CN117256739B - 一种耐高温耐酸的胰酶微丸及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种耐高温耐酸的胰酶微丸，包括丸芯和包衣层；其中，所述丸芯包括胰酶和粘合剂；所述包衣层由内向外分别是基础包衣层、耐热包衣层和耐酸包衣层。本发明通过采用所述粘合剂，提高了微丸的成形性与稳定性，粘合后易于后续制粒与干燥，且不易受潮，制成的微丸不易松散；采取了三级包衣处理，分别是基础包衣层、耐热包衣层、耐酸包衣层，除可提高饲用酶的耐温性及耐酸性外，还具有改善流动性，有利于混合均匀，为胰酶在大口黑鲈饲料中的应用奠定了基础。

Description

一种耐高温耐酸的胰酶微丸及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及制剂技术领域，具体涉及一种耐高温耐酸的胰酶微丸及其制备方法与应用。
背景技术
胰酶为胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶组成的复合酶制剂，目前将胰酶制剂添加到水产饲料中研究及商业化应用较少，主要是因为胰酶制剂在饲料制粒过程中存在耐温性不高和动物消化过程中容易被胃酸破坏等缺点。
目前解决耐温性问题主要有两种方法，一种就是后喷涂，但后喷涂由于技术上实现的难度、对技术人员的要求高、保存期酶活力的保持、设备上的投入巨大等因素，目前只在少量的大型饲料加工厂得以少量应用，推广难度大，尤其在实验室条件下或是加工量少的情况下很难做到；关于不耐酸的问题，一般胰酶总体上呈中性偏碱性，而大口黑鲈作为一种有胃鱼，如果不做保护措施，可能胰酶活性在胃中就已经被胃中酸性环境破坏，从而无法顺利到达小肠，发挥作用，如果采用真空后喷涂工艺将酶制剂喷涂到饲料颗粒表面，即使不考虑后喷涂实际影响因素的存在，也会因为酶的最适中性至碱性pH条件和胃的酸性pH环境不一致，导致酶制剂无法顺利到达小肠，从而发挥作用，所以胰酶制剂暂时没有在大口黑鲈上的成功应用。
此外，从性质上讲胰酶属于蛋白酶、碳水化合物酶类、脂肪酶类组成的混合酶，区别于目前研究较多的在饲料中添加的植酸酶、木聚糖酶、纤维素酶、甘露聚糖酶等，胰酶在物理性质上吸湿性更强、可塑性更差；因此优选粘合后不易受潮、颗粒可塑性强且不宜松散；同时，组成上绿色、经济、无污染，工艺上简单、易于大生产实际操作的粘合剂就成为能否将胰酶成功进行微丸包被的关键第一步。
但是目前常规的粘合剂一是大部分在第2-3d时，颗粒已经严重吸潮、粘成团状，无法进行后续制备，即使在多种粘合剂复配使用时，也未显现出明显优越性；二是操作过程中发现常规粘合剂工艺实现上存在较大困难，对操作人员要求较高，原因是胰酶相较于常规的酶制剂，其吸湿性更强、可塑性更差；三是如聚维酮、丙烯酸树脂等部分传统粘合剂单价较高，如果将上述单价较高粘合剂应用到水产饲料生产上，无疑是进一步增加了饲料成本，同时，这些物质本身上讲属于化学物质，作为生产助剂加到水产饲料中，进一步再被水产动物摄食，是否会对水产动物带来影响也成为不容忽视，尤其是类似大口黑鲈等对外部环境应激比较敏感的动物。
因此，提供一种耐高温耐酸的胰酶微丸及其制备方法与应用是本领域技术人员需解决的问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明目的在于提出一种耐高温耐酸的胰酶微丸及其制备方法与应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种耐高温耐酸的胰酶微丸，包括丸芯和包衣层；其中，所述丸芯包括胰酶和粘合剂；所述包衣层由内向外分别是基础包衣层、耐热包衣层和耐酸包衣层。
本发明创造性采取了三级包衣处理，分别是基础包衣层、耐热包衣层、耐酸包衣层，基础包衣层保护丸芯不受光照、氧气和湿气等外部因素影响，增强丸芯的稳定性，且经耐热包衣层和耐酸包衣层包衣处理后，微丸耐热及耐酸性能更佳。
同时，本发明制备的胰酶微丸储藏性能较好，在12个月储藏期内，酶活呈缓慢下降趋势，储藏至第12个月，低温储藏(4℃)条件下最低活性存留率(胰蛋白酶)仍能达到92.4％，室温贮藏(25℃)条件下最低活性存留率(胰蛋白酶)仍能达到88.8％。
优选的，所述基础包衣层包括氢化植物油、聚维酮、氯化钙和滑石粉；所述耐热包衣层包括十六醇、葡萄糖酸钠、氢氧化钙和变性淀粉；所述耐酸包衣层包括海藻酸钠、浒苔多糖、当归乙醇提取物和变性淀粉；所述基础包衣层、所述耐热包衣层和所述耐酸包衣层的质量比为：1-2:1-2:1-2；所述包衣层质量为所述丸芯质量的5-20％，优选为12％。
优选的，所述氢化植物油、所述聚维酮、所述氯化钙和所述滑石粉的质量比为：1-3：2-4：0.5-1.5：2-4；将混合好的包衣材料按照5-10％重量比溶解于纯水中，形成基础包衣液。
所述十六醇、所述葡萄糖酸钠、所述氢氧化钙和所述变性淀粉的质量比为：2-5：1.5-3：2-4：3-6；将混合好的包衣材料按照3-9％重量比溶解于纯水中，形成耐热包衣液。
所述海藻酸钠、所述浒苔多糖、所述当归乙醇提取物和所述变性淀粉的质量比为：3-6：0.5-2：0.8-2.4：3-6；将混合好的包衣材料按照4-8％重量比溶解于纯水中，形成耐酸包衣液。
优选的，所述粘合剂包括白藜芦醇、菊粉和木薯淀粉；其中，所述粘合剂中白藜芦醇、菊粉和木薯淀粉的质量比为1-2:1-2:2-4。
本发明粘合剂由白藜芦醇、菊粉、木薯淀粉组成(其中木薯淀粉用作粘合助剂)，通过试验表明，采用本发明粘合剂，提高了微丸的成形性与稳定性，粘合后易于后续制粒与干燥，且不易受潮，制成的微丸不易松散。同时，本发明的粘合剂所采用的白藜芦醇及菊粉本身均是优质的水产动物益生元，白藜芦醇或菊粉被水产动物摄食后对于改善水产动物肠道健康、促进水产动物消化吸收显示出优越性。
优选的，所述粘合剂添加量为所述胰酶质量的20-40％。
上述所述的一种耐高温耐酸的胰酶微丸的制备方法，包括以下步骤：
(1)按重量比称取丸芯和包衣层的原材料；
(2)将胰酶和粘合剂混合均匀后制粒，备用；
(3)将基础包衣层、耐热包衣层和耐酸包衣层的原材料分别制成基础包衣液、耐热包衣液和耐酸包衣液，依次均匀喷涂在所述步骤(2)得到的微粒中，干燥即得一种耐高温耐酸的胰酶微丸。
优选的，步骤(2)中所述制粒的步骤为：将所述胰酶和所述粘合剂混合均匀后加入水进行湿混，将混合均匀的软材制成30-80目的微粒，低温烘干即可。
优选的，所述水的添加量为4-7％；所述低温烘干为在20-30℃干燥30-60min。
优选的，步骤(3)中所述干燥为在30-50℃干燥3-8h。
如上述所述耐高温耐酸的胰酶微丸在大口黑鲈饲料中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明公开提供了一种耐高温耐酸的胰酶微丸，通过对胰酶制剂进行耐高温和耐酸的微丸包被，除可提高饲用酶的耐温性及耐酸性外，还具有改善流动性，有利于混合均匀；防止产生尘埃，利于环保；同时通过制粒增大了密度和比重，可防止在混合过程中被系统的负压气流带，防止粘壁或凝聚成块，改进溶解度，提高产品价值。
附图说明
图1为本发明应用例中A组添加胰酶对大口黑鲈肠道组织形态图；
图2为本发明应用例中B组添加胰酶对大口黑鲈肠道组织形态图；
图3为本发明应用例中C组添加胰酶对大口黑鲈肠道组织形态图；
图4为本发明应用例中D组添加胰酶对大口黑鲈肠道组织形态图；
图5为本发明应用例中E组添加胰酶对大口黑鲈肠道组织形态图；
图6为本发明应用例中F组添加胰酶对大口黑鲈肠道组织形态图。
具体实施方式
下面描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不理解为对本发明的限制。
试验用胰酶：由上海欧耐施生物技术有限公司提供，其有效成分标示值：胰蛋白酶500U/g；胰淀粉酶500U/g；胰脂肪酶1000U/g，有效成分实测值：胰蛋白酶552U/g；胰淀粉酶2995U/g；胰脂肪酶4198U/g。
实施例1
一种耐高温耐酸的胰酶微丸的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)称取原材料：基础包衣层：氢化植物油、聚维酮、氯化钙和滑石粉的质量比为1：2：0.5：2；耐热包衣层：十六醇、葡萄糖酸钠、氢氧化钙和变性淀粉的质量比为2：1.5：2：3；耐酸包衣层：海藻酸钠、浒苔多糖、当归乙醇提取物和变性淀粉的质量比为3：0.5：0.8：3；基础包衣层、耐热包衣层和耐酸包衣层的质量比为1:1:1；包衣层重量为丸芯重量的12％；
粘合剂添加量为胰酶质量的20％，粘合剂包括质量比为1:1:2的白藜芦醇、菊粉及木薯淀粉；
(2)制备包衣液：将基础包衣层原材料混合好后按照7％重量比溶解于纯水中，形成基础包衣液；将耐热包衣层原材料混合好后按照6％重量比溶解于纯水中，形成耐热包衣液；将耐酸包衣层原材料混合好后按照6％重量比溶解于纯水中，形成耐酸包衣液；
(3)将胰酶制剂与粘合剂进行干混，干混时间为5min；然后加入4％水进行湿混，湿混时间为10min，将混合均匀的软材经挤出机挤成直径相等的条状，条状物料在滚圆机旋转的摩擦盘中修整成大小规一、圆球度好的微粒，微粒大小为30-80目；将微粒在20-30℃进行低温烘干30min处理，烘干至微粒表面干燥即可；
(4)将微粒置于包衣锅内，依次均匀喷射已制备好的基础包衣液、耐热包衣液和耐酸包衣液进行包衣，制成包衣微丸，将包衣后的饲用酶微丸置于30-50℃的干燥箱或流化床内干燥5h，即得一种耐高温耐酸的胰酶微丸。
将实施例1制备的胰酶微丸进行耐热和耐酸试验，具体方法及结果如下：
耐热试验：试验比较了微丸包被处理组(实施例1)和不处理组的，微丸包被中又进一步设计了不同的饲料调质温度(根据饲料工艺的可实现性，设置了80℃、90℃、100℃三个调质温度)，其他参数设定调质时间60秒、调质水分16％，酶活检测按照南京建成生物工程研究所的试剂盒说明书进行测定。检测结果见表1，结果表明未经微丸包被处理的，在三个调制温度下试验胰酶(胰蛋白酶；胰淀粉酶；胰脂肪酶)已全部失活，而经微丸包被处理的，在实际生产中常用的80℃调质温度下，三种酶最低存留率达到了96.5％，在100℃调质温度下，最低活性存留率仍能达到85.7％。
表1胰酶微丸耐温试验
耐酸试验：将微丸包被处理后的试验胰酶分别置于pH值为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的加入一定底物的缓冲液中，37℃恒温水浴2h后，检测酶活，酶活检测按照南京建成生物工程研究所的试剂盒说明书进行测定。检测结果见表2，结果显示本发明制备的微丸包被后的胰酶颗粒耐酸性能显著，如在强酸性环境下(pH为2.0-4.0)，未经微丸包被处理的三种酶均已失活，验证了本试验三种酶均不耐酸，而本发明的微丸包被的胰酶耐酸性较强，其中胰蛋白酶活性存留率(％)达到71.6-82.6，胰淀粉酶达到96.9-98.7，胰脂肪酶达到89.2-90.5；在弱酸至中性环境下(pH为5.0-7.0)，未经微丸包被处理的三种酶活性存留率(％)较低，其中胰蛋白酶活性存留率(％)为9.78-54.3，胰淀粉酶达到42.9-70.1，胰脂肪酶达到51.1-94.1；对应的本发明的微丸包被的胰酶，胰蛋白酶活性存留率(％)为90.2-92.9，胰淀粉酶达到99.3-100，胰脂肪酶达到94.1-97.7；在弱碱至强碱性环境下(pH为8.0-10.0)，未经微丸包被处理的三种酶活性存留率(％)较低，其中胰蛋白酶活性存留率(％)为53.4-90.6，胰淀粉酶达到36.8-60.1，胰脂肪酶达到47.7-94.2，对应的本发明的微丸包被的胰酶，胰蛋白酶活性存留率(％)为94.4-99.8，胰淀粉酶达到96.7-99.2，胰脂肪酶达到98.2-99.1。
表2胰酶微丸耐酸试验
储藏试验：将实施例1制备产品和对照组在4℃及25℃两个温度条件下储存，考察胰酶微丸在储藏期内的活性，每隔3个月检测一次，酶活检测按照南京建成生物工程研究所的试剂盒说明书进行测定。结果见表3，根据结果可知，本发明制备的微丸包被后的胰酶颗粒储藏性能较好，在12个月储藏期内，酶活呈缓慢下降趋势，储藏至第12个月，低温储藏(4℃)条件下最低活性存留率(胰蛋白酶)仍能达到92.4％，室温贮藏(25℃)条件下最低活性存留率(胰蛋白酶)仍能达到88.8％。
表3胰酶微丸储藏试验
粘合剂摸索试验：试验了6种常规的粘合剂对本试验胰酶的粘合效果，试验选取的6种常规(常用)粘合剂为乙基纤维素、聚维酮、丙烯酸树脂、羟丙甲纤维素、硫代乙醇酸辛酯、聚氨酯(分别为A、B、C、D、E、F)，完整试验了不同配方常规粘合剂对本发明中胰酶制剂的粘合效果(一般试验中会选择10％-20％的添加比例，因此摸索试验时选择了15％的添加比例进行试验)，酶活检测按照南京建成生物工程研究所的试剂盒说明书进行测定。相关结果见表4，由表可知，采用的常规粘合剂，大部分在第2-3d时，颗粒已经严重吸潮、粘成团状，无法进行后续试验，即使在多种粘合剂复配使用时，也未显现出明显优越性。
试验摸索了不同配比以及粘合剂在本发明试验胰酶中的不同添加比例对本发明胰酶制剂的粘合效果，酶活检测按照南京建成生物工程研究所的试剂盒说明书进行测定。相关结果见表5(表中G、H、I分别指代白藜芦醇、菊粉和木薯淀粉)，由表可知，采用本发明粘合剂，提高了微丸的成形性与稳定性，粘合后易于后续制粒与干燥，且不易受潮，制成的微丸不易松散，与表4不同配方不同配比常规粘合剂相比，优越性明显，由于白藜芦醇和菊粉还未有用作粘合剂的报道，因此，本发明的粘合剂属于创造性开发。试验同步摸索了最佳粘合剂复配比例及在胰酶制剂中添加比例，结果显示在白藜芦醇、菊粉与木薯淀粉质量比为1-2：1-2：2-4，且粘合剂在胰酶中添加比例为20％～40％时，粘合性能最佳。
表4常规粘合剂粘合性能试验数据
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注：A、B、C、D、E、F分别指代乙基纤维素、聚维酮、丙烯酸树脂、羟丙甲纤维素、硫代乙醇酸辛酯、聚氨酯。
表5本发明粘合剂粘合性能试验数据
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注：G、H、I分别指代白藜芦醇、菊粉及木薯淀粉。
应用例胰酶添加后对大口黑鲈养殖的影响
胰酶及基础饲料来源
试验用大口黑鲈幼鱼：由江苏省镇江市欣润农业发展有限公司提供。
试验用胰酶微丸：实施例1制备。
试验用大口黑鲈基础饲料：由南京市澳华生物科技有限公司提供。
试验用基础饲料原料：由南京市澳华生物科技有限公司提供，基础饲料原料组成及营养水平见表6。
试验用成品饲料制备：按表6配方搭配好原料后，按比例分别添加胰酶微丸(具体比例见表7试验设计)。
表6基础饲料组成及营养水平(风干基础)
1)预混料为每千克饲料提供：VA20mg，VB110mg，VB215mg，VB615mg，VB128mg，VE400mg，VK320mg，VD310mg，烟酸胺100mg，VC酯1000mg，肌醇200mg，泛酸钙40mg，生物素2mg，叶酸10mg，玉米蛋白粉150mg，硫酸铜CuS04·5H2010mg，硫酸亚铁FeS04·H2O 300mg，硫酸锌ZnSO4·H2O220mg，硫酸锰MnS04·H2O25mg，碘酸钾KIO33mg，亚硒酸钠Na2Se035 mg，氯化钴COCl2·6H2O 5mg，沸石粉332mg，硫酸镁MgSO42000mg.
2)营养水平为测定值。
试验鱼与试验设计：试验用大口黑鲈幼鱼购自江苏省镇江市欣润农业发展有限公司，运至江苏省淡水水产研究所禄口基地后，先在暂养池(2*3*1m)暂养三天，观察大口黑鲈幼鱼适应情况，暂养期间不投喂；暂养结束后，选取665尾生长性能良好、健康且规格整齐(初始体重为8±0.5g)的大口黑鲈幼鱼随机分到19个标准养殖池中(2*3*1m)，开展为期10周的养殖试验，试验分成一个对照组，6个处理组，每个处理组3个重复，每个重复35尾；对照组命名为A，6个处理组依次命名为B、C、D、E、F、G；具体试验设计见表7。
表7试验设计
项目 添加水平
A组 基础日粮
B组 基础日粮+胰酶微丸250mg/kg
C组 基础日粮+胰酶微丸500mg/kg
D组 基础日粮+胰酶微丸750mg/kg
E组 基础日粮+胰酶微丸1000mg/kg
F组 基础日粮+胰酶微丸1250mg/kg
饲养管理：试验在江苏省淡水水产研究所禄口基地室外循环水养殖系统中进行，水源为池塘水，养殖池内配有增氧阀与循环水设备，用2％食盐水消毒后使用；初始投喂饲料量为初始体重的3％，每1周称1次体质量以调整投喂量，根据鱼体生长情况调整投喂饲料规格；养殖期间，水温控制在22-30℃，溶解氧含量保持在5mg/L以上，氨氮为0.627mg/L，光照为自然光源。
样品采集：10w实验结束后，每个组随机取10尾生长性能良好、健康的鱼，逐一称重并测量体长，解剖后分别测量内脏重、肝脏重、脾脏重，用于计算形体指标；用80mg/L三氯叔丁醇将鱼麻醉后，使用2ml无菌注射器(预先用肝素钠溶液湿润)，采集大口黑鲈尾静脉血，注入涂有肝素钠的1.5ml EP管中，4℃冰箱静置，在4℃、4000rpm条件下离心10min，取上层血浆备用，液氮速冻后，置于-80℃冻存，用于测定血清生化指标；每个重复组随机选取3尾鱼的中肠，4％多聚甲醛固定，用于肠道组织学观察；
指标测定
常规营养成分：分别采用105℃常压干燥法(GB/T 6435—2006)、凯氏定氮法(GB/T6432—1994)、酸水解粗脂肪法(GB/T64332006)、550℃灼烧法(GB/T6438—2007)测定饲料的水分、粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分含量；总能的检测方法参照ISO9831：1998，采用氧弹仪测定；
生长指标与形体指标：生长及形体指标根据实验测定的数据计算大口黑鲈幼鱼的增重率、饲料系数、特定生长率、存活率、肥满度、脏体指数、肝体指数、脾体指数。
生长指标：
(1)终末均重(FBW)；
(2)增重率(WGR)＝100％×(Wf-Wi)/Wi；
(3)饲料系数(FCR)＝It/(Wf+Wd-Wi)；
(4)特定生长率(SGR)＝100％×(lnWf-lnWi)/t；
(5)存活率(SR)＝100％×Nf/Ni.
形体指标：
(1)肥满度(CF)＝W/L3×100％；
(2)脏体指数(VSI)＝100％×Wv/W；
(3)肝体指数(HSI)＝100％×Wh/W；
(4)脾体指数(SSI)＝100％×Ws/W.
式中，Wf为末体质量(g)；Wi为初体质量(g)；It为总摄食饲料干重(g)；t为实验天数(d)；Wd为死亡总重(g)；W0为实验初鱼总重(g)；Wt为实验终末鱼总重(g)；Nf为实验初始鱼尾数；Ni为实验终末鱼尾数；W为鱼体体质量(g)；L为鱼体体长(cm)；Wv为鱼体内脏质量(g)；Wh为鱼体肝脏质量(g)；Ws为鱼体脾脏质量(g)；
血浆和肝脏组织匀浆生理生化指标：血浆中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、总蛋白(TP)、葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)、白蛋白(ALB)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)含量以及肝脏总蛋白(TP)、葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)含量使用日本东芝全自动生化分析仪进行测定；肝脏超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽-S转移酶(GSH-ST)活性等指标均按照南京建成生物工程研究所的试剂盒说明书进行测定；
肠道组织形态观察：肠道标本用4％多聚甲醛固定，石蜡切片脱蜡至水，进行苏木精-伊红(HE)染色，脱水后中性树胶封片。采用正置光学显微镜(Nikon Eclipse E100，NIKON DS-U3，日本)进行图像采集，所观察切片先于低倍镜下观察，选择合适区域在高倍镜下采集图片，用image-pro plus软件对绒毛高度、宽度、数量及肌层厚度等数据进行测定；
计算和统计分析：采用Excel2010进行试验数据处理，SPSS(26.0)软件进行数据分析；统计分析采用one-way ANOVA进行方差齐性检验，LSD检验多重比较；以P＜0.05表示差异显著，若检测到显著差异(P＜0.05)，则进行Duncan's后期检验以确定处理之间的显著差异；所有数据均以均值±均值标准误(mean±SEM)表示；
结果：饲料中添加胰酶对大口黑鲈的生长性能的影响：经过70d的养殖实验，饲料中添加不同浓度的胰酶对大口黑鲈生长性能的影响见表8，与对照组相比，总体上，胰酶添加后大口黑鲈的终末均重、增重率、特定生长率显著升高(P＜0.05)，饵料系数显著降低(P＜0.05)。各组存活率无明显差异。其中尤其以D组最为显著，即“基础日粮+胰酶750mg/kg”组，相较于对照组，该组终末均重、增重率、特定生长率分别提高13.89％、16.68％及3.29，饵料系数降低13.54％。
表8饲料中添加胰酶对大口黑鲈生长性能的影响
饲料中添加胰酶对大口黑鲈血清生化指标的影响，如表9所示，大口黑鲈血清中AST和ALT活性随着胰酶添加量的增加，呈先下降后上升的趋势；B、D、E、F组AST活性显著低于对照组(P＜0.05)，F组达到最小值；C组血清ALT活性低于其他处理组，但差异不显著(P＞0.05)；与对照组相比，血清ALB含量有所升高，但差异不显著(P＞0.05)，D组达到最大值；血清GLU，对照组与实验组无无显著差异(P＞0.05)；血清TG，C、D组与对照组相比显著降低(P＜0.05)；血清中ALB含量随着胰酶添加量的增加，呈先下降后上升的趋势；E组ALB含量达到最大值，且显著高于对照组(P＜0.05)。C组HDL-C与LDL-C含量显著高于对照组(P＜0.05)。
表9饲料中添加胰酶对大口黑鲈血清生化指标的影响
饲料中添加胰酶对大口黑鲈肠道组织形态的影响：如表10所示，添加胰酶对大口黑鲈肠道绒毛高度无显著影响(P＞0.05)，但随胰酶添加水平上升绒毛宽度、数量和肌层高度呈上升趋势，如图1-6为A-F组的添加胰酶对大口黑鲈肠道组织形态图，其中图左为放大100倍，图右为方法200倍；C-F组相较于对照组均有显著升高(P＜0.05)，肠道绒毛数量和肌层厚度，C-F组相较于对照组均有改善，但差异不显著(P＞0.05)。
表10饲料中添加胰酶对大口黑鲈肠道组织形态的影响
由上可知，随着胰酶添加剂量的增大，大口黑鲈的增重也逐渐提高，呈现剂量效应；但当胰酶浓度过量时，反而会抑制大口黑鲈生长，可能是因为，过量的胰酶堆积，增加了胰酶作用场所-小肠的负担；本试验条件下，添加不同浓度水平胰酶的日粮对大口黑鲈肥满度有所提高(P＜0.05)，试验结果显示，相比于其他组，添加500、750mg/kg胰酶微丸后，大口黑鲈脏体指数、肝体指数与脾脏指数均有改善，但差异不显著(P＞0.05)，这表明本发明的胰酶微丸可以一定程度上缓解大口黑鲈高淀粉饲料导致的肝脏肿大的难题。
血清生化指标通常反映动物的新陈代谢状况、健康程度及其对营养与环境因素的适应状况。在正常代谢过程中，动物血清中的转氨酶活性保持在一定的范围内，血清转氨酶活性升高与细胞坏死程度相关。.血清中的转氨酶活性升高表明肝细胞(主要是肝细胞和肝实质细胞)受损，从而使转氨酶释放到血液中，AST和ALT活性高低可以反映出动物对蛋白质合成和分解的能力，同时AST和ALT是反映动物肝脏运作状态的重要代谢酶，其活性较高时可作为衡量肝脏的损伤与否及损伤程度的指标。因此，AST和ALT水平在鱼类中常用于肝脏损伤检测。本研究结果表明，血清中AST和ALT活性随着胰酶微丸添加量的增加，呈先下降后上升的趋势。F组血清AST活性达到最小值，且显著低于其他组(P＜0.05)；说明添加胰酶可以缓解肝损伤问题，但饲料胰酶不足或过量可能会导致反作用。高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)与低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)主要在肝脏合成，是一种抗动脉粥样硬化的脂蛋白，可将胆固醇从肝外组织转运到肝脏进行代谢，由胆汁排出体外，其血清含量的高低可评价肝脏损伤程度。本试验条件下，添加一定水平胰酶后，C组血清HDL-C与LDL-C含量显著高于对照组(P＜0.05)。E组血清LDL-C含量达到最高，显著高于对照组及BD组(P＜0.05)，与其余组无显著差异(P＞0.05)，表明饲料中添加添加胰酶可显著缓解大口黑鲈胆固醇堆积问题。本研究说明添加胰酶对大口黑鲈肝功能有一定保护作用。
肠道是鱼类营养物质的消化和吸收场所，也是饲料中抗营养因子及有毒有害物质进入鱼体的第1道屏障，肠道肌层厚度、绒毛数量和高度可影响肠道屏障，从而导致整个鱼体各项机能及健康受到影响。研究发现，肠道绒毛高度的增加可以增加消化酶与营养物质的接触面积，增强鲑鱼对营养物质的吸收和利用。目前为止，胰酶对大口黑鲈肠道健康方面的影响研究较少。本实验中，绒毛高度不受日粮胰酶水平的影响(P＞0.05)。试验结果显示，饲料中添加胰酶大口黑鲈肠道绒毛宽度、数量和肌层厚度均高于对照组，表明肠道完整性和稳固性得到增强。研究认为，大口黑鲈前肠皱襞密集而细长，中性黏液细胞多，是大口黑鲈营养物质消化吸收的主要场所，肌肉层厚度下降会影响前肠蠕动的能力，对前肠物理性消化功能会产生不良影响，但绒毛面积增加而引起的吸收功能的提高，弥补了物理消化减弱这个缺陷，这也是添加500mg/kg和750mg/kg胰酶组生长性能优于对照组的一个极为重要的原因。本试验中，推测胰酶对肠道形态的影响可能是外源酶的添加以及内源酶含量以及活性的上升协同作用下，使得肠段中营养物质的消化更加彻底，可能是由于底物效应促使肠道表面积增加以容纳更多的刷状缘膜酶和转运载体。
综上，本发明制备的胰酶微丸在一定浓度下是可以促进大口黑鲈生长性能的，且饲粮中添加胰酶对大口黑鲈生长性能、抗氧化能力和肠道形态均有显著的改善作用，且呈现胰酶剂量效应，同时，建议大口黑鲈饲粮中胰酶适宜添加量为：627mg/kg。

Claims (6)

1.一种耐高温耐酸的胰酶微丸，其特征在于，包括丸芯和包衣层；
其中，所述丸芯包括胰酶和粘合剂；
所述包衣层由内向外分别是基础包衣层、耐热包衣层和耐酸包衣层；
所述基础包衣层为氢化植物油、聚维酮、氯化钙和滑石粉，所述氢化植物油、所述聚维酮、所述氯化钙和所述滑石粉的质量比为1-3：2-4：0.5-1.5：2-4；
所述耐热包衣层为十六醇、葡萄糖酸钠、氢氧化钙和变性淀粉，所述十六醇、所述葡萄糖酸钠、所述氢氧化钙和所述变性淀粉的质量比为2-5：1.5-3：2-4：3-6；
所述耐酸包衣层为海藻酸钠、浒苔多糖、当归乙醇提取物和变性淀粉，所述海藻酸钠、所述浒苔多糖、所述当归乙醇提取物和所述变性淀粉的质量比为3-6：0.5-2：0.8-2.4：3-6；
所述基础包衣层、所述耐热包衣层和所述耐酸包衣层的质量比为1-2：1-2：1-2；
所述粘合剂为白藜芦醇、菊粉和木薯淀粉，所述白藜芦醇、所述菊粉和所述木薯淀粉的质量比为1-2:1-2:2-4；所述粘合剂添加量为所述胰酶质量的20-40%；
所述包衣层质量为所述丸芯质量的5-20%。
2.根据权利要求1所述的一种耐高温耐酸的胰酶微丸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）按重量比称取丸芯和包衣层的原材料；
（2）将胰酶和粘合剂混合均匀后制粒，备用；
（3）将基础包衣层、耐热包衣层和耐酸包衣层的原材料分别制成基础包衣液、耐热包衣液和耐酸包衣液，依次均匀喷涂在所述步骤（2）得到的微粒中，干燥即得一种耐高温耐酸的胰酶微丸。
3.根据权利要求2所述一种耐高温耐酸的胰酶微丸的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述制粒的步骤为：
将所述胰酶和所述粘合剂混合均匀后加入水进行湿混，将混合均匀的软材制成30-80目的微粒，低温烘干即可。
4.根据权利要求3所述一种耐高温耐酸的胰酶微丸的制备方法，其特征在于，所述水的添加量为4-7%；所述低温烘干为在20-30℃干燥30-60min。
5.根据权利要求2所述一种耐高温耐酸的胰酶微丸的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述干燥为在30-50℃干燥3-8h。
6.如权利要求1所述耐高温耐酸的胰酶微丸在制备大口黑鲈饲料中的应用。
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