，以MOI＝3的剂量感染rMVA-S，感染24h后使用2.5％的戊二醛固定细胞，并制备电镜切片，使用透射电镜观察病毒粒子形态。
1.2、重组病毒rMVA-S在不同细胞上的生长曲线
DF-1细胞、A549细胞、HeLa细胞(1×106)接种在六孔板含DMEM培养基中，培养过夜，细胞生长平铺80％-90％时，以MOI＝0.01的剂量感染rMVA-S，感染0h、24h和48h后，反复冻融细胞3次收取病毒，使用DF-1细胞对病毒进行定量。
1.3、重组病毒rMVA-S的热稳定性
将1mL rMVA-S置于室温，每隔24h取50μL病毒液并保存，连续14天，使用DF-1细胞对所有保存的病毒液进行定量，判断重组病毒rMVA-S的热稳定性。
2、结果
2.1、重组病毒rMVA-S的病毒粒子形态观察
DF-1细胞以MOI＝3的剂量感染rMVA-S，感染24h后使用2.5％的戊二醛固定细胞，并制备电镜切片，使用透射电镜观察病毒粒子形态，结果显示重组病毒rMVA-S和野生型病毒MVA相比，病毒粒子形态没有发生改变(如图4所示)。
2.2、重组病毒rMVA-S在不同细胞上的生长曲线
DF-1细胞以MOI＝0.01的剂量感染rMVA-S，感染0h、24h、48h和72h，HeLa、A549、MDBK、MDCK细胞以MOI＝0.01的剂量感染rMVA-S，感染48h，反复冻融细胞3次收取病毒，使用DF-1细胞对病毒进行定量，结果显示重组病毒rMVA-S和野生型病毒MVA相比，在DF-1上均可以感染和复制，但在哺乳动物细胞(A549细胞、HeLa细胞)上均不能正常感染和复制，表明rMVA-S可以正常扩繁生产，且在哺乳动物体内具有良好的安全性(如图5所示)。
2.3、重组病毒rMVA-S的热稳定性
将1mL rMVA-S置于室温，每隔24h取50uL病毒液并保存，连续14天，使用DF-1细胞对所有保存的病毒液进行定量，判断重组病毒rMVA-S的热稳定性，结果显示重组病毒rMVA-S的热稳定性良好，在室温放置14天仍具有较高的活性(如图6所示)。
对比例1
不同位点插入S蛋白对重组病毒的病毒滴度的影响
1、方法
1.1、重组质粒Prk5-SIII的构建
将改造后的编码SARS-CoV-2S蛋白的基因序列(SEQ ID NO:2)以及作为筛选基因的eGFP核苷酸序列导入带有MVA同源臂(III-L，III-R)的重组载体中，得到重组质粒Prk5-SIII(SEQ ID NO:6)。构建的重组质粒Prk5-SIII主要包括痘苗病毒P11启动子、eGFP、H5启动子、S蛋白及MVA同源臂(III-L，III-R)。
1.2、重组病毒rMVA-S的构建方法
1.2.1、病毒包装
DF-1细胞(5×105)接种在六孔板含DMEM培养基中，培养过夜，细胞生长平铺60％～70％时，将MVA感染细胞；2h后转染重组质粒Prk5-SIII；培养4h后，更换成新鲜培养基继续48h，收取细胞冻融三次，获得病毒悬液。
1.2.2、重组病毒的纯化和鉴定
DF-1细胞(1×106)接种在六孔板含DMEM培养基中，培养过夜，细胞生长平铺80％～90％时，将收取的病毒悬液10倍梯度稀释感染DF-1细胞。2h后，PBS洗一遍，换成含2.5％血清，0.5％甲基纤维素(CMC)的DMEM培养基。三天后，挑取绿色荧光噬斑，并重复上述方法进行多轮筛选，利用Prk5-S中同源臂设计特异性引物SIII-F(SEQ ID NO:7，TTCTCTATCGATGCGGCACC)和SIII-R(SEQ ID NO:8，CCGGCATCTCTAGCAGTCAA)，然后进行PCR鉴定，直至得到纯净的重组病毒。PCR反应体系如下：
2×phanta max mastermix：25μL
引物F(10μM)：2μL
引物R(10μM)：2μL
模板DNA：30ng
ddH2O补充至50μL。
PCR反应程序如下：
预变性95℃3min；变性95℃15sec，退火56℃15sec，延伸72℃6min，35cycles；彻底延伸72℃5min。
将获得的纯净的重组病毒和野生型病毒样品提取病毒基因组DNA，提取方法按照DNA提取试剂盒说明书进行。将提取的野生型、重组型病毒基因组进行PCR鉴定，扩增引物同上，野生型和重组型病毒经过PCR扩增后分别可以得到长度为806bp和6013bp的产物。同时，将PCR产物进行测序。
1.3重组病毒rMVA-SIII及rMVA-S在DF-1细胞上的生长情况
DF-1细胞(1×106)接种在六孔板含DMEM培养基中，培养过夜，细胞生长平铺80％-90％时，以MOI＝0.01的剂量感染在传统的III基因缺失位点插入S蛋白的重组病毒rMVA-SIII或rMVA-S，感染0h、24h和48h后，反复冻融细胞3次收取病毒，使用DF-1细胞对病毒进行定量。
2、结果
2.1、重组病毒rMVA-SIII及rMVA-S在DF-1细胞上的生长情况
DF-1细胞以MOI＝0.01的剂量感染重组病毒rMVA-SIII或rMVA-S，感染24h、48h和72h，反复冻融细胞3次收取病毒，使用DF-1细胞对病毒进行定量，结果显示重组病毒rMVA-S与在传统的III基因缺失位点插入S蛋白的重组病毒rMVA-SIII相比，在DF-1上具有更高的病毒滴度，表明将编码新型冠状病毒S蛋白的基因序列插入在MVA069R和MVA070L基因之间比插入在传统的III基因缺失位点，能够避免MVA载体病毒生长速度受到插入基因的干扰，比插入在传统的III基因缺失位点能够产生更高滴度的MVA载体病毒，为作为疫苗毒更好地大量生产和扩繁提供了基础(见表1)。
表1重组病毒rMVA-SIII及rMVA-S的病毒滴度结果(PFU/ml)
实施例3
表达SARS-CoV-2S蛋白的重组病毒rMVA-S的小鼠免疫实验
1、方法
1.1、小鼠免疫方案
8月龄的BalB/C小鼠分为3组，每组5只，第一组为阴性对照，PBS免疫；第二组为病毒载体对照，野生型MVA免疫；第三组为重组疫苗组，插入SARS-CoV-2S蛋白序列的重组病毒rMVA-S免疫。在第0天时经滴鼻进行免疫，阴性对照组免疫50μL PBS，病毒载体对照组免疫50μL(1×107PFU)MVA，重组疫苗组免疫50μL(1×107PFU)rMVA-S。第3周采取相同剂量、相同途径加强一次，免疫前以及每次免疫后第12天取血进行抗体检测。
1.2、小鼠免疫后血清中S蛋白特异性IgG和IgA的ELISA检测
使用ELISA方法检测小鼠血清中S蛋白特异性IgG和IgA。具体方法如下，将SARS-CoV-2S蛋白包被在ELISA酶标板上，小鼠血清用1×稀释缓冲液进行4倍梯度稀释，酶标板中加入稀释后小鼠血清100μL/孔，室温孵育2小时。弃去孔中液体，拍干酶标板，用1×洗涤缓冲液洗板，300μL/孔浸泡1min，拍干酶标板，进行下一次清洗，共洗板5次。用1×稀释缓冲液将HRP标记的抗小鼠IgG或IgA的抗体1:100稀释使用，100μL/孔加入酶标板中，混匀，室温孵育1小时。弃去孔中液体，拍干酶标板，用1×洗涤缓冲液洗板，300μL/孔浸泡1min，拍干酶标板，共洗板5次。将预先配制的底物液(将底物A液和底物B液按1:1等体积混合，使用前10分钟配制)加入酶标板中，200μL/孔，混匀，室温避光孵育20分钟。加入50μL/孔终止液至酶标板中，轻轻震动酶标板至显色均匀。20分钟内读取OD450nm的光吸收值。
1.3、小鼠免疫后血清中S蛋白中和抗体的假病毒中和试验
将新冠假病毒感染Vero-E6细胞，检测萤火虫荧光素酶的表达来指示病毒感染的情况。将小鼠血清用DMEM进行4倍梯度稀释，稀释后小鼠血清分别与等量新冠假病毒在37℃孵育1h，然后加入铺有Vero-E6细胞的96孔板中，培养48h后利用荧光素酶检测系统检测萤火虫荧光素酶的表达来指示小鼠血清中中和抗体中和病毒的情况。
1.4、小鼠高剂量免疫后体重变化及存活率测定
8月龄的BalB/C小鼠分为3组，每组5只，第一组为阴性对照，PBS免疫；第二组为病毒载体对照，野生型MVA免疫；第三组为重组疫苗组，插入SARS-CoV-2S蛋白序列的重组病毒rMVA-S免疫。在第0天时使用十倍于正常免疫剂量的病毒经滴鼻免疫，阴性对照组免疫50μLPBS，病毒载体对照组免疫50μL(1×108PFU)MVA，重组疫苗组免疫50μL(1×108PFU)rMVA-S。每日测定小鼠体重变化，观察小鼠有无异常症状以及存活情况。
2、结果
2.1、小鼠免疫后血清中S蛋白特异性IgG和IgA的ELISA检测
小鼠血清用1×稀释缓冲液进行4倍梯度稀释后，通过ELISA检测血清中的S蛋白特异性IgG和IgA，结果显示阴性对照血清(PBS)及病毒载体对照血清(MVA)中均未检出S蛋白特异性IgG和IgA，而重组病毒rMVA-S免疫的小鼠血清中能够检出S蛋白特异性IgG和IgA，且二次免疫后的抗体水平均高于初次免疫(如图7所示)。
2.2、小鼠免疫后血清中S蛋白中和抗体的假病毒中和试验
小鼠血清用DMEM进行4倍梯度稀释后，分别与等量新冠假病毒在37℃孵育1h，然后加入铺有Vero-E6细胞的96孔板中，培养48h后利用荧光素酶检测系统检测萤火虫荧光素酶的表达指示假病毒的感染情况。结果显示阴性对照血清(PBS)及病毒载体对照血清(MVA)中均未检出中和抗体，而重组病毒rMVA-S免疫的小鼠血清中能够检出中和抗体，且二次免疫后中和抗体的水平高于初次免疫(如图8所示)。
2.3、小鼠高剂量免疫后体重变化及存活率测定
使用十倍于正常免疫剂量的病毒对8月龄的BalB/C小鼠经滴鼻免疫后，每日测定小鼠体重变化，观察小鼠有无异常症状以及存活情况。结果显示，小鼠体重在免疫后有所下降，但很快恢复，且rMVA-S与MVA组相比没有显著差异，整个实验过程中并未有小鼠死亡，表明重组病毒rMVA-S在小鼠上具有良好的安全性(如图9所示)。
实施例4
表达SARS-CoV-2S蛋白的重组病毒rMVA-S的小鼠攻毒保护实验
1、方法
1.1、小鼠免疫方案
同实施例3中1.1所示。
1.2、小鼠攻毒保护实验
将免疫后的8月龄的BalB/C小鼠分为3组，每组5只，第一组为阴性对照，PBS免疫；第二组为病毒载体对照，野生型MVA免疫；第三组为重组疫苗组，插入SARS-CoV-2S蛋白序列的重组病毒rMVA-S免疫。在免疫后第28天，使用SARS-CoV-2Wuhan株在小鼠上传代获得的鼠适应病毒株BMA8毒株，经滴鼻进行攻毒，每只小鼠攻毒50μL(50LD50)。每日观察小鼠症状并测定体重。
2、结果
2.2、小鼠攻毒保护实验
将免疫后的8月龄的BalB/C小鼠分为3组，分别为PBS免疫组，野生型MVA免疫组和rMVA-S免疫组。在免疫后第28天，使用BMA8毒株经滴鼻进行攻毒，每只小鼠攻毒50μL(50LD50)，每日观察小鼠症状并测定体重。结果显示，PBS免疫组和野生型MVA免疫组的小鼠体重下降迅速，在攻毒后6天即全部死亡，而rMVA-S免疫组的小鼠体重仅在攻毒后前三天出现下降且速度相对较慢，在整个攻毒保护实验过程中未出现小鼠死亡，表明表达SARS-CoV-2S蛋白的重组病毒rMVA-S可以有效保护小鼠经受SARS-CoV-2的攻毒(如图10所示)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种表达新型冠状病毒S蛋白的重组载体，其特征在于，外源插入有编码原始或改良的新型冠状病毒S蛋白的基因序列和改良型痘苗病毒安卡拉株的基因组序列或MVA069R与MVA070L的基因序列；
所述编码原始或改良的新型冠状病毒S蛋白的基因序列插入在改良型痘苗病毒安卡拉株的MVA069R和MVA070L基因之间。
2.根据权利要求1所述表达新型冠状病毒S蛋白的重组载体，其特征在于，所述改良的新型冠状病毒S蛋白的基因序列如SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求1所述表达新型冠状病毒S蛋白的重组载体，其特征在于，所述重组载体为Prk5-S；
所述Prk5-S的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
4.一种表达新型冠状病毒S蛋白的重组病毒，其特征在于，由权利要求1～3中任意一项所述重组载体包装得到。
5.权利要求4所述表达新型冠状病毒S蛋白的重组病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
用改良型痘苗病毒安卡拉株感染细胞，得到感染的细胞；
将权利要求1～3中任意一项所述重组载体转染至所述感染的细胞中，培养收集病毒，得到表达新型冠状病毒S蛋白的重组病毒。
6.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于，所述细胞包括DF-1细胞。
7.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于，在所述感染后2h进行重组载体的转染。
8.权利要求4所述重组病毒在制备防治新型冠状病毒感染的疫苗中的应用。
9.一种防治新型冠状病毒感染的疫苗，其特征在于，包括权利要求4所述重组病毒和佐剂。
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