CN117264038A - ZmMIEL1及其在培育抗旱植物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了ZmMIEL1及其在培育抗旱植物中的应用。本发明公开的ZmMIEL1为氨基酸序列是序列3或序列5的蛋白质。本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑方法对ZmMIEL1基因进行编辑，干旱处理条件下突变体玉米植株生长表现明显好于野生型。干旱条件下突变体植株叶片相对含水量显著高于对照，且正常生长条件下的突变体株系离体叶片失水速率明显低于对照，说明该基因的突变能够显著提高植物抗旱性。本发明通过编辑ZmMIEL1基因获得了抗旱的植株，与传统育种方式相比时间短，目的性强，为培育和改良抗旱植物新品种提供了基因资源，并为阐明ZmMIEL1在植物干旱逆境信号应答中的分子机制提供了理论依据。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，ZmMIEL1及其在培育抗旱植物中的应用。
背景技术
植物固着生长的特性使得它们在长期进化过程中适应和应对各种生物和非生物胁迫，在抵御这些胁迫过程中，植物常通过蛋白选择性降解来实现对自身内反应的调节，而泛素/26S蛋白酶体途径是目前已知最重要、有高度选择性的蛋白质降解途径，细胞内80％～90％的蛋白通过该途径降解，它通过调节功能蛋白质的周转或降解不正常蛋白，实现对多种代谢过程的调节。
泛素/26S蛋白酶体系统由泛素(ubiquitin,Ub)、泛素激活酶(ubiquitin-activating enzymes,E1)、泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzymes,E2)、泛素连接酶(ubiquitin ligases,E3)和26S蛋白酶体5个基本部分组成。E1负责激活Ub分子并将激活的Ub分子传递到E2上，E2负责结合Ub分子并通过E3将Ub转移到靶蛋白上，E3的主要功能是识别应该被泛素化的靶蛋白，然后使活化的Ub接近特异靶蛋白的赖氨酸，从而将Ub转移到底物上去。E3是泛素蛋白酶体途径中种类最多、发现最晚，在底物的特异性选择降解过程中作用最为关键的成员，因此对泛素连接酶E3的研究对了解泛素化修饰在植物生长发育和抗逆方面的功能尤为重要。根据E3的结构将其分为单亚基和多亚基两大类，单亚基包括HECT(homologous to E6-AP carboxy-terminus)、U-box和RING-finger 3组，而多亚基是指一组含F-box序列特征的酶。HECT型E3有约350个氨基酸的HECT结构域，介导Ub从E2到靶蛋白的共价转移，与HECT型E3不同，U-box结构域主要通过盐桥、离子螯合作用以及氢键从E2上转移泛素至靶蛋白，而RING结构域主要通过8个氨基酸与锌离子的螯合形成共价键来转移泛素，在E3单亚基类中RING型E3在生物体内所占比重较多，也是被研究较多的一类。
干旱已成为限制作物生长发育及产量的重要因素之一，利用转基因、基因编辑等技术对优良基因定向遗传改良，为作物抗旱育种提供了直接有效的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种玉米ZmMIEL1基因及其编码蛋白，调控玉米在抗旱性中的应用。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质(来源于玉米，其名称为ZmMIEL1)或调控ZmMIEL1活性或含量的物质的下述任一应用：
D1)调控植物抗旱性；
D2)制备调控植物抗旱性产品；
D3)培育抗旱性增强植物；
D4)制备培育抗旱性增强植物产品；
D5)调控植物对ABA的敏感性；
D6)制备调控植物对ABA的敏感性产品；
D7)培育ABA敏感植物；
D8)制备培育ABA敏感植物产品；
ZmMIEL1为如下A1)、A2)或A3)：
A1)氨基酸序列是序列3的蛋白质；
A2)氨基酸序列是序列5的蛋白质；
A3)将序列表中序列3或序列5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
其中，所述抗旱性可体现在干旱条件下植株(如叶片)的含水量上，或体现在失水率上，或体现在植株(如叶片)表面温度上。
对ABA的敏感性可体现在气孔对ABA的敏感性上。
为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列3或序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。
表：标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述A2)中的ZmMIEL1蛋白质，为与序列3或序列5所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。
上述A2)中的ZmMIEL1蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述A2)中的ZmMIEL1蛋白质的编码基因可通过将序列2的第152-922位或序列4的第241-1269位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，序列2的第152-922位所示的DNA分子编码序列3所示的蛋白质，序列4的第241-1269位所示的DNA分子编码序列5所示的蛋白质。
上述应用中，所述物质可为下述B1)至B9)中的任一种：
B1)编码ZmMIEL1的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；
B8)降低ZmMIEL1表达量的核酸分子；
B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官。
上述应用中，B1)所述核酸分子可为如下b11)或b12)或b13)或b14)或b15)：
b11)序列表中序列1所示的DNA分子；
b12)序列表中序列2或序列2的第152-922位所示的cDNA分子或DNA分子；
b13)序列表中序列4或序列4的第241-1269位所示的cDNA分子或DNA分子；
b14)与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码ZmMIEL1的cDNA分子或DNA分子；
b15)在严格条件下与b11)或b12)或b13)或b14)限定的核苷酸序列杂交，且编码ZmMIEL1的cDNA分子或DNA分子；
B8)所述核酸分子为靶向B1)所述核酸分子的sgRNA。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码ZmMIEL1蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的ZmMIEL1蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码ZmMIEL1蛋白质且具有ZmMIEL1蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列3或序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述应用中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％ SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％ SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％ SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％ SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％ SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％ SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％ SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％ SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述应用中，B2)所述的含有编码ZmMIEL1蛋白质的核酸分子的表达盒(ZmMIEL1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达ZmMIEL1蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动ZmMIEL1基因转录的启动子，还可包括终止ZmMIEL1基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic AcidRes.,15:9627)。
可用现有的表达载体构建含有所述ZmMIEL1基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa、PSN1301或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pBUE411载体。
上述应用中，B8)所述核酸分子具体可为靶向序列1的第262-280位和/或序列1的第443-461位的sgRNA。
B9)所述重组载体可为pBUE411-1，所述pBUE411-1为将pBUE411载体的两个BsaⅠ酶切位点识别序列间的DNA片段替换为序列12所示的DNA片段得到的重组载体。
上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为农杆菌，如农杆菌EHA105。
上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。
本发明还提供了蛋白质(为ZmMIEL1的突变体，记为ZmMIEL1-M)或与ZmMIEL1-M相关的生物材料的下述任一应用：
D1)调控植物抗旱性；
D2)制备调控植物抗旱性产品；
D3)培育抗旱性增强植物；
D4)制备培育抗旱性增强植物产品；
D5)调控植物对ABA的敏感性；
D6)制备调控植物对ABA的敏感性产品；
D7)培育ABA敏感植物；
D8)制备培育ABA敏感植物产品；
ZmMIEL1-M如下C1)或C2)：
C1)氨基酸序列是序列6、序列7、序列8、序列9、序列10或序列11的蛋白质；
C2)将序列表中序列6、序列7、序列8、序列9、序列10或序列11所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
所述生物材料为下述B1)至B7)中的任一种：
B1)编码ZmMIEL1-M的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。
本发明还提供了下述任一方法：
X1)培育抗旱性增强植物的方法，包括：降低受体植物中ZmMIEL1的含量，或降低受体植物中ZmMIEL1的活性，或敲除受体植物中ZmMIEL1的编码基因，或降低受体植物中ZmMIEL1的编码基因的表达量，得到与所述受体植物相比抗旱性增强的目的植物；
X2)提高植物抗旱性的方法，包括：降低受体植物中ZmMIEL1的含量，或降低受体植物中ZmMIEL1的活性，或敲除受体植物中ZmMIEL1的编码基因，或降低受体植物中ZmMIEL1的编码基因的表达量，得到与所述受体植物相比抗旱性增强的目的植物实现植物抗旱性的增强；
X3)培育ABA敏感植物的方法，包括：降低受体植物中ZmMIEL1的含量，或降低受体植物中ZmMIEL1的活性，或敲除受体植物中ZmMIEL1的编码基因，或降低受体植物中ZmMIEL1的编码基因的表达量，得到与所述受体植物相比ABA敏感的目的植物；
X4)增强植物ABA敏感性的方法，包括：降低受体植物中ZmMIEL1的含量，或降低受体植物中ZmMIEL1的活性，或敲除受体植物中ZmMIEL1的编码基因，或降低受体植物中ZmMIEL1的编码基因的表达量，得到与所述受体植物相比ABA敏感的目的植物实现植物ABA敏感性增强。
上述方法中，X1)-X4)所述方法可通过CRISPR/Cas9系统对所述编码基因进行编辑实现。
其中，CRISPR/Cas9系统含有靶向B1)所述核酸分子的sgRNA或能转录靶向B1)所述核酸分子的sgRNA。
X1)-X4)所述方法所得目的植物与所述受体植物相比，ZmMIEL1的编码基因可突变为ZmMIEL1-M的编码基因。具体的，X1)-X4)所述方法可使所述编码基因缺失序列1的第271-285位，或缺失序列1的第278-445位，或缺失序列1的第274-276位和第446-447位。
利用CRISPR/Cas9系统对所述编码基因进行编辑可利用含有B9)所述重组载体导入受体植物。
所述重组表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998，Method for Plant MolecularBiology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geiserson and Corey,1998,PlantMolecular Biology(2nd Edition).)。
所述目的植物理解为不仅包含B9)所述重组载体导入受体植物的第一代植物，也包括其子代。对于所述目的植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将突变后的基因(序列6、序列7、序列8、序列9、序列10或序列11所示蛋白质的编码基因)转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述目的植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
本发明还提供了具有如下D1)-D4)中任一的功能的产品，所述产品含有(或其活性为)所述调控ZmMIEL1活性或含量的物质，或ZmMIEL1-M或所述生物材料：
D1)调控植物抗旱性；
D2)培育抗旱性增强植物；
D3)调控植物对ABA的敏感性；
D4)培育ABA敏感植物。
上文中，所述植物可为M1)或M2)或M3)：
M1)单子叶植物或双子叶植物；
M2)禾本科植物；
M3)玉米。
ZmMIEL1或所述调控ZmMIEL1活性或含量的物质，或ZmMIEL1-M或所述生物材料，也属于本发明的保护范围。
本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑方法对ZmMIEL1基因进行编辑，干旱处理条件下突变体玉米植株生长表现明显好于野生型。干旱条件下突变体植株叶片相对含水量显著高于对照，且正常生长条件下的突变体株系离体叶片失水速率明显低于对照，说明该基因的突变能够显著提高植物抗旱性。本发明通过编辑ZmMIEL1基因获得了抗旱的植株，与传统育种方式相比时间短，目的性强，为培育和改良抗旱植物新品种提供了基因资源，并为阐明ZmMIEL1在植物干旱逆境信号应答中的分子机制提供了理论依据。
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
附图说明
图1.zmmiel1突变体株系基因突变检测。miel1-3、miel1-4、miel1-5分别为zmmiel1-3、zmmiel1-4、zmmiel1-5。
图2.zmmiel1突变体植株干旱表型检测。
图3.zmmiel1突变体植株叶片相对含水量和失水率检测。
图4.zmmiel1突变体植株苗期叶片表面温度检测。A、B分别为野生型、zmmiel1-3、zmmiel1-4、zmmiel1-5材料在正常浇水和干旱处理条件下的红外相机下的叶片温度显示，C和D为对应的日光灯下的植株状态图。
图5.zmmiel1突变体植株拔节期抗旱表型检测。
图6.zmmiel1突变体植株拔节期叶片表面温度(左图)和叶片相对含水量(右图)检测。
图7.外源ABA对zmmiel1突变体气孔开度影响检测。
各图中，*表示具有显著差异，p＜0.05；**表示具有显著差异，p＜0.01。
具体实施方式
本发明利用CRISPR/Cas9系统编辑玉米基因组中的ZmMIEL1基因，发现ZmMIEL1基因突变后可以提高玉米的抗旱性。在玉米自交系ND101中，ZmMIEL1基因的基因序列如序列1所示，cDNA的序列有两种(即转录本有两种)，分别如序列2与序列4所示，CDS序列分别为序列2的第152-922位与序列4的第241-1269位，分别编码序列3与序列5所示的蛋白质。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
下述实施例中的玉米自交系ND101(Zhiquan Qiang et al.,The transcriptionfactor ZmMYB69 represses ligninbiosynthesis by activating ZmMYB31/42
expressionin maize,PLANT PHYSIOLOGY 2022:189:1916–1919)，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、ZmMIEL1基因编辑植株的获得
1，ZmMIEL1基因编辑重组载体的构建
采用双靶点的方法设计靶点(C1(靶序列1)，5’-CGCCGCGGGTTCGCCAGGA-3’(序列1的第262-280位)；C2(靶序列2)，5’-GTTGTGGCAATGGCGGCAG-3’(序列1的第443-461位)。
将pBUE411载体的两个BsaⅠ识别序列间的DNA片段替换为序列12所示的DNA片段，得到重组基因编辑载体pBUE411-1。pBUE411-1含有靶序列1与靶序列2，能够转录两个分别靶向靶序列1和靶序列2的sgRNA。
在序列12中，第1-381位为OsU3启动子，第382-400位为靶序列1，第401-476位为sgRNA骨架DNA；第477-767位为OsU3终止子，第768-1292位为TaU3启动子，第1293-1311位为靶序列2，第1312-1387位为sgRNA骨架DAN；第1388-1678位为OsU3终止子。
2，基因编辑玉米植株的构建与鉴定
将重组基因编辑载体pBUE411-1导入农杆菌EHA105菌株，得到重组菌EHA105-pBUE411。通过农杆菌介导的遗传转化方法，将重组菌EHA105-pBUE411导入玉米自交系ND101中以靶序列1与靶序列2为靶点，对ZmMIEL1基因进行编辑，针对Basta抗性培养基筛选得到T0代转基因苗，获得T0代转基因植株。取T0代转基因植株的幼苗叶片进行筛选抗性基因Bar拷贝数的PCR检测(引物序列：Bar-F:ACAAGCACGGTCAACTTCC；Bar-R:GAGGTCGTCCGTCCACTC)，筛选得到转基因阳性植株。
将经鉴定的T0代转基因植株进行自交获得T1代基因编辑植株，T1代基因编辑植株进行自交，得到T2代基因编辑植株。选用靶点验证引物对目的基因序列进行基因编辑检测，获取3个突变体株系，分别记为zmmiel1-3、zmmiel1-4、zmmiel1-5，对其进行序列分析得知3个株系的编辑类型分别是d15、d168、d3+d2(图1)。将三个突变株系的T2代植株自交得到T3代基因编辑植株，将T3代纯合植株用于后续干旱实验。
其中，zmmiel1-3缺失序列1的第271-285位，使得所编码的蛋白质缺失第11-15位；zmmiel1-3中转录本1与转录本2编码的蛋白质序列如序列6与序列7所示；
zmmiel1-4缺失序列1的第278-445位，使得所编码的蛋白质发生移码突变；zmmiel1-4中转录本1与转录本2编码的蛋白质序列如序列8与序列9所示；
zmmiel1-5缺失序列1的第274-276位与第446-447位，使得所编码的蛋白质发生缺失突变与移码突变；zmmiel1-5中转录本1与转录本2编码的蛋白质序列如序列10与序列11所示。
实施例2、zmmiel1突变体株系苗期抗旱性检测
将野生型(即玉米自交系ND101)和实施例1得到的zmmiel1突变体株系(T3代zmmiel1-3、zmmiel1-4、zmmiel1-5)播种于进口土：草炭土：蛭石等比例混合的土中，每小盆170g，每盆种4粒种子，待幼苗长至一叶一心期时进行间苗，每盆保留生长大小、状态相对一致的植株，幼苗在温室中继续生长。两叶一心期，在托盘中加入水，待水分充分吸收后，将所有小盆转移至另一个干燥的托盘中，此时，将种植的野生型、突变体植株分别分为两个处理(对照处理组与干旱处理组)，对照处理继续正常培养，按时浇水，干旱处理植株不再浇水，进行干旱胁迫处理，每天定时观察。
1，表型观察
干旱处理大约7天(此时为三叶一心期)拍照记录。结果如图2所示，图2左侧为对照处理情况，右侧为干旱处理情况。结果显示，zmmiel1突变体株系与野生型相比，具有明显的抗旱表型。
2，zmmiel1突变植株叶片相对含水量检测
观察盆内幼苗的状态，当出现干旱表型时，取正常浇水(对照处理)及干旱处理条件下突变体株系和野生型植株的叶片各9片，称取叶片的重量记为W1；再将叶片截段放入50mL离心管中，加入蒸馏水，使叶片吸水至饱和(约24h)，然后将叶片上的水用吸水纸擦干，重新称重记为W2；称重后将叶片烘干(80℃2d以上)，测干重记为W3。计算相对含水量，相对含水量＝(W1-W3)/(W2-W3)×100％。
结果如图3中A所示，结果显示，对照处理下各植株的相对含水量无显著差异；干旱处理下zmmiel1-3、zmmiel1-4、zmmiel1-5的相对含水量分别为78.04±3.28％、82.93±2.37％和83.13±2.58％，均显著高于野生型玉米自交系ND101的相对含水量71.30±2.90％)，p＜0.05。
3，zmmiel1突变植株离体叶片失水率检测
正常浇水处理下的野生型和zmmiel1突变体株系在温室中生长10天左右，分别取地上部分最上一片展开叶，用万分之一电子天平称量鲜重；在温度为27℃，湿度为30％-45％的条件下放置1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0小时后，进行称量。计算失水率：失水率＝(起始重量-失水后重量)/起始重量×100％。每次实验野生型和突变体株系各做3个重复，3次独立重复实验。根据失水率和时间制作成失水曲线。
结果如图3中B所示，结果显示3个突变株系失水率均显著低于野生型材料，说明3个突变体株系较对照植株具有耐旱性。
4，zmmiel1突变体植株叶片表面温度检测
对于干旱处理株系，采用红外热成像仪检测干旱处理5天的植株的叶片表面温度，以反应叶片的失水速率。
结果如图4所示，红外热成像仪也检测到突变体株系的叶片表面温度低于对照植株，说明其失水速率快于野生型。
实施例3、zmmiel1突变体拔节期抗旱表型检测
将野生型(即玉米自交系ND101)和实施例1得到的zmmiel1突变体株系(T3代zmmiel1-3、zmmiel1-4、zmmiel1-5)播种于草炭土、鸡粪、蛭石、珍珠岩，其重量比例为20:2:1:1混合的土中，每盆8kg，每盆种10粒种子，待幼苗长至三叶一心期时进行间苗，每盆保留生长大小、状态相对一致的植株，幼苗在温室中继续生长。待苗长到三叶一心期，在桶内加入足够多的水，待水分充分吸收后，去除托盘，此时，将种植的野生型、突变体平均分为两份，分别做干旱处理和浇水处理，浇水处理继续正常培养，按时浇水，干旱处理不再浇水，进行干旱胁迫处理，每天定时观察，拔节期拍照记录。
图5表示干旱处理条件下的表型结果，左侧为正常浇水情况，右侧为干旱处理的情况，结果显示，zmmiel1突变体与野生型相比，具有明显的抗旱表型。
同时对拔节期植株进行叶片表面温度检测及叶片相对含水量测试，结果表明，干旱处理下zmmiel1突变体叶片含水量显著高于对照，其表面温度高于对照植株(图6)。
zmmiel1-3、zmmiel1-4、zmmiel1-5的相对含水量分别为79.53±7.38％、77.15±7.78％和82.39±4.11％，均显著高于野生型玉米自交系ND101的相对含水量为68.38±7.38％。
实施例4、外源ABA对zmmiel1突变体植株气孔开度影响检测
以正常浇水处理下的野生型(玉米自交系ND101)和zmmiel1突变体(zmmiel1-3、zmmiel1-4、zmmiel1-5)一叶一心期第一片完全展开叶为操作对象，将该叶片置于气孔开度缓冲液中(10mMKCl，50μM CaCl2，10mM MES，Tris调pH＝5.6)，光照处理2h使气孔完全开放。将一部分叶片放入含有10μM ABA缓冲液中进行处理，另一部分放在不含ABA的缓冲液中作为对照。处理2h后在玉米叶片背面涂抹透明指甲油，并撕取下表皮，显微镜拍摄照片，用Image J软件统计气孔开度(用气孔开口横径表示)。
气孔运动实验结果如图7所示，对照条件下，除zmmiel1-4外各植株之间气孔开度无差异，但在ABA处理条件下，zmmiel1突变体气孔开度显著比野生型小，对ABA的作用敏感，说明ZmMIEL1对植物气孔运动调节有响应，在植物响应干旱胁迫方面有较大的应用价值。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
/>
/>
/>
/>
/>
Claims (10)
1.蛋白质或调控所述蛋白质活性或含量的物质的下述任一应用：
D1)调控植物抗旱性；
D2)制备调控植物抗旱性产品；
D3)培育抗旱性增强植物；
D4)制备培育抗旱性增强植物产品；
D5)调控植物对ABA的敏感性；
D6)制备调控植物对ABA的敏感性产品；
D7)培育ABA敏感植物；
D8)制备培育ABA敏感植物产品；
所述蛋白质为如下A1)、A2)或A3)：
A1)氨基酸序列是序列3的蛋白质；
A2)氨基酸序列是序列5的蛋白质；
A3)将序列表中序列3或序列5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述物质为下述B1)至B9)中的任一种：
B1)编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；
B8)降低权利要求1中所述蛋白质表达量的核酸分子；
B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下b11)或b12)或b13)或b14)或b15)：
b11)序列表中序列1所示的DNA分子；
b12)序列表中序列2或序列2的第152-922位所示的cDNA分子或DNA分子；
b13)序列表中序列4或序列4的第241-1269位所示的cDNA分子或DNA分子；
b14)与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子；
b15)在严格条件下与b11)或b12)或b13)或b14)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子；
B8)所述核酸分子为靶向B1)所述核酸分子的sgRNA。
4.蛋白质或与所述蛋白质相关的生物材料的下述任一应用：
D1)调控植物抗旱性；
D2)制备调控植物抗旱性产品；
D3)培育抗旱性增强植物；
D4)制备培育抗旱性增强植物产品；
D5)调控植物对ABA的敏感性；
D6)制备调控植物对ABA的敏感性产品；
D7)培育ABA敏感植物；
D8)制备培育ABA敏感植物产品；
所述蛋白质为如下C1)或C2)：
C1)氨基酸序列是序列6、序列7、序列8、序列9、序列10或序列11的蛋白质；
C2)将序列表中序列6、序列7、序列8、序列9、序列10或序列11所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
所述生物材料为下述B1)至B7)中的任一种：
B1)编码所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。
5.下述任一方法：
X1)培育抗旱性增强植物的方法，包括：降低受体植物中权利要求1中所述蛋白质的含量，或降低受体植物中权利要求1中所述蛋白质的活性，或敲除受体植物中权利要求1中所述蛋白质的编码基因，或降低受体植物中权利要求1中所述蛋白质的编码基因的表达量，得到与所述受体植物相比抗旱性增强的目的植物；
X2)提高植物抗旱性的方法，包括：降低受体植物中权利要求1中所述蛋白质的含量，或降低受体植物中权利要求1中所述蛋白质的活性，或敲除受体植物中权利要求1中所述蛋白质的编码基因，或降低受体植物中权利要求1中所述蛋白质的编码基因的表达量，得到与所述受体植物相比抗旱性增强的目的植物实现植物抗旱性的增强；
X3)培育ABA敏感植物的方法，包括：降低受体植物中权利要求1中所述蛋白质的含量，或降低受体植物中权利要求1中所述蛋白质的活性，或敲除受体植物中权利要求1中所述蛋白质的编码基因，或降低受体植物中权利要求1中所述蛋白质的编码基因的表达量，得到与所述受体植物相比ABA敏感的目的植物；
X4)增强植物ABA敏感性的方法，包括：降低受体植物中权利要求1中所述蛋白质的含量，或降低受体植物中权利要求1中所述蛋白质的活性，或敲除受体植物中权利要求1中所述蛋白质的编码基因，或降低受体植物中权利要求1中所述蛋白质的编码基因的表达量，得到与所述受体植物相比ABA敏感的目的植物实现植物ABA敏感性增强。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：X1)-X4)所述方法通过CRISPR/Cas9系统对所述编码基因进行编辑实现。
7.根据权利要求1-4中任一所述的应用，或，权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述植物为M1)或M2)或M3)：
M1)单子叶植物或双子叶植物；
M2)禾本科植物；
M3)玉米。
8.具有如下D1)-D4)中任一的功能的产品，含有权利要求1-3中任一所述调控所述蛋白质活性或含量的物质，或权利要求4所述蛋白质或所述生物材料：
D1)调控植物抗旱性；
D2)培育抗旱性增强植物；
D3)调控植物对ABA的敏感性；
D4)培育ABA敏感植物。
9.根据权利要求8所述的产品，其特征在于：所述植物为M1)或M2)或M3)：
M1)单子叶植物或双子叶植物；
M2)禾本科植物；
M3)玉米。
10.权利要求1中所述蛋白质或权利要求1-3中任一所述调控所述蛋白质活性或含量的物质，或权利要求4所述蛋白质或所述生物材料。
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