CN117305417A - 基于fret距离调控的比率型荧光编码微球及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于FRET距离调控的比率型荧光编码微球及其制备方法,比率型荧光编码微球包括编码探针、荧光探针、捕获探针和微球;荧光探针包括荧光探针1和荧光探针2,编码探针前端与捕获探针杂交,后端与荧光探针杂交;在荧光探针1和荧光探针2上分别修饰不同的荧光基团,在编码探针上不同位置修饰荧光淬灭基团,利用FRET效率随着荧光基团之间的距离的增加而逐渐递减,导致荧光的差异来实现比率编码。本发明通过改变编码区域修饰的BHQ的位置,从而实现FAM和Cy5的不同比率,该编码方式设计简单,DNA杂交稳定,试剂用量少,可操作性强,测量结果准确,重复性好。并且该编码技术可与PCR技术结合进行高灵敏多重核酸检测。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域,尤其涉及一种基于FRET距离调控的比率型荧光编码微球及其制备方法。
背景技术
在常规检测中,如果存在多个检测目标,必须要将检测样本分成若干份,然后对单个目标逐一进行检测,造成的弊端是大大增加了检测时间和试剂消耗。随着时代和科技的进步,多重检测逐渐成为医学临床检测领域一项重要的检测方法。在临床上,多重检测被广泛应用于疾病诊断、治疗、监测和愈后观察,其主要是通过对单个样本进行同时多种生物标志物的定性和定量分析,比如细胞因子、核酸序列或者肿瘤生物标志物等。总而言之,与单一生物标志物检测相比,多重生物标志物检测能够有效的帮助临床医生以更少的时间和成本获得更多的诊断信息,从而实现对患者的精准治疗。
随着对多重检测需求的日益发展,流式微球分析技术由于其快速结合动力学、灵活制备和多重分析能力,受到越来越多的关注。流式微球分析技术是以悬浮的荧光编码微球作为液相反应的载体,以快速高通量的流式细胞仪作为检测手段进行的多元检测,既能够为后基因组时代的科学研究提供技术支持,又能提供高通量的新一代分子诊断技术平台。
荧光编码微球制备的关键在于编码的策略。目前主流的编码方法有以下几种:①有机荧光染料编码微球,该编码方法是通过将两种不同比例的有机荧光染料掺杂在微球内部,实现编码。②量子点编码微球,该编码方式是通过两种不同激发波长的量子点掺杂在微球内部,达到编码的目的。③荧光蛋白编码微球,该编码策略是将几种的荧光蛋白包裹在微球表面,实现编码。④混合编码,该编码策略为,将多种荧光物质进行掺杂,如有机荧光染料和量子点进行掺杂,实现微球编码。但是这些编码方法有,编码原理复杂,编码过程耗时,编码成本较高等缺点。本发明提出的编码方法,使用市售的磁性微球,可以实现微球的复用,编码原理简单,编码成本低。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术中的不足,提供了一种基于FRET距离调控的比率型荧光编码微球及其制备方法:基于FRET距离调控的比率型荧光编码微球包括荧光探针1(5’端标记荧光基团Cy5),荧光探针2(5’端标记荧光基团FAM),编码探针(中间特定位置修饰猝灭基团BHQ)。荧光探针1和荧光探针2可与编码探针同时且完全杂交,通过编码探针上BHQ的修饰位置,来调整荧光基团与猝灭基团的距离,从而调控FRET的效率,根据两种荧光的比率来实现微球编码,最后通过流式细胞仪进行高通量检测。具体步骤为:可选择Cy5为参比荧光,保持Cy5荧光强度不变,改变BHQ1的位置,来改变FAM的猝灭效率,从而实现Cy5和FAM不同的荧光比率,以此来编码微球。同理,可选择FAM为参比荧光,保持FAM荧光强度不变,通过改变BHQ3的位置,来改变Cy5的荧光强度,从而实现FAM和Cy5不同的荧光比率。在流式细胞仪中,微球成单列依次通过测量区,两束激光呈垂直角度作用在为微球上,通过同时检测两种荧光的强度,观察微球在流式细胞仪的分析软件上的相对位置来确定微球的种类和检测的目标物,从而实现靶标的高通量检测。
该编码技术的特点在于仅仅改变编码区域修饰的BHQ的位置,来调整FRET效率,从而实现FAM和Cy5的不同比率,最终在流式细胞仪上实现位置的变化。该编码方式设计简单,DNA杂交稳定,试剂用量少,可操作性强,测量结果准确,重复性好。并且该编码技术可与PCR技术结合进行高灵敏多重核酸检测。
为了实现上述目的,本发明提供了一种基于FRET距离调控的比率型荧光编码微球,所述比率型荧光编码微球包括编码探针、荧光探针、捕获探针和微球;所述荧光探针包括荧光探针1和荧光探针2,所述编码探针前端与捕获探针杂交,后端与荧光探针杂交;在所述荧光探针1和荧光探针2上分别修饰不同荧光基团,在编码探针上不同位置修饰荧光淬灭基团,利用FRET效率随着荧光基团之间的距离的增加而逐渐递减,导致荧光的差异来实现比率编码。
上述的基于FRET距离调控的比率型荧光编码微球,进一步的,所述荧光探针1的DNA序列如SEQ ID NO.10所示,所述荧光探针2的DNA序列如SEQ ID NO.11所示;所述编码探针为DNA序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.9所示。
上述的基于FRET距离调控的比率型荧光编码微球,进一步的,在SEQ ID NO.1上不修饰荧光淬灭基团得到编码探针1;
在SEQ ID NO.1的第15个碱基上修饰荧光淬灭基团得到编码探针2;
在SEQ ID NO.1的第8个碱基上修饰荧光淬灭基团得到编码探针3;
在SEQ ID NO.1的第5个碱基上修饰荧光淬灭基团得到编码探针4。
上述的基于FRET距离调控的比率型荧光编码微球,进一步的,
在SEQ ID NO.9的第15个碱基上修饰荧光淬灭基团得到编码探针5;
在SEQ ID NO.9的第12个碱基上修饰荧光淬灭基团得到编码探针6;
在SEQ ID NO.9的第10个碱基上修饰荧光淬灭基团得到编码探针7;
在SEQ ID NO.9的第6个碱基上修饰荧光淬灭基团得到编码探针8;
在SEQ ID NO.9的第1个碱基上修饰荧光淬灭基团得到编码探针9。
上述的基于FRET距离调控的比率型荧光编码微球,进一步的,在所述荧光探针1的5’端标记荧光基团Cy5,在所述荧光探针2的5’端标记荧光基团FAM,荧光淬灭基团为BHQ1;以Cy5为参比荧光,保持Cy5荧光强度不变,改变BHQ1的位置,来改变FAM的猝灭效率,从而实现Cy5和FAM不同的荧光比率。
在荧光探针1的5’端标记荧光基团FAM,在荧光探针2的5’端标记荧光基团Cy5也能产生同样的效果,只是猝灭基团的位置需要调整。
在荧光探针1的3’端标记荧光基团FAM,在荧光探针2的3’端标记荧光基团Cy5也能产生同样的效果,只是猝灭基团的位置需要调整。
荧光基团使用Cy5与Alexa Fluor 488或者其他荧光基团,只是猝灭基团的位置需要调整。
上述的基于FRET距离调控的比率型荧光编码微球,进一步的,在所述荧光探针1的5’端标记荧光基团Cy5,在所述荧光探针2的5’端标记荧光基团FAM,荧光淬灭基团为BHQ3;以FAM为参比荧光,保持FAM荧光强度不变,通过改变BHQ3的位置,来改变Cy5的荧光强度,从而实现FAM和Cy5不同的荧光比率。
上述的基于FRET距离调控的比率型荧光编码微球,进一步的,所述捕获探针的DNA序列如SEQ ID NO.12所示。
基于一个总的技术构思,本发明还提供了一种基于FRET距离调控的比率型荧光编码微球的制备方法,其制备方法包括以下步骤:
S1、将捕获探针与微球的偶联得到偶联有捕获探针的微球;
S2、将编码探针与荧光探针1和荧光探针2的杂交;
S3、将杂交后的探针与偶联有捕获探针的微球进行孵育得到基于FRET距离调控的比率型荧光编码微球。
上述的制备方法,进一步的,所述S1具体为:将微球与识别探针分散来微球洗涤液中,25℃,1200r条件下反应1h,反应结束后洗涤3次,分散在微球洗涤液中。进一步的,所述微球洗涤液的PH为7.5。所述微球洗涤液中表面活性剂为吐温-20。
上述的制备方法,进一步的,所述S2具体为:将荧光探针1、荧光探针2和编码探针等浓度混合后,进行退火,95℃,5分钟,然后自然冷却至室温。进一步的,所述编码探针的终浓度为3μM,所述荧光探针1和荧光探针2的终浓度大于等于3μM。进一步的,所述微球洗涤液的PH为7.5。所述微球洗涤液中表面活性剂为吐温-20。
上述的制备方法,进一步的,所述S3具体为:将杂交后的探针与偶联有捕获探针的微球在25℃下,1200r条件下反应2小时,反应结束后将微球洗涤三次,分散到微球洗涤液中。进一步的,所述微球洗涤液的PH为7.5。所述微球洗涤液中表面活性剂为吐温-20。
基于一个总的技术构思,本发明还提供了一种基于FRET距离调控的型荧光编码微球在多重核酸检测中的应用。
与现有技术相比,本发明的优点在于:
本发明提供了一种基于FRET距离调控的比率型荧光编码微球,是一种新的液相悬浮芯片的制备策略,通过改变编码探针中BHQ的修饰位置来调整FRET的效率,从而改变对应微球的荧光值,导致微球在流式细胞仪上分布在不同的位置,最后筛选出可明显区分的九种比率荧光编码微球。与现有技术相比,本发明的优势在于:本发明的DNA序列设计简单且仅涉及到4条链杂交,且四条链之间都是完全杂交,稳定性好,重复性好,测量结果准确。
附图说明
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
图1为本发明实施例10中基于FRET距离的比率型荧光编码微球的制备过程。
图2为本发明实施例1至9中基于FRET距离的比率型荧光编码微球的设计原理。
图3为本发明实验一中微球修饰的紫外光谱图。
图4为本发明实验二中共6种编码探针1区的DNA序列筛选图,筛选前的编码微球位置分布如图中的A所示,筛选后的编码微球位置分分布如图中的B所示。
图5为本发明实验二中筛选后的编码微球的荧光强度图,FAM的荧光强度如图中的A所示,Cy5的荧光强度如图中的9B所示。
图6为本发明实验二中筛选后的编码微球的激光共聚焦图。
图7为本发明实验三中共6种编码探针2区的DNA序列筛选图,筛选前的编码微球位置分布如图中的A所示,筛选后的编码微球位置分布如图中的B所示。
图8为本发明实验三中筛选后的编码微球的荧光强度图,FAM的荧光强度如图中的A所示,Cy5的荧光强度如图中的B所示。
图9为本发明实验三中筛选后的编码微球的激光共聚焦图。
图10为本发明实验四中筛选后的九种编码微球的流氏细胞仪表征图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,基于本发明中的实施例,显然,所描述的实施例仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
实施例1
本发明的一种基于FRET距离调控的比率型荧光编码微球包括2条荧光探针、1条编码探针、1条捕获链。依次将编码探针、荧光探针,捕获探针与微球相连。
两条荧光探针是固定序列,荧光探针1的DNA序列如SEQ ID NO.10所示,具体为:ATCATCACATCATAC,其5’端标记荧光基团Cy5。
荧光探针2的DNA序列如SEQ ID NO.11所示,具体为:AGTCCAAGACACTCA,其5’端标记荧光基团FAM。
捕获探针的DNA序列如SEQ ID NO.12所示,具体为:Biotin-TTTTTTCATCATCATCATCA。
编码探针1的DNA序列如SEQ ID NO.1所示,具体为:TGAGTGTCTTGGACTTGTATGATGTGATGATTGATGATGATGATGA。
编码探针与荧光探针1、荧光探针2完全互补。斜体称为编码探针区,非斜体称为非编码探针区。
两条荧光探针是固定序列,各含15个碱基,荧光探针1标记激发波长为640nm的荧光基团,荧光探针2标记激发波长为488nm的荧光基团。由于编码探针上BHQ的位置不同,所以每一种微球上的Cy5和FAM的荧光值不同,导致每一种微球在流式分析软件中分布在不同的位置。
实施例2
本发明的一种基于FRET距离调控的比率型荧光编码微球包括2条荧光探针、1条编码探针、1条捕获链。依次将编码探针、荧光探针,捕获探针与微球相连。
两条荧光探针是固定序列,荧光探针1的DNA序列如SEQ ID NO.10所示,具体为:ATCATCACATCATAC,其5’端标记荧光基团Cy5。
荧光探针2的DNA序列如SEQ ID NO.11所示,具体为:AGTCCAAGACACTCA,其5’端标记荧光基团FAM。
捕获探针的DNA序列如SEQ ID NO.12所示,具体为:Biotin-TTTTTTCATCATCATCATCA。
编码探针2的DNA序列如SEQ ID NO.2所示,具体为:TGAGTGTCTTGGAC/iBHQ1dT/TGTATGATGTGATGATTGATGATGATGATGA。
编码探针与荧光探针1、荧光探针2完全互补。
实施例3
本发明的一种基于FRET距离调控的比率型荧光编码微球包括2条荧光探针、1条编码探针、1条捕获链。依次将编码探针、荧光探针,捕获探针与微球相连。
两条荧光探针是固定序列,荧光探针1的DNA序列如SEQ ID NO.10所示,具体为:ATCATCACATCATAC,其5’端标记荧光基团Cy5。
荧光探针2的DNA序列如SEQ ID NO.11所示,具体为:AGTCCAAGACACTCA,其5’端标记荧光基团FAM。
捕获探针的DNA序列如SEQ ID NO.12所示,具体为:Biotin-TTTTTTCATCATCATCATCA。
编码探针3的DNA序列如SEQ ID NO.2所示,具体为:TGAGTGT/iBHQ1dT/TTGGACTTGTATGATGTGATGATTGATGATGATGATGA。(iBHQ1dT也是标记在T碱基,这个修饰只能修饰在T碱基上,修饰哪个位置就把那个位置的碱基变成T。)
编码探针与荧光探针1、荧光探针2完全互补。
实施例4
本发明的一种基于FRET距离调控的比率型荧光编码微球包括2条荧光探针、1条编码探针、1条捕获链。依次将编码探针、荧光探针,捕获探针与微球相连。
两条荧光探针是固定序列,荧光探针1的DNA序列如SEQ ID NO.10所示,具体为:ATCATCACATCATAC,其5’端标记荧光基团Cy5。
荧光探针2的DNA序列如SEQ ID NO.11所示,具体为:AGTCCAAGACACTCA,其5’端标记荧光基团FAM。
捕获探针的DNA序列如SEQ ID NO.12所示,具体为:Biotin-TTTTTTCATCATCATCATCA。
编码探针4的DNA序列如SEQ ID NO.2所示,具体为:TGAG/iBHQ1dT/GTCTTGGACTTGTATGATGTGATGATTGATGATGATGATGA。
编码探针与荧光探针1、荧光探针2完全互补。
实施例5
本发明的一种基于FRET距离调控的比率型荧光编码微球包括2条荧光探针、1条编码探针、1条捕获链。依次将编码探针、荧光探针,捕获探针与微球相连。
两条荧光探针是固定序列,荧光探针1的DNA序列如SEQ ID NO.10所示,具体为:ATCATCACATCATAC,其5’端标记荧光基团Cy5。
荧光探针2的DNA序列如SEQ ID NO.11所示,具体为:AGTCCAAGACACTCA,其5’端标记荧光基团FAM。
捕获探针的DNA序列如SEQ ID NO.12所示,具体为:Biotin-TTTTTTCATCATCATCATCA。
编码探针5的DNA序列如SEQ ID NO.2所示,具体为:GTATGATGTGATGA/iBHQ3NEdT/TTGAGTGTCTTGGACTTGATGATGATGATGA。(iBHQ3NEdT与iBHQ1dT是两个不同的猝灭基团)
实施例6
本发明的一种基于FRET距离调控的比率型荧光编码微球包括2条荧光探针、1条编码探针、1条捕获链。依次将编码探针、荧光探针,捕获探针与微球相连。
两条荧光探针是固定序列,荧光探针1的DNA序列如SEQ ID NO.10所示,具体为:ATCATCACATCATAC,其5’端标记荧光基团Cy5。
荧光探针2的DNA序列如SEQ ID NO.11所示,具体为:AGTCCAAGACACTCA,其5’端标记荧光基团FAM。
编码探针6的DNA序列如SEQ ID NO.2所示,具体为:GTATGATGTGA/iBHQ3NEdT/GATTTGAGTGTCTTGGACTTGATGATGATGATGA。
编码探针与荧光探针1、荧光探针2完全互补。斜体称为编码探针区,非斜体称为非编码探针区。
实施例7
本发明的一种基于FRET距离调控的比率型荧光编码微球包括2条荧光探针、1条编码探针、1条捕获链。依次将编码探针、荧光探针,捕获探针与微球相连。
两条荧光探针是固定序列,荧光探针1的DNA序列如SEQ ID NO.10所示,具体为:ATCATCACATCATAC,其5’端标记荧光基团Cy5。
荧光探针2的DNA序列如SEQ ID NO.11所示,具体为:AGTCCAAGACACTCA,其5’端标记荧光基团FAM。
编码探针7的DNA序列如SEQ ID NO.2所示,具体为:GTATGATGT/iBHQ3NEdT/ATGATTTGAGTGTCTTGGACTTGATGATGATGATGA。
编码探针与荧光探针1、荧光探针2完全互补。斜体称为编码探针区,非斜体称为非编码探针区。
实施例8
本发明的一种基于FRET距离调控的比率型荧光编码微球包括2条荧光探针、1条编码探针、1条捕获链。依次将编码探针、荧光探针,捕获探针与微球相连。
两条荧光探针是固定序列,荧光探针1的DNA序列如SEQ ID NO.10所示,具体为:ATCATCACATCATAC,其5’端标记荧光基团Cy5。
荧光探针2的DNA序列如SEQ ID NO.11所示,具体为:AGTCCAAGACACTCA,其5’端标记荧光基团FAM。
编码探针8的DNA序列如SEQ ID NO.2所示,具体为:GTATG/iBHQ3NEdT/TGTGATGATTTGAGTGTCTTGGACTTGATGATGATGATGA。
编码探针与荧光探针1、荧光探针2完全互补。斜体称为编码探针区,非斜体称为非编码探针区。
实施例9
本发明的一种基于FRET距离调控的比率型荧光编码微球包括2条荧光探针、1条编码探针、1条捕获链。依次将编码探针、荧光探针,捕获探针与微球相连。
两条荧光探针是固定序列,荧光探针1的DNA序列如SEQ ID NO.10所示,具体为:ATCATCACATCATAC,其5’端标记荧光基团Cy5。
荧光探针2的DNA序列如SEQ ID NO.11所示,具体为:AGTCCAAGACACTCA,其5’端标记荧光基团FAM。
编码探针9的DNA序列如SEQ ID NO.2所示,具体为:BHQ3-TTATGATGTGATGATTTGAGTGTCTTGGACTTGATGATGATGATGA。
编码探针与荧光探针1、荧光探针2完全互补。斜体称为编码探针区,非斜体称为非编码探针区。
列举以上序列,但不仅限于上述序列。这里选取9条编码探针作为编码序列(可不局限于9条编码序列),这里选取荧光探针的碱基个数15作为稳定杂交的适宜碱基个数(可不局限于15个碱基个数),编码探针中间添加一个不杂交碱基T,目的在于减少杂交时的空间位阻。
实施例10
一种实施例1-9的基于FRET距离调控的比率型荧光编码微球的制备方法,参见图1,包括以下步骤:
(1)捕获探针与微球的偶联:将1μm的链霉亲和素修饰的磁性微球与识别探针分散在微球洗涤液中,25℃,1200r条件下反应1h使编码探针结合在微球上得到偶联有捕获探针的微球。反应结束后洗涤3次,分散在微球洗涤液中(微球洗涤液的PH为7.5。微球洗涤液中表面活性剂为吐温-20)。
(2)编码探针与两种荧光探针的杂交:将3μM荧光探针1、3μM荧光探针2和3μM编码探针等浓度混合后,进行退火,95℃,5分钟,然后自然冷却至室温。
(3)偶联完成的微球与杂交完成探针进行孵育:将杂交后的探针与偶联有捕获探针的微球在25℃下,1200r条件下反应2小时,反应结束后将微球洗涤三次,分散到微球洗涤液中。
(4)使用流式细胞仪对修饰后的微球进行比率荧光分析:利用FRET效率随着荧光基团之间的距离的增加而逐渐递减,导致荧光的差异来实现比率编码,两条荧光探针是固定序列,各含15个碱基,荧光探针1标记激发波长为640nm的荧光基团,荧光探针2标记激发波长为488nm的荧光基团,荧光分子的选择受流式细胞仪的两个荧光通道条件限制。
图2是实施例1至9中基于FRET距离调控的比率型荧光编码微球的实验原理图。
实验一:捕获探针与微球的结合。
将捕获探针与微球在25℃下反应30分钟,反应结束后离心1分钟收集上清液,通过紫外可见分光光度计检测上清液中DNA的吸光度。
紫外可见分光光度计检测结果参见图3:从吸光度值可以看出上清液中还有未反应的编码探针,说明微球上结合的编码探针已达到饱和状态。
实验二:编码探针1区的DNA序列的筛选。
首先以Cy5探针为参比,保持Cy5荧光强度不变,改变BHQ1的位置,来改变FAM的猝灭效率,从而实现Cy5和FAM不同的荧光比率,随后将此探针与微球一起孵育2小时,孵育完成后用微球洗涤液清洗三次,最后分散在微球洗涤液中,以此来编码一部分微球。使用流式细胞仪检测微球上两种荧光信号,设置FL1的激发波长为488nm,收集波长范围为505-525nm,设置FL6的激发波长为640nm,收集波长范围为650-670nm。
图4为流式细胞仪检测结果,该图横坐标表示荧光基团FAM的荧光强度,纵坐标表示荧光基团Cy5的荧光强度,则每一个点代表每一颗微球上FAM与Cy5的荧光值,图中的A表示以Cy5为参比,FAM荧光强度不断改变的不同编码探针的微球分布在不同的区域。
为了精准区分每一种编码微球,我们考察实施例1至4中不同编码探针的编码微球位置分布。如图中的B所示。
图5为将流式结果进一步处理的结果。发现:Cy5的荧光强度基本不变,FAM的荧光强度随着BHQ的位置靠近而减弱,再次证明成功筛选出五种探针。
图6为激光共聚焦显微镜成像:将筛选出来的编码微珠置于激光共聚焦显微镜下进行成像,使用100倍油镜观察微球上的FAM和Cy5的荧光值变化,可以得到相同结论。
实验三:编码探针2区的DNA序列的筛选。
以FAM为参比,保持FAM荧光强度不变,改变BHQ3的位置,来改变Cy5的荧光强度,从而实现FAM和Cy5不同的荧光比率,随后将此探针与微球一起孵育2小时,孵育完成后用微球洗涤液清洗三次,最后分散在微球洗涤液中,以此来编码剩余的微球。使用流式细胞仪检测微球上两种荧光信号,仪器参数设置同实验一。
流式细胞仪检测结果如图7所示,该图横坐标表示荧光基团FAM的荧光强度,纵坐标表示荧光基团Cy5的荧光强度,则每一个点代表每一颗微球上FAM与Cy5的荧光值,图中的A表示以FAM为参比,Cy5荧光强度不断改变的不同编码探针的微球分布在不同的区域。
为了精准区分每一种编码微球,我们筛选出6种不同编码探针:没有修饰BHQ的参比探针以及实施例5至9中的编码探针,如图中的B所示。
将流式结果进一步处理,参见图8中的A和B,FAM的荧光强度基本不变,Cy5的荧光强度随着BHQ的位置靠近而减弱,再次证明成功筛选出六种探针。
参见图9:将筛选出来的编码微珠置于激光共聚焦显微镜下进行成像,同时检测FAM与Cy5的荧光信号(仪器参数设置同实验一)观察实验结果,可以得到相同结论。
实验四:九种比率型荧光编码微球的流式细胞仪表征图。
将筛选得到的九条编码探针(实施例1至9中的编码探针)与偶联捕获探针的微球反应1小时,反应结束后洗涤三次,接着加入荧光探针1、荧光探针2反应1小时,反应结束洗涤三次然后分散在缓冲溶液中,通过流式细胞仪检测微球上两种荧光信号。
流式细胞仪检测结果如图10所示,可以看出有九种不同的比率型荧光编码微球分布在不同的区域,且位置区分明显。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例而已,并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上,然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员,在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下,都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰,或修改为等同变化的等效实施例。因此,凡是未脱离本发明技术方案的内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰,均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
Claims (10)
1.一种基于FRET距离调控的比率型荧光编码微球,其特征在于,所述比率型荧光编码微球包括编码探针、荧光探针、捕获探针和微球;所述荧光探针包括荧光探针1和荧光探针2,所述编码探针前端与所述捕获探针杂交,后端与所述荧光探针杂交;在所述荧光探针1和荧光探针2上分别修饰不同的荧光基团,在编码探针上不同位置修饰荧光淬灭基团,利用FRET效率随着荧光基团之间的距离的增加而逐渐递减,导致荧光的差异来实现比率编码。
2.根据权利要求1所述的基于FRET距离调控的比率型荧光编码微球,其特征在于,所述荧光探针1的DNA序列如SEQ ID NO.10所示,所述荧光探针2的DNA序列如SEQ ID NO.11所示;所述编码探针为DNA序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.9所示;所述捕获探针的DNA序列如SEQ ID NO.12所示。
3.根据权利要求2所述的基于FRET距离调控的比率型荧光编码微球,其特征在于,
在SEQ ID NO.1的不修饰荧光淬灭基团得到编码探针1;
在SEQ ID NO.1的第15个碱基上修饰荧光淬灭基团得到编码探针2;
在SEQ ID NO.1的第8个碱基上修饰荧光淬灭基团得到编码探针3;
在SEQ ID NO.1的第5个碱基上修饰荧光淬灭基团得到编码探针4。
4.根据权利要求2所述的基于FRET距离调控的比率型荧光编码微球,其特征在于,
在SEQ ID NO.9的第15个碱基上修饰荧光淬灭基团得到编码探针5;
在SEQ ID NO.9的第12个碱基上修饰荧光淬灭基团得到编码探针6;
在SEQ ID NO.9的第10个碱基上修饰荧光淬灭基团得到编码探针7;
在SEQ ID NO.9的第6个碱基上修饰荧光淬灭基团得到编码探针8;
在SEQ ID NO.9的第1个碱基上修饰荧光淬灭基团得到编码探针9。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的基于FRET距离调控的比率型荧光编码微球,其特征在于,在所述荧光探针1的5’端标记荧光基团Cy5,在所述荧光探针2的5’端标记荧光基团FAM,荧光淬灭基团为BHQ1;以Cy5为参比荧光,保持Cy5荧光强度不变,改变BHQ1的位置,来改变FAM的猝灭效率,从而实现Cy5和FAM不同的荧光比率。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的基于FRET距离调控的比率型荧光编码微球,其特征在于,在所述荧光探针1的5’端标记荧光基团Cy5,在所述荧光探针2的5’端标记荧光基团FAM,荧光淬灭基团为BHQ3;以FAM为参比荧光,保持FAM荧光强度不变,通过改变BHQ3的位置,来改变Cy5的荧光强度,从而实现FAM和Cy5不同的荧光比率。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的基于FRET距离调控的比率型荧光编码微球,其特征在于,所述捕获探针的5’端修饰生物素;
和/或,所述微球为1μm的链霉亲和素修饰的磁性微球。
8.一种权利要求1至7中任一项所述基于FRET距离调控的比率型荧光编码微球的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括以下步骤:
S1、将捕获探针与微球的偶联得到偶联有捕获探针的微球;
S2、将编码探针与荧光探针1和荧光探针2的杂交;
S3、将杂交后的探针与偶联有捕获探针的微球进行孵育得到基于FRET距离调控的比率型荧光编码微球。
9.根据权利要求8所述的制备方法,其特征在于,所述S1具体为:将微球与识别探针分散来微球洗涤液中,25℃,1200r条件下反应1h;
和/或,所述S2具体为:将荧光探针1、荧光探针2和编码探针等浓度混合后,进行退火,95℃,5分钟,然后自然冷却至室温;
和/或,所述S3具体为:将杂交后的探针与偶联有捕获探针的微球在25℃下,1200r条件下反应2小时。
10.根据权利要求8所述的制备方法,其特征在于,所述S2中所述编码探针的终浓度为3μM,所述荧光探针1和荧光探针2的终浓度大于等于3μM。
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