CN117288953A - 一种子宫内膜癌的预后方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种子宫内膜癌的预后方法，所述方法包括确定来自女性生殖道的子宫液样品中下列蛋白质PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、CAPG、AGR2、BCAM、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、IF2B3、PLD3和MX1中的一种或多种的表达水平。本发明也提供包括用于检测所述蛋白质的工具的试剂盒，所述试剂盒用于疾病的诊断和预后。

Description

一种子宫内膜癌的预后方法

本申请是分案申请，其原申请的国际申请号为PCT/EP2018/069841，中国国家申请号为201880049974.5，申请日为2018年7月20日，发明名称为“作为子宫内膜癌的标志物的CTNB1”。

本申请要求2017年7月21日提交的欧洲专利申请EP17382483.0的权益。

技术领域

本发明涉及子宫内膜癌的诊断和预后。

背景技术

在发达国家，子宫内膜癌(EC)是女性生殖道最常见的浸润性肿瘤，也是女性第四常见的癌症，2017年美国共诊断61380例，估计死亡10920人。目前，70％的EC病例是在疾病早期诊断的，此时肿瘤仍然局限于子宫内膜内，与96％的5年生存率相关。然而，30％的EC患者仅在与5年生存率急剧下降相关的疾病晚期被诊断，已经存在肌层浸润和/或淋巴结感染时5年生存率下降到67％，而在远端转移的情况中5年生存率下降到18％。因此，改善早期诊断是适当管理EC和降低与该疾病相关的死亡率的主要问题。

像被诊断为EC的女性中的93％出现的异常阴道出血这样的症状的存在有助于早期发现EC患者。然而，许多其他良性疾病也产生类似的症状。对子宫内膜良性病变的患者和患有EC的患者的辨别只有在冗长的诊断过程后才能实现，该过程包括盆腔检查和经阴道超声检查，以及随后的对子宫内膜活检进行的确认性组织病理学检查。在这一过程中使用的优选活检被称为子宫抽吸和/或移液管活检，是通过从子宫腔内微创抽吸子宫内膜液获得的。由于目前对子宫抽吸物的诊断程序依赖于细胞物质的存在，因此，遗憾的是，该过程具有的诊断失败和相关的不充分采样率分别为8％和15％。该比例在绝经后妇女中增加到12％和22％。在那些情况中，需要在宫腔镜引导下进行活检，而这种侵入性技术会增加并发症的风险，包括子宫穿孔、出血和对其他器官可能的伤害。

到目前为止，已经进行很多研究来鉴定EC蛋白生物标志物，主要是在组织和血清样品中(例如，参见DeSouza LV等，“Endometrial cancer biomarker discovery andverification using differentially tagged clinical samples withmultidimensional liquid chromatography and tandem mass spectrometry”，Mol CellProteomics MCP-2007,第6卷1170–8页，或Kemik P等，“Diagnostic and prognosticvalues of preoperative serum levels of YKL-40,HE-4 and DKK-3 in endometrialcancer”，Gynecol Oncol-2016；第140卷，64–9页)。它们都没有转化为临床应用。

尽管活检应该提供有关肿瘤组织学和肿瘤分级的信息，以有助于EC患者的风险分层，并指导手术分期，然而，不幸的是，可供检查的细胞数量有限，并且病理解释中观察者间具有高度的变异性，由此导致活检和最终的子宫切除术标本之间的EC组织分型和等级的不一致性为40-50％。因此，敏感、特异且可重复的生物标志物(其改进EC肿瘤的组织学类型和分级的诊断、预后和术前评估)对于正确管理EC患者和降低与该疾病相关的死亡率和发病率至关重要。

在EC的亚型或各种表现形式中，子宫内膜样子宫内膜癌(EEC)是EC中最常见的组织学类型，与非子宫内膜样EC病例(NEEC)相比，预后良好。NEEC占所有EC病例的约20％，但占EC复发和死亡则超过50％。在NEEC中，浆液性EC(SEC)是最常见的亚型。对于这两种结果不同的组织学的鉴别，目前还没有可行的检验方法。

总之，尽管已经做了很多努力，仍然需要具有高敏感性和特异性的生物标志物对子宫内膜癌进行诊断乃至预后，特别是需要用于临床实践的生物标志物。

发明内容

本发明人已经确定，在由子宫液分离的外泌体中可检测到的某些蛋白质标志物为子宫内膜癌(EC)提供了有价值的诊断信息。许多这些蛋白质在未分离外泌体级分的子宫液中得到证实。因此，这些蛋白质是有意义的诊断生物标志物，在子宫液中进行分析时，该标志物可以在EC和非癌症对照之间进行高敏感性和特异性的鉴别。

另外，本发明人已经确定，在所述子宫液中，以及在所述子宫液的外泌体级分中检测到的一些蛋白质是子宫内膜癌(EC)的有意义的预后生物标志物。这些蛋白至允许以高敏感性和高特异性区分子宫内膜癌的亚型，从而使这些亚型中假阳性和假阴性分类的风险最小化。

此外，作为在没有侵入性实践的情况下获得的样品中(例如在子宫液样品中)可检测到的蛋白质，这些样品又是EC诊断中的常规样品类型，这些蛋白质在EC患者的分类和管理的临床实践中具有真正的优势和改进。

在以前的研究中，本发明人证明子宫抽吸物的液体级分对于筛选EC蛋白至生物标志物具有重要价值(例如参见Martínez-Garcia E等，“Development of a sequentialworkflow based on LC-PRM for the verification of endometrial cancer proteinbiomarkers in uterine aspirate samples”，Oncotarget-2016，第7(33)卷，53102-53114页)。该文献展示了采用基于LC-PRM的连续工作流程所进行的研究，说明了生物标志物验证阶段对于填补发现和临床实践之间的空白的重要性。该研究强调了26种蛋白质在诊断EC患者和非EC患者(对照)中的益处。

关于子宫液的外泌体中鉴别的用于EC的新型诊断生物标志物，本发明的一个方面是EC的诊断方法，所述方法包括确定来自女性生殖道的子宫液样品中的一种或多种选自由AGRIN、MVP、VAMP8、SYIC、RAB8A、MX1、IMB1、CLIC1、SMD3、ILF2、TERA、RL11、BCAM、ANXA2、LAT1、RUVB1、SH3L3、RPL13A、RS16、RSSA、RL12、PDIA1、RL29、PPIA、AGR2、MMP9、KPYM、TACD2、FAS、SORT、LAT1、ADA10、ITA3、RUXE、PSMD2、VPS35、ANXA4、PLD3、SSRA、LAMP2、PODXL、CLD6、IF2B3、CD59、MLEC、PGBM、S10AC、CD14、H10、CD81、AR6P1、VAC14、ITB3和CD166组成的组的蛋白质的表达水平。

本发明的另一方面是一种或多种选自由AGRIN、MVP、VAMP8、SYIC、RAB8A、MX1、IMB1、CLIC1、SMD3、ILF2、TERA、RL11、BCAM、ANXA2、LAT1、RUVB1、SH3L3、RPL13A、RS16、RSSA、RL12、PDIA1、RL29、PPIA、AGR2、MMP9、KPYM、TACD2、FAS、SORT、LAT1、ADA10、ITA3、RUXE、PSMD2、VPS35、ANXA4、PLD3、SSRA、LAMP2、PODXL、CLD6、IF2B3、CD59、MLEC、PGBM、S10AC、CD14、H10、CD81、AR6P1、VAC14、ITB3和CD166组成的组的蛋白质在来自女性生殖道的子宫液样品中作为诊断EC的离体标志物的应用。该方面也可表述为检测受试者中一个或多个子宫内膜癌标志物的体外方法，其包括(a)获得来自女性生殖道的子宫液样品；和(b)检测来自女性生殖道的子宫液样品中至少一种选自AGRIN、MVP、VAMP8、SYIC、RAB8A、MX1、IMB1、CLIC1、SMD3、ILF2、TERA、RL11、BCAM、ANXA2、LAT1、RUVB1、SH3L3、RPL13A、RS16、RSSA、RL12、PDIA1、RL29、PPIA、AGR2、MMP9、KPYM、TACD2、FAS、SORT、LAT1、ADA10、ITA3、RUXE、PSMD2、VPS35、ANXA4、PLD3、SSRA、LAMP2、PODXL、CLD6、IF2B3、CD59、MLEC、PGBM、S10AC、CD14、H10、CD81、AR6P1、VAC14、ITB3和CD166的子宫内膜癌标志物的量，所述标志物提供EC诊断的信息。一般来说，它包括使用一种或多种选自由AGRIN、MVP、VAMP8、SYIC、RAB8A、MX1、IMB1、CLIC1、SMD3、ILF2、TERA、RL11、BCAM、ANXA2、LAT1、RUVB1、SH3L3、RPL13A、RS16、RSSA、RL12、PDIA1、RL29、PPIA、AGR2、MMP9、KPYM、TACD2、FAS、SORT、LAT1、ADA10、ITA3、RUXE、PSMD2、VPS35、ANXA4、PLD3、SSRA、LAMP2、PODXL、CLD6、IF2B3、CD59、MLEC、PGBM、S10AC、CD14、H10、CD81、AR6P1、VAC14、ITB3和CD166组成的组的蛋白质在由女性生殖道分离出的子宫液样品中作为用于诊断子宫内膜癌的离体标志物。

用一种或多种以列蛋白质诊断EC可以通过使用试剂盒实现，所述试剂盒包括用来确定这些蛋白质的表达水平的工具。因此，本发明的一个方面也是试剂盒，所述试剂盒包括固相载体和用于检测下列蛋白质AGRIN、MVP、VAMP8、SYIC、RAB8A、MX1、IMB1、CLIC1、SMD3、ILF2、TERA、RL11、BCAM、ANXA2、LAT1、RUVB1、SH3L3、RPL13A、RS16、RSSA、RL12、PDIA1、RL29、PPIA、AGR2、MMP9、KPYM、TACD2、FAS、SORT、LAT1、ADA10、ITA3、RUXE、PSMD2、VPS35、ANXA4、PLD3、SSRA、LAMP2、PODXL、CLD6、IF2B3、CD59、MLEC、PGBM、S10AC、CD14、H10、CD81、AR6P1、VAC14、ITB3和CD166中的一种或多种的表达水平的工具。

本发明的另一方面是所述试剂盒的应用，所述试剂盒包括用于确定用来诊断EC的一种或多种上述蛋白质的工具。

关于EC诊断的附加方面，提供了用于识别怀疑患有EC的受试者的方法，所述方法包括：

a)体外确定女性子宫液样品中的一种或多种选自由AGRIN、MVP、VAMP8、SYIC、RAB8A、MX1、IMB1、CLIC1、SMD3、ILF2、TERA、RL11、BCAM、ANXA2、LAT1、RUVB1、SH3L3、RPL13A、RS16、RSSA、RL12、PDIA1、RL29、PPIA、AGR2、MMP9、CLIC1、BCAM和KPYM组成的组的蛋白质的表达水平；

b)可选地体外确定从子宫液分离出的含有外泌体的级分中一种或多种选自由AGRIN、MVP、TACD2、FAS、VAMP8、SYIC、SORT、LAT1、TERA、RUVB1、RS16、RSSA、SMD3、ADA10、RPL13A、RL11、IMB1、AGR2、ITA3、RUXE、RL12、PSMD2、MX1、VPS35、ILF2、PDIA1、ANXA4、MMP9、RAB8A、SH3L3、RL29、PLD3、PPIA、ANXA2、SSRA、LAMP2、PODXL、CLD6、IF2B3、CD59、MLEC、PGBM、S10AC、CD14、H10、CD81、AR6P1、VAC14、ITB3和CD166组成的组的蛋白质的表达水平；和

c)将步骤(a)的水平和可选地步骤(b)的水平与参考对照的水平进行比较，其中如果步骤(a)中确定的水平和可选地步骤(b)中的水平高于参考对照的水平，则表明受试者疑患子宫内膜癌。

在另一方面，本发明提供决定或推荐是否对怀疑患有子宫内膜癌的受试者实施医疗方案的方法，该方法包括以下步骤：

a)体外确定女性子宫液样品中一种或多种选自由AGRIN、MVP、VAMP8、SYIC、RAB8A、MX1、IMB1、CLIC1、SMD3、ILF2、TERA、RL11、BCAM、ANXA2、LAT1、RUVB1、SH3L3、RPL13A、RS16、RSSA、RL12、PDIA1、RL29、PPIA、AGR2、MMP9和KPYM组成的组的蛋白质的表达水平；

b)可选地的体外确定从子宫液分离出的含有外泌体的级分中一种或多种选自由AGRIN、MVP、TACD2、FAS、VAMP8、SYIC、SORT、LAT1、TERA、RUVB1、RS16、RSSA、SMD3、ADA10、RPL13A、RL11、IMB1、AGR2、ITA3、RUXE、RL12、PSMD2、MX1、VPS35、ILF2、PDIA1、ANXA4、MMP9、RAB8A、SH3L3、RL29、PLD3、PPIA、ANXA2、SSRA、LAMP2、PODXL、CLD6、IF2B3、CD59、MLEC、PGBM、S10AC、CD14、H10、CD81、AR6P1、VAC14、ITB3和CD166组成的组的蛋白质的表达水平；和

c)将步骤(a)的水平和可选地步骤(b)的水平与参考对照的水平进行比较，其中如果步骤(a)中确定的水平和可选地步骤(b)中的水平高于参考对照的水平，则表明受试者疑患子宫内膜癌。

其中：

i)如果受试者被诊断为患有子宫内膜癌，或疑患子宫内膜癌，则推荐开始医疗方案，和

ii)如果患者被诊断为未患子宫内膜癌，考虑到医生对患者的检查结果，可选地进行随访。

通过确定实验样品中的标志物水平，技术人员还可以确定可被推荐的最合适的疗法，因为样品中检测到的水平可反映疾病的范围(即严重程度)。

关于子宫液中用于EC的新型预后生物标志物，本发明的第一方面是鉴别诊断子宫内膜癌的方法，该方法包括确定来自女性生殖道的子宫液样品中CTNB1的表达水平。

另一个方面是子宫内膜癌的预后方法，该方法包括确定来自女性生殖道的子宫液样品中下列蛋白质PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、CAPG、AGR2、BCAM、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、IF2B3、PLD3和MX1中的一种或多种的表达水平。

这些方法给出了重要的诊断和预后信息，这是因为，由于可以区分EC的两种不同的生理表现，即子宫内膜样子宫内膜膜癌(EEC)和非子宫内膜样子宫内膜癌(NEEC)，因此可以进行准确的预后，EEC具有更好的可能结果(即，更好的预后)。换言之，确定子宫液样品中的蛋白质允许鉴别诊断EEC和NEECI。

正如以下的实施例将描述的，上述蛋白质允许诊断EC或准确的预后EC，因为它们在来自患有EEC的患者和患有NEEC的患者的分离样品中有差异表达。EC受试者的子宫液样品与非EC受试者(健康对照)的子宫液样品的差异表达可实现具有诊断价值的蛋白质的差异检测。与NEEC亚型相比，EEC亚型中具有预后价值的蛋白质显著增加，但NEEC肿瘤中增加的CAPG除外。因此，它们允许对最流行的组织学亚型的肿瘤进行分类。因此这些蛋白质是可用的工具，以用于改善诊断、预后和/或术前风险评估，并有助于预测最佳手术治疗。此外如下所示，已经开发出一些具有这些和其他蛋白质的蛋白质组(蛋白质组合)，其允许准确区分EC和非EC样品，也可以准确区分EC的组织类型(AUC 0.99)。结合病理组织学检查，这些组有望排除更多侵入性诊断取样的需要，并有助于预测EC患者的最佳手术治疗。

因此，一般来说，本发明的一个方面是子宫内膜癌(EC)的预后的方法，该方法包括确定来自女性生殖道的子宫液样品中下列蛋白质PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、CAPG、AGR2、BCAM、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、IF2B3、PLD3和MX1中的一种或多种的表达水平。

本发明的第二方面是一种或多种选自由PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、CAPG、AGR2、BCAM、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、IF2B3、PLD3和MX1组成的组的蛋白质在来自女性生殖道的子宫液样品中作为预后EC的离体标志物的应用。该方面也可表述为检测受试者中一个或多个子宫内膜癌标志物的体外方法，其包括：(a)获得来自女性生殖道的子宫液样品；和(b)检测样品中至少一种选自由PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、CAPG、AGR2、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、BCAM、IF2B3、PLD3和MX1组成的组的子宫内膜癌标志物的量，所述标志物提供EEC和NEEC的鉴别诊断的信息。一般来说，它包括使用一种或多种选自由PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、CAPG、AGR2、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、BCAM、IF2B3、PLD3和MX1组成的组的蛋白质在来自女性生殖道的分离出的子宫液样品中作为用于预后子宫内膜癌的离体标志物的用途。

在第三方面，本发明提供一种或多种选自由PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、CAPG、AGR2、BCAM、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、IF2B3、PLD3和MX1组成的组的蛋白质在第一方面的方法中用于子宫内膜癌的预后的用途。即，这些蛋白质用于鉴别诊断EEC和NEEC。

重要的是，本发明的蛋白质生物标志物对象可通过简单低成本的方法进行评估，例如免疫化学、化学发光测定或ELISA，在医院中广泛使用的平台。因此，这些蛋白质生物标志物可以容易地作为常规的临床诊断和/或预后试剂盒来实施，并且医疗卫生系统的成本降低。另外，基于本发明提供的生物标志物的诊断试剂盒试验可改善当前的诊断和预后过程，使得子宫抽吸物能够为疾病提供有价值的诊断和预后信息。

因此，在第四方面，本发明提供用于EC的预后的试剂盒的应用，该试剂盒包括固相载体和用于检测下列蛋白质PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、CAPG、AGR2、BCAM、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、IF2B3、PLD3和MX1中的一种或多种的表达水平的工具，并可选地包括用于检测下列蛋白质XPO2、PRDX1、CLIC1、PDIA1、KPYM、ENOA、GSTP1、GTR1、CH10、MIF、PEBP1、TPIS、NGAL和LDHA中的一种或多种的表达水平的工具。

该方面也可表述为用于EC预后的试剂盒，所述试剂盒包括固相载体和用于检测下列蛋白质PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、CAPG、AGR2、BCAM、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、IF2B3、PLD3和MX1中的一种或多种的表达水平工具，并可选地包括用于检测下列蛋白质XPO2、PRDX1、CLIC1、PDIA1、KPYM、ENOA、GSTP1、GTR1、CH10、MIF、PEBP1、TPIS、NGAL和LDHA中的一种或多种的表达水平的工具。

开发了新型的试剂盒，其有助于实现本发明的方法和应用。因此，在第五方面中，本发明也提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括固相载体和用于检测一种或多种选自由PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、CAPG、AGR2、BCAM、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、IF2B3、PLD3、MX1、XPO2、PRDX1、CLIC1、PDIA1、KPYM、ENOA、GSTP1、GTR1、CH10、MIF、PEBP1、TPIS、NGAL和LDHA组成的组的蛋白质的表达水平的工具。

另一方面是一种试剂盒，所述试剂盒包括固相载体和用于检测至少一组选自由LAMP、MMP9、PIGR；AGRIN、MMP9、PIGR；AGR2、PIGR、PLD3；AGR2、BCAM、PODXL；BCAM、PODXL；PIGR、PLD3；BCAM、PIGR；CLD6、RAB8A；CLD6、PODXL；BCAM、RL29；BCAM、PODXL；CLD6、PPIA；AGRIN、BCAM；ANXA、BCAM；BCAM、RAB8A；BCAM、SYIC；CLD6、IFB3；以及表C中所列的组组成的组的蛋白质的表达水平的工具。

在另外的方面中，本发明提供用于检测PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、CAPG、AGR2、BCAM、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、IF2B3、PLD3、MX1的表达水平的工具在本发明的第一方面的方法中用于子宫内膜癌的预后的应用。因此，它们是用于鉴别诊断EEC和NEEC的工具。也提供了用于检测PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、CAPG、AGR2、BCAM、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、IF2B3、PLD3、MX1的表达水平的工具，和可选地提供的用于检测XPO2、PRDX1、CLIC1、PDIA1、KPYM、ENOA、GSTP1、GTR1、CH10、MIF、PEBP1、TPIS、NGAL和LDHA的表达水平的工具，在本发明的第一方面的方法中用于子宫内膜癌的预后的应用。

在另外的方面中，本发明提供一种通过鉴别诊断NEEC和EEC来鉴别怀疑患有子宫内膜癌的受试者并进一步鉴别EC亚型的方法，该方法包括：

a)体外确定来自受试者的女性生殖道的子宫液样品中一种或多种选自由PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、CAPG、AGR2、BCAM、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、IF2B3、PLD3、MX1组成的组的蛋白质的表达水平；以及可选地确定一种或多种选自由XPO2、PRDX1、CLIC1、PDIA1、KPYM、ENOA、GSTP1、GTR1、CH10、MIF、PEBP1、TPIS、NGAL和LDHA组成的组的蛋白质的表达水平；和

b)将步骤(a)的水平与参考对照的水平进行比对，其中如果对于PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、AGR2、BCAM、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、IF2B3、PLD3、MX1而言步骤(a)中确定的水平高于参考对照的水平，且CAPG的水平低于参考对照的水平，则表明受试者怀疑患有NEEC和EEC。

在本发明的该方面中，参考对照的水平由非EC和NEEC样品中模糊选择。如上所述，在EEC中的表达水平高于在NEEC中的表达水平，除CAPG外。另外，CADH1、CAPG、CTNB1和CD44的水平也高于在非EC(非癌症)的对照样品。

在另外的方面中，本发明提供一种根据预后决定或推荐是否对患有子宫内膜癌的受试者启动医学方案的方法，该方法包括以下步骤：

a)体外确定来自受试者的女性生殖道的子宫液样品中一种或多种选自由PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、CAPG、AGR2、BCAM、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、IF2B3、PLD3、MX1组成的组的蛋白质的表达水平，以及可选地XPO2、PRDX1、CLIC1、PDIA1、KPYM、ENOA、GSTP1、GTR1、CH10、MIF、PEBP1、TPIS、NGAL和LDHA中的一种或多种蛋白质的表达水平；和

b)通过区分EEC和NEEC来确定所述EC的预后，如果试验样品中PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、AGR2、BCAM、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、IF2B3、PLD3、MX1的蛋白质水平高于参考对照的水平，且CAPG低于参考对照的水平；

其中：

i)如果受试者被诊断为患有内宫内膜癌或怀疑患有子宫内膜癌，且受试者被鉴别诊断为患有EEC，于是推荐启动用于EEC的医疗方案；

ii)如果受试者被诊断患有子宫内膜癌或怀疑患有子宫内膜癌，且受试者被鉴别诊断为患有NEEC，于是推荐启动用于NEEC的医疗方案；并且

通过确定测试样品中的标志物水平，技术人员还可确定能够被推荐的最适合的疗法，因为样品中检测到的水平可能反映疾病的浸润性。

最后，本发明的另一方面提供一种算法，其用于执行上述方面中限定的任一种诊断和/或预后方法。在本发明的意义上，术语“算法”也是面板(panel)或决策图、预测器以及数据组合的同义词，以正确地对单个样品进行分类。

根据本发明的方案和实施方式，EC的诊断和预后可使用数学算法来进行，该算法评估生物分子、蛋白质、抗体和/或mRNA的可检测水平，包括上述EC诊断和预后的一个或多个生物标志物，其与其他临床参数结合或独立于其他临床参数，以准确地将单个样品归类为来自健康患者、子宫内膜非恶性疾病患者、子宫内膜癌前疾病患者、子宫内膜癌患者或如上所述的样品，从而进一步将单个样品归类为来自具有子宫内膜癌的特定组织学亚型的受试者、具有该疾病的特定组织学等级或阶段的受试者、或具有EC特定分子亚型的受试者。

分类算法可以简化为确定特定的生物标志物或生物标志物子集的测定量是否高于或低于特定的截止数。当使用多个生物标志物时，分类算法可以是线性回归公式。作为选择，分类算法可以是多种学习算法中任一种的产物。在复杂分类算法的情况下，可能需要使用计算机，例如可编程数字计算机对数据执行该算法，从而确定分类。在这两种情况下，人们都可以将状态记录在有形介质上，例如，以计算机可读的格式，如内存驱动器或磁盘，或简单地打印在纸上。结果也可以报告在计算机屏幕上。该算法用作诊断和/或预后方法，特别是用于执行在先前方面中公开的方法的试剂盒的一部分。

根据所述水平、分数和/或计算值确定用于EC的诊断和/或预后的一种或多种蛋白质的表达水平之后，在是否患有恶性前病变和/或EC的选择之间，和/或患有不同EC亚型的选择之间做出决定。

附图说明

图1显示了区分EEC和NEEC的标志物的ROC曲线，具体而言，NEEC病例是浆液性子宫内膜癌(SEC)。显示了CTNB1、XPO2和CAPG单独的敏感性和特异性；以及三者组合(或蛋白质组)的敏感性和特异性。

具体实施方式

除非另有说明，本申请书中使用的所有术语应理解为本领域已知的一般含义。本申请中使用的某些术语的其他更具体的定义如下所述，除非另有明确规定的定义提供了更广泛的定义，否则旨在统一适用于说明书和权利要求书。

本发明提供了新型标志物，其用于诊断和预后女性生殖道液体中的子宫内膜癌。

术语“诊断”为本领域技术人员所知。如本文所用，“诊断”被理解为意识到受试者的特定医疗状况并发症或风险；确定疾病或状况的性质；或区分一种疾病或状况与另一种疾病或状况。它既指试图确定或鉴别可能的疾病或失调的过程，也指由该过程所达成的意见。从诊断程序的意义上讲，诊断可以被视为试图将个人的状况分为单独的、不同的类别，以便作出有关治疗和预后的医学决定。随后，诊断意见通常以疾病或其他情况来描述。然而，诊断可以采取多种形式。这可能是检测存在并命名疾病、病变、功能障碍或残疾的问题。这可能是为管理或预后分类的练习。它可以指示连续的异常程度或分类中的异常类型。一般而言，本说明书中列出的诊断标志物是对照(非癌症个体)的分离样品和子宫内膜癌样品(包括几种类型的EC)中在水平表达上差异检测到的那些蛋白质。

本发明第一方面的体外方法可以使用以下样品来执行：(a)无症状受试者，(b)已经被鉴定为怀疑患有子宫内膜癌的受试者，(c)已诊断为子宫内膜癌的受试者，作为补充确认诊断试验；或(d)患病风险高的受试者。

在本发明中，本发明的任一方面的方法中提及的术语“参考对照水平”应理解为给定的分子标志物或给定的多种分子标志物的组合的预定义值，在第一或第二方面以及在特定实施方式中列出的任一种蛋白质的本例中，其来源于样品或样品组中所述分子标志物或多种标志物的水平。如果在蛋白质水平上确定表达水平，则“参考表达水平”是蛋白质量的预定义值，而如果在mRNA水平上确定表达水平，则“参考表达水平”是mRNA量的预定义值。样品取自受试者或受试者组，其中，疾病的存在、不存在、阶段、组织学亚型或等级或病程之前已正确执行。该值用作阈值来区分待分析的状况存在的受试者和那些不存在该状况的受试者(即，子宫内膜癌的受试者与没有子宫内膜癌的受试者)，以确定疾病的组织学亚型，发展或患有子宫内膜癌的风险，等等。该参考对照水平也有助于确定受试者是否必须开始医疗方案以及该方案是否有效。由其得到“参考对照水平”的受试者或多个受试者可包括不存在状况的一个或多个受试者、存在状况的一个或多个受试者，或者两者。本领域的技术人员利用所掌握的一般知识，能够选择更适合于获得本发明的每种方法的参考对照水平的受试者或受试者组。从选定的受试者组获取参考值的方法在当前技术中是众所周知的(BurtisC.A等，2008，第14章，““Statistical Treatment of Reference Values”部分)。在特定情况中，“参考对照水平”是利用常规ROC分析定义的截止值(Receiver OperatingCharacteristic analysis)。正如技术人员所理解的，最佳截止值将根据诊断或预后方法的具体应用来限定：目的、诊断或预后的目标人群、特异性和敏感性之间的平衡等。

本文中使用的“预后”是指对疾病的可能进展和结果的预测。它包括：肿瘤分级(试图以可复制的方式表达肿瘤中细胞分化的水平，因为越来越多的增生与肿瘤的浸润性相关)、肿瘤分期(试图以可复制的方式表达患者肿瘤的范围)、肿瘤组织学亚型和肿瘤分子亚型。如本文所用，预后在特定实施方式中意味子宫内膜样子宫内膜癌和非子宫内膜样子宫内膜癌之间的区别。

术语“来自女性生殖道的液体样品”指的是由形成女性生殖道一部分的子宫器官产生的液体，并通过抽吸(如真空抽吸(即“子宫抽吸样品”)，或通过康尼埃移液管抽吸，和/或从子宫腔中取出液体的任何其他方法获得。因此，它包括子宫冲洗液。根据本发明，尤其是在没有之前的盐水输注步骤的情况下进行液体抽吸。也就是说，术语“抽吸”不包括那些由子宫冲洗液产生的样品。

在本发明中，可互换地称为“胞外小泡”、“微囊泡”、“外泌体样小泡”或“子宫小泡”的“外泌体”，是存在于许多真核生物液体(包括血液、尿液和细胞培养物的培养基)中的细胞衍生小泡。报道的外泌体的直径在30至100nm之间，比低密度脂蛋白(LDL)大，但比例如红细胞小得多。外泌体在多泡体与质膜融合时从细胞中释放，或直接由质膜释放。外泌体可能用于诊断、预后、治疗，以及用作健康和疾病的标志物。“从UA分离的含有外泌体的级分”被理解为从主要包含外泌体的子宫抽吸物中的任何纯化级分。由子宫抽吸物分离外泌体的方法的非限制性实例以下详述。

在与用于子宫液的外泌体中鉴别的EC的新型诊断生物标志物有关的方面的特定的实施方式中，可选地结合以上或以下的任何实施方式，本发明的一个方面是EC的诊断方法，样品是子宫液抽吸物(UA)。

在EC诊断方法的另一特定实施方式中，可选地结合以上或以下的任何实施方式，样品是由子宫抽吸物分离的含有外泌体的级分(子宫液样品)，所述方法包括确定一种或多种选自由AGRIN、MVP、TACD2、FAS、VAMP8、SYIC、SORT、LAT1、TERA、RUVB1、RSSA、RS16、SMD3、ADA10、RPL13A、RL11、IMB1、AGR2、ITA3、RUXE、RL12、PSMD2、MX1、VPS35、ILF2、PDIA1、ANXA4、MMP9、RAB8A、SH3L3、RL29、PLD3、PPIA、ANXA2、SSRA、LAMP2、PODXL、CLD6、IF2B3、CD59、MLEC、PGBM、S10AC、CD14、H10、CD81、AR6P1、VAC14、ITB3和CD166组成的组的蛋白质的表达水平。

在另一实施方式中，EC的诊断方法包括确定由UA分离的含有外泌体的级分部分中一种或多种选自由AGRIN、MVP、TACD2、FAS、VAMP8、SYIC、SORT、LAT1、TERA、RUVB1、RS16、RSSA、SMD3、ADA10、RPL13A、RL11、IMB1、AGR2、ITA3、RUXE、RL12、PSMD2、MX1、VPS35、ILF2、PDIA1、ANXA4、MMP9、RAB8A、SH3L3、RL29、PLD3、PPIA、ANXA2、SSRA、LAMP2、PODXL、CLD6、IF2B3、CD59、MLEC、PGBM、S10AC、CD14、H10、CD81、AR6P1、VAC14、ITB3和CD166组成的组的蛋白质的表达水平；以及确定来自女性生殖道的子宫液样品中一种或多种选自由AGRIN、MVP、VAMP8、SYIC、RAB8A、MX1、IMB1、CLIC1、SMD3、ILF2、TERA、RL11、BCAM、ANXA2、LAT1、RUVB1、SH3L3、RPL13A、RS16、RSSA、RL12、PDIA1、RL29、PPIA、AGR2、MMP9和KPYM组成的组的蛋白质的表达水平，后一种样品没有分离或纯化外泌体。

在特定的实施方式中，EC的诊断方法包括确定两种或更多种蛋白质，更特别是三种或更多种蛋白质，甚至超过四种蛋白质的表达水平。

在另一特定的实施方式中，EC的诊断方法还包括确定一种或多种选自由PERM、OSTP、CTNB1、CAYP1、XPO2、NGAL、SG2A1、CADH1、SPIT1、MMP9、NAMPT、LDHA、CASP3、PRDX1、MIF、K2C8、CAPG、MUC1、ANXA1、HSPB1、PIGR、CH10、CD44、CLIC1、TPIS、GSTP1、GTR1、ENOA、PDIA1、KPYM、ANXA2和FABP5组成的组的蛋白质的表达水平。

在另一特定的实施方式中，可选地结合以上或以下的任何实施方式，EC的诊断方法包括确定由UA分离的还有外泌体的级分中至少一组选自由AGRIN、CD81、TERA；AGRIN、CD59、MVP；AGR2、AGRIN、CD81；AGRIN、CD166、MVP；AGRIN、CD81；AGRIN、CD166；AGRIN、CD59；和AGRIN、MMP9组成的组的蛋白质(即生物标志物)的表达水平；和/或确定子宫抽吸物中至少一组选自由MMP9、PODXL、RAB8A；MMP9、PODXL、RSSA；AGRIN、MMP9、PODXL；MMP9、PODXL、VAMP8；MMP9、MX1；MMP9、RSSA；MMP9、MVP；MMP9、RAB8A；MMP9、VAMP8；BCAM、MMP9；MMP9、AGRIN组成的组的蛋白质(即生物标志物)的表达水平。

在另一特定的实施方式中，可选地结合以上或以下的任何实施方式，EC的诊断方法还包括确定至少一组选自由表D的列举物(在本说明书的末尾说明)组成的组的蛋白质(即生物标志物)的表达水平。

本发明的另一方面是一种或多种选自由AGRIN、MVP、VAMP8、SYIC、RAB8A、MX1、IMB1、CLIC1、SMD3、ILF2、TERA、RL11、BCAM、ANXA2、LAT1、RUVB1、SH3L3、RPL13A、RS16、RSSA、RL12、PDIA1、RL29、PPIA、AGR2、MMP9、KPYM、TACD2、FAS、SORT、LAT1、ADA10、ITA3、RUXE、PSMD2、VPS35、ANXA4、PLD3、SSRA、LAMP2、PODXL、CLD6、IF2B3、CD59、MLEC、PGBM、S10AC、CD14、H10、CD81、AR6P1、VAC14、ITB3和CD166组成的组的蛋白质在来自女性生殖道的子宫液样品中作为诊断EC的离体标志物的应用。该方面也可表述为用于检测受试者的一种或多种子宫内膜癌的体外方法，该方法包括：(a)由女性生殖道获得子宫液样品；和(b)检测来自女性生殖道的子宫液样品中的至少一种选自AGRIN、MVP、VAMP8、SYIC、RAB8A、MX1、IMB1、CLIC1、SMD3、ILF2、TERA、RL11、BCAM、ANXA2、LAT1、RUVB1、SH3L3、RPL13A、RS16、RSSA、RL12、PDIA1、RL29、PPIA、AGR2、MMP9、KPYM、TACD2、FAS、SORT、LAT1、ADA10、ITA3、RUXE、PSMD2、VPS35、ANXA4、PLD3、SSRA、LAMP2、PODXL、CLD6、IF2B3、CD59、MLEC、PGBM、S10AC、CD14、H10、CD81、AR6P1、VAC14、ITB3和CD166的子宫内膜癌标志物的量，所述标志物提供EC诊断的信息。一般来说，它包括一种或多种选自由AGRIN、MVP、VAMP8、SYIC、RAB8A、MX1、IMB1、CLIC1、SMD3、ILF2、TERA、RL11、BCAM、ANXA2、LAT1、RUVB1、SH3L3、RPL13A、RS16、RSSA、RL12、PDIA1、RL29、PPIA、AGR2、MMP9、KPYM、TACD2、FAS、SORT、LAT1、ADA10、ITA3、RUXE、PSMD2、VPS35、ANXA4、PLD3、SSRA、LAMP2、PODXL、CLD6、IF2B3、CD59、MLEC、PGBM、S10AC、CD14、H10、CD81、AR6P1、VAC14、ITB3和CD166组成的组的蛋白质在来自女性生殖道的分离出的子宫液样品中作为用于诊断子宫内膜癌的离体标志物的用途。

用上述一种或多种蛋白质来诊断EC可通过使用包括确定这些蛋白质的表达水平的工具的试剂盒进行。在诊断试剂盒的特定实施方式中，它包括用于检测由UA分离出的含有外泌体的级分中的下列蛋白质AGRIN、MVP、TACD2、FAS、VAMP8、SYIC、SORT、LAT1、TERA、RUVB1、RSSA、RS16、SMD3、ADA10、RPL13A、RL11、IMB1、AGR2、ITA3、RUXE、RL12、PSMD2、MX1、VPS35、ILF2、PDIA1、ANXA4、MMP9、RAB8A、SH3L3、RL29、PLD3、PPIA、ANXA2、SSRA、LAMP2、PODXL、CLD6、IF2B3、CD59、MLEC、PGBM、S10AC、CD14、H10、CD81、AR6P1、VAC14、ITB3和CD166中的一种或多种的表达水平的工具。

在另一特定的实施方式中，可选地结合以上或以下的任何实施方式，试剂盒包括进一步检测下列蛋白质PERM、OSTP、CTNB1、CAYP1、XPO2、NGAL、SG2A1、CADH1、SPIT1、MMP9、NAMPT、LDHA、CASP3、PRDX1、MIF、K2C8、CAPG、MUC1、ANXA1、HSPB1、PIGR、CH10、CD44、CLIC1、TPIS、GSTP1、GTR1、ENOA、PDIA1、KPYM、ANXA2和FABP5中的一种或多种的表达水平的工具。

此外在另一更特定的实施方式中，试剂盒包括检测一种或多种给出特定预后信息并选自PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、CAPG、XPO2、PRDX1、CLIC1、PDIA1、KPYM、ENOA、GSTP1、GTR1、CH10、MIF、PEBP1、TPIS、NGAL、LDHA、AGR2、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、BCAM、IF2B3、PLD3和MX1的蛋白质(即预后生物标志物)的表达水平的工具。

本发明的另一方面是所述试剂盒用于诊断EC的应用，所述试剂盒包括确定以上定义的一种或多种的蛋白质的工具。

在试剂盒的应用的另一特定实施方式中，用于检测蛋白质的表达水平的工具是用于执行选自由免疫测定、生物发光测定、荧光测定、化学发光测定、电化学测定、质谱及其组合组成的组的测定或技术的工具。

本文所列所有蛋白质的Uniprot数据库登录号对应于2007年7月7日可访问的版本。此外，它们显示于实施例的表格中。

AGRINUniprot数据库登录号为O00468。这种蛋白质是硫酸肝素基膜糖蛋白，参与神经肌肉连接的形成和维持。

MVP，也称为主要拱顶蛋白，Uniprot数据库登录号为Q14764。它参与信号转导。

VAMP8，也称为囊泡相关膜蛋白8，其Uniprot数据库登录号为Q9BV40。它是可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(SNARE)，通过直接控制自噬体膜与溶酶体膜的融合参与自噬。

SYIC，也称为异亮氨酸-tRNA连接酶，Uniprot数据库登录号为P41252SYIC。

RAB8A，也称为Ras相关蛋白Rab-8A，Uniprot数据库登录号为P61006。它是参与细胞内膜运输的小GTPases Rab。

MX1，也称为干扰素诱导的GTP结合蛋白MX1，其Uniprot数据库登录号为P20591。它对多种RNA病毒和一些DNA病毒具有抗病毒活性。

IMB1，也称为输入蛋白亚基β-1，Uniprot数据库登录号为Q14974。它参与核蛋白输入。

SMD3，也称为小核核糖核蛋白Sm D3，其Uniprot数据库登录号为P62318。它是剪接体的成分。

ILF2，也称为白细胞介素增强因子结合因子2，Uniprot数据库登录号为Q12905。它参与IL2基因的调节。

TERA，也称为过渡性内质网ATP酶，其Uniprot数据库登录号为P55072。这种蛋白质参与了过渡性内质网的形成。

RL11，也称为60S核糖体蛋白L11，其Uniprot数据库登录号为P62913。这种蛋白质是核糖体的成分，因此，它参与了细胞内蛋白质的合成。

BCAM，也称为基底细胞粘附分子，其Uniprot数据库登录号为P50895。这种蛋白质是层粘连蛋白α-5受体。

ANXA2，也称为膜联蛋白A2，Uniprot数据库登录号为P07355。这种蛋白是钙调节的膜结合蛋白，其抑制PSCK9增强的LDLR降解。

LAT1，也称为大中性氨基酸转运体小亚基1，Uniprot数据库登录号为Q01650。这种蛋白质参与细胞氨基酸的摄取。

RUVB1，也称为Pontin52或INO80复合亚基H，Uniprot数据库登录号为Q9Y265。该蛋白质是NuA4组蛋白乙酰转移酶复合物的成分，它主要通过核小体组蛋白H4和H2A的乙酰化参与选择基因的转录激活。

SH3L3，也称为SH3结构域结合富谷氨酸样蛋白3或SH3结构域结合蛋白1，其Uniprot数据库登录号为Q9H299。这种蛋白质可能参与谷胱甘肽活性的调节。

RPL13A，也称为60S核糖体蛋白，Uniprot数据库登录号为P40429。它在炎症过程中参与干扰素-γ诱导的转录选择性翻译抑制。

RS16，也称为40S核糖体蛋白S16，Uniprot数据库登录号为P62249。

RSSA，也称为40S核糖体蛋白SA或层粘连蛋白受体1，其Uniprot数据库登录号为P08865。它对于40S核糖体亚基的组装和/或稳定性是必需的。

RL12，也称为60S核糖体蛋白L12，Uniprot数据库登录号为P30050。

RL29，也称为60S核糖体蛋白L29，Uniprot数据库登录号为P47914。这种蛋白质是大核糖体亚基的成分。

PPIA，也称为肽酰-脯氨酰-顺反式异构酶A、亲环素A或旋转异构酶A，其Uniprot数据库登录号为P62937。这种蛋白质参与蛋白质折叠。

AGR2，也称为前梯度蛋白2同源物或HPC8，Uniprot数据库登录号为O95994。该蛋白至参与MUC2转录后的合成和分泌。

PODXL，也称为PodoAddixin或GCTM-2抗原，UnPROT数据库登录号为O0592。它参与粘附、细胞形态和癌症进展的调节。

CD59，也称为CD59糖蛋白或MAC抑制蛋白，其Uniprot数据库登录号为P13987。它参与补体膜攻击复合物(MAC)作用的抑制。

TACD2，也称为肿瘤相关钙信号转导子2或细胞表面糖蛋白Trop-2，其Uniprot数据库登录号为P09758。这种蛋白质可能作为生长因子受体发挥作用。

FAS，也称为脂肪酸合成酶，具有的Uniprot数据库的登录号为P49327。它参与由乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A和NADPH形成长链脂肪酸。

SORT，也称为Sortilin或神经降压素受体3，Uniprot数据库登录号为Q99523。这种蛋白质在高尔基体室中作为分类受体发挥作用，并在细胞表面作为清除受体发挥作用。

ADA10，也称为去整合素和含金属蛋白酶结构域的蛋白10，Uniprot数据库登录号为O14672。它参与数种细胞表面蛋白的蛋白水解释放，如TNFα的膜结合前体。

PGBM，也称为基底膜特异性硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白或Perlecan，Uniprot数据库登录号为P98160。它参与固定负电荷膜电荷和血管化。

ITA3，也称为整合素α-3或VLA-3亚基α，Uniprot数据库登录号为P26006。它是纤维连接蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白、表皮整联配体蛋白、血栓反应蛋白和CSPG4的受体。

RUXE，也称为小核核糖核蛋白E，其Uniprot数据库登录号为P62304。这种蛋白质参与组蛋白3'-端的加工。可能间接地在头发发育过程中起作用。

PSMD2，也称为26S蛋白酶体非ATPase调节亚基2，其Uniprot数据库登录号为Q13200。它参与泛素化蛋白的ATP依赖性降解。

VPS35，也称为液泡蛋白分类相关蛋白35，Uniprot数据库登录号为Q96QK1。它参与防止选定的跨膜运输蛋白误分到溶酶体降解途径。

AnnAs4，也称为膜联蛋白A4或脂质素Ⅳ，UNIPRT数据库登录号为P09525。它参与膜融合相关的过程和胞吐。

PLD3，也称为磷脂酶D3或胆碱磷酸酶3，Uniprot数据库登录号为Q8IV08。这种蛋白质可能参与APP的处理。

S10AC，也称为蛋白质S100-A12或钙粒蛋白C，Uniprot数据库登录号为P80511。这种蛋白质参与炎症过程和免疫响应的调节。

CD14，也称为单核细胞分化抗原CD14，Uniprot数据库登录号为P08571。该蛋白质是细菌脂多糖(LPS)的辅助受体，参与对细菌LPS的先天免疫应答。

LAMP2，也称为溶酶体相关膜糖蛋白2，Uniprot数据库登录号为P13473。它参与伴侣蛋白介导的自噬。

CLD6，也称为Claudin-6或Skullin，Uniprot数据库登录号为P56747。它参与细胞间隙紧密连接的特异性闭塞。

F2B3，也称为胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白3或VICKZ家族成员3，Uniprot数据库登录号为O00425。它参与靶向转录产物向细胞质蛋白RNA复合物的募集。

MLEC，也称为Malectin，Uniprot数据库登录号为Q14165。这种蛋白质参与蛋白质N-糖基化的早期步骤。

H10，也称为组蛋白H1.0或组蛋白H1'，Uniprot数据库登录号P07305。这种蛋白质参与核小体链向高阶结构的缩合。

CD166，也称为CD166抗原，Uniprot数据库登录号为Q13740。它参与异型和同型细胞-细胞接触。

CD81，也称为CD81抗原或Tetraspanin-28，Uniprot数据库登录号为P60033。这种蛋白可能参与了淋巴瘤细胞生长的调节。

AR6P1，也称为ADP核糖化因子样蛋白6-相互作用蛋白1，Uniprot数据库登录号为Q15041。该蛋白质参与SLC1A1/EAAC1介导的谷氨酸转运。

VAC14，也称为蛋白VAC14同系物或Tax1结合蛋白2，Uniprot数据库登录号为Q08AM6。该蛋白质参与来自早期核内体的核内体载体囊泡(ECV)/多囊体(MVB)转运中间产物的生物起源。

ITB3，也称为整合素β-3，Uniprot数据库登录号为P05106。这种蛋白参与细胞信号转导，这是因为它形成了几种配体的细胞受体，如纤维粘连蛋白，层粘连蛋白或骨桥蛋白等。

PIGR，也称为聚合免疫球蛋白受体，Uniprot数据库登录号为P01833，2007年6月26日-v4。该受体结合上皮细胞基底外侧表面的聚合IgA和IgMPIGR。

VIME，也称为波形蛋白，是在各种非上皮细胞，特别是间充质细胞中发现的III类中间丝。波形蛋白附着于细胞核、内质网和线粒体，或者从侧面或者由末端。它的Uniprot数据库登录号为P08670，2007年1月23日-v4。

CTNB1，也称为连环素β-1，Uniprot数据库登录号P35222，1994年2月1日-v1。它用作中心体凝聚力的负调节因子，能够阻断恶性肾和肠上皮细胞的失活。

CAYP1，也称为钙磷蛋白，Uniprot数据库登录号为Q13938，1997年11月1日-v1。它是钙结合蛋白，可在细胞信号事件中发挥作用。

WFDC2，WAP四-二硫核心结构域蛋白2，是广谱蛋白酶抑制剂，也称为附睾分泌蛋白E4。它Uniprot数据库的登录号为Q14508 2002年1月23日-v2。

CADH1，也称为钙粘蛋白-1或E-钙粘蛋白，Uniprot数据库登录号为P12830，1993年7月1日-v3。该蛋白参与调节上皮细胞的细胞-细胞粘附、迁移和增殖的机制。具有强大的浸润抑制作用。

CD44，也称为CD44抗原，Uniprot数据库登录号为P16070，2010年10月5日-v3。通过其对HA的亲和力，也可能通过其对其他配体如骨桥蛋白、胶原蛋白和基质金属蛋白酶(MMPs)的亲和力来介导细胞-细胞和细胞-基质的相互作用。

XPO2，也称为exportin-2，Uniprot数据库登录号为P550620，2005年3月29日-v3。除其他外，该蛋白已被披露为输出输入蛋白α的受体，介导输入蛋白α在输入底物(货物)后从细胞核再输出到细胞质，以及以其活性GTP结合形式与输入蛋白α和GTPase Ran协同结合。

SG2A1，也称为乳腺珠蛋白-B，其Uniprot数据库登录号为O75556，1998年11月1日-v1。其可与雄激素和其他类固醇结合。

ENOA，也称为α-烯醇化酶，Uniprot数据库登录号为P067320，2007年1月23日-v2。它是多功能酶，除了在糖酵解中的作用外，还在诸如生长控制、耐缺氧和过敏反应等各种过程中发挥作用。也可能在血管内和细胞周围的纤溶系统中发挥作用，这是因为它具有在诸如白细胞和神经元等几种细胞类型的细胞用作纤溶酶原的受体和激活剂的能力。刺激免疫球蛋白产生。

LEG3，称为galectin-3，也称为galectin-3，是结合IgE的半乳糖特异性凝集素。可能与α-3，β-1整合素介导CSPG4刺激的内皮细胞迁移。与DMBT1一起，为早期胚胎发生过程中柱状上皮细胞的终末分化所需(相似性)。在细胞核中：用作mRNA前剪接因子。参与急性炎症反应，包括中性粒细胞活化和粘附、单核巨噬细胞的化学性诱导、凋亡中性粒细胞的调理素作用和肥大细胞的活化。它Uniprot数据库登录号为P17931，2008年11月25日-v5。

LEG1，也称为蛋白质LEG1同源物，参与肝脏的早期发育。它Uniprot数据库登录号为P09382，2005年3月29日-v2。

CAPG，也称为巨噬细胞加帽蛋白，其Uniprot数据库登录号为P401211，2010年11月30日-v2。它是钙敏感蛋白，可逆地阻断肌动蛋白微丝的倒钩端，但不切断预先形成的肌动蛋白微丝。可能在巨噬细胞功能中起重要作用。

PRDX1，也称为过氧化物酶-1，UnPROT数据库登录号为Q06830，1994年6月1日-v1。它参与细胞的氧化还原调节。

CLIC1，也称为氯离子胞内通道蛋白1，Uniprot数据库登录号为O00299，2007年1月23日-v4。它插入膜中并形成氯离子通道。通道活性取决于pH值。膜插入似乎是氧化还原调节的，并且可能仅在氧化条件下发生。参与细胞周期的调节。

PDIA1，也称为蛋白质二硫键异构酶，其Uniprot数据库登录号为P07237，1997年11月1日-v3。它催化二硫键的形成、断裂和重排。

KPYM，也称为丙酮酸激酶PKM，Uniprot数据库登录号为P14618，2007年1月23日-v4。它是糖酵解酶，催化磷酸基基团从磷酸烯醇丙酮酸(PEP)转移到ADP，生成ATP，并在肿瘤细胞的半胱天冬酶独立细胞死亡中起到普遍作用。

GSTP1，也称为谷胱甘肽S-转移酶P，其Uniprot数据库登录号为P09211，2007年1月23日-v2。它通过p25/p35易位而负向地调节CDK5活性以防止神经变性。

GTR1Uniprot数据库登录号为P11166，2006年10月3日-v2。它是促进葡萄糖转运体。这种同种型可能是构成性或基础性葡萄糖摄取的原因。它具有非常广泛的底物特异性；能运输多种醛糖，包括戊糖和己糖。

CH10，也称为10kDa热休克蛋白，线粒体，Uniprot数据库登录号为P61604，2007年1月23日-v2。它与CPN60均为线粒体蛋白质生物合成所必需。在Mg-ATP存在下与CPN60结合并抑制后者的ATP酶活性。

MIF，也称为巨噬细胞迁移抑制因子，Uniprot数据库登录号为P14174，2007年1月23日-v4。它参与细菌病原体的先天免疫反应。

PEBP1，磷脂酰乙醇胺结合蛋白1，它结合ATP、阿片类化合物和磷脂酰乙醇胺。它是丝氨酸蛋白酶抑制剂，抑制凝血酶、神经蛋白酶和糜蛋白酶，但不抑制胰蛋白酶、组织型纤溶酶原激活剂和弹性蛋白酶(相似性)。通过抑制RAF1的活化、分离RAF1/MEK复合物以及用作MEK磷酸化的竞争性抑制剂来抑制RAF1的激酶活性。它Uniprot数据库登录号为P30086，2007年1月23日-v3。

TPIS，也称为三聚磷酸异构酶，Uniprot数据库登录号为P60174，2011年10月19日-v3。这种蛋白质参与糖异生的途径，这是碳水化合物生物合成的一部分。

NGAL，也称为中性粒细胞明胶酶相关脂蛋白，Uniprot数据库登录号为P80188，1995年11月1日-v2。它参与白细胞介素-3(IL3)缺乏引起的细胞凋亡并参与先天免疫。

LDHA，也称为L-乳酸脱氢酶A链，其Uniprot数据库登录号为P00338，2007年1月23日-v2。这种蛋白质参与由丙酮酸合成(S)-乳酸的亚通道的步骤1。

这些蛋白中的一些与组织样品中的EC分级有关。然而，没有有意义的数据与女性生殖道的子宫液样品的值相关。如上所公开，检测子宫液(抽吸物或冲洗液)中的标志物意味着在妇科疾病的临床实践中从常规取样中收集数据的优势，避免了成本，更重要的是，组织活检。

如上所述，作为第一方面，本发明也提供子宫内膜癌的鉴别诊断方法，所述方法包括确定来自女性生殖道的子宫液样品中CTNB1的表达水平。

在子宫内膜癌的鉴别诊断方法的特定实施方式中，子宫液样品是来自女性生殖道的子宫抽吸液样品。

在另一特定的实施方式中，该方法还包括确定下列蛋白质MMP9、AGRIN、CAPG、HSPB1和XPO2中的一种或多种的表达水平。

在另一特定的实施方式中，其还包括确定下列蛋白质PIGR、VIME、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、AGR2、BCAM、PODXL、CD59、CLD6、IF2B3、PLD3和MX1中的一种或多种的表达水平。

在子宫内膜癌的鉴别诊断方法的另一特定实施方式中，该方法还包括确定下列蛋白质PRDX1、CLIC1、PDIA1、KPYM、ENOA、GSTP1、GTR1、CH10、MIF、PEBP1、TPIS、NGAL、CAYP1、SG2A1、LDHA、PERM、OSTP、SPIT1、NAMPT、CASP3、K2C8、MUC1、ANXA1、ANXA2、FABP5和WFDC2中的一种或多种的表达水平。

然而，在另一特定的实施方式中，所述方法还包括确定一种或多种选自由XPO2、PRDX1、CLIC1、PDIA1、KPYM、ENOA、GSTP1、GTR1、CH10、MIF、PEBP1、TPIS、NGAL和LDHA组成的组的蛋白质的表达水平。

在另一特定的实施方式中，所述方法还包括确定由子宫抽吸液分离的含有外泌体的级分中一种或多种选自由CLD6、BCAM、IF2B3、PLD3和MX1组成的组的蛋白质的表达水平。

然而，在另一特定的实施方式中，该方法还包括确定至少一组选自由LAMP、MMP9、PIGR；AGRIN、MMP9、PIGR；AGR2、PIGR、PLD3；AGR2、BCAM、PODXL；BCAM、PODXL；PIGR、PLD3；BCAM、PIGR；CLD6、RAB8A；CLD6、PODXL；BCAM、RL29；BCAM、PODXL；CLD6、PPIA、AGRIN、BCAM；ANXA、BCAM；BCAM、RAB8A；BCAM、SYIC；CLD6、IFB3；以及表C中所列的组组成的组的蛋白质的表达水平。

在所述导电的另一特定实施方式中，子宫内膜癌的鉴别诊断通过区分非子宫内膜样子宫内膜癌和子宫内膜样子宫内膜癌和非癌症而确定。

在所述方法的另一特定实施方式中，在蛋白质水平上确定表达水平。

在更特定的实施方式中，蛋白质水平通过选自由免疫测定、生物发光测定、荧光测定、化学发光测定、电化学测定、质谱及其组合组成的组的测定或技术来确定。

在另一特定的实施方式中，使用能够与蛋白质结合的抗体或其片段来确定蛋白质的表达水平。

更特别是，所述抗体或其片段形成试剂盒的一部分。

如上所述，本发明的另一方面是一种或多种选自由PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、CAPG、AGR2、BCAM、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、IF2B3、PLD3和MX1组成的组的蛋白质在来自女性生殖道的子宫液样品中作为用于对子宫内膜癌预后的离体标志物的应用。更特别是，至少CTNB1的表达水平的应用。

本发明也涉及一种或多种选自由PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、CAPG、AGR2、BCAM、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、IF2B3、PLD3和MX1组成的组的蛋白质在前述方面和实施方式的任一种的方法中用于对子宫内膜癌预后的应用。

另一方面是用于子宫内膜癌的预后，以及用于子宫内膜癌的鉴别诊断的试剂盒的应用，所述试剂盒包括固相载体和用于检测下列蛋白质PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、CAPG、AGR2、BCAM、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、IF2B3、PLD3和MX1中的一种或多种的表达水平的工具，以及可选的用于检测下列蛋白质XPO2、PRDX1、CLIC1、PDIA1、KPYM、ENOA、GSTP1、GTR1、CH10、MIF、PEBP1、TPIS、NGAL和LDHA中的一种或多种的表达水平的工具。

在试剂盒的应用的特定实施方式中，所述试剂盒包括固相载体和用于检测至少一组选自由LAMP、MMP9、PIGR；AGRIN、MMP9、PIGR；AGR2、PIGR、PLD3；AGR2、BCAM、PODXL；BCAM、PODXL；PIGR、PLD3；BCAM、PIGR；CLD6、RAB8A；CLD6、PODXL；BCAM、RL29；BCAM、PODXL；CLD6、PPIA、AGRIN、BCAM；ANXA、BCAM；BCAM、RAB8A；BCAM、SYIC；CLD6、IFB3；以及表C中所列的组组成的组的蛋白质的表达水平的工具。

在试剂盒的应用的特定实施方式中，用于检测蛋白质的表达水平的工具是用于执行选自由免疫测定、生物发光测定、荧光测定、化学发光测定、电化学测定、质谱及其组合组成的组的测定或技术的工具。

更特别是，用于检测蛋白质的表达水平的工具是抗体或其片段。

本发明的另一方面是试剂盒，所述试剂盒包括固相载体和用于检测一种或多种选自由PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、CAPG、AGR2、BCAM、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、BCAM、IF2B3、PLD3、MX1、XPO2、PRDX1、CLIC1、PDIA1、KPYM、ENOA、GSTP1、GTR1、CH10、MIF、PEBP1、TPIS、NGAL和LDHA组成的组的蛋白质的表达水平的工具。特别包括用于检测至少CTNB1的表达水平的工具。

另一方面是试剂盒，所述试剂盒包括固相载体和用于检测至少一组选自由LAMP、MMP9、PIGR；AGRIN、MMP9、PIGR；AGR2、PIGR、PLD3；AGR2、BCAM、PODXL；BCAM、PODXL；PIGR、PLD3；BCAM、PIGR；CLD6、RAB8A；CLD6、PODXL；BCAM、RL29；BCAM、PODXL；CLD6、PPIA、AGRIN、BCAM；ANXA、BCAM；BCAM、RAB8A；BCAM、SYIC；CLD6、IFB3；以及表C中所列的组组成的组的蛋白质的表达水平的工具。

在试剂盒的特定实施方式中，所述试剂盒还包括用于检测至少一组选自由MMP9、PODXL、RAB8A；MMP9、PODXL、RSSA；AGRIN、MMP9、PODXL；MMP9、PODXL、VAMP8；MMP9、MX1；MMP9、RSSA；MMP9、MVP；MMP9、RAB8A；MMP9、VAMP8；BCAM、MMP9；MMP9、AGRIN；AGRIN、CD81、TERA；AGRIN、CD59、MVP；AGR2、AGRIN、CD81；AGRIN、CD166、MVP；AGRIN、CD81；AGRIN、CD166；AGRIN、CD59；AGRIN、MMP9以及表D中所列的那些蛋白质组组成的组的蛋白质的表达水平的工具。

在试剂盒的更特定的实施方式中，用于检测蛋白质的表达水平的工具是用于执行选自由免疫测定、生物发光测定、荧光测定、化学发光测定、电化学测定、质谱及其组合组成的组的测定或技术的工具。

更特别是，试剂盒包括抗体或其片段作为检测蛋白质表达水平的工具。

在试剂盒的另一特定实施方式中，它们是用于执行酶联免疫吸附测定的试剂盒。

在另一特定实施方式中，试剂盒还包括嵌板图(panel diagram)，用于对个体样品进行分类。

本发明也涉及计算机实现的方法，所述方法用于执行如以上所公开并如任一个实施方式中限定的鉴别诊断方法，其中在确定了一种或多种用于EC的诊断和/或预后的蛋白质的表达水平之后，给予所述水平以值和/或分数，并可选地以数学公式计算以获得计算值；其中，根据所述水平、分数和/或计算值，在是否患有EC的选择之间和/或患有不同EC亚型的选择之间做出决定。

如上所述，本发明的目的也在于以用于EC的预后方法作为另一方面。在本发明第一方面的特定实施方式中，所述方法包括确定来自女性生殖道的子宫液样品中PIGR、VIME、LEG1和CAPG中的一种或多种的表达水平。

在本发明该方面的另一特定实施方式中，可选地结合以上或以下的任何实施方式，子宫液样品是来自女性生殖道的子宫抽吸液样品。

在子宫抽吸液中差异检测蛋白质是非常有利的，因为只需最少的操作，并且能够获得有临床意义的信息。

在该方面的另一特定实施方式中，该方法包括确定下列蛋白质PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2和CADH1中的一种或多种的表达水平。正如实施例中将描述的，确定这七种蛋白质之一的水平可以对ROC曲线下面积为0.74至0.85(置信区间为95％)的EC亚型作出高度敏感性和特异性的诊断。

本发明人也确定，通过检测所述子宫液(特别是子宫抽吸液)中其他蛋白质的表达水平，可以提高EC亚型分类的稳健性(敏感性和特异性)，以及该疾病诊断的稳健性。因此，在第一和其他方面的另一特定实施方式中，可选地结合以上或以下的任何实施方式，该方法还包括确定下列蛋白质XPO2、PRDX1、CLIC1、PDIA1、KPYM、ENOA、GSTP1、GTR1、CH10、MIF、PEBP1、TPIS、NGAL、CAPG、CD44、LEG1、LEG3和LDHA中的一种或多种的表达水平。

更特别是，它还包括确定一种选自由XPO2、PRDX1、CLIC1、PDIA1、KPYM、ENOA、GSTP1、GTR1、CH10、MIF、PEBP1、TPIS、NGAL、CAPG、CD44、LEG1、LEG3和LDHA组成的组的蛋白质的表达水平。

在本发明的第一和其他方面的另一特定实施方式中，可选地结合以上或以下的任何实施方式，该方法包括确定两种选自由PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、CAPG、AGR2、BCAM、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、IF2B3、PLD3、MX1、XPO2、PRDX1、CLIC1、PDIA1、KPYM、ENOA、GSTP1、GTR1、CH10、MIF、PEBP1、TPIS、NGAL和LDHA组成的组的蛋白质的表达水平，其中至少一种蛋白质选自由PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1和CAPG组成的组。

在另一特定的实施方式中，该方法包括确定两种选自由PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、CAPG、AGR2、BCAM、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、IF2B3、PLD3、MX1、XPO2、PRDX1、CLIC1、PDIA1、KPYM、ENOA、GSTP1、GTR1、CH10、MIF、PEBP1、TPIS、NGAL和LDHA组成的组的蛋白质的表达水平。

在第一和其他方法的方面的另一特定实施方式中，该方法包括确定两种选自由AGR2、BCAM、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、IF2B3、PLD3和MX1组成的组的蛋白质的表达水平。

在本发明第一和其他方法的方面的另一特定实施方式中，可选地结合以上或以下的任何实施方式，该方法包括确定三种选自由PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、CAPG、AGR2、BCAM、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、IF2B3、PLD3、MX1、XPO2、PRDX1、CLIC1、PDIA1、KPYM、ENOA、GSTP1、GTR1、CH10、MIF、PEBP1、TPIS、NGAL和LDHA组成的组的蛋白质的表达水平，其中至少一种蛋白质选自由PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1和CAPG组成的组。

在本发明第一和其他方法的方面的另一特定实施方式中，可选地结合以上或以下的任何实施方式，该方法包括确定三种选自由PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、CAPG、AGR2、BCAM、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、IF2B3、PLD3、MX1、XPO2、PRDX1、CLIC1、PDIA1、KPYM、ENOA、GSTP1、GTR1、CH10、MIF、PEBP1、TPIS、NGAL和LDHA组成的组的蛋白质的表达水平。

在本发明第一和其他方法的方面的另一特定实施方式中，该方法包括确定三种选自由AGR2、BCAM、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、IF2B3、PLD3和MX1组成的蛋白质的表达水平。

在用于EC的预后方法的另一特定实施方式中，该方法还包括确定由子宫抽吸液分离出的含有外泌体的级分中一种或多种选自由CLD6、BCAM、IF2B3、PLD3和MX1组成的组的蛋白质的表达水平。

本发明人在子宫抽吸物的级分(所述级分以更纯化的形式包含外迷途)中检测到，某些标志物(蛋白质)在EEC和NEEC中差异表达。因此，本发明包括可选的步骤，该可选的步骤用于确定经处理的子宫抽吸物(外泌体级分)中特定的标志物或验证子宫液中确定的预后，或者在未分离外泌体的子宫液没有给出相关数据的情况下增加该方法的敏感性。

在更特定的实施方式中，EC的预后或鉴别诊断方法包括确定至少一组选自由LAMP、MMP9、PIGR；AGRIN、MMP9、PIGR；AGR2、PIGR、PLD3；AGR2、BCAM、PODXL；BCAM、PODXL；PIGR、PLD3；BCAM、PIGR；CLD6、RAB8A；CLD6、PODXL；BCAM、RL29；BCAM、PODXL；CLD6、PPIA；AGRIN、BCAM；ANXA、BCAM；BCAM、RAB8A；BCAM、SYIC；CLD6、IFB3；以及表C中所列的组组成的组的蛋白质的表达水平。

选自LAMP、MMP9、PIGR；AGRIN、MMP9、PIGR；AGR2、PIGR、PLD3；AGR2、BCAM、PODXL；BCAM、PODXL；PIGR、PLD3；BCAM、PIGR(下表B)；以及表C中所列的那些(在本说明书末尾加以说明)的特定组合，当在子宫抽吸物中检测到这些蛋白质的表达水平时，被确定具有很高的预后价值。下表B显示了AUC和95％值的置信区间(Cl)。数据来源于EEC和NEEC的样品分析。在表C中也显示了AUC值。

另一方面，表A显示了下列组合的AUC值和95％的置信区间：CLD6、RAB8A；CLD6、PODXL；BCAM、RL29；BCAM、PODXL；CLD6、PPIA、AGRIN、BCAM；ANXA、BCAM；BCAM、RAB8A；BCAM、SYIC；CLD6、IFB3，在由子宫抽吸物分离出的含有外泌体的级分中检测到这些蛋白质的表达水平时，其提供了重要的预后信息。数据来源于EEC和NEEC的样品分析。

表A

蛋白质1	蛋白质2	AUC	CI 95％下限	CI 95％上限	样品
						CLD6	RAB8A	0,894	0,775	1	外泌体s
CLD6	PODXL	0,931	0,849	1	外泌体s
						BCAM	RL29	0,922	0,857	0,987	外泌体s
BCAM	PODXL	0,908	0,823	0,993	外泌体s
						CLD6	PPIA	0,926	0,839	1	外泌体s
AGRIN	BCAM	0,903	0,821	0,984	外泌体s
						ANXA	BCAM	0,919	0,838	0,999	外泌体s
BCAM	RAB8A	0,923	0,853	0,993	外泌体s
						BCAM	SYIC	0,913	0,825	1	外泌体s
CLD6	IFB3	0,894	0,775	1	外泌体s

表B

蛋白质1

蛋白质2

蛋白质3

AUC

CI 95％下限

CI 95％上限

样品

LAMP2

MMP9

PIGR

0,984

0,956

1

子宫抽吸物

AGRIN

MMP9

PIGR

0,98

0,946

1

子宫抽吸物

AGR2

PIGR

PLD3

0,977

0,94

1

子宫抽吸物

AGR2

BCAM

PODXL

0,973

0,933

1

子宫抽吸物

BCAM

PODXL

0,943

0,862

1

子宫抽吸物

PIGR

PLD3

0,949

0,871

1

子宫抽吸物

BCAM

PIGR

0,936

0,863

1

子宫抽吸物

在更特定的实施方式中，该方法包括确定CTNB1、XPO2和CAPG的表达水平。正如以下描述并图示(图1)，这种组合可以允许敏感性和特异性地鉴别诊断EEC和NEEC(浆液性EC；SEC)。

在本发明的第一和其他方法的方面的另一特定实施方式中，可选地结合以上或以下的任何实施方式，该方法包括确定四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或十一种选自由PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、CAPG、AGR2、BCAM、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、IF2B3、PLD3、MX1、XPO2、PRDX1、CLIC1、PDIA1、KPYM、ENOA、GSTP1、GTR1、CH10、MIF、PEBP1、TPIS、NGAL和LDHA组成的组的蛋白质的表达水平，其中至少一种蛋白质选自由PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1和CAP组成的组。

在本发明的第一和其他方法的方面的另一特定实施方式中，可选地结合以上或以下的任何实施方式，该方法包括确定下列蛋白质PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、CAPG、AGR2、BCAM、PODXL、MMP9和CD59的表达水平。

在以上和以下提供的任一种实施方式中，对于本发明的任一个方面，在蛋白质水平上确定表达水平。在该实施方式中，一种或多种蛋白质标志物包括但不限于天然序列肽、亚型、嵌合多肽、标志物的所有同源物、片段和前体，包括多肽及其衍生物的修饰形式。在更特定的实施方式中，蛋白质水平通过选自由免疫测定、生物发光测定、荧光测定、化学发光测定、电化学测定、质谱及其组合组成的组的测定或技术来确定。

在以上或以下提供的特定的实施方式中，表达水平由免疫化学确定。

本文中使用的术语“免疫化学”指的是利用抗体与所述抗原特异结合的原理，检测样品中的抗原的各种技术(通常是蛋白质和肽，在本例中是以上所列的任一种单独的或组合的蛋白质)。可视化抗体-抗原相互作用可以通过多种方式实现。在最常见的情况下，抗体与酶(如过氧化物酶)结合，以催化产生颜色的反应。作为选择，抗体也可以标记至荧光团(如荧光素或罗丹明)。免疫化学技术可以是直接的，也可以是间接的。直接法是一步染色法，并且包括直接与抗原反应的经标记抗体(如FITC结合抗血清)。虽然该技术仅使用一种抗体而因此简单快速，但由于信号放大很小所以敏感性较低，如采用间接法，其不如间接法常用。间接法包括与样品中的目标抗原结合的未标记的一次抗体(第一层)和与初级抗体反应的标记的二次抗体(第二层)。该方法比直接检测策略更敏感，这是因为如果二次抗体与荧光或酶报告剂结合，则由于几个二次抗体与各一次抗体结合而产生的信号放大所致。

如果二次抗体与几种生物素分子(能够招募到亲和素、链亲和素或中性亲和素酶的复合物)缀合，可以实现进一步的扩增。间接法除了具有更高的敏感性外，还具有的优点是只需产生相对少量的标准缀合(标记)二次抗体。采用直接法，必须为每一种所关注的抗原标记每一种一次抗体。必须记住，如果经标记核酸探针(专为与某一靶核酸序列结合而设计)稍后可由经标记的抗体检测，则免疫化学技术也可用于检测某些核酸序列。因此，蛋白质的检测可如下进行：使用设计为结合靶蛋白RNA的特定序列的标记核酸，然后使用选择性结合标记的标记抗体来检测所述标记核酸。

免疫测定程序合适地包括酶联免疫吸附测定(ELISA，如多重ELISA)、酶免疫斑点测定、凝集测定、抗体-抗原-抗体夹心测定、抗原-抗体-抗原夹心测定、免疫层析或其他普通技术人员熟知的免疫测定形式，例如放射免疫测定，以及蛋白质微阵列形式。

在一个实施方式中，结合以上或以下提供的任一个实施方式，通过免疫测定确定蛋白质的表达水平。

在另一个实施方式中，结合以上或以下提供的任一个实施方式，蛋白质的表达水平由ELISA；更特别是多重ELISA确定。

作为选择，蛋白质的表达水平可由生物发光、荧光、化学发光、电化学或质谱确定。

作为选择，蛋白质的表达水平可通过质谱测定蛋白质的蛋白质特征性肽(proteotypic peptide)(具有与给定蛋白质组中所研究的蛋白质唯一相关的氨基酸序列的肽)的水平来确定。

在另一个实施方式中，结合以上或以下提供的任一个实施方式，使用能够与一种或多种靶蛋白结合的抗体或其片段确定蛋白质的表达水平。

术语“能够与一种或多种靶蛋白结合的抗体或其片段”应理解为能够选择性与靶蛋白结合的任何免疫球蛋白或其片段。它包括单克隆抗体和多克隆抗体。术语“其片段”包括其大小和构象适合结合靶蛋白的表位的抗体的任何部分。适宜的片段包括F(ab)、F(ab')和Fv。“表位”是由免疫系统(B细胞、T细胞或抗体)识别的抗原的一部分。

用于特异性检测的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。制备和表征抗体的手段在现有技术中是众所周知的。产生多克隆抗体的方法在现有技术中是众所周知的。简而言之，通过用蛋白质免疫动物制备多克隆抗体；然后，收集免疫动物的血清并分离抗体。多种动物可用于抗血清的制备。通常，用于制造抗血清的动物可以是兔、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠或山羊。

此外，可以使用公知的技术制备单克隆抗体(MAbs)。通常，过程包括用与疾病相关的蛋白质免疫合适的动物。以有效量施用免疫组合物以刺激抗体生成细胞。制备单克隆抗体的方法通常按照与多克隆抗体的制备相同的线开始。免疫原作为抗原注入动物体内。抗原可与佐剂(如完全或不完全弗氏佐剂)混合。以大约两周的间隔，用相同的抗原重复免疫。

在第三方面的另一特定实施方式中，执行本发明的工具形成试剂盒的一部分。在试剂盒中可包括用于检测靶蛋白的抗体或其片段。试剂盒还可包括使抗体-抗原相互作用可视化的工具(添加剂、溶剂)。

在本发明的第五方面中这些抗体可用作确定靶蛋白的表达的“工具”。

因此，在本发明的第一和其他方法的方面的特定实施方式中，使用能够与蛋白质结合的抗体或其片段确定蛋白质的表达水平。

在另一特定实施方式中，所述抗体或其片段形成试剂盒的一部分。

在本发明第一和其他方法的方面下，关于待分析的蛋白质(来自列表中的两个至十一个)的所有以上提供的实施方式也是本发明的第二、第三和第四方面的应用的特定实施方式。

作为选择，在mRNA水平上确定表达水平。

在一个实施方式中，每一个标志物的mRNA的量通过聚合酶链反应检测，该反应例如使用与一个或多个多核苷酸子宫内膜癌标志物或这种多核苷酸的补体杂交的寡核苷酸引物。在其他的实施方式中，mRNA的量使用杂交技术检测，该技术采用与一个或多个多核苷酸子宫内膜癌标志物或这种多核苷酸的补体杂交的寡核苷酸探针。

在使用mRNA检测时，该方法可如下执行：根据本领域公知的标准方法使分离的mRNA与试剂结合以转化为cDNA，在容器中用扩增反应试剂(例如cDNA-PCR反应试剂)与适当的核酸引物混合物处理转化的cDNA；使容器的内容物反应以产生扩增产物；以及分析扩增产物以检测样品中一种或多种多核苷酸子宫内膜癌标志物的存在。对于mRNA，分析步骤可以使用Northern印迹分析来完成以检测样品中多核苷酸子宫内膜癌标志物的存在。分析步骤可如下进一步完成：定量检测扩增产物中多核苷酸子宫内膜癌标志物的存在，并将检测到的标志物的量与使用类似引物获得的正常和恶性组织中已知存在或不存在此类标志物的一组预期值进行比较。

在另一个实施方式中，本发明提供了一种方法，其中mRNA如下检测：(a)将mRNA与样品分离，并使mRNA与试剂组合以将其转化为cDNA；(b)用扩增反应试剂和与一种或多种多核苷酸子宫内膜癌标志物杂交的核酸引物处理转化的cDNA以产生扩增产物；(c)分析扩增产物以确定编码子宫内膜癌蛋白质标志物的mRNA的存在量；和(d)将确定的mRNA量与相对使用类似方法获得的正常和疾病组织(例如，恶性组织)的一组预期值检测到的量进行比较。

在本发明的特定实施方式中，RT-PCR可用于扩增子宫内膜癌蛋白质标志物的mRNA以进行检测和分析。本发明的其他实施方式使用定量RT-PCR以定量确定子宫内膜癌蛋白质标志物的mRNA的量。本发明的其他实施方式使用实时RT-PCR进行量化和分析。

关于本发明的装置或试剂盒，在本发明的特定实施方式中提供所述试剂盒以用于患者样品的分析。这种装置或试剂盒将包括专门识别一种或多种蛋白质的试剂，其中至少一个蛋白质的子集选自以上所列的蛋白质，以及下文所列的表A至表F。所关注的装置包括阵列，其中试剂在诸如载玻片、凝胶、多孔板等基底上空间分离。作为选择，所述试剂可作为试剂盒提供，所述试剂盒包括悬浮或可悬浮形式的试剂，例如与珠结合的试剂。感兴趣的试剂包括包括专门针对自身抗体标志物的试剂。此类试剂可包括抗原蛋白质或肽等。此类装置或试剂盒可进一步包括细胞因子特异性抗体或其片段；等等。

如上所述，本发明的一个方面是试剂盒的应用，所述试剂盒包括固相载体和用于检测下列蛋白质PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、CAPG、AGR2、BCAM、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、IF2B3、PLD3和MX1中的一种或多种的表达水平的工具，并可选地包括用于检测下列蛋白质XPO2、PRDX1、CLIC1、PDIA1、KPYM、ENOA、GSTP1、GTR1、CH10、MIF、PEBP1、TPIS、NGAL和LDHA中的一种或多种的表达水平的工具，所述试剂盒用于通过区分EEC和NEEC对子宫内膜进行预后。

在试剂盒的应用的特定实施方式中，所述试剂盒是那些试剂盒，其包括固相载体和用于检测两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种和十一种选自由PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、CAPG、AGR2、BCAM、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、IF2B3、PLD3和MX1、XPO2、PRDX1、CLIC1、PDIA1、KPYM、ENOA、GSTP1、GTR1、CH10、MIF、PEBP1、TPIS、NGAL和LDHA组成的组的蛋白质的表达水平的工具。更特别是，所述试剂盒包括固相载体和用于检测这些蛋白质中三种蛋白质的表达水平的工具。

在试剂盒的应用的特定实施方式中，它们是包括固相载体和用于检测至少一组选自由LAMP、MMP9、PIGR；AGRIN、MMP9、PIGR；AGR2、PIGR、PLD3；AGR2、BCAM、PODXL；BCAM、PODXL；PIGR、PLD3；BCAM、PIGR；CLD6、RAB8A；CLD6、PODXL；BCAM、RL29；BCAM、PODXL；CLD6、PPIA、AGRIN、BCAM；ANXA、BCAM；BCAM、RAB8A；BCAM、SYIC；CLD6、IFB3；以及表C中所列的组组成的组的蛋白质的表达水平的工具的试剂盒。

在试剂盒的应用的更特定的实施方式中，试剂盒是包括固相载体和用于检测CTNB1、XPO2和CAPG的表达水平的工具的那些试剂盒。

在试剂盒的应用的另一特定实施方式中，用于检测蛋白质的表达水平的工具是能够与一种或多种靶蛋白特异性结合的抗体或其片段。

根据第五方面，本发明涉及一种试剂盒，所述试剂盒包括固相载体和用于检测一种或多种选自由PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、CAPG、AGR2、BCAM、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、BCAM、IF2B3、PLD3、MX1、XPO2、PRDX1、CLIC1、PDIA1、KPYM、ENOA、GSTP1、GTR1、CH10、MIF、PEBP1、TPIS、NGAL和LDHA组成的组的蛋白质的表达水平的工具。

在第五方面的特定实施方式中，试剂盒包括固相载体和用于检测至少一组选自由LAMP、MMP9、PIGR；AGRIN、MMP9、PIGR；AGR2、PIGR、PLD3；AGR2、BCAM、PODXL；BCAM、PODXL；PIGR、PLD3；BCAM、PIGR；CLD6、RAB8A；CLD6、PODXL；BCAM、RL29；BCAM、PODXL；CLD6、PPIA、AGRIN、BCAM；ANXA、BCAM；BCAM、RAB8A；BCAM、SYIC；CLD6、IFB3；以及表C中所列的组的蛋白质的表达水平的工具。

在更特定的实施方式中，试剂盒包括用于检测2至500组，更特别是2至400组的组合的表达水平的工具。

在另一特定实施方式中，可选地结合以上或以下的任一个实施方式，所述试剂盒还包括用于检测至少一组选自由MMP9、PODXL、RAB8A；MMP9、PODXL、RSSA；AGRIN、MMP9、PODXL；MMP9、PODXL、VAMP8；MMP9、MX1；MMP9、RSSA；MMP9、MVP；MMP9、RAB8A；MMP9、VAMP8；BCAM、MMP9；MMP9、AGRIN；AGRIN、CD81、TERA；AGRIN、CD59、MVP；AGR2、AGRIN、CD81；AGRIN、CD166、MVP；AGRIN、CD81；AGRIN、CD166；AGRIN、CD59；AGRIN、MMP9以及表D中所列的那些蛋白质组组成的组的蛋白质的表达水平的工具。

当在子宫抽吸物中检测蛋白质的表达水平时，从下表E中选择的特定组合；以及表D中列出的那些组合(在本说明的末尾说明)被确定为具有较高的诊断价值。下表E显示了AUC和95％值的置信区间(Cl)。数据来源于非EC和EC(包括EEC和NEEC)的样品分析。在表D中也显示了AUC值。

表E.子宫抽吸物的诊断值的组合

蛋白质1	蛋白质2	蛋白质3	AUC	CI 95％下限	CI 95％上限	样品
							MMP9	PODXL	RAB8A	0,976	0,942	1	子宫抽吸物
MMP9	PODXL	RSSA	0,981	0,956	1	子宫抽吸物
							AGRIN	MMP9	PODXL	0,979	0,953	1	子宫抽吸物
MMP9	PODXL	VAMP8	0,971	0,935	1	子宫抽吸物
							MMP9	MX1		0,951	0,891	1	子宫抽吸物
MMP9	RSSA		0,962	0,919	1	子宫抽吸物
							MMP9	MVP		0,956	0,906	1	子宫抽吸物
MMP9	RAB8A		0,96	0,918	1	子宫抽吸物
							MMP9	VAMP8		0,952	0,905	1	子宫抽吸物
BCAM	MMP9		0,954	0,898	1	子宫抽吸物
							MMP9	AGRIN		0,94	0,89	0,992	子宫抽吸物

表F.由子宫抽吸物分离的含有外泌体的级分中诊断值的组合

蛋白质1	蛋白质2	蛋白质3	AUC	CI 95％下限	CI 95％上限	样品
							AGRIN	CD81	TERA	0,944	0,902	0,986	外泌体
AGRIN	CD59	MVP	0,944	0,902	0,986	外泌体
							AGR2	AGRIN	CD81	0,943	0,903	0,982	外泌体
AGRIN	CD166	MVP	0,938	0,896	0,98	外泌体
							AGRIN	CD81		0,934	0,89	0,979	外泌体
AGRIN	CD166		0,926	0,878	0,975	外泌体
							AGRIN	CD59		0,921	0,871	0,97	外泌体
AGRIN	MMP9		0,9	0,848	0,961	外泌体

另一方面，表F显示了下列组合AGRIN、CD81、TERA；AGRIN、CD59、MVP；AGR2、AGRIN、CD81；AGRIN、CD166、MVP；AGRIN、CD81；AGRIN、CD166；AGRIN、CD59；AGRIN、MMP9的AUC值和95％的置信区间，当在由子宫抽吸物分离的含有外泌体的级分中检测蛋白质的表达水平时，以上组合给出了重要的诊断信息。数据来源于非EC和EC(包括EEC和NEEC)的样品分析。

如第四方面所述，在该第五方面的特定实施方式中，用于检测蛋白质的表达水平的工具是与靶蛋白特异性结合的抗体或其片段。

在本发明的第四和第五方面的另一特定实施方式中，试剂盒是ELISA试剂盒。在该实施方式中，试剂盒包括固相载体和用于检测以上提供的任何蛋白质和蛋白质组合的表达水平的工具。在另一实施方式中，试剂盒包括固相载体和与待检测的靶蛋白特异性结合的抗体或其片段，这些抗体与能产生信号的报道分子结合。

“固相载体”包括硝化纤维膜、玻璃或聚合物。最常用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固相载体可以是条、管、珠、盘或微孔板的形式，或任何其他适合进行免疫分析的表面。

在本说明书中使用的“报道分子”是指根据其化学性质提供分析可识别的信号以允许检测与抗原结合的抗体的分子。检测可以是定性的，也可以是定量的。这类分析中最常用的报道分子是酶、荧光团或含有放射性核素的分子(即放射性同位素)。在酶免疫分析的情况中，酶通常通过戊二醛或高碘酸盐与次级抗体结合。然而，将容易认识到的是，存在各种各样的不同的缀合技术，这对于本领域的技术人员来说是容易获得的。常用的酶包括辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶等。与特定酶一起使用的底物通常被选择用于在被相应酶水解后产生可检测的颜色变化。例如，5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐/硝基蓝四唑适用于与碱性磷酸酶偶联物一起使用；对于过氧化物酶结合物，常用1,2-苯二胺，5-氨基水杨酸，3,3:5,5:四甲基对二氨基联苯或联甲苯胺。也可采用荧光底物，其产生荧光产物而不是上述显色底物。荧光底物的实例是荧光素和罗丹明。当被特定波长的光照激活时，荧光色素标记的抗体吸收光能，诱导分子中的激发状态，然后以光学显微镜可目视检测到的特征颜色发射光。免疫荧光和EIA技术均在本领域中很成熟，并且对于本发明的方法特别优选。然而，也可以使用其他报道分子，例如放射性同位素、化学发光和生物发光分子和/或染料和其他显色物质。

特定报道分子缀合抗体的选择将在很大程度上取决于本发明的测试试剂盒的预期用途和用户。

用于测量生物标志物水平的结合测定可使用固相或均质形式。合适的测定法包括夹心式或竞争性结合测定。夹心式免疫测定的实例描述于美国专利号4,168,146和美国专利号4,366,241，两个专利的全部内容均以引用的方式并入本文中。竞争性免疫测定的实例公开于美国专利号4,235,601、美国专利号4,442,204和美国专利号5,208,535，任一个专利的全部内容以应用的方式并入本文中。

多个生物标志物可使用多重分析形式测量，例如，通过使用结合分析阵列实现的多路复用、利用标签的光谱识别进行的多路复用、结合试验的流式细胞术分析对颗粒进行的多复用，例如使用系统。

本发明的试验可通过任何合适的方法进行。在一个实施方式中，在单个样品中测量生物标志物水平，并且那些测量可在单个测定室或测定装置中进行，包括但不限于测定板的单孔、单个测定盒、单侧流装置、单个测定管等。生物标志物水平可使用本领域普通技术人员可用的许多技术中的任何一种来测量，例如直接物理测量(例如质谱法)或结合测定(例如免疫测定、凝集测定和免疫色谱分析)。该方法还可包括测量由化学反应产生的信号，例如，光吸收率的变化、荧光的变化、化学发光或电化学发光的产生、反射率、折射率或光散射的变化、可检测标签从表面的累积或释放，氧化或还原或氧化还原物质、电流或电势、磁场的变化等。适宜的检测技术可通过测量标签的光致发光(例如，通过测量荧光、时间分辨荧光、倏逝波荧光、上转换荧光粉、多光子荧光等)、化学发光、电化学发光、光散射、光吸收、放射性、磁场、酶活性(例如，通过引起光吸收或荧光变化或引起化学发光的发射的酶反应来测量酶活性)。作为选择，可使用不需要使用标记的检测技术，例如基于测量质量(例如，表面声波测量)、折射率(例如，表面等离子体共振测量)或分析物固有发光的技术。

在另一实施方式中，试剂盒是微阵列。

在另一实施方式中，试剂盒包括定义组的编码蛋白质子宫内膜癌标志物的基因的试剂盒。以上对要分析的特定蛋白质(列表中2至11)提供的所有实施方式也是微阵列的特定实施方式，该蛋白质的表达因子宫内膜疾病而明显改变。

在另一特定实施方式中，本发明的试剂盒还包括嵌板图，用于对个体样品进行分类。

本发明的另一方面是一种根据预后决定或推荐是否对患有子宫内膜癌的受试者启动医学方案的方法。在该方法的特定实施方式中，它包括

a)体外确定来自受试者的女性生殖道的子宫液样品中一种或多种选自由PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、CAPG、AGR2、BCAM、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、IF2B3、PLD3、MX1组成的组的蛋白质的表达水平，以及可选地XPO2、PRDX1、CLIC1、PDIA1、KPYM、ENOA、GSTP1、GTR1、CH10、MIF、PEBP1、TPIS、NGAL和LDHA中的一种或多种蛋白质的表达水平；和

b)如果测试样品中PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、AGR2、BCAM、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、IF2B3、PLD3、MX1的蛋白质水平高于参考对照的水平，且CAPG低于参考对照的水平，则通过区分EEC和NEEC来确定所述EC的预后；

其中：

i)如果受试者被诊断为患有内宫内膜癌或怀疑患有子宫内膜癌，且受试者被鉴别诊断为患有EEC，则推荐启动用于EEC的医疗方案，其包括全子宫切除术和双侧输卵管卵巢切除术，还可选地补充以淋巴结切除术；

ii)如果受试者被诊断患有子宫内膜癌或怀疑患有子宫内膜癌，且受试者被鉴别诊断为患有NEEC，则推荐启动用于NEEC的医疗方案，其包括全子宫切除术和双侧输卵管卵巢切除术、盆腔和主动脉旁淋巴结切除术、网膜切除术和腹膜活检。

在决定或推荐是否根据既定的预后对患有子宫内膜癌的受试者启动医学方案的方法的另一特定实施方式中，如果受试者被诊断患有EEC，则推荐从放疗、化疗及其组合中选择辅助治疗。在另一特定实施方式中，如果患者被诊断患有NEEC，则推荐化疗作为辅助治疗。

本发明的另一方面是提供一种算法，其用于执行上述方面和实施方式中定义的任一种诊断和/或预后方法。

在特定的实施方式中，该算法是计算机实现的方法，以用于EC的诊断和/或EC的预后，特别是用于通过确定EC亚型，特别是EEC或NEEC来对疾病进行预后。该算法允许决定样品是否来自患有EC的受试者决定；以及决定来自患有EC的受试者的样品是否患有EEC或患有NEEC。在更特定的实施方式中，该算法提供了推荐的治疗。因此，也提供了一种计算机实现的方法以用于执行以上定义的方法，其中在确定一种或多种用于EC的诊断和/或预后的蛋白质的表达水平之后，给予所述水平以值和/或分数，并可选地以数学公式计算以获得计算值；其中根据所述水平、分数和/或计算值，在是否患有EC的选择之间和/或患有不同EC亚型的选择之间做出决定。

换言之，在本发明的算法的另一特定实施方式中，在确定一种或多种用于EC的诊断和/或预后的蛋白质的表达水平之后，给予所述水平以值和/或分数，并可选地以数学公式计算以获得计算值；其中根据所述水平、分数和/或计算值，在是否患有EC的选择之间和/或患有不同EC亚型的选择之间做出决定。

本发明也包括通过区分子宫内膜样子宫内膜癌(EEC)和非子宫内膜样子宫内膜癌(NEEC)来对子宫内膜癌进行预后的方法，该方法包括确定来自女性生殖道的分离样品中下列PIGR和VIME蛋白质中的一种或多种的表达水平。

发明人首次发现，这两种蛋白通过离开女性生殖道的样品可用于区分EC亚型。样品可特别选自子宫器官的组织活检和生殖道的液体(即子宫抽吸物)。该方法包括进一步检测一种或多种选自由CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、CAPG、AGR2、BCAM、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、IF2B3、PLD3、MX1、XPO2、PRDX1、CLIC1、PDIA1、KPYM、ENOA、GSTP1、GTR1、CH10、MIF、PEBP1、TPIS、NGAL和LDHA组成的组的蛋白质的表达水平。表达水平特别在蛋白质水平上确定，特别是通过与一种或多种蛋白质特异性结合的抗体或所述抗体的片段而确定。可用于执行本发明的试剂盒的部分或工具也是本发明的一部分。

通过本发明人进行的试验，鉴别出提供EC关键信息的蛋白质。这是VIME的情况，它在EEC样品和NEEC(SEC)样品中有差异表达。因此，这种蛋白质不仅可以对EC亚型进行分类，还可以确认诊断。本发明包括EC的诊断和/或预后的方法，该方法包括确定在女性的分离样品(特别是来自女性生殖道的分离样品)中VIME的表达水平。

除此之外，测定的样品允许确定来自女性生殖道的液体样品中某些蛋白质在EC和子宫内膜增生之间的差异表达。子宫内膜增生是由于过量的雌激素刺激引起的子宫内膜增厚。这是一种良性疾病。然而，它被认为是EC的前期病变，应明确诊断。在采用EC样品(具有任何亚型；EEC和NEEC)和包括子宫内膜增生的非EC样品对照的测定中，发现16种蛋白质在增生和其他非EC对照(具有正常的子宫内膜或患有不同于增生的良性疾病如肌瘤或息肉的妇女)之间差异显著，调整后的p-值<0.05，倍数变化大于2。其中NAMPT、ENOA、CATD和GSTP1四项的AUC均高于0.85。适当的验证后，它们开始诊断增生与EC。因此，本发明也涉及一种用于受试者中的子宫内膜增生的诊断和/或预后的方法，该方法包括确定女性的分离样品(特别是来自女性生殖道)中下列蛋白质NAMPT、ENOA、CATD和GSTP1中的一种或多种的表达水平。对增生(EC的前期病变)的早期检测可以增加患者的随访，以便尽早发现任何恶性。与本方面相关，本发明还提供了一种使用本发明的NAMPT、ENOA、CATD和GSTP1标志物中的一种或多种来监测增生的医疗方案的方法：降低或恢复到正常水平的标志物(即，恢复到无增生对照受试者的水平)表明患者对药物方案反应良好，因此，所述方案是有效的；如果标志物的水平没有显著变化或其增大，这可能表明该方案无效和/或增生有很高的风险演变为EC。在那些情况下，应该进行外科治疗。

本发明的离体方法提供了诊断和/或预后的信息。在一个实施方式中，本发明的方法还包括以下步骤：(i)收集诊断和/或预后信息，和(ii)将信息保存在数据载体中。

在本发明的意义上，“数据载体”被理解为包含用于子宫内膜癌的诊断和/或预后的有意义的信息数据的任何工具，例如纸张。载体也可以是能够承载预后数据的任何实体或装置。例如，载体可以包括存储介质，例如ROM，例如CD-ROM或半导体ROM，或者磁记录介质，例如软盘或硬盘。此外，载体可以是诸如电信号或光信号等可传输载体，其可经由电缆或光缆或通过无线电或其他方式来传输。当诊断/预测数据体现在能够通过电缆或其它装置或工具直接传送的信号中时，载体可由该电缆或其它装置或工具构成。其他载体涉及到USB装置和计算机档案。合适的数据载体的实例是纸张、CD、USB、PC中的计算机档案，或具有相同信息的声音记录。

在说明书和权利要求书中，“包含”一词和该词的变体并不排除其他技术特征、添加剂、成分或步骤。此外，“组成”一词还包括“由……。构成”的情况。本发明的附加目的、优点和特征将在本领域技术人员审查说明书时变得显而易见，或者可以通过本发明的实践来学习。以下实施例以图解的方式提供，它们并不意图限制本发明。此外，本发明涵盖本文所描述的特定和优选实施方式的所有可能组合。

实施例

实施例1.来自子宫液的外泌体中以及子宫液中EC的诊断和预后的生物标志物

1.样品、试剂和方法

1.1患者和样品描述

在三个不同机构招募患者：HUVH(西班牙巴塞罗那希伯伦大学医院)、HUAV(西班牙莱达维拉诺瓦大学医院)和UMCF(德国弗莱堡弗莱堡大学医学中心)。每个参与机构都获得了伦理许可，并在参与者签署知情同意书后获得样品。

通过用Cornier Pipelle(Gynetics Medical Products)抽吸获得子宫抽吸物(UAs)。将样品放入1.5mL试管中，并在冰浴上进行所有处理，处理包括以1:1的比例(体积/体积)添加磷酸盐缓冲盐(PBS)，轻轻移取样品，并在F45-30-11转子(Eppendorf微型离心机5417R)中以2500g(4℃)离心20分钟以去除细胞级分。然后将剩余的上清液(SN)级分等分，并在-80℃下冷冻直至需要。

对于外泌体(简称ELVs)分离，ELVs是遵循Thery等http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18228490对先前描述的ELVs分离方案进行修改，通过差速离心从UAs的SNs中获得的。简而言之，将SNs解冻并在PBS中稀释至最终体积为25mL。在Thermo Scientific Heraeus MultifugeX3R离心机(FiberLite转子F15-8x-50c)上进行10000xg(4℃)的离心步骤30分钟，以去除细胞碎片、大颗粒和凋亡体。将得到的富含MVs的球粒再次悬浮在50μL的PBS中，并于-80℃冷冻。然后，将上清液转移到超离心管(BeckmanCoulter)中，并装入PBS，在带有AH-629转子的Thermo Scientific Sorvall WX超离心分离机上，在100,000xg(4℃)进行第一超离心步骤2小时。该第二次离心的上清液为可溶性部分，并于-80℃冷冻。将该第一球团再次悬浮在PBS中，并再次以100,000xg(4℃)离心1小时。最终的富含ELVs的球团(可能与微囊泡(MVs)和一些剩余的凋亡小体一起)再次悬浮在50μL的PBS中。5微升的MVs和ELVs球粒于-80℃保存以用于粒径分布和NTA定量，其余样品于-80℃冷冻以供蛋白质提取。

1.2通过液相色谱-平行反应监测(LC-PRM)分析提取和鉴定蛋白质

关于发现阶段，将ELVs以1:1的比率(体积/体积)再次悬浮在由40mM Tris-pH8、300mM NaCl、10mM EDTA、2％Triton X-100和1:100蛋白酶抑制剂(Sigma-Aldrich)构成的裂解缓冲液中。然后，样品于-20℃冷冻至少8小时，随后在冰上解冻，并以100％的振幅(Labsonic M，Sartorius Stedim Biotech)进行5秒的5个周期超声波处理，以确保膜破裂。提取的蛋白于-20℃储存直到需要为止。

对ELVs和无需分离ELVs的子宫抽吸物(UA)执行验证阶段。为了由ELVs提取蛋白质以用于验证阶段，将裂解缓冲液中的洗涤剂改为<1％的NP-40，使蛋白质提取已经适合于溶液中直接消化和LC-MS/MS。其余的程序保持不变。从UAs的液体部分提取蛋白质；以100％的振幅(Labsonic M，Sartorius Stedim Biotech)对其进行每次5秒的5个周期的超声处理，以破坏样品中存在的微囊泡、蛋白质聚集体和/或粘液。然后，按照制造商的说明书使用Albumin&IgG depletion spin trap试剂盒(GE Healthcare)以从样品中去除白蛋白和免疫球蛋白G。所有提取的蛋白质在-20℃保存直至需要时。其中未进行白蛋白和免疫球蛋白G耗尽的子宫液样品(ELVs或未分离ELVs的UA)也获得诊断和预后值数据。

在发现阶段，将溶于0.1％甲酸的肽首先装载在室内填充柱(Jupiter C18，3μm，Phenomenex，Torrance，CA)中的150μm ID x 20cm nano-LC上，并用EASY nanoLC系统(Thermo Scientific)分离。对于肽的洗脱，使用恒定速率为600nL/min的5-40％ ACN(0.2％ FA)的1小时线性梯度。LC系统与QExactive plus Orbitrap串联质谱仪(ThermoFisher Scientific)连接，并使用XCalibur软件(Thermo Fisher Scientific)获取RAW文件。采用前体分离窗口为m/z 2.0的Top-12方法执行串联质谱。分辨率为70.000(m/z 400)以用于测量扫描(AGC 1e⁶，最大注入时间200ms，扫描范围m/z 300至2000)，为17.500用于MS/MS光谱(AGC于5e⁵，最大注入时间50ms，扫描范围m/z 200至2000)。标准化碰撞能量(NCE)设置为25，排除时间设置为10秒。

关于蛋白质鉴定，为进行SILAC定量，使用MaxQuant(版本1.3.0.3)分析RAW文件。采用的默认参数：MS/MS片段误差容限为20ppm，Carbamidomethylatin(C)固定和氧化(M)以及Acetyl(蛋白质N-term)作为变量修改。选择精氨酸(Arg10)和赖氨酸(Lys8)作为重标签，并应用“运行间匹配(match between run)”选项。根据SwissProt数据库搜索RAW文件。对于存在/不存在分析，使用PEAKS 7.0(http://www.bioinfor.com/)进行无标签分析。对于数据库搜索，根据包含37254个条目的Human Uniprot数据库搜索RAW文件。对于搜索参数，前体误差容限设置为10ppm，对于MS2片段，容限设置为0.01Da。对于胰蛋白酶，允许最多2次错裂。脲基甲基化(C)、脱酰胺作用(NQ)和氧化(M)是变量修改。仅考虑假发现率(FDR)低于1％的肽。为验证潜在的生物标志物，PEAKS结果被上传至Scaffold proteome软件(http://www.proteomesoftware.com/)。

对发现阶段进行统计分析，以获得两个不同的结果：(1)由不同亚组的患者中存在或不存在的蛋白质构成的定性数据；和(2)由代表每种蛋白质相对于内标物的相对丰度的SILAC比率获得的表达结果构成的定量数据。

对于定性数据，对每种蛋白质进行Fisher精确试验，以比较各组之间的存在/不存在(p值<0.001)。对于定量数据，在每对组之间进行Student-t试验，以选择差异表达的蛋白质。试验仅针对存在于每组超过4个个体的那些蛋白质进行。为解决由于进行多次试验(每种蛋白质一次)而产生的多重比较问题，使用Benjamini和Hockberg方法(调整的p值<0.25和FC>1.3)调整p值以获得对FDR的强有力控制。

所有分析均使用统计程序“R”(R版本3.2，版权所有(C)2015R统计计算的R基础)进行。

基于发现阶段(49)的结果，通过选择性反应监测(SRM)选择了总计54个蛋白质，连同从我们组先前的结果中选择的5个候选蛋白一起用于靶向实验。基于之前质谱实验中的可检测性，选择了每种蛋白质中两种独特的肽进行SRM监测。对于每种选定的肽，购买同位素标记的版本(¹⁵N₂，¹³C₆-赖氨酸，15N4，13C6-精氨酸)，并掺加于每个样品中作为内标。基于实验稀释曲线(未显示数据)为每个单独的肽建立线性响应范围，以该范围内的浓度加入内标。同时，混合同位素标记的肽并用于生成MS2光谱库和保留时间知识数据库。

通过SRM测定了来自107例患者独立组的Lys-C和胰蛋白酶消化样品中的总计85种内源性肽及其相应的内标。在三重四极质谱仪(5500Q-Trap，AB Sciex Instruments，Foster，CA，USA)上对每个肽最强烈的五个转换进行了监测，该谱仪配备有内径为75μm、装有1.9μM C18颗粒的反相色谱25cm柱(日本nikkyotechnos Co.，ltd)和2cm预柱(AcclaimPepMap 100，C18，15μM，100A)。上样缓冲液：含0.1％甲酸的H2O；洗脱缓冲液：ACN，0.1％甲酸。采用的流速为250nL/min，并使用40分钟内的5％至40％洗脱缓冲液的色谱梯度。在生物样品的SRM测量之间进行空白运行，以避免样品携带。以预定的SRM模式进行测量，使用300秒的窗口和1.5秒的目标循环时间。

对于验证阶段的数据分析，基于与目标肽(轻重形式)相关的转换痕迹的共洗脱，使用Skyline v2.5评估与目标肽对应的转换基团；轻SRM相对强度与重SRM相对强度的关系。目视检查所有肽峰。所有过渡区域用作在MSstats Skyline plug-in(版本3.3)中实现的线性混合效应模型的输入，以计算不同样品组之间的蛋白质倍数变化和调整后的p值。

对于预测因子的开发，基于log2变化的转换区，使用MSstats来估计所有样品中存在的蛋白质的量，然后将其用作定义组之间逻辑回归模型的输入变量。以曲线下面积(AUC)作为性能指标，在数据集的2/3内评估每种蛋白质的分类能力。选择最具鉴别性的蛋白质作为第一分类物。增加AUC值(deltaAUC>0.02)的同时重复添加最具鉴别性的蛋白质。在每次迭代中，使用患者的不同子集重复分类评估程序500次。通过从无替换的原始队列中随机选择患者生成样品子集，并对每个样品子集进行平衡。最终的一致性模型由500个重复中选择最多的蛋白质组合构成。最终的模型被拟合至完整的数据集，并使用ROC曲线下的面积、敏感性、特异性和准确性来量化预测精度。用于统计程序“R”的pROC包用于绘制ROCs，以计算AUCs和其他性能值(即敏感性、特异性和准确性)；考虑到“最佳截止”获得这些结果，因为该点是获得最大值的敏感性和特异性的总和。

2.结果

2.1.发现阶段

在这个项目的发现阶段，使用来自10个EEC(也缩写为EC1)患者、10个NEEC(也缩写为EC2，尤其是SEC)患者和10个对照患者(N＝30)的子宫抽吸物来分离ELVs。

一旦确保分离的囊泡的纯度，在1D-SDS-PAGE分离之前，在30个样品(EEC n＝10，NEEC n＝10，CTRL n＝10)中的每一个中以2:1的重/轻比加入相同量的Super-SILAC混合物(内标)。每个凝胶通道被切成10条带，每条带经历胰蛋白酶消化以提取肽，从而产生300个单独的LC-MS/MS运行。MS/MS数据的蛋白质数据库搜索得到了2138个蛋白质的总体鉴别，仅考虑那些鉴定为具有至少1个独特肽的蛋白质，以及那些错误发现率(FDR)低于1％的肽。用MaxQuant软件进一步处理MS/MS光谱，得到920个蛋白质的定量结果，即鉴定出的蛋白质组的总定量率为43％。

共有152个蛋白质差异表达，调整后的p值<0,25，倍数变化小于-1,3或大于1,3。其中147个蛋白质是潜在的诊断生物标志物(由CTRL与EC的比较得到的差别)，28个蛋白质是潜在的预后生物标志物(由EEC与NEEC的比较得到的差别)。在定量分析的同时，进行了存在/不存在研究，以考虑那些由于缺乏重的对应物而无法定量但仍然与某一组中的存在有关的蛋白质。鉴于此，用PEAKS软件重新分析RAW文件，并进行Fisher试验以选择在组中显著存在的那些蛋白质(p值<0.001)。这项分析包括总计30个候选物，对应29个潜在的诊断生物标志物和9个潜在的预后生物标志物。

总之，结合(i)相对定量分析，(ii)存在/不存在研究，以及(iii)诸如排除候选列表中其家族过度表示的蛋白质或在癌症中下调的蛋白质等生物学标准，生成了54个候选物的最终列表；始终尊重上述统计限制。在54个候选生物标志物中，50个对应于诊断生物标志物，15个对应于预后生物标志物，其中37个仅具有诊断潜力，2个仅具有预后潜力，13个同时具有诊断和预后潜力。

2.2.UAs ELVs中蛋白质生物标志物的验证

一旦获得上一节所述的54个候选物的列表，其目的在于通过在新的更大的患者队列中使用LC-SRM来验证这些候选物的潜力。正如在发现阶段的研究中，UAs的ELVs部分是所选定的分析样品。除了评估每个标志物在诊断EC和区分组织学亚型方面的个体潜力外，这里也试图通过组合不同候选物来生成诊断和预后模型。此外，评估了各候选物在独立队列中在UAs的全液体级分中的分类能力。

共招募107名患者进入验证阶段(队列B)，分为三组：EEC或EC1(n＝45)、NEEC或EC2(n＝21)和CTRL(n＝41)。具体而言，NEEC对应于诊断为患有浆液性子宫内膜癌(SEC)的患者。从其看出，ELVs由UAs分离并表征，如先前的章节所示(未显示数据)。在发现阶段产生的54个蛋白质候选生物标志物列表通过LC-SRM进行验证。为此，每一个蛋白质选择两个独特的胰蛋白酶肽，其中总共85个内源性肽最终由预定的SRM监测。然而，在与51种蛋白质相对应的85种肽中，只检测到69种；在任何样品中均未检测到三个候选物(TNR6、CLH1和PSB3)。

作为该SRM实验结果，观察到48个潜在的诊断生物标志物中的43个(89.6％)在验证阶段(调整后的p值<0.01)也具有显著性(即观察到CTRL和EC之间存在丰度的显著差异)，从而证实了它们作为独立的诊断生物标志物的潜力。45种定量蛋白质中，共有29种表现出分别区分EC和CTRL病例(AUC值高于0.75，在表6中用粗体突出显示)的高精确度。5个最重要的个体生物标志物是AGRIN(AUC＝0.90,CI95:0.85-0.96)、TACD2(AUC＝0.87,CI95:0.81-0.94)、SORT(AUC＝0.86,CI95:0.79-0.93)、MVP(AUC＝0.86,CI95:0.78-0.93)和FAS(AUC＝0.85,CI95:0.78-0.92)。下表2.1显示了ELVs中用于EC诊断的选定的生物标志物的列表。

关于潜在的预后生物标志物(即EC1(EEC)与EC2(NEEC)的比较)，发现15个候选物中只有5个蛋白质在验证阶段差异表达(调整后的p值<0.01)。验证的生物标志物为CLD6、IF2B3、BCAM、PLD3和MX1。在45个量化的蛋白质中，共有4个显示出高精确度来区分EC1和EC2病例，其AUC值高于0.75：CLD6(AUC＝0.88,CI95:0.76-1.00)、BCAM(AUC＝0.87,CI95:0.76-0.97)、IF2B3(AUC＝0.80,IC95:0.68-0.93)和PLD3(AUC＝0.79,IC95:0.66-0.93)。下表2.2显示了ELVs中用于EC预后的选定的生物标志物的列表。

2.3.通过UAs全液中的靶向蛋白质组学对候选物进行验证

为了解将这些生物标志物的使用转移到更容易获得且不需要分离细胞外囊泡的样品中是否可行，旨在研究在UAs的整个液体级分的外泌体中识别的生物标志物。为此，选择总共67名患者(队列C)，将其分为三组：EEC(n＝22)、NEEC(n＝20)和CTRL(n＝25)。

对于这部分研究共分析了总计51种蛋白质。每个蛋白质选择两个独特的胰蛋白酶肽，其中总共75个内源性肽最终由预定的SRM监测。总共仅检测到37种蛋白质，随后量化以用于进行AUC评估。

评估了该验证研究中获得的结果，并与先前进行的研究进行了比较，以了解将基于ELV的生物标志物转化为UAS的全液体的可行性。首先，观察到与分析ELVs时的可检测性相比，ELVs生物标志物在UAs全液中的可检测性非常有限；在ELVs中检测到的51个生物标志物中，仅有34个(66.7％)在UAs中被检测到。

在接下来的表1.1和表1.2中，列出了在UAs全液级分中用于EC诊断和在UAs的所述全液级分中用于EC预后(EEC和NEEC的比较)的显著性生物标志物。

表1.1.子宫抽吸物中的诊断用生物标志物

表1.2.子宫抽吸物中的预后用生物标志物

表2.1.由UA分离的含有外泌体的级分(ELV)中诊断用生物标志物：

表2.2.ELVs中EC预后用生物标志物

实施例2.在116个患者的队列中通过区分子宫抽吸物中的EEC(EC1)和NEEC(EC2)病例对EC进行预后

1.样品、试剂和方法

1.1患者和样品描述

2012年至2015年，瓦尔希布伦大学医院(西班牙巴塞罗那)、阿纳乌维拉诺瓦大学医院(西班牙莱达)和弗赖堡大学医学中心(德国弗赖堡)共招募了总计116名妇女。所有患者签署了经各医院伦理委员会批准的知情同意书。基于经阴道超声检查的结果，所有妇女都因EC怀疑而进入EC诊断过程，即出现aa异常子宫出血(AUB)和/或绝经后妇女子宫内膜厚度大于4mm以及绝经前妇女子宫内膜厚度大于8mm。116名妇女中，69例诊断为EC，包括49例子宫内膜样EC(EEC)和20例非子宫内膜样浆液性ECs(SEC或NEEC)。其余47名妇女为子宫内膜正常或被诊断为良性疾病(包括子宫内膜增生)的非EC女性。患者的临床病理特征描述于以下的患者表格。

表3.参与研究的妇女的临床特征

*等级未定的1个病例

用Cornier Pipelle(Eurogine Ref.03040200)通过抽吸收集子宫抽吸物，并将其转移到1.5ml微管中。以1:1(体积/体积)的比率添加磷酸盐缓冲盐，并以2500x g离心20分钟，以便将流体级分与细胞级分分分离。子宫抽吸液的体积为100μl至1ml，保持在-80℃直至使用。

1.2.用于液相色谱-平行反应监测(LC-PRM)分析的样品的制备

用于LC-PRM分析的样品的制备如Martinez Garcia E等人之前所述进行“Development of a sequential workflow based on LC-PRM for the verification ofendometrial cancer protein biomarkers in uterine aspirate samples”，Oncotarget-2016，第7卷(33)，53102-53114页(在前)。简而言之，对子宫抽吸物的液体级分进行超声波处理，并使用Albumin&IgG depletion spin trap试剂盒(GE Healthcare)从50μl的各样品中去除白蛋白和免疫球蛋白G蛋白。使用Bradford法估计总蛋白浓度。然后，将全部116个样品分成12.5μg的两个相同的等分试样，通过技术一式双份进行后续步骤和分析。在两步连续蛋白水解之前，对样品进行变性、还原和烷基化处理，所述两步连续蛋白水解使用37℃采用第一Lys-C内蛋白酶MS级(Thermo Scientific)(蛋白酶/总蛋白量的比率为1/150(重量/重量))进行4小时和在37℃过夜的胰蛋白酶(Promega)(蛋白酶/总蛋白量的比率为1/50(重量/重量))。在每个样品((C端精氨酸¹³C₆，¹⁵N₄，Δm＝10Da，C端赖氨酸¹³C₆，¹⁵N₂，Δm＝8Da或当其不适用于重亮氨酸¹³C₆，¹⁵N₁，Δm＝7Da或苯丙氨酸¹³C₉，¹⁵N₁，Δm＝10Da)中加入稳定同位素标记的合成肽的混合物。最后，样品经固相萃取纯化(Sep PaktC18，50mg，Waters)，真空干燥并再次悬浮在0.1％的甲酸中，之后进行LC-PRM分析。如实施例1中，其中未进行白蛋白和免疫球蛋白G消耗的子宫液样品(UA)也获得了预后值数据。

1.3.LC-PRM设置

在以柱切换模式下操作的Dionex Ultimate 3000 RSLC色谱系统上进行肽的分离。使用0.05％三氟乙酸和1％乙腈的水溶液的流动相，流速为5μl/min，将250ng经消化样品的等效物注入物并加载至trap柱(75μm×2cm，C18 pepmap 100，3μm。通过从2％溶剂A至35％溶剂B的线性梯度在48分钟内以300nl/min将肽进一步洗脱至分析柱(75μm×15cm，C18pepmap 100，2μm)。溶剂A为0.1％甲酸水溶液，溶剂B为0.1％甲酸的乙腈溶液。在QExactiveplus质谱仪(Thermo Scientific)上进行PRM分析。MS周期由以70000分辨率(200m/z)进行的MS1全扫描和随后的以35,000分辨率(200m/z)获得的标准化碰撞能量为20的定时目标MS2扫描构成。对于MS2事件，前体离子的四极隔离窗设置为1m/z单位，每对内源性和同位素标记肽的定时视窗的持续时间设置为2分钟。

1.4.PRM数据处理

PRM数据如Martinez等人(在前)所述处理。简而言之，使用Skyline程序(v3.1)提取每个前体的五个强度最高片段离子(即PRM转换)的提取离子色谱(XIC)区域(美国华盛顿大学McCoss实验室)。使用光谱匹配法基于光谱对比角的余弦(cosθ)确定肽的同一性，该光谱对比角余弦在参比物的五次转换的峰面积(没有生物基质的合成肽混合物的PRM获取)与临床样品中内源性和重肽的相应转换面积之间计算。如果内源性和同位素标记的肽的cosθ均大于0.98，则可以接受肽的检测和鉴定。低于量化限值的MS测量产生的分数低于0.98，在这种情况下，面积值被背景评估所代替。

1.5.统计分析

从Skyline提取每个肽的轻/重面积比，并计算重复之间的平均值。在SPSS(版本20.0)(IBM，Armonk，NY，USA)和Graph Pad Prism(版本6.0)(GraphPad Software，LaJolla，CA，USA)中进行统计分析。使用非参数Mann-Whitney U试验对患者组之间的监测的肽水平进行比较，这是因为数据不服从正态分布。采用Benjamini-Hochberg-FDR法对多次比较的P值进行了调整。低于0.05的经调整的p值被认为具有统计学意义。使用接收器工作特性(ROC)分析来评估生物标志物的特异性和敏感性，并估计每个蛋白质的ROC曲线下面积(AUC)。

1.6.分类物的开发

为了评估不同蛋白质组合对两类临床样品的分类能力，针对数据调整逻辑回归模型。为每个回归模型生成ROC曲线，得到AUC，以及用于区分不同组的“最优”截止点处的敏感性和特异性。最优截止点对应于使到识别(对角线)线的距离最大化的阈值。最优性标准为：最大(敏感性+特异性)。用Delong法计算AUCs的95％置信区间(CI)。用自引重采样(bootstrap resampling)和Fawcett描述的平均方法计算敏感性和特异性值的95％ CIs。所有的ROC分析均使用R“pROC”包进行(Robin等，“pROC:and open-source package for Rand S+to analyze and compare ROC curves”，BMC Bioinformatics-2011，第12:77卷)。为评估每个蛋白质组的鲁棒性，通过对数据集中的每个样品应用逻辑回归模型(对数据集中的其余样品进行调整)，从而得出新的ROC曲线，然后进行通常的ROC分析，来执行“留一法”交叉验证程序。

2.结果

EEC是EC中最常见的组织学类型，与非子宫内膜样EC病例相比具有良好的预后。NEEC代表所有EC病例的约20％，但占EC的复发和死亡则超过50％。在NEEC中，浆液性EC(SEC)是最常见的亚型。在调查49例EEC和20例SEC的队列中的51种蛋白质的丰度后，来自EEC患者的子宫抽吸物样品中11种蛋白质的水平显著升高(调整后p值<0.05)，如表4所示。其中，6种蛋白质的倍数变化大于2，呈现最高的个体AUC值：PIGR，0.85(95％ CI，0.734-0.958)；CAYP1，0.83(95％ CI，0.725-0.942)；CTNB1，0.78(95％ CI，0.670-0.895)；SG2A1，0.77(95％ CI，0.661-0.880)；VIME，0.76(95％ CI，0.645-0.881)；和WFDC2，0.74(95％CI，0.624-0.855)。

表4.鉴别诊断EEC和SEC(NEEC)的蛋白质

*p值<0.05

发明人发现，如果除了确定表4中一种或多种蛋白质的表达水平外，还分析了其他蛋白质的水平，则分类的鲁棒性就会提高。特别是XPO2、PRDX1、CLIC1、PDIA1、KPYM、ENOA、GSTP1、GTR1、CH10、MIF、PEBP1、TPIS、NGAL和LDHA中的一种或多种的水平。

按照与前面描述的相同的步骤，在诊断和预后用生物标志物中评估2至12种蛋白质，特别是2种和3种蛋白质的所有可能组合以鉴定将改善个体生物标志物结果的蛋白质组。由CTNB1、XPO2和CAPG构成的三种蛋白质的组合对于区分子宫液样品中的EEC和SEC而言是表现最好的组，AUC为0.99(95％ CI，0.90-1)。该组实现了95％(95％ CI，85％-100％)的敏感性和95.9％(95％ CI,89.8％-100％)的特异性(图1)。完成“留一法”交叉验证之后，敏感性的值为95％，特异性的值为89.9％。

从图1可以推断出，标志物CTNB1和CAPG对于鉴别诊断SEC和EEC而言给出了令人感兴趣的敏感性和特异性的值，但令人惊讶的是，CTNB1、CAPG以及XPO2的组合(组)给出了高度敏感性和特异性的鉴别诊断。因此，该组将被理解为诊断组，也理解为可靠的预后组，其允许对EC亚型进行分类。对疾病的正确分类越早越好，这主要是由于尽快采用正确的医疗方案，从而提高了生存率。

在本研究中，公开了一种通过使用从女性生殖道获得的液体活检(即子宫抽吸液)来可靠地区分EEC和SEC组织学的方法。这提出了真正的改进，因为目前的诊断程序是基于对该样品中有限的细胞含量的组织学检查，并且与重要的缺陷相关：平均22％的未确诊患者，以及EC病例的高达50％的不正确组织类型和/或分级分配。

这项调查的临床优势在于，参加研究的妇女涵盖了进入EC诊断过程的妇女的广泛变异性。对于EC患者，包括两种最常见的组织学，EEC和SEC病例。非EC患者包括所有主要因AUB或子宫内膜增厚而怀疑EC的妇女。这包括患有良性病变(主要是息肉、肌瘤和子宫内膜增生)的妇女，以及子宫内膜正常的妇女。此外，这项研究包括具有功能性子宫内膜的绝经前妇女和多数表现为萎缩性子宫内膜的绝经后妇女。

关于所研究的蛋白质在改善EC患者风险组分配中的作用，目前主要的风险分层系统，如欧洲医学肿瘤学会(ESMO)分类，关注的是肿瘤的组织学、分级、肌层浸润和淋巴血管浸润。由于大多数信息在术前是不可获得的，组织学亚型和分级成为风险组分配和确定手术分期程序的范围的关键因素。来自本发明的三种蛋白质(CTNB1、XPO2和CPG)的组合使得能够准确区分EEC和NEEC(SEC)组织学EC类型，其敏感性为95.0％，特异性为95.9％。

这三种蛋白以前与EC有关。β-连环蛋白(CTNB1)在上皮细胞-细胞粘附，以及在Wnt信号传导途径中负责细胞增殖和分化的关键基因转录中具有重要作用。与当前试验的观察结果一致，CTNB1在EEC组织试样中有描述，但在NEEC肿瘤中没有。巨噬细胞加帽蛋白(CAPG)通过重塑肌动蛋白丝调节细胞运动。它参与了几种癌症的细胞迁移和浸润。与CTNB1不同，在组织水平上，与EEC相比，在更具浸润性的SEC肿瘤中CAPG水平更高，这与本文报道的子宫抽吸物中的结果一致。最后，exportin-2(XPO2)，也称为细胞凋亡易感蛋白，在有丝分裂纺锤体检查点中发挥作用。XPO2的耗尽导致细胞周期停滞，因此，它与肿瘤的增殖有关；尽管它也与肿瘤的浸润和转移有关。在包括EC在内的许多癌症类型中都观察到较高水平的XPO2，并且其与较高的癌症分级和较差的患者预后呈正相关。尽管在本研究中观察到EEC和SEC病例间XPO2的水平没有显著差异，但在由CTNB1和CAPG形成的组中加入XPO2明显改善了其性能。

值得注意的是，这项研究涵盖了EC的重要临床需求，因为本文描述的基于子宫抽吸物的蛋白质组学方法为蛋白质组学特征的鉴定铺平了道路，这些特征将EC肿瘤分为更具临床相关性的风险组，从而有助于外科治疗预测。因此，已经实现了第一步，其特征为能够准确分类最常见的组织学。总之，期望基于子宫抽吸物的生物标志物的开发改善EC患者的管理，并节省巨大的医疗成本。

如说明书中所示，表C和表D中的特定蛋白质组列在下面：

表C.用于子宫液样品中EC(EEC对NEEC)预后的蛋白质组

表D.用于子宫液样品中EC诊断的蛋白质组

本发明也涉及下列条款的内容：

条款1.一种子宫内膜癌的预后方法，所述方法包括确定来自女性生殖道的子宫液样品中下列蛋白质：PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、CAPG、AGR2、BCAM、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、IF2B3、PLD3和MX1中的一种或多种的表达水平。

条款2.根据条款1所述的方法，其中所述子宫液样品是来自女性生殖道的子宫抽吸液样品。

条款3.根据条款1至2中任一项所述的方法，所述方法包括确定下列蛋白质：PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1和WFDC2中的一种或多种的表达水平。

条款4.根据条款1至3中任一项所述的方法，所述方法还包括确定下列蛋白质：XPO2、PRDX1、CLIC1、PDIA1、KPYM、ENOA、GSTP1、GTR1、CH10、MIF、PEBP1、TPIS、NGAL和LDHA中的一种或多种的表达水平。

条款5.根据条款1至4中任一项所述的方法，所述方法还包括确定一种选自由XPO2、PRDX1、CLIC1、PDIA1、KPYM、ENOA、GSTP1、GTR1、CH10、MIF、PEBP1、TPIS、NGAL和LDHA组成的组的蛋白质的表达水平。

条款6.根据条件1至5中任一项所述的方法，所述方法还包括确定由子宫抽吸物分离的含有外泌体的级分中一种或多种选自由CLD6、BCAM、IF2B3、PLD3和MX1组成的组的蛋白质的表达水平。

条款7.根据条款1至6中任一项所述的方法，所述方法包括确定至少一组选自由LAMP、MMP9、PIGR；AGRIN、MMP9、PIGR；AGR2、PIGR、PLD3；AGR2、BCAM、PODXL；BCAM、PODXL；PIGR、PLD3；BCAM、PIGR；CLD6、RAB8A；CLD6、PODXL；BCAM、RL29；BCAM、PODXL；CLD6、PPIA、AGRIN、BCAM；ANXA、BCAM；BCAM、RAB8A；BCAM、SYIC；CLD6、IFB3；以及表C中所列的组组成的组的蛋白质的表达水平。

条款8.根据条款1至7中任一项所述的方法，其中通过区分非子宫内膜样子宫内膜癌与子宫内膜样子宫内膜癌而确定子宫内膜癌的预后。

条款9.根据条款1至8中任一项所述的方法，其中在蛋白质水平上确定表达水平。

条款10.根据条款1至9中任一项所述的方法，其中所述蛋白质水平通过选自由免疫测定、生物发光测定、荧光测定、化学发光测定、电化学测定、质谱及其组合组成的组的测定或技术来确定。

条款11.根据条款9至10中任一项所述的方法，其中使用能够与蛋白质结合的抗体或其片段来确定蛋白质的表达水平。

条款12.根据条款11所述的方法，其中所述抗体或其片段形成试剂盒的一部分。

条款13.一种或多种选自由PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、CAPG、AGR2、BCAM、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、IF2B3、PLD3和MX1组成的组的蛋白质在来自女性生殖道的子宫液样品中作为用于对子宫内膜癌预后的离体标志物的应用。

条款14.一种或多种选自由PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、CAPG、AGR2、BCAM、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、IF2B3、PLD3和MX1组成的组的蛋白质在前述条款1至13中任一项所述的方法中用于对子宫内膜癌预后的应用。

条款15.一种用于子宫内膜癌的预后的试剂盒的应用，所述试剂盒包括固相载体和用于检测下列蛋白质PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、CAPG、AGR2、BCAM、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、IF2B3、PLD3和MX1中的一种或多种的表达水平的工具，以及可选的用于检测下列蛋白质XPO2、PRDX1、CLIC1、PDIA1、KPYM、ENOA、GSTP1、GTR1、CH10、MIF、PEBP1、TPIS、NGAL和LDHA中的一种或多种的表达水平的工具。

条款16.根据条款15所述的试剂盒的应用，所述试剂盒包括固相载体和用于检测至少一组选自由LAMP、MMP9、PIGR；AGRIN、MMP9、PIGR；AGR2、PIGR、PLD3；AGR2、BCAM、PODXL；BCAM、PODXL；PIGR、PLD3；BCAM、PIGR；CLD6、RAB8A；CLD6、PODXL；BCAM、RL29；BCAM、PODXL；CLD6、PPIA、AGRIN、BCAM；ANXA、BCAM；BCAM、RAB8A；BCAM、SYIC；CLD6、IFB3；以及表C中所列的组组成的组的蛋白质的表达水平的工具。

条款17.根据条款15至16中任一项所述的试剂盒的应用，其中所述用于检测蛋白质的表达水平的工具是用于执行选自由免疫测定、生物发光测定、荧光测定、化学发光测定、电化学测定、质谱及其组合组成的组的测定或技术的工具。

条款18.根据条款15至17中任一项所述的试剂盒的应用，其中所述用于检测蛋白质的表达水平的工具是抗体或其片段。

条款19.一种试剂盒，所述试剂盒包括固相载体和用于检测一种或多种选自由PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、CAPG、AGR2、BCAM、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、BCAM、IF2B3、PLD3、MX1、XPO2、PRDX1、CLIC1、PDIA1、KPYM、ENOA、GSTP1、GTR1、CH10、MIF、PEBP1、TPIS、NGAL和LDHA组成的组的蛋白质的表达水平的工具。

20.一种试剂盒，所述试剂盒包括固相载体和用于检测至少一组选自由LAMP、MMP9、PIGR；AGRIN、MMP9、PIGR；AGR2、PIGR、PLD3；AGR2、BCAM、PODXL；BCAM、PODXL；PIGR、PLD3；BCAM、PIGR；CLD6、RAB8A；CLD6、PODXL；BCAM、RL29；BCAM、PODXL；CLD6、PPIA；AGRIN、BCAM；ANXA、BCAM；BCAM、RAB8A；BCAM、SYIC；CLD6、IFB3；以及表C中所列的组组成的组的蛋白质的表达水平的工具。

条款20.根据条款19所述的试剂盒，所述试剂盒还包括用于检测至少一组选自由MMP9、PODXL、RAB8A；MMP9、PODXL、RSSA；AGRIN、MMP9、PODXL；MMP9、PODXL、VAMP8；MMP9、MX1；MMP9、RSSA；MMP9、MVP；MMP9、RAB8A；MMP9、VAMP8；BCAM、MMP9；MMP9、AGRIN；AGRIN、CD81、TERA；AGRIN、CD59、MVP；AGR2、AGRIN、CD81；AGRIN、CD166、MVP；AGRIN、CD81；AGRIN、CD166；AGRIN、CD59；AGRIN、MMP9以及那些表D中所列的蛋白质组组成的组的蛋白质的表达水平的工具。

条款21.根据权利要求19至20中任一项所述的试剂盒，其中所述用于检测蛋白质的表达水平的工具是用于执行选自由免疫测定、生物发光测定、荧光测定、化学发光测定、电化学测定、质谱及其组合组成的组的测定或技术的工具。

条款22.根据条款19至21中任一项所述的试剂盒，其中所述用于检测蛋白质的表达水平的工具是抗体或其片段。

条款23.根据条款19至22中任一项的试剂盒，所述试剂盒是用于执行酶联免疫吸附测定的试剂盒。

条款24.根据条款19至23中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包括嵌板图，以用于对个体样品进行分类。

条款25.一种计算机实现的方法，所述方法用于执行条款1至12中任一项所述所限定的方法，其中在确定了一种或多种用于EC的诊断和/或预后的蛋白质的表达水平之后，对所述水平赋予值和/或分数，并可选地以数学公式计算以获得计算值；其中，根据所述水平、分数和/或计算值，在是否患有EC的选择之间和/或患有不同EC亚型的选择之间做出决定。

引用列表

-DeSouza LV等，“Endometrial cancer biomarker discovery andverification using differentially tagged clinical samples withmultidimensional liquid chromatography and tandem mass spectrometry”，Mol CellProteomics MCP-2007,第6卷，1170–8页

-Kemik P等，“Diagnostic and prognostic values of preoperative serumlevels of YKL-40,HE-4and DKK-3in endometrial cancer”，Gynecol Oncol-2016；第140卷，64–9页

-Martínez-Garcia E等，“Development of a sequential workflow based onLC-PRM for the verification of endometrial cancer protein biomarkers inuterine aspirate samples”，Oncotarget-2016,第7(33)卷，53102-53114页

Robin等，“pROC:and open-source package for R and S+to analyze andcompare ROC curves”，BMC Bioinformatics-2011，第12:77卷

Claims (16)

1.一种子宫内膜癌(EC)的预后方法，所述方法包括确定来自女性生殖道的子宫液样品中下列蛋白质PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、CAPG、AGR2、BCAM、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、IF2B3、PLD3和MX1中的一种或多种的表达水平。

2.一种根据预后决定或推荐是否对患有子宫内膜癌的受试者启动医学方案的方法，该方法包括以下步骤：

a)体外确定来自受试者的女性生殖道的子宫液样品中选自由PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、CAPG、AGR2、BCAM、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、IF2B3、PLD3、MX1组成的组的一种或多种蛋白质的表达水平，以及可选地XPO2、PRDX1、CLIC1、PDIA1、KPYM、ENOA、GSTP1、GTR1、CH10、MIF、PEBP1、TPIS、NGAL和LDHA中的一种或多种蛋白质的表达水平；和

b)如果测试样品中PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、AGR2、BCAM、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、IF2B3、PLD3、MX1的蛋白质水平高于参考对照的水平，且CAPG低于参考对照的水平，则通过区分EEC和NEEC来确定所述EC的预后；

其中：

i)如果受试者被诊断为患有内宫内膜癌或怀疑患有子宫内膜癌，且受试者被鉴别诊断为患有EEC，则推荐启动用于EEC的医疗方案；

ii)如果受试者被诊断患有子宫内膜癌或怀疑患有子宫内膜癌，且受试者被鉴别诊断为患有NEEC，则推荐启动用于NEEC的医疗方案；并且

通过确定测试样品中的标志物水平，技术人员还能够确定能被推荐的最合适的疗法，因为样品中检测到的水平可反映疾病的范围。

3.一种通过鉴别诊断NEEC和EEC来鉴别怀疑患有子宫内膜癌的受试者并进一步鉴别EC亚型的方法，该方法包括：

a)体外确定来自受试者的女性生殖道的子宫液样品中选自由PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、CAPG、AGR2、BCAM、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、IF2B3、PLD3、MX1组成的组的一种或多种蛋白质的表达水平；以及可选地XPO2、PRDX1、CLIC1、PDIA1、KPYM、ENOA、GSTP1、GTR1、CH10、MIF、PEBP1、TPIS、NGAL和LDHA中的一种或多种蛋白质的表达水平；和

b)将步骤(a)的水平与参考对照的水平进行比对，其中如果对于PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、AGR2、BCAM、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、IF2B3、PLD3、MX1而言步骤(a)中确定的水平高于参考对照的水平，且CAPG的水平低于参考对照的水平，则表明受试者怀疑患有NEEC和患有EEC。

4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，确定PIGR的表达水平。

5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述子宫液样品是来自女性生殖道的子宫抽吸液样品。

6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法包括确定以下组中的一种或多种的表达水平：LAMP、MMP9、PIGR；AGRIN、MMP9、PIGR；AGR2、PIGR、PLD3；PIGR、PLD3；和BCAM、PIGR。

7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在蛋白质水平上确定所述表达水平。

8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，其中所述蛋白质水平通过选自由免疫测定、生物发光测定、荧光测定、化学发光测定、电化学测定、质谱及其组合组成的组的测定或技术来确定。

9.如权利要求7至8中任一项所述的方法，其中，其中使用能够与蛋白质结合的抗体或其片段来确定所述蛋白质的表达水平。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述抗体或其片段形成试剂盒的一部分。

11.选自由PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、CAPG、AGR2、BCAM、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、IF2B3、PLD3和MX1组成的组的一种或多种蛋白质用于权利要求1所述的子宫内膜癌的预后方法中的应用。

12.用于确定PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、CAPG、AGR2、BCAM、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、IF2B3、PLD3、MX1中的一种或多种的表达水平的工具，和可选地用于确定XPO2、PRDX1、CLIC1、PDIA1、KPYM、ENOA、GSTP1、GTR1、CH10、MIF、PEBP1、TPIS、NGAL和LDHA的表达水平的工具用于权利要求1-3中任一项所述的子宫内膜癌的预后方法的应用。

13.一种试剂盒，其包括固相载体和用于检测一种或多种选自由LAMP、MMP9、PIGR；AGRIN、MMP9、PIGR；AGR2、PIGR、PLD3；PIGR、PLD3；BCAM、PIGR组成的组中的至少一组蛋白质以及表C中所列的组的蛋白质的表达水平的工具。

14.一种试剂盒用于EC的预后的应用，所述试剂盒包括固相载体和用于检测下列PIGR、VIME、CTNB1、CAYP1、SG2A1、WFDC2、CADH1、CD44、LEG3、LEG1、CAPG、AGR2、BCAM、PODXL、MMP9、CD59、CLD6、IF2B3、PLD3和MX1中的一种或多种的表达水平的工具，以及可选地用于检测下列蛋白质XPO2、PRDX1、CLIC1、PDIA1、KPYM、ENOA、GSTP1、GTR1、CH10、MIF、PEBP1、TPIS、NGAL和LDHA中的一种或多种的表达水平的工具。

15.如权利要求13所述的试剂盒或如权利要求14所述的试剂盒的应用，其中，所述用于检测蛋白质的表达水平的工具是抗体或其片段。

16.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，在确定了一种或多种所述蛋白质的表达水平之后，为所述水平赋予值和/或分数，并可选地以数学公式计算以获得计算值；其中，根据所述水平、分数和/或计算值，在是否患有EC的选择之间和/或患有不同EC亚型的选择之间做出决定。