CN117265030A - 一种合成γ-聚谷氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种合成γ‑聚谷氨酸的方法。本发明筛选出γ‑聚谷氨酸的高产菌株，即副地衣芽孢杆菌TR‑1，已进行生物保藏，保藏编号为CCTCC M 20231731。该菌株从土壤筛选获得，活性高、生长代谢能力较强，可以长期运用于发酵器中发酵，后期可以逐渐减少菌种投加量；发酵底物利用价格低廉的玉米秸秆、地瓜秧、小麦秸秆等高碳物料来生产发酵聚谷氨酸，尤其是采用玉米秸秆为发酵底物时产量最高，可达80g/L以上，为玉米秸秆的综合利用寻求了一条新路径；本发明发酵生产γ‑聚谷氨酸的培养基组分简单，容易获得，成本低，发酵周期较短，对物料要求度不高，可以进行大规模工业化生产应用。

Description

一种合成γ-聚谷氨酸的方法

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种合成γ-聚谷氨酸的方法，采用玉米秸秆为发酵底物。

背景技术

γ-聚谷氨酸(γ-polyglutamic acid，γ-PGA)是由D-谷氨酸或L-谷氨酸通过α-氨基和γ-羧基形成γ-酰胺键连接而成的一种新型生物高分子聚合物，相对分子质量在10kDa到2000kDa之间。γ-PGA具有良好的生物相容性，离子吸附性和生物降解性，对人体和环境无害等性质，常用于化妆品、食品加工、农业、医药、环保等领域。

γ-聚谷氨酸的合成方法主要有提取法、化学合成法、酶转化法和微生物发酵法，目前微生物发酵法使用最多，专利申请号：CN202310371012利用微生物发酵法生产γ-聚谷氨酸，发明所用的发酵培养基以酶解液作为主要碳源，所述酶解液通过将豆粕、西谷椰子树木髓木屑经酸泡、碱泡、水泡洗后，用纤维素酶和黑曲霉酸性蛋白酶酶解得到。酶解液制作过程麻烦，实验材料多，且成本高。

专利申请号：CN202310187309利用空气包裹剂进行发酵，空气包裹剂包括：卵磷脂、椰油基葡糖苷、大豆油和石蜡油。以此方法生产γ-聚谷氨酸最高产量为35-42g/L，空气包裹制作麻烦，成本高。专利申请号：CN202210340897公开了一株蓝色解淀粉芽孢杆菌YZHY21.A02利用豆浆发酵生成γ-聚谷氨酸，也可以利用黄豆固体发酵生成聚谷氨酸，固体发酵的聚谷氨酸产率为4.9g/100g黄豆，豆浆和黄豆购买成本高，发酵成本高。专利申请号：CN202211354365利用一株副地衣芽孢杆菌进行微生物发酵，24h发酵周期内发酵生产聚谷氨酸浓度能达到50g/L以上，能够进行谷氨酸非依赖型生产聚谷氨酸，所使用的碳源和氮源为实验室药品。

目前，关于γ-聚谷氨酸的合成，所用的发酵基底，制作麻烦，且成本较高，不适用于大规模生产，因此如何通过较低的生产成本，生产出高产量的聚谷氨酸是目前研究的重点。玉米秸秆属于农业固体废弃物，玉米秸秆还田技术，玉米秸秆腐化效率慢，时间久，不能被很好的利用，而且秸秆中含有大量的幼虫卵和带菌体，粉碎过程中很难清除，被埋入土壤后能很快成长，成为病虫害的一种隐患。利用玉米秸秆作为发酵底物，既可以降低生产成本，又可以解决玉米秸秆的利用问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题就是提供一种合成γ-聚谷氨酸的方法，以玉米秸秆为发酵底物，发酵生成γ-聚谷氨酸，同时提供了副地衣芽孢杆菌(Bacillusparalicheniform)TR-1，已进行生物保藏，保藏编号为CCTCC M 20231731。该菌株从土壤中筛选获得，可以利用玉米秸秆合成γ-聚谷氨酸，其产量最高可达80g/L以上。

采用的技术方案为：

一种合成γ-聚谷氨酸的方法，筛选副地衣芽孢杆菌TR-1，将含有副地衣芽孢杆菌TR-1的种子液接种到发酵培养基中，好氧发酵得到γ-聚谷氨酸。

优选的，副地衣芽孢杆菌TR-1，即Bacillus paralicheniform TR-1，中国典型培养物保藏中心保藏编号CCTCC M 20231731，保藏日期2023年09月18日。

优选的，发酵培养基包括碳源、氮源、谷氨酸钠、磷酸氢二钾、蒸馏水，发酵培养基的pH为6.0～7.5；其中，碳源为玉米秸秆、地瓜秧、小麦秸秆中的任一种或多种混合；氮源为黄豆饼、豆粕、鸡粪中的任一种；

使用的C:N比为10～25：1。

优选的，好氧发酵方试为摇瓶发酵或发酵罐发酵。

优选的，使用摇瓶发酵时，发酵的条件为：温度28～39℃，转速120～220rpm，时间12～60h；

使用发酵罐发酵时，发酵条件为：温度28～39℃，搅拌转速120～220rpm，发酵时间24～60h，通气量为0.8～1.2vvm。

优选的，种子液与发酵培养基的体积比为1～15：100。

优选的，接种量1％～15％，培养温度30～40℃，pH6.0～7.5，搅拌速度140～220rpm，培养24～72h。

优选的，副地衣芽孢杆菌TR-1的筛选包括如下步骤：

a.样品处理：选取枯枝落叶覆盖的土壤，挖取10～15cm深处的土壤，取一定量土壤，加入到无菌蒸馏水中，震荡混匀，然后水浴加热10min，冷却后取上清液用无菌水进行梯度稀释，稀释倍数为10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷，37℃培养24h，得到初步的菌群群落；其中，土壤的质量与无菌水的体积比为1:9(g/L)；

b.初筛：取步骤(1)中稀释10¹～10⁷倍的样品，各取100μL涂布在初筛平板培养基上，倒置培养；使用接种环挑取菌落大，粘度大，易拉丝的菌株划线培养，获取单菌落纯培养保藏于新的LB固体培养基中作为初筛菌株(初筛平板培养基也是LB固体培养基，因此单菌落重新找新的LB固体培养基进行培养)；

c.检测筛选：将初筛所得菌株，分别接种于种子培养基中，37℃下180rpm培养12h，将种子液以体积比2％接种量接种于发酵培养基中，37℃下180rpm培养48h，发酵液4℃，4800rpm离心25min，取上清液用紫外分光光度计检测γ-聚谷氨酸产量，筛选一株产γ-聚谷氨酸产量最高的菌株进行扩大培养、保存。

采用紫外分光光度计检测时，取离心后的上清液，然后加入4倍体积的无水乙醇，放到4℃冰箱内沉淀12h，然后取出，4℃，8000rpm离心15min，去掉上清液，沉淀物用超纯水溶解，在紫外分光光度计216nm处检测吸光度，并根据标准曲线计算γ-聚谷氨酸产量。

标准曲线是根据不同浓度的γ-聚谷氨酸标准液，使用紫外分光光度计在216nm处检测吸光度，以吸光度为纵坐标、γ-聚谷氨酸浓度为横坐标，绘制标准曲线。

优选的，初筛平板培养基为LB固体培养基，组分为：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂18g/L，121℃，灭菌20min。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明筛选出一株γ-聚谷氨酸高产菌株，即副地衣芽孢杆菌(Bacillusparalicheniform)TR-1，已进行生物保藏，保藏编号为CCTCC M 20231731，该菌株从土壤中筛选获得，活性较高、生长代谢能力较强，可以长期运用于发酵器中发酵，后期可以逐渐减少菌种投加量；

本发明的发酵底物利用价格低廉的玉米秸秆、地瓜秧、小麦秸秆等高碳物料来生产发酵聚谷氨酸，尤其是采用玉米秸秆为发酵底物时产量最高，最高可达80g/L以上，为玉米秸秆的综合利用寻求了一条新路径；

本发明发酵生产γ-聚谷氨酸的培养基组分简单，容易获得，成本低，发酵周期较短，对物料要求度不高，可以进行大规模工业化生产应用。

保藏说明：

菌种名称：副地衣芽孢杆菌

拉丁名：Bacillus paralicheniform

菌株编号：TR1

保藏机构：中国典型培养物保藏中心

保藏机构简称：CCTCC

地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，邮编：430072

保藏编号：CCTCC M 20231731

保藏日期：2023年09月18日

附图说明

图1为本发明计算γ-聚谷氨酸产量的标准曲线；

图2为本发明的副地衣芽孢杆菌TR-1的形态图。

具体实施方式

附图仅用于示例性说明；下面结合实施例对发明进行详细说明；应当理解，实施例中的公知常识或现有技术可能会省略。

实施例1

一种合成γ-聚谷氨酸的方法，采用如下步骤：

(1)玉米秸秆预处理：将玉米秸秆在60℃下干燥，烘干后用粉碎机粉碎，过40目筛，获得玉米秸秆粉末。

(2)种子液培养：挑取一环副地衣芽孢杆菌TR-1平板培养的单菌落接种于液体种子培养基中，35℃，200rpm振荡培养18h至对数生长中期，得到种子液。种子液的组分为：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，采用121℃，灭菌20min。

其中，副地衣芽孢杆菌TR-1的筛选过程为：

选取枯枝落叶覆盖较厚的土壤，挖取10-15cm厚的土壤，取10g土壤，加入90ml无菌蒸馏水中，震荡30min混匀，然后100℃水浴加热10min，冷却后取上清液用无菌水进行梯度稀释，稀释倍数为10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷，37℃培养24h，得到初步的菌群群落，然后对该群落进行筛选。

首先进行初筛，选择上述步骤中稀释10¹～10⁷倍的样品，各取100μL涂布在初筛平板培养基上，倒置培养；初筛平板培养基为LB固体培养基。由于γ-聚谷氨酸生产菌的粘稠度较高，因此初步筛选γ-聚谷氨酸生产菌株时可以根据培养基中菌落形态作为筛选标记，使用接种环挑取菌落大，粘度大，易拉丝的菌株划线培养，获取单菌落纯培养保藏于LB固体培养基中作为初筛菌株。然后进行复筛，将初筛所得菌株，分别接种于种子培养基中，37℃下180rpm培养12h，将种子液以体积比2％接种量接种于发酵培养基中，37℃下180rpm培养48h，发酵液4℃，4800rpm离心25min，取上清液检测γ-聚谷氨酸产量，筛选出γ-聚谷氨酸高产菌作为菌落接种于种子液中。

检测方式和绘制曲线：

将取的上清液加入到4倍体积的无水乙醇，放到4℃冰箱内沉淀12h，然后取出，4℃，8000rpm离心15min，去掉上清液，沉淀物用超纯水溶解，在紫外分光光度计216nm处检测吸光度，并根据标准曲线计算γ-聚谷氨酸产量。

标准曲线的制作：取0.01gγ-聚谷氨酸标准样品，加超纯水用100ml容量瓶定容，配置成0.1g/L的γ-聚谷氨酸标准液，分别取0、5、10、15、20、25、30ml的标准液定容至100ml，使用紫外分光光度计在216nm处检测吸光度。标准曲线的绘制：根据不同浓度的标准样所对应的吸光度做折线图，得到标准曲线，其公式为y＝0.0007x+0.017，R²＝0.9976其中y为吸光度，x为样品中γ-聚谷氨酸浓度。

(3)发酵培养：使用摇瓶发酵培养，采用透气的硅胶塞封口，不需要进行通气。按照8％(v/v)的接种量，将步骤2培养得到的种子液转接到发酵培养基中(包括的碳源为玉米秸秆，200g/L；鸡粪20g/L；硫酸镁0.5g/L；谷氨酸钠45g/L；磷酸二氢钾3g/L和余量的蒸馏水组成，培养基初始pH 7.0，121℃灭菌30min)，在温度35℃条件下，搅拌转速200rpm培养48h，发酵得到含γ-聚谷氨酸的发酵液。

通过紫外分光光度计在216nm处检测，再利用标准曲线，发酵得到γ-聚谷氨酸产量为80.65g/L。

紫外检测与计算方法：取发酵液1ml，4800rpm，4℃，离心25min除去菌体，取上清液，然后加入4倍体积预冷的无水乙醇，放到4℃冰箱内沉淀12h，然后取出，在4℃下8000rpm离心15min，去掉上清液，沉淀物用超纯水溶解，定容至100ml，在紫外分光光度计216nm处检测其吸光度，通过公式y＝0.0007x+0.017，(其中y为吸光度，x为样品浓度)计算出样品浓度，所得结果×100为最终浓度。

实施例2、3

按照实施例1的方式生产γ-聚谷氨酸，区别在于实施例2～3中步骤3发酵培养过程中，碳源与实施例1不同，具体列于表1中。

表1实施例1～3中步骤3不同碳源和发酵后γ-聚谷氨酸含量

实施例4、5

按照实施例1的方式生产γ-聚谷氨酸，区别在于实施例4、5中步骤3发酵培养过程中，氮源与实施例2不同，具体列于表2中。

表2实施例1、4～5中步骤3不同氮源和发酵后γ-聚谷氨酸含量

实施例6～9

按照实施例1的方式生产γ-聚谷氨酸，区别在于实施例6～9中步骤3发酵培养过程中，碳源的浓度与实施例1不同，具体列于表3中。

表3实施例1、6～9中步骤3玉米秸秆浓度和发酵后γ-聚谷氨酸含量

实施例10～13

按照实施例1的方式生产γ-聚谷氨酸，区别在于实施例10～13中步骤3发酵培养过程中，鸡粪的浓度与实施例1不同，具体列于表4中。

表4实施例1、10～13中步骤3鸡粪浓度和发酵后γ-聚谷氨酸含量

实施例14～17

按照实施例1的方式生产γ-聚谷氨酸，区别在于实施例14～17中步骤3发酵培养过程中，谷氨酸钠的浓度与实施例1不同，具体列于表5中。

表5实施例1、14～17中步骤3谷氨酸钠浓度和发酵后γ-聚谷氨酸含量

实施例18～21

按照实施例1的方式生产γ-聚谷氨酸，区别在于实施例18～21中步骤3发酵培养过程中，温度与实施例1不同，具体列于表6中，其中吸光度值略。

表6实施例1、18～21中步骤3发酵温度和发酵后γ-聚谷氨酸含量

实施例22～25

按照实施例1的方式生产γ-聚谷氨酸，区别在于实施例22～25中步骤3发酵培养过程中，接种量与实施例1不同，具体列于表7中，其中吸光度值略。

表7实施例1、22～25中步骤3接种量和发酵后γ-聚谷氨酸含量

实施例26～29

按照实施例1的方式生产γ-聚谷氨酸，区别在于实施例26～29中步骤3发酵培养过程中，发酵时间与实施例1不同，具体列于表8中，其中吸光度值略。

表8实施例1、26～29中步骤3发酵时间和发酵后γ-聚谷氨酸含量

实施例30～33

按照实施例1的方式生产γ-聚谷氨酸，区别在于实施例30～32中步骤3发酵培养过程中，振荡的转速与实施例1不同，具体列于表9中，其中吸光度值略。

表9实施例1、30～33中步骤3震荡转速和发酵后γ-聚谷氨酸含量

本发明实例实验数据均采用三组平行对照，表中所用数据为平均值。根据实例数据可以看出，副地衣芽孢杆菌TR-1使用实例1物料产γ-聚谷氨酸最佳的条件为：35℃、种液接种量为8％(v/v)，玉米秸秆与鸡粪的比值为10，谷氨酸钠添加量20g/L，最高产量可达80.65g/L。

实施例34

发酵罐发酵：将步骤2中的种子液以8％(v/v)的接种量接种于5L发酵罐，发酵培养基装液量为3L，发酵温度35℃，罐压0.02Mpa，通风比1:1.25，转速350rpm，发酵过程中pH值会下降，每当pH值下降，就加入6M NaOH调节，使pH值保持在7.2左右，培养72h。所述发酵培养基组分及含量为玉米秸秆，200g/L；鸡粪20g/L；硫酸镁0.5g/L；谷氨酸钠45g/L；磷酸二氢钾3g/L。

本实例中γ-聚谷氨酸产量为66.58g/L。

按照上述实施例34的发酵方式生产γ-聚谷氨酸，区别在于发酵培养过程中的转速不同，具体列于表10中，，其中吸光度值略。

表10实施例34～38中发酵转速和发酵后γ-聚谷氨酸含量

由上述表格可以看出，随着转速的增加γ-聚谷氨酸的产量也随之增加，原因是因为随着转速的增加，罐内的溶氧量也会增加，有利于发酵培养的有效转化。

当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种合成γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，筛选副地衣芽孢杆菌TR-1，将含有副地衣芽孢杆菌TR-1的种子液接种到发酵培养基中，好氧发酵得到γ-聚谷氨酸。

2.根据权利要求1所述的一种合成γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，副地衣芽孢杆菌TR-1，即Bacillus paralicheniform TR-1，中国典型培养物保藏中心保藏编号CCTCC M20231731，保藏日期2023年09月18日。

3.根据权利要求1所述的一种合成γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，发酵培养基包括碳源、氮源、谷氨酸钠、磷酸氢二钾、蒸馏水，发酵培养基的pH为6.0～7.5；其中，碳源为玉米秸秆、地瓜秧、小麦秸秆中的任一种或多种混合；氮源为黄豆饼、豆粕、鸡粪中的任一种；

使用的C:N比为10～25：1。

4.根据权利要求1所述的一种合成γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，好氧发酵方试为摇瓶发酵或发酵罐发酵。

5.根据权利要求4所述的一种合成γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，使用摇瓶发酵时，发酵的条件为：温度28～39℃，转速120～220rpm，时间12～60h；

使用发酵罐发酵时，发酵条件为：温度28～39℃，搅拌转速120～220rpm，发酵时间24～60h，通气量为0.8～1.2vvm。

6.根据权利要求1所述的一种合成γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，种子液与发酵培养基的体积比为1～15：100。

7.根据权利要求1所述的一种合成γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，接种量1％～15％，培养温度30～40℃，pH6.0～7.5，搅拌速度140～220rpm，培养时间24～72h。

8.根据权利要求1所述的一种合成γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，副地衣芽孢杆菌TR-1的筛选包括如下步骤：

a.样品处理：选取枯枝落叶覆盖的土壤，挖取10～15cm深处的土壤，取一定量土壤，加入到无菌蒸馏水中，震荡混匀，然后水浴加热10min，冷却后取上清液用无菌水进行梯度稀释，稀释倍数为10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷，37℃培养24h，得到初步的菌群群落；

b.初筛：取步骤(1)中稀释10¹～10⁷倍的样品，各取100μL涂布在初筛平板培养基上，倒置培养；使用接种环挑取菌落大，粘度大，易拉丝的菌株划线培养，获取单菌落纯培养保藏于LB固体培养基中作为初筛菌株；

c.检测复筛：将初筛所得菌株，分别接种于种子培养基中，37℃下180rpm培养12h，将种子液接种于发酵培养基中，37℃下180rpm培养48h，发酵液4℃，4800rpm离心25min，取上清液用紫外分光光度计检测γ-聚谷氨酸产量，筛选一株产γ-聚谷氨酸产量高的菌株进行扩大培养、保存。

9.根据权利要求8所述的一种合成γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，初筛平板培养基为LB固体培养基，组分为：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂18g/L，且在121℃，灭菌20min。