CN117281761B - 促进水通道蛋白3表达的氨基酸组合物及应用、日化品 - Google Patents
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Abstract
本申请属于化妆品生产技术领域，公开了一种促进表皮细胞水通道蛋白3表达的氨基酸组合物，包括玉竹提取物、白芨提取物、麦冬提取物以及甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、色氨酸、亮氨酸、精氨酸等多种氨基酸，本申请通过上述多种植物提取物以及多种氨基酸的复配使用，提升了组合物的保湿、舒缓效果，并且，在特定的几种氨基酸复配使用时，组合物的保湿、舒缓效果得到了出乎意料的提升，兵器，本组合物还能够促进表皮角质细胞水通道蛋白AQP‑3的表达，此外本申请还公开了促进表皮细胞水通道蛋白3表达的氨基酸组合物的应用，以及含有促进表皮细胞水通道蛋白3表达的氨基酸组合物的日化品。
Description
技术领域
本发明涉及日化品生产技术领域，尤其涉及促进水通道蛋白3表达的氨基酸组合物及应用、日化品。
背景技术
AA传统上被归类为营养必需氨基酸（Essential Amino Acid, EAA）或非必需氨基酸（Non-essential Amino Acid, NEAA），这取决于生物体能够自身合成，或是必须从外界获取（Wu, 2009）。而蛋白质的合成受能量供给、基因转录与翻译以及AA作为底物的利用效率等多方面的影响。AA的摄入为乳蛋白的合成提供了底物基础。
动物需要从日粮中获得必需的AA以满足自身需求，这些需要包括蛋白质合成的原料，一些必需代谢物（例如神经递质、NO、CO以及H2S）的前体，葡萄糖和N代谢的氨来源所必需的氧化反应，机体中酸碱平衡和羧化反应的CO2原料。
中国专利申请201811209012.X公开了一种强效保湿中药组合物发酵原浆及制备与应用，由包括以下重量份数的中药组分制成：玉竹5-50%，芦荟5-50%，麦冬5-50%，白芨5-50%，仙人掌5-50%，所述强效保湿中药组合物发酵原浆以中医君臣佐使理论为指导进行组方，采用发酵提取法制备，具有强效保湿、清除自由基、抑制黑色素生成等作用，同时具有天然、安全、温和的特点。应用该发酵原浆制成的化妆品，具有强效保湿、抗衰老、美白功效；
同时，该方案提到，玉竹为君药，具有养阴润燥、生津止渴的功效，通过调理身体内部环境，达到滋润皮肤的目的，现代研究结果表明玉竹含有丰富的多糖、维他命A与烟酸，能够增强人体抗病能力，延缓衰老。麦冬和芦荟为臣药，麦冬具有生津解渴、润肺止咳之效，现代药理研究也表明，麦冬主要含皂苷、生物碱、谷甾醇、氨基酸、维生素等，具有抗疲劳、清除自由基、提高细胞免疫功能等作用，白芨为佐药，具有收敛止血、消肿生肌之功效，现代研究也表明白芨对于皮肤缺水引起的皮肤皲裂有良好的治疗效果。
因此，不难看出，上述物质搭配使用具有一定的保湿效果，但与此同时，观察说明书的实施例可以看出，在该方案中，当玉竹、芦荟、麦冬、白芨、仙人掌5种成分搭配使用时，其能够起到良好的保湿效果；
同时通过对应用实施例1和应用对比例1的观察可见，当改变制备方法后，组合物的保湿效果有明显的下降，说明其制备方法具有一定的独特性，并非所有制备方法得到的组合物均能得到良好的保湿效果。
中国专利申请201811112039.7公开了一种皮肤屏障修护组合物及其制备方法，其配方包括：水相保湿剂、油相乳化剂、活性物和有机合成中间体，油相乳化剂包括按重量份计的以下成分：牛油果树果脂6-9％、深海两节荠籽油1-6％、椰油醇-辛酸酯/癸酸酯3-6％、白池花籽油0 .5-4％、异硬脂醇异硬脂酸酯2-10％、C12-20烷基葡糖苷1-6％和C14-22醇1-6％；制备方法包括步骤一，选材；步骤二，生产油相乳化剂；步骤三，生产水相保湿剂；步骤四，添加活性物乳化；步骤五，加入有机合成中间体；步骤六，卸料包装；
该方案能够减轻皮肤因炎症或受刺激而带来的不适感，且有效的舒缓成分能够增强表皮层厚度，加强皮肤屏障功能，从而强化皮肤的生理防御系统、加速皮肤的新陈代谢、帮助恢复表皮层的正常免疫功能和预防和改善红血丝；
但尽管该方案中包括麦冬提取物与多种氨基酸的使用，但与此同时，其活性成分还包括水解大米蛋白、辣薄荷提取物、水解假丝酵母提取物、长角豆果提取物、水解羽扇豆蛋白、水解三色堇提取物等多种植物提取物，另外从该方案的实施例也不难看出，其对皮肤屏障的修护作用是通过多种植物提取物、氨基酸、植物精油的复配产生的协同作用。
中国专利申请97103818.X公开了一种绿色保健药的制造方法，其中包含多种中药以及多种氨基酸，且上述的多种中药中包括白芨、玉竹、麦冬；同时在说明书内给出多种对应症状所使用的配方，但需要注意的是，该方案并没有提及白芨、玉竹、麦冬与氨基酸复配得到的组合物具有保湿功效，仅公开了其在中药领域的效果与应用；
同样的，中国专利申请201510195422.3公开了一种胃溃疡、十二指肠溃疡医学配方食品，尽管上述方案中包含多种氨基酸和白芨、玉竹、麦冬等物质，但该方案仅公开了其作为药物的效果和应用，并未在保湿功效上做过多研究。
本方案需要解决的问题：如何开发一种新的具有保湿、舒缓效果的组合物。
发明内容
本发明的目的是提供一种促进表皮细胞水通道蛋白3表达的氨基酸组合物，该组合物通过多种植物提取物、多种氨基酸的配合使用，制备出一种具有良好的保湿、舒缓效果的组合物。
为实现上述目的，本申请公开了一种促进表皮细胞水通道蛋白3表达的氨基酸组合物，包括如下组分：
一种促进表皮细胞水通道蛋白3表达的氨基酸组合物，按质量份数计，包括以下组分：
白芨提取物 1～10份；
玉竹提取物 0.2～15份；
麦冬提取物 1～10份；
甘氨酸 1～10份；
脯氨酸 0.1～5份；
丝氨酸 0.1～5份；
色氨酸 0.1～5份；
亮氨酸 0.1～5份；
精氨酸 0.1～5份；
CHA 0.01～1份；
水 余量。
优选地，按质量份数计，包括以下组分：
白芨提取物 1～8份；
玉竹提取物 0.5～12份；
麦冬提取物 1～8份；
甘氨酸 1～8份；
脯氨酸 0.5～2份；
丝氨酸 0.5～5份；
色氨酸 0.5～5份；
亮氨酸 0.5～5份；
精氨酸 0.5～5份；
CHA 0.01～0.5份；
水 余量。
优选地，所述白芨提取物的提取方法为：
将白芨干燥中药材粉碎过40目筛，按照每克白芨60～100mL提取溶剂的比例，以蒸馏水为提取溶剂，回流条件下提取2～3h，过滤，收集滤液，将滤液浓缩，加入乙醇析出沉淀物；将沉淀物用纯水，加热复溶，然后离心2～3次后，得到白芨提取物。
优选地，所述玉竹提取物的提取方法为：
将玉竹的干燥中药材粉碎过40目筛，按照每克玉竹15～20mL提取溶剂的比例，以10%浓度的乙醇为提取溶剂，90℃回流提取1～2h，离心、过滤，收集滤液，记为第一次滤液；向滤渣中加入提取第一次滤液基本相同体积的10%浓度的乙醇，按与提取第一次滤液相同的方法再提取一次得到第二次滤液；合并第一次滤液和第二次滤液，浓缩除去乙醇，得到玉竹提取物。
优选地，所述麦冬提取物的提取方法为：
将麦冬的干燥中药材粉碎过40目筛，按照每克麦冬12～15mL提取溶剂的比例，以20%浓度的乙醇为提取溶剂，超声波提取2h～3h，离心、过滤，收集滤液，记为第一次滤液；向滤渣中加入提取第一次滤液基本相同体积的20%浓度的乙醇，按与提取第一次滤液相同的方法再提取一次得到第二次滤液；合并第一次滤液和第二次滤液，浓缩除去乙醇，得到麦冬提取物。
优选地，所述促进表皮细胞水通道蛋白3表达的氨基酸组合物的pH值为7.6～7.8，电导率为1.2～1.8mS/cm。
此外，本申请还公开了如上述的促进表皮细胞水通道蛋白3表达的氨基酸组合物制备具有保湿舒缓作用的日化品的用途。
此外，本申请还公开了一种日化品，含有0.5～5wt%上述的促进表皮细胞水通道蛋白3表达的氨基酸组合物。
优选地，所述日化品为膏霜、啫喱、乳液、精华液、喷雾、爽肤水、面膜、洁面乳、化妆水、香水、卸妆水、口红、腮红。
本申请的有益效果是：
本申请中的白芨提取物中的黄酮类成分具有抗氧化和抗炎作用，能够减轻皮肤炎症反应，缓解皮肤过敏、红肿等不适感。同时，皂苷类成分具有清洁和抗菌作用，能够清除皮肤表面的污垢和细菌，保持皮肤清洁，减少刺激和感染；另外，白芨提取物中的多糖类成分具有良好的保湿作用，能够吸收空气中的水分，形成保湿层，防止皮肤水分流失，使皮肤保持滋润和弹性；
并且玉竹提取物中的黄酮类成分具有抗氧化和抗炎作用，能够减轻皮肤炎症反应，缓解皮肤过敏、红肿等不适感。同时，皂苷类成分具有清洁和抗菌作用，能够清除皮肤表面的污垢和细菌，保持皮肤清洁，减少刺激和感染；
同时玉竹提取物中的多糖类成分具有良好的保湿作用，能够吸收空气中的水分，形成保湿层，防止皮肤水分流失，使皮肤保持滋润和弹性；
麦冬提取物中的皂苷类成分具有清洁和抗菌作用，能够清除皮肤表面的污垢和细菌，保持皮肤清洁，减少刺激和感染。同时，多糖类成分具有舒缓作用，能够减轻皮肤炎症反应，缓解皮肤过敏、红肿等不适感；
并且，麦冬提取物中的多糖类和氨基酸等成分具有良好的保湿作用，能够吸收空气中的水分，形成保湿层，防止皮肤水分流失，使皮肤保持滋润和弹性。
同时结合具有良好的保湿能力的氨基酸进一步提高了组合物的保湿能力，并且，在组合物制备过程中，我们惊喜地发现，当使用不同种类的氨基酸进行复配时，其保湿效果也有所不同，同时，部分氨基酸搭配使用后，出乎预期的进一步提升了组合物的保湿效果。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明进行清楚、完整的描述，在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
植物提取物的制备方法：
1.白芨提取物的制备方法：将白芨干燥中药材粉碎过40目筛，按照每克白芨60mL提取溶剂的比例，以蒸馏水为提取溶剂，回流条件下提取2h，过滤，收集滤液，将滤液浓缩，加入乙醇析出沉淀物；将沉淀物用纯水，加热复溶，然后离心3次后，得到白芨提取物；
2.玉竹提取物的制备方法：将玉竹的干燥中药材粉碎过40目筛，按照每克玉竹15mL提取溶剂的比例，以10%浓度的乙醇为提取溶剂，90℃回流提取1h，离心、过滤，收集滤液，记为第一次滤液；向滤渣中加入提取第一次滤液基本相同体积的10%浓度的乙醇，按与提取第一次滤液相同的方法再提取一次得到第二次滤液；合并第一次滤液和第二次滤液，浓缩除去乙醇，得到玉竹提取物；
3.麦冬提取物的制备方法：将麦冬的干燥中药材粉碎过40目筛，按照每克麦冬15mL提取溶剂的比例，以20%浓度的乙醇为提取溶剂，超声波提取2h，离心、过滤，收集滤液，记为第一次滤液；向滤渣中加入提取第一次滤液基本相同体积的20%浓度的乙醇，按与提取第一次滤液相同的方法再提取一次得到第二次滤液；合并第一次滤液和第二次滤液，浓缩除去乙醇，得到麦冬提取物。
实施例1-4
一种促进表皮细胞水通道蛋白3表达的氨基酸组合物，配方如表1所示：
表1
| 组份组别 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 |
| 白芨提取物 | 1 | 2 | 5 | 8 |
| 玉竹提取物 | 0.5 | 5 | 10 | 12 |
| 麦冬提取物 | 8 | 5 | 2 | 1 |
| 甘氨酸 | 8 | 5 | 2 | 1 |
| 脯氨酸 | 0.5 | 1 | 1.5 | 2 |
| 丝氨酸 | 0.5 | 2 | 3 | 5 |
| 色氨酸 | 0.5 | 2 | 3 | 5 |
| 亮氨酸 | 0.5 | 2 | 3 | 5 |
| 精氨酸 | 0.5 | 2 | 3 | 5 |
| CHA | 0.01 | 0.2 | 0.3 | 0.5 |
| 水 | 79.99 | 73.8 | 67.2 | 55.5 |
对比例1-9
一种组合物，配方如表2所示：
表2
| 组份组别 | 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 | 对比例4 | 对比例5 | 对比例6 | 对比例7 | 对比例8 | 对比例9 |
| 白芨提取物 | 0 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| 玉竹提取物 | 10 | 0 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 麦冬提取物 | 2 | 2 | 0 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
| 甘氨酸 | 2 | 2 | 2 | 0 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
| 脯氨酸 | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 0 | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 |
| 丝氨酸 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 0 | 3 | 3 | 3 |
| 色氨酸 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 0 | 3 | 3 |
| 亮氨酸 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 0 | 3 |
| 精氨酸 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 0 |
| CHA | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 |
| 水 | 72.2 | 77.2 | 69.2 | 69.2 | 68.7 | 70.2 | 70.2 | 70.2 | 70.2 |
对比例10-18
一种组合物，配方如表3所示：
表3
| 组份组别 | 对比例10 | 对比例11 | 对比例12 | 对比例13 | 对比例14 | 对比例15 | 对比例16 | 对比例17 | 对比例18 |
| 白芨提取物 | 0 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| 玉竹提取物 | 10 | 0 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 麦冬提取物 | 2 | 2 | 0 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
| 甘氨酸 | 2 | 2 | 2 | 0 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
| 脯氨酸 | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 0 | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 |
| 丝氨酸 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 0 | 3 | 3 | 3 |
| 色氨酸 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 0 | 3 | 3 |
| 亮氨酸 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 0 | 3 |
| 精氨酸 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 0 |
| CHA | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 |
| 水 | 67.2 | 67.2 | 67.2 | 67.2 | 67.2 | 67.2 | 67.2 | 67.2 | 67.2 |
| 芦荟提取物 | 5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 仙人掌提取物 | 0 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 辣薄荷提取物 | 0 | 0 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 赖氨酸 | 0 | 0 | 0 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 天冬氨酸 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1.5 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 苏氨酸 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3 | 0 | 0 | 0 |
| 缬氨酸 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3 | 0 | 0 |
| 异亮氨酸 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3 | 0 |
| 苯丙氨酸 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3 |
对比例10-18各原料介绍：
芦荟提取物：芦荟中含有的芦荟多糖、氨基酸及金属盐等与天然保湿因子的成分相同，具有很好的保湿性；
仙人掌提取物：仙人掌汁中富含氨基酸、超氧化物歧化酶（SOD）及多糖等生物成分，对皮肤有滋养作用；
辣薄荷提取物：具有薄荷的香气，添加到化妆品可作气味抑制剂，掩盖配方原料难闻的气味，并且调理皮肤，具有清洁、保湿作用，舒缓炎症，抗头皮屑，增强皮肤渗透性，促进皮肤吸收，适用于清洁、保湿、舒缓类等产品；
赖氨酸：人类和哺乳动物的必需氨基酸之一；
天冬氨酸：其左旋型是构成蛋白质的20种基本氨基酸之一，属于人体内非必需氨基酸的一种；
苏氨酸：苏氨酸的结构中含有羟基，对人体皮肤具有持水作用，与寡糖链结合，对保护细胞膜起重要作用；
缬氨酸：人体必需的8种氨基酸和生糖氨基酸，它能促进身体正常生长，修复组织，调节血糖，并提供需要的能量；
异亮氨酸：是人体必需氨基酸之一，属脂肪族中性氨基酸的一种，与亮氨酸和缬氨酸一起合作修复肌肉，控制血糖，并给身体组织提供能量；
苯丙氨酸：人体必需氨基酸之一，属芳香族氨基酸，在体内大部分经苯丙氨酸羟化酶催化作用氧化成酪氨酸，并与酪氨酸一起合成重要的神经递质和激素，参与机体糖代谢和脂肪代谢。
性能测试：
1.化妆品保湿功效：表皮角质细胞水通道蛋白AQP-3含量测定
细胞类型：HACAT；
细胞实验过程：
步骤1：细胞接种，按照密度2X105个，每孔加2mL细胞悬液，一般下午铺板，培养箱（37℃，5%CO2）中孵育过夜（6孔板）。
步骤2：次日上午，观察细胞密度达40%～60%，开始给药。
步骤3：给药，将实施例及对比例制得的组合物通过细胞培养基稀释至浓度为10mg/ml，稀释后每孔给药量2mL，培养过夜后收集样品。
样品处理
1.1、超声破碎：
观察细胞密度达70～80%时，即可将细胞消化下来进行超声破碎，再收集样品待测试。具体实验步骤如下：
1.1.1细胞消化：弃去培养液，加灭菌PBS溶液清洗两次，每次1mL/孔，洗后弃去PBS，每孔加0.5mL 0.25%胰酶-EDTA，培养箱（37℃，5%CO2）消化约4min，显微镜下观察，细胞变圆，即可加入每孔1.5mL的完培终止消化。
1.1.2用1mL移液器或者巴氏吸管轻吹，每孔上下左右均吹一下，然后将细胞转移至1.5mL离心管，1000rpm离心4min后，弃上清，加入1mL 4℃预冷的PBS清洗一次，后重悬细胞，吹打混匀后再次离心，弃上清，立刻加入0.5mL预冷的PBS再重悬后超声，转移过程中，细胞均放在冰水中，保证细胞蛋白不变性。
1.1.4超声破碎：换用小探头，输出功率调至30%，超声探头应浸没在液面3mm左右，且不能碰触离心管管壁，将细胞样调整到适宜的位置，按启动键开始超声，一般超声两个轮回，每次5min，超声完后，10000rpm离心8min。
1.1.5小心吸取上清液，转移至50uL的离心管中分装，用于试剂盒测试，样品不测试存放于-80℃冰箱中保存。
1.2 ELISA检测：根据AQP-3 ELISA检测试剂盒的操作说明书进行检测。
测试结果如表4、表5所示：
表4：水通道蛋白3试验结果表（对比例1-18）
| 样品信息 | 给药浓度（mg/mL） | 平均值AQP-3浓度（ng/mL） | AQP-3上调率% | P值 |
| 空白 | / | 41.86 | / | / |
| 对比例1 | 1 | 45.93 | 9.72% | ＜0.05 |
| 对比例2 | 1 | 42.56 | 1.67% | ＞0.05 |
| 对比例3 | 1 | 43.21 | 3.23% | ＞0.05 |
| 对比例4 | 1 | 44.10 | 5.35% | ＜0.05 |
| 对比例5 | 1 | 44.20 | 5.59% | ＞0.05 |
| 对比例6 | 1 | 42.23 | 0.88% | ＞0.05 |
| 对比例7 | 1 | 43.53 | 3.99% | ＞0.05 |
| 对比例8 | 1 | 43.5 | 3.92% | ＞0.05 |
| 对比例9 | 1 | 44.1 | 5.35% | ＜0.05 |
| 对比例10 | 1 | 40.46 | -3.34% | ＞0.05 |
| 对比例11 | 1 | 41.23 | -1.51% | ＞0.05 |
| 对比例12 | 1 | 43.85 | 4.75% | ＞0.05 |
| 对比例13 | 1 | 42.16 | 0.72% | ＞0.05 |
| 对比例14 | 1 | 41.67 | -0.45% | ＞0.05 |
| 对比例15 | 1 | 43.20 | 3.20% | ＞0.05 |
| 对比例16 | 1 | 43.56 | 4.06% | ＞0.05 |
| 对比例17 | 1 | 42.10 | 0.57% | ＞0.05 |
| 对比例18 | 1 | 43.10 | 2.96% | ＞0.05 |
注：P<0.050，表示样品组与空白对照相比有显著性差异。
结论：由于上表可以看出，当对对比例1-14进行细胞水通道蛋白3（AQP-3）试验时，除了对比例1/4/5有一定的促进水通道蛋白3（AQP-3），其他均无效果；
表5：水通道蛋白3试验结果表（实施例1-4）
注：P<0.050，表示样品组与空白对照相比有显著性差异。
结论：由于上表可以看出，实施例在1-4内范围内均对水通道蛋白3（AQP-3），与空白组相比，均有显著性差异。
2.化妆品舒缓功效测试－体外TNF-α炎症因子含量测定-脂多糖诱导巨噬细胞RAW264.7测试
测试方法：
2.1细胞：选用小鼠单核巨噬细胞白血病细胞系RAW264.7，细胞株来源于美国典型物质保藏中心（ATCC）。
2.2试验方法
2.2.1细胞消化、接种
2.2.1.1采用胰蛋白酶/EDTA，具体消化浓度及用量需根据实验室细胞特性确定：胰酶浓度宜为0.25%，胰酶用量：T25培养瓶1mL，T75培养瓶3mL。
2.2.1.2显微镜下观察，至大部分细胞变圆并处于悬浮状态时，加入约胰酶体积2～3倍的含血清的DMEM培养基终止消化，并收集至离心管中，800r/min离心6min，转速及离心时间可根据实验室细胞特性进行确定。
2.2.1.3离心结束后，弃掉上清液，向离心管中加入一定体积的细胞培养基，弯头吸管吹打混匀细胞，细胞计数仪或血球计数板进行计数。
2.2.1.4用细胞培养基稀释细胞至接种密度（接种后24h融合度达到45%～60%），接种至96孔板中，每孔液量为200μL，接种结束后，放置于CO2培养箱中培养24h±2h。
2.2.2诱导及给药
2.2.2.1弃掉96孔板中的培养基，开展诱导及给药操作。受试物孔中加入含有一定浓度受试物和LPS的培养基，阴性对照孔中加入含有LPS的细胞培养基，阳性对照孔中需要加入含有阳性对照和LPS的培养基，空白/溶剂对照孔中加入细胞培养基，每孔200μL，给药完毕后将96孔板放置于CO2培养箱中培养24h±2h。
2.2.2.2细胞上清收集
孵育培养结束后，收集200μL细胞培养上清液于1.5mL无菌离心管中，置于-80℃超低温冰箱冷冻保存。
2.2.3 ELISA检测：根据TNF-α ELISA检测试剂盒的操作说明书进行检测。
测试结果如表6、表7所示：
表6：TNF-α 试验结果表（对比例1-18）
| 样品信息 | 给药浓度（mg/mL） | TNF-α浓度（ng/mL） | TNF-α抑制率% | P值 |
| 空白 | / | 52.61 | / | / |
| 对比例1 | 1 | 49.51 | 5.89% | ＜0.05 |
| 对比例2 | 1 | 50.16 | 4.66% | ＞0.05 |
| 对比例3 | 1 | 53.16 | -1.05% | ＞0.05 |
| 对比例4 | 1 | 54.16 | -2.95% | ＞0.05 |
| 对比例5 | 1 | 52.10 | 0.97% | ＞0.05 |
| 对比例6 | 1 | 48.60 | 7.62% | ＜0.05 |
| 对比例7 | 1 | 49.10 | 6.67% | ＜0.05 |
| 对比例8 | 1 | 50.19 | 4.60% | ＞0.05 |
| 对比例9 | 1 | 49.45 | 6.01% | ＜0.05 |
| 对比例10 | 1 | 53.10 | -0.93% | ＞0.05 |
| 对比例11 | 1 | 52.10 | 0.97% | ＞0.05 |
| 对比例12 | 1 | 54.16 | -2.95% | ＞0.05 |
| 对比例13 | 1 | 52.16 | 0.86% | ＞0.05 |
| 对比例14 | 1 | 51.26 | 2.57% | ＞0.05 |
| 对比例15 | 1 | 50.98 | 3.10% | ＞0.05 |
| 对比例16 | 1 | 53.45 | -1.60% | ＞0.05 |
| 对比例17 | 1 | 54.12 | -2.87% | ＞0.05 |
| 对比例18 | 1 | 52.13 | 0.91% | ＞0.05 |
注：P<0.050，表示样品组与空白对照相比有显著性差异。
结论：由于上表可以看出，当对对比例1-14进行细胞炎症因子TNF-α试验时，除了对比例1/7具有显著性差异，其他均无效果；
表7：TNF-α 试验结果表（实施例1-4）
注：P<0.050，表示样品组与空白对照相比有显著性差异。
结论：由于上表可以看出，实施例1-4均对炎症因子TNF-α产生抑制效果，与空白组相比，均有显著性差异。
3 斑马鱼保湿试验：
3.1.评价原理：
斑马鱼用0.9%氯化钠处理，由于渗透压的原因皮肤表面将会失水皱缩，尾部面积因皱缩而变小，通过对尾部面积的影响评价化妆品的补水保湿效果。
2.实验方案：
受测试斑马鱼分成6组，空白组、模型组、样品+模型1组、样品+模型2组、品+模型3组、样品+阳性组（供试品通过溶解到标准稀释水中的方式接触到斑马鱼皮肤），测试方案如表8所示，测试结果如表9、表10所示：
表8：保湿实验方案表
| 样品信息 | 空白组 | 模型组 | 样品1+组分 | 样品+阳性组 |
| / | 养殖水 | 0.9% Nacl | 0.9%Nacl+0.5%实施例1组合物浓度的日化品 | 0.9%Nacl+0.5%尿素 |
表9：斑马鱼保湿试验结果表（对比例1-18）
| 样品信息 | 样品浓度（%） | 尾鳍面积 | 相对保湿效果（%） | P值 |
| 空白 | / | 46886.5 | / | ＜0.0001 |
| 对比例1 | 0.5 | 41608 | / | / |
| 对比例2 | 0.5 | 40589 | -19.30% | ＞0.05 |
| 对比例3 | 0.5 | 41910 | 5.72% | ＜0.05 |
| 对比例4 | 0.5 | 42056 | 8.49% | ＜0.05 |
| 对比例5 | 0.5 | 43106 | 28.38% | ＜0.05 |
| 对比例6 | 0.5 | 40160 | -27.43% | ＞0.05 |
| 对比例7 | 0.5 | 41556 | -0.99% | ＞0.05 |
| 对比例8 | 0.5 | 41038 | -10.80% | ＞0.05 |
| 对比例9 | 0.5 | 39250 | -44.67% | ＞0.05 |
| 对比例10 | 0.5 | 38975 | -49.88% | ＞0.05 |
| 对比例11 | 0.5 | 41656 | 0.91% | ＞0.05 |
| 对比例12 | 0.5 | 41789 | 3.43% | ＞0.05 |
| 对比例13 | 0.5 | 40890 | -13.60% | ＞0.05 |
| 对比例14 | 0.5 | 39860 | -33.12% | ＞0.05 |
| 对比例15 | 0.5 | 41032 | -10.91% | ＞0.05 |
| 对比例16 | 0.5 | 42056 | 8.49% | ＞0.05 |
| 对比例17 | 0.5 | 41206 | -7.62% | ＞0.05 |
| 对比例18 | 0.5 | 40569 | -19.68% | ＞0.05 |
注：P<0.050，表示样品组与空白对照相比有显著性差异。
结论：由于上表可以看出，当对对比例1-14进行斑马鱼保湿试验，与模型组对比，除了对比例3/4/5具有显著性差异，其他均无效果；
表10：斑马鱼保湿试验结果表（实施例1-4）
注：P<0.050，表示样品组、空白对照与模型组相比有显著性差异。
结论：由于上表可以看出，在斑马鱼保湿上，实施例1-4与空白组相比，均有显著性差异。
Claims (7)
1.一种促进表皮细胞水通道蛋白3表达的氨基酸组合物，其特征在于，按质量份数计，包括以下组分：
白芨提取物 1～10份；
玉竹提取物 0.2～15份；
麦冬提取物 1～10份；
甘氨酸 1～10份；
脯氨酸 0.1～5份；
丝氨酸 0.1～5份；
色氨酸 0.1～5份；
亮氨酸 0.1～5份；
精氨酸 0.1～5份；
CHA 0.01～1份；
水 余量；
所述白芨提取物的提取方法为：
将白芨干燥中药材粉碎过40目筛，按照每克白芨60～100mL提取溶剂的比例，以蒸馏水为提取溶剂，回流条件下提取2～3h，过滤，收集滤液，将滤液浓缩，加入乙醇析出沉淀物；将沉淀物用纯水，加热复溶，然后离心2～3次后，得到白芨提取物；
所述玉竹提取物的提取方法为：
将玉竹的干燥中药材粉碎过40目筛，按照每克玉竹15～20mL提取溶剂的比例，以10%浓度的乙醇为提取溶剂，90℃回流提取1～2h，离心、过滤，收集滤液，记为第一次滤液；向滤渣中加入提取第一次滤液相同体积的10%浓度的乙醇，按与提取第一次滤液相同的方法再提取一次得到第二次滤液；合并第一次滤液和第二次滤液，浓缩除去乙醇，得到玉竹提取物；
所述麦冬提取物的提取方法为：
将麦冬的干燥中药材粉碎过40目筛，按照每克麦冬12～15mL提取溶剂的比例，以20%浓度的乙醇为提取溶剂，超声波提取2h～3h，离心、过滤，收集滤液，记为第一次滤液；向滤渣中加入提取第一次滤液相同体积的20%浓度的乙醇，按与提取第一次滤液相同的方法再提取一次得到第二次滤液；合并第一次滤液和第二次滤液，浓缩除去乙醇，得到麦冬提取物。
2.根据权利要求1所述的促进表皮细胞水通道蛋白3表达的氨基酸组合物，其特征在于，按质量份数计，包括以下组分：
白芨提取物 1～8份；
玉竹提取物 0.5～12份；
麦冬提取物 1～8份；
甘氨酸 1～8份；
脯氨酸 0.5～2份；
丝氨酸 0.5～5份；
色氨酸 0.5～5份；
亮氨酸 0.5～5份；
精氨酸 0.5～5份；
CHA 0.01～0.5份；
水 余量。
3.根据权利要求1所述的促进表皮细胞水通道蛋白3表达的氨基酸组合物，其特征在于，所述促进表皮细胞水通道蛋白3表达的组合物的pH值为7.6～7.8，电导率为1.2～1.8mS/cm。
4.采用权利要求1-3中任一所述的促进表皮细胞水通道蛋白3表达的氨基酸组合物制备保湿舒缓作用的日化品的用途。
5.一种日化品，其特征在于，含有0.5～5wt%的如权利要求1-3中任一所述的促进表皮细胞水通道蛋白3表达的氨基酸组合物。
6.根据权利要求5所述的日化品，其特征在于，所述日化品为膏霜、乳液、喷雾。
7.根据权利要求5所述的日化品，其特征在于，所述日化品为啫喱、精华液、爽肤水、面膜、洁面乳、化妆水、香水、卸妆水、口红、腮红。
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