CN117244047A - 异胞嘧啶脱氨酶vcz蛋白的结晶方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了一种土壤宏基因组来源的异胞嘧啶脱氨酶VCZ蛋白的表达纯化、晶体结构及其在肿瘤化疗中的应用。本公开的VCZ蛋白通过X‑射线衍射技术获得与5‑氟尿嘧啶的复合物晶体结构，分辨率可达空间群为P212121。该VCZ蛋白复合物联合5‑氟异胞嘧啶可以做为酶‑前体药物对被设计进入肿瘤细胞进行特异性清除，具有广阔的应用前景。

Description

异胞嘧啶脱氨酶VCZ蛋白的结晶方法及其应用
技术领域
本公开属于生物技术领域，具体涉及一种来源于土壤的异胞嘧啶脱氨酶的表达纯化、结晶方法、晶体结构及其在肿瘤治疗中的应用。
背景技术
基因介导的酶-前药物治疗方法(gene-directed enzyme prodrug therapy,GDEPT)是最成功的药物递送和癌症治疗方法之一。通过转基因方法，设计一种编码特定酶的基因，由含有肿瘤特异性启动子的载体携带，该载体可以在肿瘤细胞中特异性表达。表达的酶会进一步将不具备活性的前体药物分解为细胞毒性药物，抑制肿瘤细胞生长并促进其死亡。
用于GDEPT的理想酶类应该具有高的催化活性和特异性。同时，前药必须是无毒或极低毒的，而分解代谢物对肿瘤细胞应该是剧毒的，并且半衰期长以及高“旁观者效应”。目前，一些酶-前药对已在结直肠癌、胆管癌、乳腺癌等患者的临床试验中被报道。例如：来自单纯疱疹病毒(HSV)的胸苷激酶(TK)可以催化更昔洛韦(GCV)生成GCV-单磷酸，而GCV-单磷酸可以被宿主的激酶进一步催化生成GCV-三磷酸作为dGTP的类似物，从而抑制DNA复制，促进细胞死亡。在癌症治疗中广泛使用的化疗试剂5-氟尿嘧啶(5-FU)也可以由低毒的前药5-氟胞嘧啶(5-FC)通过胞嘧啶脱氨酶(CD)蛋白产生。肿瘤细胞中的5-FU可被催化为5-氟脱氧尿嘧啶-5’-单磷酸(5-FUDMP)、5-氟脱氧尿嘧啶5’-三磷酸(5-FDUTP)和5-氟尿嘧啶5’-三磷酸(5-FUTP)，这些嘧啶类抗代谢产物会抑制胸腺嘧啶合成酶和/或错结合到RNA和DNA中，从而导致肿瘤细胞死亡。然而，肠道菌群胞嘧啶脱氨酶也能催化5-FC生成不需要的5-FU，从而对机体产生有害影响。
异胞嘧啶(isocytosine，又名2-aminouracil)作为胞嘧啶的异构体，是一种非天然核苷，通常用于研究不同核碱基之间氢键的形成。基于宏基因组库技术的研究发现了三种潜在的异胞嘧啶脱氨酶，可以特异性地将异胞嘧啶转化为尿嘧啶，包括VCZ、URA3、URA4。实验表明，URA3和VCZ能够将异胞嘧啶转化为尿嘧啶，而不能将胞嘧啶转化为尿嘧啶，并能将5-氟异胞嘧啶(5-FIC)转化为5-FU，这表明VCZ/5-FIC有潜力成为一种新的癌症治疗酶/前药系统。
发明内容
本公开的目的在于提供一种土壤来源的异胞嘧啶脱氨酶的表达纯化、晶体结构及其应用。
本公开通过对来源于土壤宏基因组筛选的Obesumbacterium proteus菌种中的异胞嘧啶脱氨酶VCZ(Uniprot ID:A0A4Q9D6T1)蛋白进行基因工程改造，以获得在大肠杆菌中的高效表达、纯化和结晶方法，以及所述异胞嘧啶脱氨酶VCZ蛋白的第1位到第455位氨基酸的三维晶体结构。本公开还涉及所述异胞嘧啶脱氨酶VCZ蛋白的三维晶体结构与催化产物5-氟尿嘧啶(5-FU)的复合物结构及应用。
在第一方面，本公开提供了一种结晶的异胞嘧啶脱氨酶VCZ蛋白复合物，所述复合物包括：异胞嘧啶脱氨酶VCZ蛋白；和5-氟尿嘧啶。
在一些实施方式中，所述异胞嘧啶脱氨酶VCZ蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的氨基酸序列。
本公开针对VCZ蛋白进行X-射线衍射，得到晶体的衍射数据，以来源于Pseudomonas aeruginosa的Pa0142蛋白作为模型进行结构解析，最终得到异胞嘧啶脱氨酶VCZ与5-氟尿嘧啶底物的复合物三维晶体结构，该结构描述了VCZ蛋白的二级结构组成、肽链走向、组织模式以及三维分子构造。
在一些实施方式中，所述复合物具有表1中所列的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的原子坐标。
在一些实施方式中，所述复合物中至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％氨基酸的主链碳骨架的原子结构坐标与表1中所列的坐标的平均跟方差≤至少在一些实施方式中，所述复合物具有表1中列出的原子坐标(x,y,z)±(1.0,1.0,1.0)确定的三维结构。
在一些实施方式中，所述复合物的分辨率为在一些实施方式中，所述复合物的晶体结构具有空间群P212121。在一些实施方式中，所述复合物的晶胞参数为：α＝90°，β＝90°，γ＝90°。
在一些实施方式中，所述复合物的一个晶体学不对称单位中含有2个VCZ蛋白分子，构成同源二聚体，以及2个5-氟尿嘧啶分子。
在一些实施方式中，所述2个5-氟尿嘧啶分子分别位于所述2个VCZ蛋白分子的活性中心。
在一些实施方式中，每个VCZ蛋白分子的二级结构包括17个α螺旋和17个β折叠，其中，β1至β6折叠、β15至β17折叠，以及α1螺旋和α16螺旋组成头部结构域，剩余的二级结构元件组成催化核心结构域。
在一些具体实施方式中，每个VCZ蛋白分子具有如下的二级结构：β折叠1，即Thr5-Lys9的氨基酸片段；β折叠2，即Leu13-Val15的氨基酸片段；β折叠3，即Glu23-Glu32的氨基酸片段；β折叠4，即Arg35-Gly40的氨基酸片段；α螺旋1，即Asp42-Ala46的氨基酸片段；β折叠5，即Glu51-Asp54的氨基酸片段；β折叠6，即His58-Pro62的氨基酸片段；β折叠7，即Leu64-Asn66的氨基酸片段；α螺旋2，即His70-Leu75的氨基酸片段；α螺旋3，即Pro80-Ala82的氨基酸片段；α螺旋4，即Leu87-Trp98的氨基酸片段；α螺旋5，即Pro103-Leu119的氨基酸片段；β折叠8，即Cys121-Leu129的氨基酸片段；α螺旋6，即Leu138-Ile148的氨基酸片段；β折叠9，即Arg151-Ser158的氨基酸片段；α螺旋7，即Glu177-Tyr191的氨基酸片段；β折叠10，即Leu200-Pro206的氨基酸片段；α螺旋8，即Arg214-Gln227的氨基酸片段；β折叠11，即Ser230-Leu235的氨基酸片段；α螺旋9，即Asp239-Phe249的氨基酸片段；α螺旋10，即Pro253-Asp259的氨基酸片段；β折叠12，即Val267-His271的氨基酸片段；α螺旋11，即Arg279-Thr286的氨基酸片段；β折叠13，即Gly289-His292的氨基酸片段；α螺旋12，即Pro294-Arg299的氨基酸片段；α螺旋13，即Ile307-Glu313的氨基酸片段；β折叠14，即Ser316-Leu319的氨基酸片段；α螺旋14，即Met332-Phe347的氨基酸片段；α螺旋15，即Ala353-Asn370的氨基酸片段；β折叠15，即Phe385-Asp389的氨基酸片段；α螺旋16，即Pro402-Phe408的氨基酸片段；β折叠16；即Phe416-Ile419的氨基酸片段；β折叠17，即Gln422-Arg426的氨基酸片段；α螺旋17，即Leu435-Val450的氨基酸片段。
在第二方面，本公开提供了一种异胞嘧啶脱氨酶VCZ蛋白的表达和纯化方法，包括如下步骤：
(1)将含有VCZ蛋白的全长基因的重组载体转化至大肠杆菌中，从而表达带有标签的融合蛋白；
(2)将上述获得的融合蛋白通过亲和层析分离目的蛋白，并切掉标签，再通过凝胶过滤层析获得纯化的VCZ蛋白。
在一些实施方式中，将来源于土壤宏基因组筛选的菌株Obesumbacteriumproteus中的异胞嘧啶脱氨酶VCZ蛋白进行了基因工程改造，将其全长基因(SEQ ID NO:2)克隆在pET28a载体上。
在一些实施方式中，选择使用大肠杆菌的原核表达系统(但不排除其他的表达系统，如在其他细菌或者其他的真核生物细胞中进行表达)；对异胞嘧啶脱氨酶VCZ蛋白以融合蛋白的方式进行表达，有限选择了His标签得到了可溶性表达(但不排除其他标签，如MBP或GST等标签也有可溶性表达)。在一些实施方式中，所述标签为His6-Sumo标签，并在后续过程中使用ULP1蛋白酶切掉His6-Sumo标签。
在一些具体实施方式中，所述方法包括：构建融合野生型VCZ全长基因(SEQ IDNO:2)的重组载体，用该载体转化大肠杆菌，从而表达带有标签His6-Sumo的融合蛋白，记为His6-Sumo-VCZ，将上述获得的融合蛋白通过与所述特异标签识别的方法，优选Ni-NTA亲核层析(分离原理为：低咪唑浓度缓冲液进行上样，高咪唑浓度缓冲液进行洗脱)分离目的蛋白，并使用ULP1酶切掉His6-Sumo标签，再通过凝胶过滤层析的方法得到高纯度的VCZ蛋白，所获得的目的蛋白溶液均一性较好。
在一些具体实施方式中，表达质粒为经过改造的融合Sumo标签的pET28a载体，转化菌株为大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)。扩大培养时添加硫酸锌使得其终浓度达到2mM。
在一些具体实施方式中，所述Ni-NTA亲和层析的平衡缓冲液优选为10-20mM TrispH 8.0，400-600mM NaCl和20-30mM咪唑pH 8.0。在一些具体实施方式中，所述Ni-NTA亲和层析的平衡缓冲液优选为10mM Tris pH 8.0，500mM NaCl和25mM咪唑pH8.0。
在一些具体实施方式中，所述Ni-NTA亲和层析的洗脱缓冲液优选为10-20mM TrispH 8.0，400-600mM NaCl和400-600mM咪唑pH 8.0。在一些具体实施方式中，所述Ni-NTA亲和层析的洗脱缓冲液优选为10mM Tris pH8.0，500mM NaCl和500mM咪唑pH8.0。
在第三方面，本公开提供了一种异胞嘧啶脱氨酶VCZ蛋白的结晶方法，包括如下步骤：在含有VCZ蛋白和5-氟尿嘧啶的溶液中使纯化的VCZ蛋白结晶，以获得晶体化的VCZ蛋白。
在一些实施方式中，所述晶体化的VCZ蛋白是复合物，所述复合物包含VCZ蛋白和5-氟尿嘧啶。
在一些实施方式中，所述结晶包括通过悬滴气相扩散法或坐滴气相扩散法进行结晶。
在一些实施方式中，结晶条件包括：0.1-0.3M硫酸锂一水、0.05-0.2M Bis-Tris缓冲液pH 6.5和20-30％w/v聚乙二醇。在一些实施方式中，结晶条件包括：0.2M硫酸锂一水、0.1M Bis-Tris缓冲液pH 6.5和25％w/v聚乙二醇3350。
在一些实施方式中，结晶液滴中蛋白溶液与晶体试剂的体积比为1:2至2:1的范围内。
在一些实施方式中，蛋白溶液中，VCZ蛋白的浓度为5-20mg/mL，5氟-尿嘧啶浓度为2-5mM，优选为4mM。
在一些实施方式中，所述结晶的温度为4-37℃，优选为16-20℃。
在一些具体实施方式中，所述方法包括如下步骤：将纯化的VCZ蛋白浓缩至浓度为5-20mg/mL，优选使用10mg/mL，并按照比例加入5-氟尿嘧啶底物(优选4mM浓度)，使用结晶试剂盒(来自Hampton Research,RIGAKU等公司的Crystal Screen I/II，Index，Wizard I/II,Wizard III/IV等)作为晶体生长的初筛条件，采用悬滴(或坐滴)气相扩散法进行结晶。温度为4-37℃(优选使用18℃)。
在一些具体实施方式中，采用坐滴以及悬滴气相扩散法进行结晶，结晶液滴中蛋白溶液与结晶试剂体积比在2:1至1:2的范围内，优选体积比为1:1，蛋白溶液中蛋白浓度为5-20mg/mL，优选使用10mg/mL，5-氟尿嘧啶底物优选4mM浓度，结晶条件为0.2M硫酸锂一水、0.1M Bis-Tris缓冲液pH 6.5和25％w/v聚乙二醇3350。晶体培养在4至25℃进行。
在一些实施方式中，所述晶体化的VCZ蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述复合物具有表1中所列的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的原子坐标。
在一些实施方式中，所述复合物中至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％氨基酸的主链碳骨架的原子结构坐标与表1中所列的坐标的平均跟方差≤至少在一些实施方式中，所述复合物具有表1中列出的原子坐标(x,y,z)±(1.0,1.0,1.0)确定的三维结构。
在第四方面，本发明提供了根据第三方面所述的方法获得的晶体化的异胞嘧啶脱氨酶VCZ蛋白，具有良好的衍射性能。
在第五方面，本发明提供了根据第一方面所述的异胞嘧啶脱氨酶VCZ蛋白复合物或第三方面所述的结晶方法获得的晶体化的异胞嘧啶脱氨酶VCZ蛋白在筛选、开发和/或制备肿瘤化疗的药物中的应用。
在一些实施方式中，所述药物为5-氟异胞嘧啶前体药物。
在一些实施方式中，所述肿瘤可以为结直肠癌、胆管癌、乳腺癌等。
在一些实施方式中，所述异胞嘧啶脱氨酶VCZ蛋白具有对应于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中第91、168、210和/或326位氨基酸的突变。在一些实施方式中，对应于SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列，所述异胞嘧啶脱氨酶VCZ蛋白具有L91A、L168A、F210A和/或S326A的突变。具有上述突变的异胞嘧啶脱氨酶VCZ蛋白的脱氨酶活性得到提高。
本公开的应用包括但不限于异胞嘧啶脱氨酶VCZ蛋白与5-氟异胞嘧啶的药物对在肿瘤化疗前体药物筛选及新有利蛋白突变体构建等方面的应用，即利用该类异胞嘧啶特异性脱氨酶蛋白结构及其分子内的相互作用作为理论依据，设计新的酶-前体药物对，以此生成5-氟尿嘧啶及其类似物，应用于包括但不限于结直肠癌等肿瘤化疗临床试验中。
附图说明
图1示出了来源于Obesumbacterium proteus中的异胞嘧啶脱氨酶VCZ蛋白的凝胶过滤层析结果。
图2示出了来源于Obesumbacterium proteus中的异胞嘧啶脱氨酶VCZ蛋白的SDS-PAGE检测结果。
图3示出了Obesumbacterium proteus中的异胞嘧啶脱氨酶VCZ蛋白与5-氟尿嘧啶底物复合物的晶体图片。
图4示出了Obesumbacterium proteus中的异胞嘧啶脱氨酶VCZ蛋白与5-氟尿嘧啶底物复合物的同源二聚体结构的三维示意图。
图5示出了Obesumbacterium proteus中的异胞嘧啶脱氨酶VCZ蛋白与5-氟尿嘧啶底物复合物的同源二聚体结构的微观三维示意图。
图6示出了异胞嘧啶脱氨酶VCZ蛋白与5-氟尿嘧啶底物复合物的体外催化活性及体内抗癌能力的验证结果。其中，6A示出了野生型VCZ蛋白是由TLC实验确定的异胞嘧啶特异性脱氨酶，6B示出了野生型和结晶型VCZ蛋白对异胞嘧啶底物催化活性的TLC实验结果，6C示出了野生型和结晶型VCZ蛋白对5-氟异胞嘧啶(5-FIC)底物催化活性的TLC实验结果，6D-6E为野生型VCZ及其11种不同突变体在5-FIC或IC处理的293T细胞系中的表达水平，6F示出了用CCK-8法测定VCZ/5-FIC对在HCT116细胞系中的旁观者效应，6G示出了CCK-8法测定CT26细胞系VCZ/5-FIC对的旁观者效应。数值表示为平均值±SEM，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
具体实施方式
为使本公开的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本公开进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本公开，并不用于构成对本公开的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。这样的结构和技术在许多出版物中也进行了描述。
定义
除非另有定义，否则本公开使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本公开所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。
除非上下文另有明确说明，否则本文所用的表述“一种”和“一个”包括复数指代。例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞及本领域技术人员可知晓的等同物等等。
本文所用的术语“约”表示其后的数值的±20％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±10％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±5％的范围。
相对于参照氨基酸序列具有“百分比(％)序列同一性”指在比对序列和(根据需要)引入缺口以获得最大百分比序列同一性后，候选序列中与参照氨基酸序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，但不考虑任何保守取代为序列同一性的一部分。为了确定氨基酸序列同一性百分比，可以以本领域范围内的各种方式进行比对，例如使用BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在被比较序列全长上实现最大比对所需的任何算法。
本公开提供了一种土壤宏基因组来源的异胞嘧啶脱氨酶的表达纯化、晶体结构及其在肿瘤化疗中的应用。本公开涉及的VCZ蛋白含455个氨基酸(氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)，分子量约为49.5kDa，等电点约为5.83；在表达菌株Escherichia coli BL21(DE3)中具有高度可溶性表达，且纯度及均一性良好。本公开的异胞嘧啶脱氨酶VCZ蛋白通过X-射线衍射技术获得与5-氟尿嘧啶的复合物晶体结构，分辨率可达空间群为P212121。该结构整体上由17个α螺旋和17个β折叠组成。其中由His271、His68、His234、His70、Asp322等氨基酸构成脱氨反应依赖的金属离子结合位点，由Glu237、Tyr130、Trp90、Gln73、Ser326等氨基酸构成了底物识别口袋。上述氨基酸共同组成异胞嘧啶特异性脱氨酶VCZ的活性中心，并可以催化5-氟异胞嘧啶脱氨成临床常用化疗药物5-氟尿嘧啶。该脱氨酶VCZ联合5-氟异胞嘧啶可以做为酶-前体药物对被设计进入肿瘤细胞进行特异性清除，具有广阔的应用前景。
下面提供实施例和附图以帮助理解本公开。但应理解，这些实施例和附图仅用于说明本公开，但不构成任何限制。本公开的实际保护范围在权利要求书中进行阐述。应理解，在不脱离本公开精神的情况下，可以进行任何修改和改变。
实施例1.异胞嘧啶脱氨酶VCZ蛋白的表达与纯化
来源于土壤宏基因组筛选的变形肥杆菌(Obesumbacterium proteus)菌株中的异胞嘧啶脱氨酶VCZ蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，核酸序列如SEQ ID NO:2所示。
通过分子克隆技术将VCZ的全长基因克隆到经过改造的pET28a载体上，用来表达氨基末端融合6个His以及Sumo标签的融合蛋白，将重组载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，37℃振荡培养至OD600约为0.6-1.0(优选0.8)时加入终浓度为0.1-1.0mM(优选0.2mM)的IPTG进行诱导表达，表达条件为：16℃振荡培养20h或20℃振荡培养16h或25℃振荡培养8h，优选18℃250rpm振荡培养14-16小时，随后通过离心收集细菌，用于纯化。扩大培养时添加硫酸锌使得其终浓度达到2mM。
将离心收集的表达菌以适量缓冲液(20mM Tris pH 8.0，500mM NaC1，25mM咪唑)重悬菌体，使用低温超高压细胞破碎仪裂解菌体，以17000rpm高速离心1h去除沉淀和其它颗粒状杂质。将离心后上清液与Ni-NTA亲和介质结合后，用含有20mM Tris pH 8.0、500mMNaC1和25mM咪唑的缓冲液继续冲洗介质100mL，去除杂蛋白。最终用含有20mM Tris pH8.0、500mM NaC1和500mM咪唑的洗脱液将目的蛋白从亲和介质上洗脱下来，通过透析以及添加ULP1蛋白酶将His6-Sumo标签切除，以30KDa分子量截留的浓缩管将洗脱液浓缩。将浓缩后的蛋白溶液进一步用凝胶过滤层析(层析柱优选Superdex 200,16/600，Cytiva公司)的方法纯化，使用的缓冲液为10mM Tris pH 8.0，100mM NaC1。洗脱下来的目的蛋白的凝胶过滤层析的结果如图1所示，SDS-PAGE检测结果如图2所示，结果显示所获得的目的蛋白溶液均一性较好。将洗脱下来的目的蛋白进行浓缩至浓度为优选10mg/mL，于-80℃保存，用于结晶实验。
实施例2.异胞嘧啶脱氨酶VCZ蛋白与5-氟尿嘧啶的结晶
将经由实施例1表达纯化好的异胞嘧啶脱氨酶蛋白VCZ浓缩至10mg/mL，使用结晶试剂盒(来自Hampton research以及Rigaku公司的Index，Crystal screen I/II，WizardI/II,Wizard III/IV等)作为晶体生长的初筛条件与5-氟尿嘧啶孵育，采用悬滴(或坐滴)气相扩散法进行结晶。本实施例在多个不同结晶实际条件下获得了初始晶体，通过后期的优化调整。具体地，结晶液滴中蛋白溶液与结晶试剂体积比在2:1至1:2的范围内，优选体积比为1:1，蛋白溶液中蛋白浓度为5-20mg/mL，优选使用10mg/mL，5-氟尿嘧啶底物优选4mM浓度，结晶条件为0.2M硫酸锂一水、0.1M Bis-Tris缓冲液pH 6.5和25％w/v聚乙二醇3350，晶体培养在4至25℃进行，获得的异胞嘧啶脱氨酶VCZ蛋白与5-氟尿嘧啶复合物的晶体图片如图3所示，并收集到一套分辨率为的X射线衍射数据。
实施例3.异胞嘧啶脱氨酶VCZ的衍射数据收集与结构解析
本实施例将制备的晶体以100％浓度的甘油与生长晶体的条件(0.2M硫酸锂一水、0.1M Bis-Tris缓冲液pH6.5和25％w/v聚乙二醇3350)进行预混，使甘油终浓度达到10-25％(优选20％)处理后，液氮速冻并保存至液氮罐中。晶体X射线衍射数据的收集在上海光源(SSRF)生物大分子晶体学光束线站(包含但不限于BL18U1)进行，数据处理使用包含但不限于HKL3000软件包。结构解析以来源于Pseudomonas aeruginosa的Pa0142(PDB ID：3HPA)蛋白作为模型，采用分子置换方法，利用PHENIX以及coot软件对解析的结构进行相位与坐标的修正，最终得到异胞嘧啶脱氨酶VCZ与产物5-氟尿嘧啶的三维晶体结构，原子坐标如表1所示，晶体参数如表2所示。本领域的普通技术人员可理解的，于其中所述晶体三维结构中的原子具有表1中所列的至少30％的原子坐标，或者3D蛋白的晶体三维结构中至少30％氨基酸的主链碳骨架的原子结构坐标与表1中的坐标的平均根方差小于或等于1.80A的原子坐标，均可被认为与3D蛋白具有雷同结构。
具体而言，所述的异胞嘧啶脱氨酶VCZ的三维晶体结构，一个晶体学不对称单元内含有两个VCZ蛋白分子。每个分子由17个α螺旋以及17个β折叠组成。整体结构可分为由β1至β6折叠，β15至β17，以及两个α螺旋α1及α16组成头部结构域，其他二级结构原件组成催化核心结构域。其中：β折叠1，即Thr5-Lys9的氨基酸片段；β折叠2，即Leu13-Val15的氨基酸片段；β折叠3，即Glu23-Glu32的氨基酸片段；β折叠4，即Arg35-Gly40的氨基酸片段；α螺旋1，即Asp42-Ala46的氨基酸片段；β折叠5，即Glu51-Asp54的氨基酸片段；β折叠6，即His58-Pro62的氨基酸片段；β折叠7，即Leu64-Asn66的氨基酸片段；α螺旋2，即His70-Leu75的氨基酸片段；α螺旋3，即Pro80-Ala82的氨基酸片段；α螺旋4，即Leu87-Trp98的氨基酸片段；α螺旋5，即Pro103-Leu119的氨基酸片段；β折叠8，即Cys121-Leu129的氨基酸片段；α螺旋6，即Leu138-Ile148的氨基酸片段；β折叠9，即Arg151-Ser158的氨基酸片段；α螺旋7，即Glu177-Tyr191的氨基酸片段；β折叠10，即Leu200-Pro206的氨基酸片段；α螺旋8，即Arg214-Gln227的氨基酸片段；β折叠11，即Ser230-Leu235的氨基酸片段；α螺旋9，即Asp239-Phe249的氨基酸片段；α螺旋10，即Pro253-Asp259的氨基酸片段；β折叠12，即Val267-His271的氨基酸片段；α螺旋11，即Arg279-Thr286的氨基酸片段；β折叠13，即Gly289-His292的氨基酸片段；α螺旋12，即Pro294-Arg299的氨基酸片段；α螺旋13，即Ile307-Glu313的氨基酸片段；β折叠14，即Ser316-Leu319的氨基酸片段；α螺旋14，即Met332-Phe347的氨基酸片段；α螺旋15，即Ala353-Asn370的氨基酸片段；β折叠15，即Phe385-Asp389的氨基酸片段；α螺旋16，即Pro402-Phe408的氨基酸片段；β折叠16；即Phe416-Ile419的氨基酸片段；β折叠17，即Gln422-Arg426的氨基酸片段；α螺旋17，即Leu435-Val450的氨基酸片段。其中包含由His271、His68、His234、His70、Asp322等氨基酸构成异胞嘧啶脱氨反应依赖的金属离子结合位点，由Glu237、Tyr130、Trp90、Gln73、Ser326等氨基酸构成了底物结合识别口袋，如图4和图5所示。
表1
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表2
*最高分辨率显示在括号中。
实施例4.脱氨酶测定
使用不同核苷的薄层色谱(TLC)方法对野生型VCZ蛋白或其突变体蛋白进行了脱氨酶测定。
脱氨酶测定方法：
酶促测定在含有10mM Tris-HCl pH 8.0和100mM NaCl的缓冲液中进行。在所有反应中，1μM纯化的重组野生型VCZ蛋白或其突变体蛋白，20mM底物(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶核苷、异胞嘧啶、5-氟异胞嘧啶或胸腺嘧啶)加入总容积为20μL的反应体系。37℃孵育1h。取等量1μl，在涂有硅胶60F254的预饱和(30min)铝板上显影，显影1-1.5h。斑点距板底2cm，间距1.4cm，以甲醇:氯仿(1:9)为溶剂显影。将斑点暴露在254nm紫外光下观察。
TLC实验结果显示，野生型VCZ蛋白对异胞嘧啶IC及其衍生物5-氟异胞嘧啶5-FIC进行了特异性脱氨，而对其他核苷如胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶等没有脱氨(图6A)。由于鸟嘌呤的溶解度较低，很难直接比较VCZ与鸟嘌呤的催化活性(图6A)。此外，脱氨实验结果证实，参与反应的关键残基，如Q73A、E237A、H271A、D322A和D322E突变，显著降低了异胞嘧啶底物的催化活性(图6B)。此外，与异胞嘧啶碱的堆叠相互作用所必需的W90A也表现出对底物的催化能力的明显丧失，而L91A对VCZ的催化能力的影响不太大(图6B)。
与这些显著变化相比，填充底物通道的三个残基F88A、L168A和F210A突变会发生构象变化，但对VCZ对底物的催化活性影响较小，说明这些残基对VCZ的催化能力影响并不严重，可能是提高催化效率所必需的(图6B)。此外，与异胞嘧啶相比，野生型和突变体VCZ蛋白对5-FIC底物的脱氨活性表现出相似的趋势，其中S326A和W90A对5-FIC脱氨活性的影响更为显著(图6C)。综上所述，这些结果表明VCZ酶对5-FIC底物的催化活性略弱于异胞嘧啶底物。
实施例5.VCZ/5-FIC对肿瘤治疗的体内验证
5-FU被广泛用于结直肠癌的一线化疗，从而强调了本公开的临床意义。本实施例中验证了VCZ突变体在体外确定的催化活性与其体内的功能相关联。
细胞和质粒：将人胚胎肾源性细胞系293T、小鼠结肠癌细胞系CT26和人结肠癌细胞系HCT116分别培养于DMEM培养基、高糖(杭州科益生物科技)、10％胎牛血清(FBS)(以色列BI公司)、100U/ml青霉素和链霉素中，在95％空气和5％ CO2组成的环境中，37℃加湿培养箱中培养。将野生型VCZ及其突变体的编码基因克隆到带C端标记的哺乳动物表达载体pLV中。
细胞转染：采用Hieff TransTM脂质体转染试剂(Yeason)，将野生型VCZ及其突变体0.1μg质粒导入96孔细胞培养皿中培养的HCT116细胞中进行瞬时转染。转染后，细胞在DMEM中孵育24小时，然后加入100μM的5-FIC、IC或5-FU。在进行CCK-8检测之前，细胞再孵育48小时。将野生型VCZ及其突变体的1μg质粒转染至12孔细胞培养皿中的HCT116细胞中，DMEM孵育48h后采集样本进行Western blot分析。将野生型VCZ及其突变体的2μg质粒转染到293T细胞中，于6孔细胞培养皿中DMEM孵育48h。收集细胞样本进行Western blot分析，收集上清液对HCT116和CT26细胞株进行处理。
Western blot：样品用PBS洗涤，用RIPA裂解缓冲液(美伦生物)裂解。用SDS-PAGE上样缓冲液(Yeason)将蛋白加载到10％ PAGE凝胶上，恒压下凝胶运行。蛋白在80V下转移到PVDF膜上80分钟。用5％脱脂干乳在TBST中阻断膜，用抗小鼠单克隆抗体(Beyotime)在4℃下以1:10 00的稀释度孵育过夜。然后将膜洗净，用酶标山羊抗小鼠抗体(Beyotime)按1:30 00稀释孵育1小时。使用增强显像技术对波段进行可视化。
使用293T细胞转染野生型VCZ或其突变体，然后用200μM的5-FIC或IC处理48小时(图6D、6E)。由于293T细胞对5-FU处理不太敏感，所以通过收集含有不同浓度的5-FIC或IC催化产物的上清液来间接评估VCZ突变体的功能。然后，使用收集的上清液来处理人类结直肠癌细胞HCT116或对5-FU治疗敏感的小鼠结直肠癌细胞CT26。细胞处理48小时，通过CCK-8法评估细胞活力(图6F-6G)。结果表明，含有5-FIC的野生型VCZ、L91A、L168A和F210A催化产物的上清液对HCT116细胞株和CT26细胞株的增殖均有显著影响，突变体F88A和S326A催化的上清液对CT26细胞也有杀伤作用。这些结果与TLC实验显示的体外催化实验的观察结果一致，证实了Gln73、Trp90、Glu237、His271和Asp322对VCZ的体内催化能力至关重要。
以上结果表明了野生型或结晶型VCZ蛋白在结直肠癌细胞系中的治疗作用，通过5-FIC底物的VCZ突变体抑制肿瘤的体内疗效与其在体外观察到的催化活性一致。
本公开的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本公开的技术方案做出的技术变形，均落入本公开的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种结晶的异胞嘧啶脱氨酶VCZ蛋白复合物，所述复合物包括：异胞嘧啶脱氨酶VCZ蛋白；和5-氟尿嘧啶。
2.根据权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述异胞嘧啶脱氨酶VCZ蛋白具有如SEQID NO:1所示的氨基酸序列，或与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述复合物具有表1中所列的至少30％的原子坐标，或者所述复合物中至少30％氨基酸的主链碳骨架的原子结构坐标与表1中所列的坐标的平均跟方差≤至少
4.根据权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述复合物的晶体结构具有空间群P212121；和/或
所述复合物的晶胞参数为：α＝90°，β＝90°，γ＝90°。
5.根据权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述复合物含有：
2个VCZ蛋白分子构成同源二聚体，以及
2个5-氟尿嘧啶分子，
优选地，所述2个5-氟尿嘧啶分子分别位于所述2个VCZ蛋白分子的活性中心；
优选地，每个VCZ蛋白分子的二级结构包括17个α螺旋和17个β折叠，其中，β1至β6折叠、β15至β17折叠，以及α1螺旋和α16螺旋组成头部结构域，剩余的二级结构元件组成催化核心结构域。
6.一种异胞嘧啶脱氨酶VCZ蛋白的结晶方法，包括如下步骤：在含有VCZ蛋白和5-氟尿嘧啶的溶液中使纯化的VCZ蛋白结晶，以获得晶体化的VCZ蛋白，
优选地，所述晶体化的VCZ蛋白是复合物，所述复合物包含VCZ蛋白和5-氟尿嘧啶。
7.根据权利要求6所述的结晶方法，其特征在于，所述结晶包括通过悬滴气相扩散法或坐滴气相扩散法进行结晶；
优选地，结晶条件包括：0.1-0.3M硫酸锂一水、0.05-0.2M Bis-Tris缓冲液pH 6.5和20-30％w/v聚乙二醇，优选为0.2M硫酸锂一水、0.1M Bis-Tris缓冲液pH 6.5和25％w/v聚乙二醇3350；
优选地，结晶液滴中蛋白溶液与晶体试剂的体积比为1:2至2:1的范围内；
优选地，蛋白溶液中，VCZ蛋白的浓度为5-20mg/mL，5氟-尿嘧啶浓度为2-5mM；
优选地，所述结晶的温度为4-37℃，优选为16-20℃。
8.根据权利要求6所述的结晶方法，其特征在于，所述晶体化的VCZ蛋白具有如SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列，或与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列；和/或
所述晶体化的VCZ蛋白具有表1中所列的至少30％的原子坐标，或者所述晶体化的VCZ蛋白中至少30％氨基酸的主链碳骨架的原子结构坐标与表1中所列的坐标的平均跟方差≤至少
9.根据权利要求6-8中任一项所述的方法获得的晶体化的异胞嘧啶脱氨酶VCZ蛋白。
10.根据权利要求1-5任一项所述的异胞嘧啶脱氨酶VCZ蛋白复合物或权利要求6-8任一项所述的方法获得的晶体化的异胞嘧啶脱氨酶VCZ蛋白在筛选、开发和/或制备肿瘤化疗药物中的应用，优选地，所述药物为5-氟异胞嘧啶前体药物。
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