CN117243898A - 一种用于治疗糖尿病的舌下含服递送体系及其制备方法与应用 - Google Patents
一种用于治疗糖尿病的舌下含服递送体系及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种用于治疗糖尿病的舌下含服递送体系及其制备方法与应用。通过流化床涂布器使重组多肽DBAYL在微颗粒上进行涂布,制备得到舌下含服递送体系制剂,在舌下给药具有更大的渗透性,大大提高药物利用率。其通过舌下淋巴组织到颈静脉,然后被快速递送到全身,避免肝脏首过效应,作用效果极快,舌下含服的给药方式简单易行,更为人性化。以PACAP衍生多肽DBAYL为例,舌下含服稳定性高、生物利用度高,舌下含服20min即达到最大值,利用率为12~17%,药物利用率较口服提高约23倍。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,特别涉及一种用于治疗糖尿病的舌下含服递送体系及其制备方法与应用。
背景技术
糖尿病已成为现代疾病中的第二杀手,其对人体的危害仅次于癌症,且目前的糖尿病患者有年轻化的倾向。世界卫生组织预测,至2025年全球范围内糖尿病患者人数将是目前的2倍,约达3亿人。患者中约90%为Ⅱ型糖尿病患者,近75%的患者在印度与中国等发展中国家,而且发病率在逐年上前,临床使用的Ⅱ型糖尿病治疗药物多是针对胰岛素抵抗进行设计,但主要缺陷是长期使用会引起胰腺分泌胰岛素的胰岛β细胞的功能损伤,使病情加重。皮下注射,最常见的给药方式,可使用普通注射器或笔式注射器笔,后者使用更为便捷,疼痛感有所降低,但注射笔注射部位皮肤可能红肿发热,皮下有硬结;长期使用皮下脂肪纤维化增生,可能造成药物吸收效果下降。此外使用锐器,处置不当造成的血源性感染的风险等等。该方式也会降低患者用药依从性.
吸入给药避免了口服导致蛋白酶对胰岛素的分解,曾认为可能替代注射的重要方向。其控制血糖的疗效与注射胰岛素相近,并能够减轻注射的痛苦。但是其生物利用度仅相当于注射胰岛素的10%,需加大给药量,成本高于注射胰岛素。同时吸入剂量和效率难以精准控制,并有导致肺癌的风险报告。近百年来一直阻碍口服胰岛素的两大难关仍未被征服:生物利用度较低与药效学个体化差异较大。药物生物利用率较低可能导致需要加大剂量进而可能导致潜在的副作用。目前口服降糖药分为刺激胰岛素分泌药和抗糖尿病药。二者虽作用机理不同,但终究要依赖自身的胰岛β细胞分泌的胰岛素发挥作用。研究表明,Ⅱ型“糖友”在诊断之初,胰岛功能就已降至正常人的50%,
此后,随着病程的延长,患者胰岛功能将以大约每年5%的速度衰减,直至完全衰竭。此外这些药物中绝大多数要在肝脏代谢分解,口服后会加重肝脏的负担。上述糖尿病药物的给药方式各有利弊,如何保障生物利用率,亟需新型给药方式弥补缺陷。
许多用于人类和动物疾病治疗和预防或用作食品补充剂的生物材料如蛋白质和全细胞只有有限的保存期限。所述有限的保存期限被认为是蛋白质在储藏温度时的不稳定性的结果。虽然一些蛋白质和细胞培养物的所述保存期限可通过在低温(即4℃~8℃)保存它们得以延长,通常保存期限少于18个月。生物活性蛋白一般折叠成复杂的各蛋白独特的三维结构形式。所述蛋白一般在3种水平上组织;具有一级结构,由共价结合的氨基酸残基直链组成(肽链);二级结构,其中所述肽链折叠为规则形状(如a螺旋和B-折叠片层);和三级结构,其中所述折叠的链本身进一步折叠形成压缩结构。此外,一些由多于一条多肽链组成的蛋白质保持紧密排列以形成所谓四级结构。正是所述三级和/或四级结构决定了蛋白质最终生物活性。所述蛋白质最终结构可被许多环境因子影响,例如温度,pH,某种辅因子或金属的存在或缺失,氧气、酶、氧化或还原试剂的存在和水或湿气的存在。当条件没有优化时,蛋白质可能不能正确折叠或可能变性,从而丧失其生物功能或至少减弱。广义而言,动物、植物和微生物的细胞可被认为是复杂的蛋白质材料,因为其含有附在细胞膜和/或细胞壁内的众多蛋白质,所述膜或壁转而在所述细胞表面呈递其他蛋白质。因为具有蛋白质,细胞生存力取决于其存在的环境;例如温度,pH,某种辅因子或金属的存在或缺失,某些营养物、代谢废料、氧气、酶、氧化或还原试剂的存在或缺失和水或湿度的存在可单独或共同地作用以影响生存力。
本领域有许多已知技术用于稳定蛋白质,其中一些简要讨论如下。真空冷冻干燥(低压冻干法)常用于制备在真空中等使用的蛋白质。传统冷冻干燥涉及冷冻所述生物蛋白溶液并从中移去冰晶体,这是通过在真空中将其转变为水蒸汽(升华)。此方法常导致所述蛋白的天然结构受损。为了有助于增加冷冻干燥制得的生物蛋白的稳定性,可在产品制剂中使用添加剂如缓冲或稳定剂。然而,冷冻干燥期间,当所述溶液的温度经过一天缓慢降至-20℃时,所述添加剂可能在不同的凝固点固化。结果,所述终产物可能是细软块状物质,其实际是由各代表单独组分的不同层组成。大体上,所述加入以保护所述生物蛋白的添加剂可从中物理或化学分离,使得它们不能用作保护剂。
本发明开发前商业使用的技术中,微囊化技术可能被认为对于制备生物蛋白和细胞最有用。通常不需要主要设备且批量大小可小到10g-20g,这使其可用于制备可能非大量的生物蛋白。此方法使用有机溶剂溶解所述生物蛋白质,之后用水包油包水(w/o/w)或水包油包固体(s/o/w)乳液法将其包埋在聚合物微球体中。通过简单过滤除去水后将蛋白捕获入所述固体微球体并将溶剂蒸发掉。虽然微囊化可被认为是制备用于储藏和将来使用的生物蛋白质和全细胞的合适方法,但是该技术在药物和生物技术产业仍处于发展阶段。所述技术的明显困境在于蛋白质很可能被所用溶剂和所需的乳化/匀化过程变性。此外,依本方法生产的产品质量可能被认为不理想,因为有痕量溶剂残留在所述微胶囊核心,其可能妨碍用本技术生产的产品的商业化。通过粘膜给药方式的药物已被广泛研究,如硝酸甘油等心血管药物已经被广泛运用,另有舌下止痛药芬太尼等也被证实起效快,镇静剂如咪达唑仑,三唑仑和依托咪酯的粘膜给药方式也在临床上有巨大的优势。止吐药物、治疗勃起功能障碍的药物均在这方面有相关的研究。睾酮和雌激素的口服粘膜制剂已被开发出来,雌激素对绝经妇女心血管疾病的短期给药也已被证明产生冠状动脉和外周血管扩张,减少血管阻力和改善内皮功能。这些都说明了舌下给药这一治疗方法具有较好的前景
本发明者基于热喷雾干燥和微囊化技术开发了一种替代方法,其中活性成分如蛋白质可稳定的时间延长,制备糖尿病治疗舌下含服体系包含稳定活性物的产品及其相同活性物的组合物的方法,以提高生物利用度。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足,提供一种用于治疗糖尿病的舌下含服递送体系的制备方法。
本发明的另一目的在于,提供上述方法制备得到的用于治疗糖尿病的舌下含服递送体系。
本发明的再一目的在于,提供上述方法制备得到的用于治疗糖尿病的舌下含服递送体系的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现:
一种用于治疗糖尿病的舌下含服递送体系的制备方法,包括以下步骤:
(1)制备涂布液和微颗粒;
(2)将微颗粒加入流化床涂布器的加工室,抽真空并预热;
(3)降低加工室的温度,加入气流进行流化;
(4)将多肽加入涂布液中混匀,加入流化床涂布器进行涂布,涂布结束后得到载药微粒,即用于治疗糖尿病的舌下含服递送体系。
步骤(1)中所述的涂布液的组分为以质量计甘露醇9~11%、丙二醇3~4%、琥珀酰明胶0.5~1%、甘氨酸0.3~0.7%、右旋糖酊0.2~0.6%,人血清白蛋白0.01~0.05%,使用标准磷酸钠缓冲液调至pH=7,余量为水;优选为甘露醇10%、丙二醇3.5%、琥珀酰明胶0.7%、甘氨酸0.5%、右旋糖酊0.4%,人血清白蛋白0.03%,使用标准磷酸钠缓冲液调至pH=7,余量为水。
步骤(1)中所述的微颗粒为水凝胶微粒核心,具体组分以质量计为甘露醇50~60%、CMC钠4~8%、壬基酚聚氧乙烯醚1~3%、海藻酸钠13~18%和乳糖15~25%,优选为甘露醇56%、CMC钠6%、壬基酚聚氧乙烯醚2%、海藻酸钠16%和乳糖20%。
上述的水凝胶微粒核心的制备方法具体为:首先将海藻酸钠、壬基酚聚氧乙烯醚、乳糖和水混合,得到基础凝胶,并且将羧甲基纤维素钠溶于葡萄糖酸钙溶液混合,得到金属盐离子液体溶液;向金属盐离子液体溶液中加入基础凝胶后,搅拌均匀,得到分散颗粒;将所得到的分散颗粒依次进行过滤分离和干燥,得到水凝胶微粒核心。
步骤(2)中所述的预热为加热到50~70℃保持1~2h,优选为加热到60℃保持1h。
步骤(3)中所述的温度为降低至30~45℃,优选为40℃。
步骤(3)中所述的气流的流速为200~400m3空气/小时,优选为300m3空气/小时。
步骤(3)中所述的气流为惰性气体,优选为在进入加工室前经过流化床涂布器的过滤器过滤为氮气。
步骤(4)中所述的多肽为能够降低血糖的多肽,优选为一种高稳定性VPAC2型受体特异激动剂DBAYL,制备方法和氨基酸序列已在专利ZL201210005129.2中公开。
步骤(4)中所述的多肽与涂布液的质量比为1~2:1~2,优选为1:1。
步骤(4)中所述的涂布加入的涂布液的体积与水凝胶微粒核心的体积比为1~2:1~2,优选为1:1。
步骤(4)中所述的涂布为从流化床涂布器的加工室的底部向上喷洒。
步骤(4)中所述的涂布的速率为25~35g/min,优选为30g/min。
一种用于治疗糖尿病的舌下含服递送体系,通过上述制备方法制备得到。
上述用于治疗糖尿病的舌下含服递送体系在制备治疗/预防糖尿病的药剂中的应用。
所述的载药微粒包括至少一种活性成分、糖类和水混溶性溶剂的涂布液性凝胶形成;提供包括一种或多种水溶化合物的颗粒,所述颗粒在仪器的加工室内以螺旋路径向上移动的方式,在所述室内流化,喷洒所述涂布液以产生包覆颗粒,同时保证包覆颗粒干燥,通过舌下递送,以打造多肽的高效递送,提高生物利用率。
所述活性成分,其中含有活性成分可能在光、热、空气或湿气存在下不稳定。例如生物材料,如蛋白质、肽、活细胞或微生物,不稳定的,对光、热、空气或湿气敏感的生物材料
加工室进行上述操作时,涂布液在接触所述颗粒前可以是微滴的形式。进入所述加工室一秒钟以内在所述颗粒上变为固态流化并通过在其中施加热量加热到约30℃-80℃而干燥。所述颗粒可旋转。从而使所述颗粒以螺旋路径向上移动。开始前,所述加工室内的空气可用惰性气体更换,如氮气。在进入所述加工室时的温度可为约30℃~45℃或35℃~40℃。在所述室内流化,喷洒所述涂布液以产生包覆颗粒,向上喷洒所述涂布液从而该涂布液沿着所述颗粒流动形成的圆柱移动。以约10°~70°的角度,从所述加工室内多个喷雾出口喷洒所述涂布液。在实施方式中,所述涂布液可为室温如约20℃。所述包覆颗粒加热干燥,在平衡条件下进行。
本发明提供法制备时包含至少一种活性成分的产品。至少一种活性成分可选:多肽
本发明提供用所述产品给对象递送至少一种活性成分。对象可以是人或动物。当药物与载体混合溶解时,通过形成水凝胶溶液粘附在粘膜组织上,扩散系数增加,与黏蛋白形成物理化学键,在高渗透的作用下推送治疗多肽和蛋白质药物到粘膜组织,经由舌下淋巴,血管系统循环。剂型可以是释片剂或微胶囊。
本发明提供用于制备包括至少一种活性成分的产品的仪器,所述仪器包括:设有一个或多个出口用于引导液体进入其中的加工室,位于所述加工室底部的入口和出口,因此允许气体穿过所述加工室移动,其中所述入口提供有导向组件从而当气体吸入所述入口时,离开所述导向组件的气体以旋转路径向上移动。
本发明广泛涉及一种制备包含活性成分的产品的方法。所述产品通过可称为“微胶囊”的方法获得。在某些实施方式中,本发明提供用于稳定/保存不稳定材料的方法,例如光、热、空气或湿气敏感的材料,特别是生物材料如蛋白质、肽、活细胞、和微生物。本发明方法开发了稳定/保存用于给予人或动物的蛋白质和肽的具体应用。通过本发明方法生产的所述稳定化产品在给予对象时产生组成型蛋白质和肽改善的效果。本发明的方法可在仅30℃~40℃的操作温度下进行,意味着其与许多热敏感的活性成分可相容。
一方面,本发明提供用于制备包括至少一种活性成分的产品的方法,所述方法包括:(i)提供包括至少一种活性成分、糖类和水混溶性溶剂的涂布液;(ii)提供包括一种或多种水溶性凝胶形成化合物的颗粒;(iii)以所述颗粒在仪器的加工室内以螺旋路径向上移动的方式在所述室内流化所述颗粒;(iv)在所述颗粒上喷洒所述涂布液以产生包覆颗粒;(v)使所述包覆颗粒干燥,(vi)通过舌下粘膜系统递送颗粒治疗药物。
本发明的目的通过下述技术方案实现,概括的说,所述方法涉及在合适的加工室内向可接受的微粒赋形材料(颗粒,优选微粒)上喷洒含结合至少一种糖类的活性成分和水混溶性溶剂的液体,其中所述颗粒在包被时通过所述室以螺旋路径向上移动。所述颗粒在所述加工室内的移动类似飓风中空气的移动。所述颗粒的包覆产生微囊化且因此稳定了所述活性成分。所述加工室中所述颗粒的螺旋形轨迹提供了平滑、均匀的所述涂布液的涂层,其形成含活性成分和其他水溶性材料如糖和氨基酸的水凝胶。所述涂布液和颗粒的性质使本方法生产的产品能具体用于缓释递送应用,如粘膜和舌下递送治疗活性成分。在该应用中,所述水溶性材料接触唾液时溶解,从而在所述涂层表面产生微孔,其促进了所述微胶囊分解入液体凝胶。所述凝胶在粘膜表面排成一行,从而递送所述活性成分并优化吸收。因此,依本发明方法制备的产品代表用于治疗活性成分的便捷固体舌下含服递送形式,其可取代注射需求。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果,
1、本发明的方法可成功制备具有十亿分之几活性成分的剂型,其中所述成分分布均匀。细胞因子的体内作用通常是催化性且因此为了实现所需的生物活性,仅需纳克或皮克量。将该小量均匀分布在固体物质中尤其困难且在药物工业上没有先例。活性成分可包埋在排阻水、光、氧气和微生物的保护环境中。在生物材料如蛋白质和肽的情况中,稳定性可持续最多4年时间而不用冷冻。
2、本发明方法所用的颗粒优选直径约50~800微米的微粒、或约100~600微米、或约200~400微米,然而应理解也可使用其他尺寸的颗粒,这取决于所述活性成分和所述产品的预计用途。小颗粒比大颗粒溶解更快,这是因为水能更快地渗透表面进入所述核心从而引起凝胶形成。同样,使用不同尺寸颗粒的混合物可优化持续缓释效果。所用的颗粒组合物保证包含所述活性成分的所述涂布液有效结合所述颗粒的表面而没有显著的结块或损失。
3、本发明方法优选在封闭无菌环境中进行,或换句话说,在没有或基本没有污染物的环境中。常规污染物包括微生物等,然而本领域技术人员易理解实施本发明方法时也需要排除任何其他有害污染物。实施本方法的环境优选没有或基本没有氧气,从而最小化活性成分的氧化可能性。没有氧气或基本没有氧气的环境可通过用惰性气体如氮气置换所述加工室中所含的氧气实现。然而应理解也可使用其他惰性气体如二氧化碳或氯。
4、药物通过口服具有较低的生物利用度,人粘膜与皮肤不同,由40-50层的非角质化细胞组成,具有更大的渗透性,这对于亲和性生物大分子如肽和蛋白质的系统递送尤其重要。颊粘膜的可及性使药物出现不良反应,可快速方便地去除药物作用。此外,口腔和舌下区域具有低酶活性,存在于胃和肠液中胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶在口腔粘膜中大部分不存在。颊粘膜高度血管化和丰富的淋巴组织,穿透颊粘膜上皮的分子从该组织直接排出到颈静脉可被快速递送到全身循环中而避免肝脏首过效应。颊粘膜中的细胞周转时间比胃肠道中的更慢(4~14天),使药物更有效粘附于颊粘膜。因此,颊粘膜的相对高的渗透性对大分子剂量的用药要求较低,降低了药物的成本以及高剂量用药导致的不良副作用。但粘膜的吸收表面积较低,并且唾液的恒定流动可导致药物吞咽而非穿过颊粘膜起作用。同时应用之前必须考虑口味问题以免出现太刺激气味,粘膜给药的方式可改善患者用药顺应性差的问题,简单易行,依从性较好;同样也降低静脉注射、肌肉注射等途径高成本。与鼻腔粘膜相比,舌下粘膜不易损伤,而修复功能又强,安全性更好。
5、依从性高;大大提高生物利用度,通过舌下毛细血管吸收入血,不经过胃肠道,不会被胃肠道的酸、碱、酶环境分解破坏,且不受食物作用和胃排空状态的影响(餐后血糖、空腹血糖);其次舌下含服也不会通过肝脏血管,避免了肝脏这个“解毒化工厂”大量代谢分解和灭活、保持较强药效;舌下黏膜对药物吸收速度快,仅次于气雾吸入,快于肌肉或皮下注射,更快于口服,而贴片是最慢的;适合意识丧失而无法吞咽的急症患者。
6、选用特定表达载体表达重组多肽DBAYL,在舌下给药具有更大的渗透性,大大提高药物利用率。其通过舌下淋巴组织到颈静脉,然后被快速递送到全身,避免肝脏首过效应,作用效果极快,舌下含服的给药方式简单易行,更为人性化。以PACAP衍生多肽DBAYL为例,舌下含服稳定性高、生物利用度高,舌下含服20min即达到最大值,利用率为12~17%,药物利用率较口服提高约23倍。
附图说明
图1为FITC-DBAYL-SACS的生物利用度检测结果图,其中a为制备得到的FITC-DBAYL-SACS照片图,b为生物利用度检测结果图的生物利用度检测结果图。
图2为舌下含服递送体系的长期药效学作用实验结果图。
图3为舌下含服递送体系对小鼠体重、血糖及饮食饮水量的影响结果图,其中a为血糖、b为体重、c为饮食量、d为饮水量。
图4为舌下含服递送体系对小鼠给药后14h内急性血糖影响监测结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
下面实施方案中若未注明具体试验条件,则通常按照常规试验条件或按照试剂公司所建议的试验条件。所使用的的材料、试剂等,若无特殊说明,均为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1制备用于治疗糖尿病的舌下含服递送体系
原料配比
水凝胶微粒核心:甘露醇(56%)、羧甲基纤维素钠(6%)、壬基酚聚氧乙烯醚(2%)、海藻酸钠(16%)和乳糖(20%)。
水凝胶微粒核心的制备方法为:首先将海藻酸钠、壬基酚聚氧乙烯醚、乳糖和水混合,得到基础凝胶,并且将羧甲基纤维素钠溶于葡萄糖酸钙溶液混合,得到金属盐离子液体溶液;向金属盐离子液体溶液中加入基础凝胶后,搅拌均匀,得到分散颗粒;将所得到的分散颗粒依次进行过滤分离和干燥,得到水凝胶微粒核心。
制备得到的水凝胶微粒核心大小:700um~425um(30%),425um~180um(55%),<180um(15%)。
涂布液:每100mg甘露醇(10%)、丙二醇(3.5%)、琥珀酰明胶(0.7%)、甘氨酸(0.5%)、右旋糖酊(0.4%),人血清白蛋白(0.03%)、加入标准磷酸钠缓冲液调节至pH=7,和注射用水(至100%)。
DBAYL:一种高稳定性VPAC2型受体特异激动剂DBAYL,制备方法和氨基酸序列已在专利ZL201210005129.2中公开。
制备方法
1、将涂布液的组分甘氨酸、甘露醇、琥珀酰明胶、丙二醇、右旋糖酊和缓冲液溶于注射用水中,然后用0.2微米膜滤器过滤,加入人血清白蛋白,最后加入注射用水补充重量。
2、按厂商说明对装有火箭驱动器的胡特林TurbojetTM流化床涂布器的加工室加热处理灭菌一小时,并将流化床涂布器切换至循环过滤氮气模式。
3、将水凝胶微粒核心装载入流化床涂布器的加工室、抽真空、流化然后加热到约60℃持续一小时。加工室于负压条件下经导向组件吸取气体,导向组件适于引起所吸入气体以旋转路径向上移动,进而带起颗粒使之以旋转路径向上移动。
4、将加工室中微粒的温度降至40℃,然后以300m3空气/小时的速率流化加工室的内容物,使微粒以螺旋路径向上移动。
5、在步骤1中制备的涂布液中加入等质量的灭菌的DBAYL混匀,然后取以水凝胶微粒核心相同体积的涂布液在平衡条件下以30g/分钟的速率从流化床涂布器的加工室的底部向上喷洒进行涂布。
6、调整流化速率,缓慢上升至900m3空气/小时,将步骤5中制备得到的微粒干燥至少于0.25%水活性含量,得到涂布了DBAYL的载药微粒,即用于治疗糖尿病的舌下含服递送体系DBAYL-舌下体系SACS。
7、将步骤6中得到的微粒依本领域标准程序压缩产物至200mg片剂,之后将片剂包装到氮气冲洗的铝/铝箔填充物中并储存在不超过25℃的温度中。
参照上述步骤,制备不载药的SACS微粒,区别仅在于步骤5中不加入DBAYL。
实施例2生物利用度检测
参照实施例1的制备方法,制备得到FITC-DBAYL-SACS舌下体系,区别仅在于步骤5中将DBAYL替换为FITC-DBAYL。通过不同时间点取血检测495nm处的吸光值,检测FITC-DBAYL-SACS舌下体系在体内的生物利用度,具体步骤为:
1、FITC-DBAYL-SACS舌下体系的制备
(1)将待交联的蛋白DBAYL(浓度10mg/mL)在交联反应液透析三次4℃,至pH=9.0,交联反应液配制方法:7.56g NaHCO3,1.06g Na2CO3,7.36g NaCl,加水定容至1L。
(2)将FITC溶于DMSO中,浓度为1mg/mL。每次交联使用的FITC均应新鲜配制,避光。
(3)按P:F(DBAYL:FITC)=1mg:150μg的比例将FITC缓慢加入于DBAYL溶液中边加边轻轻晃动使其与DBAYL混合均匀,暗处4℃反应8h。
(4)加入5M的NH4Cl至终浓度50mM,4℃终止反应2h。
(5)将交联物在PBS中透析四次以上,至透析液清亮。
(6)交联物的鉴定。
(7)蛋白浓度计算:蛋白浓度(mg/mL)=[A280-0.31×A495]/1.4。
(8)F/P比例计算:3.1×A495/[A280-0.31×A495]。
(9)制备而成的FITC-DBAYL为淡黄色澄清透亮溶液。检测到蛋白浓度为7.36mg/mL,该交联物F/P值为4.9。表明DBAYL成功连接FITC荧光基团。
(10)FITC-DBAYL置于pH7.4的磷酸盐缓冲液中,加入0.1%NaNO3、1%BSA,4℃暗处保存。
(11)按实施例1的方法制备FITC-DBAYL-SACS舌下给药体系,区别为将DBAYL替换为FITC-DBAYL,得到载有荧光基团的FITC-DBAYL-SACS舌下体系。
2、生物利用度检测
db/m小鼠购自常州卡文斯实验动物有限公司
(1)麻醉小鼠:配制2%的戊巴比妥钠麻醉溶液,以3.74mL/kg的剂量腹腔注射实验鼠。
(2)麻醉检查:10~15min后保证小鼠适度麻醉,以给药时小鼠舌头不会动为标准。
(3)舌下给药:用移液枪将SACS或DBAYL-SACS溶液注射进小鼠舌下,给药的体积为5ul,剂量为500nmol/kg小心保持小鼠身体坐立姿势,上肢下垂;头部与身体在同一条直线上,以防止药液侧流或吞咽,并保持姿势30min。
(4)按步骤(3)的方法处理小鼠通过FITC-DBAYL-SACS给药后,通过眼静脉丛取血,分别取5min、10min、20min、30min、40min、50min的血样各50ul后,离心取上清。
(5)通过多功能生物发光仪在波长495nm下检测发光强度。
结果如图1所示,实验发现在20min时FITC-DBAYL-SACS在体内的生物利用度可达到最高,为起始值的14.80%±1.51。而后在30~50min内其利用度趋于下降。表明该生物利用度便证明了该药物通过舌下粘膜给药的路径进入体内,该生物利用度的体内实验也证明DBAYL与舌下体系通过舌下粘膜组织共同给药方式可达到动物实验药物所需的浓度。
实施例3探索最佳用药浓度
为了评估用于治疗糖尿病的舌下含服递送体系的长期药效学作用,通过糖耐量实验(GTT)实验摸索长期给药的浓度。
(1)取48只6周龄的雄性II型糖尿病模型鼠(db/db小鼠)室温下培养于12小时昼夜循环的SPF级房间内,适应性喂养2周后,根据体重将小鼠随机分为6组(n=6)。
(2)实验前一天晚上饥饿处理小鼠12h(可饮水)。
(3)随机将小鼠分为6个组分别为0nmol/kg、62.5nmol/kg、125nmol/kg、250nmol/kg、500nmol/kg、1000nmol/kg并标记。
(4)剪尾取血并用罗氏ACCU-CHEK血糖仪测定各实验组的血糖值,记录为-30min的血糖值。
(5)在15min后麻醉小鼠并以0nmol/kg、62.5nmol/kg、125nmol/kg、250nmol/kg、500nmol/kg、1000nmol/kg剂量对应的组别舌下给药并保持15min使药物吸收,舌下给药的方法参照实施例2相关实验,其中对照组注射0.9%的NaCl溶液。
(6)给药15min后测血糖并记录0min的血糖值。
(7)以0.01mL/g的剂量腹腔注射20%的葡萄糖,并分别在注射葡萄糖5min、10min、15min、30min、60min、90min、120min之后检测血糖,分别记为对应时间的血糖值。
(8)绘制不同时间点的血糖曲线。
结果如图2所示,实验发现DBAYL-舌下体系SACS舌下给药降血糖的效果呈现剂量依赖性。低于125nmol/kg的药物浓度在GTT中第一相和第二相胰岛素分泌中的降血糖效果并不明显(p>0.05);而DBAYL在500nmol/kg的浓度下,与空白对照组对比显著地降低了第一相和第二相血糖的水平(p<0.05),并且其降血糖效果与1000nmol/kg的无显著性差异,因此500nmol/kg的浓度具有半最大效应。
1998年,Filipsson[175]等人对PACAP27和PACAP38的研究中指出,在33pmol/kg的浓度下二者均可以下显著地和等量增强糖刺激的胰岛素分泌(GSIS),具有半最大效应。在考量药物的浓度上,应考虑半最大效应浓度,而不是选用最大有效剂量。因为药物的高浓度用药可能会产生一定的毒副作用以及耐药性,并且更大的使用剂量会造成更加高的生产使用成本,不利于药物的推广使用,综合考量在后续实验的时候选择500nmol/kg的浓度为DBAYL的给药浓度。
实施例4舌下含服递送体系对db/db小鼠体重、血糖及饮食饮水量的作用db/db小鼠购自常州卡文斯实验动物有限公司
BAY55-9837多肽购自百奥泰生物科技(广州)
(1)取48只6周龄的雄性II型糖尿病模型鼠(db/db小鼠)室温下培养于12小时昼夜循环的SPF级房间内,适应性喂养2周后,根据体重将小鼠随机分为7组(n=7);设置七组实验组,分别为DBAYL多肽(S.L.)、SACS微粒(S.L.)、DBAYL-SACS舌下体系(S.L.),腹腔注射给药DBAYL(i.p.)、BAY55-9837(i.p.)、艾塞那肽Exendin-4(i.p.)和等体积生理盐水NS(i.p.),并喂养一组对照小鼠(db/m小鼠)用以对照,其中S.L.表示舌下给药,舌下给药的方法参照实施例2相关实验,i.p.表示腹腔注射给药,剂量为每天500nmol/(kgB.W.)。连续舌下给药或腹腔注射1次/天,每天给药一次并连续给药8周,每周一和周三上午10:00时检测各处理组小鼠的体重、空腹血糖值、饮食量、饮水量。
(2)在8周后,收集小鼠血液,眼眶处(眼静脉丛)取血,室温放置1~2h后,4000rpm离心10min,收集上清即为血清。检测血清中的血脂四项指标(总胆固醇、甘油三酸酯、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇),检测治疗12周后对糖尿病模型鼠(db/db小鼠)血脂水平的改善作用。
结果如图3所示,实验结果显示,DBAYL-SACS舌下体系处理组db/db小鼠的空腹血糖水平在连续给药第6周开始明显低于NS(i.p.)对照组小鼠。与DBAYL(S.L)组相比,第6周、第8周DBAYL-SACS舌下体系处理组db/db小鼠空腹血糖水平分别下降了28.49%和25%(p<0.01),与DBAYL(i.p)组相比没有明显差异;DBAYL-SACS舌下体系处理组db/db小鼠体重在连续第5周后明显低于NS对照组,第5周和第8周后体重比NS(i.p.)对照组小鼠体重明显降低10.29%、9.83%(p<0.01)(图3b)。
DBAYL-SACS舌下体系对db/db小鼠的饮食量、饮水量也具有明显的调节作用,与NS对照组小鼠相比较,第8周时DBAYL-SACS舌下体系处理组db/db小鼠的饮食量分别为NS(i.p.)组小鼠的28.57%(图3c),而饮水量分别为NS(i.p.)组小鼠的27.28%(p<0.01)(图3d)。而BAY55-9837(i.p.)处理组连续用药未明显改善db/db小鼠的体重、空腹血糖值、饮食量和饮水量,可能与其腹腔注射后的半衰期(5min)较短有关。临床用药Exendin-4的连续用药可显著改善db/db小鼠的体重、空腹血糖值,但对db/db小鼠的体重及饮食量的影响与DBAYL-SACS舌下体系处理组相近,考虑其在临床用药上频繁出现的恶心呕吐、厌食等副作用的出现,并未显示出较好的优势,因此证明实施例1制备的用于治疗糖尿病的舌下含服递送体系DBAYL-SACS舌下体系,相较其他实验组具有更好的降血糖效果和调节作用,。
实例五14h连续检测急性药效作用
(1)6周龄的雄性II型糖尿病模型鼠(db/db小鼠)室温下培养于12小时昼夜循环的SPF级房间内,适应性喂养2周后,根据体重将小鼠随机分为7组(n=7)。
(2)随机将小鼠分为7个组:NS(i.p.)、SACS(S.L.)、DBAYL-SACS舌下体系(S.L.)、DBAYL(S.L.)、DBAYL(i.p.)、BAY55-9837(i.p.)、Exendin-4(i.p.)并标记,其中S.L.表示舌下给药,i.p.表示腹腔注射给药。
(3)测血糖并记录为0min的血糖值。
(4)参照实施例2相关实验麻醉小鼠,分别以500nmol/kg的剂量舌下给药并保持15min使药物吸收或腹内注射500nmol/kg给药;
(5)给药后分别在1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h测血糖,同时在4h、9h时给食,其余时间禁止进食。
(6)实验结束后,恢复给食。
(7)绘制不同时间点的葡萄糖曲线。
在急性糖耐量实验中,DBAYL-SACS舌下体系(S.L.)可表现出较好的促胰岛素分泌及降低血糖的作用。为了模拟DBAYL作用后机体的血糖动态情况,本实验设计了给药后14h内对db/db小鼠的血糖监测,模拟给药后的血糖动态变化,同时在4、9h时给食30min。实验结果如图4所示,在未进食的1~4h时,血糖水平显著低于NS(i.p.)组(p<0.01),1h、4h时血糖值分别为NS(i.p.)组的45.83%、81.25%(p<0.01);第4h恢复食物摄入后DBAYL-SACS舌下体系(S.L.)实验组表现出显著性低于NS(i.p.)组的血糖水平。而在9h第二次给食时表现出糖耐受能力逐渐下降。图中在4h和9h处的箭头代表恢复小鼠进食,*表示与DBAYL-SACS舌下体系(S.L.)组与NS(i.p.)组比较,*即p<0.05,**即p<0.01。
14h的血糖检测可以模拟DBAYL在体内的动态药效学。在4h、9h给食模拟每餐进食,因此通过本研究14h的模拟可以较为直观的观察DBAYL的作用药效,在1~8h内可将血糖初步稳定在可控范围内。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于治疗糖尿病的舌下含服递送体系的制备方法,包括以下步骤:
(1)制备涂布液和微颗粒;
(2)将微颗粒加入流化床涂布器的加工室,抽真空并预热;
(3)降低加工室的温度,加入气流进行流化;
(4)将多肽加入涂布液中混匀,加入流化床涂布器进行涂布,涂布结束后得到载药微粒,即用于治疗糖尿病的舌下含服递送体系。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:
步骤(1)中所述的涂布液的组分为以质量计甘露醇9~11%、丙二醇3~4%、琥珀酰明胶0.5~1%、甘氨酸0.3~0.7%、右旋糖酊0.2~0.6%,人血清白蛋白0.01~0.05%,使用标准磷酸钠缓冲液调至pH=7,余量为水。
3.根据权利要求1或2任一所述的制备方法,其特征在于:
步骤(1)中所述的微颗粒为水凝胶微粒核心,具体组分为以质量计为甘露醇50~60%、CMC钠4~8%、壬基酚聚氧乙烯醚1~3%、海藻酸钠13~18%和乳糖15~25%。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于:
所述的水凝胶微粒核心的制备方法具体为:
首先将海藻酸钠、壬基酚聚氧乙烯醚、乳糖和水混合,得到基础凝胶,并且将羧甲基纤维素钠溶于葡萄糖酸钙溶液混合,得到金属盐离子液体溶液;向金属盐离子液体溶液中加入基础凝胶后,搅拌均匀,得到分散颗粒;将所得到的分散颗粒依次进行过滤分离和干燥,得到水凝胶微粒核心。
5.根据权利要求1~4任一所述的制备方法,其特征在于:
步骤(2)中所述的预热为加热到50~70℃保持1~2h。
6.根据权利要求1~5任一所述的制备方法,其特征在于:
步骤(3)中所述的温度为降低至30~45℃;
步骤(3)中所述的气流的流速为200~400m3空气/小时。
7.根据权利要求1~6任一所述的制备方法,其特征在于:
步骤(4)中所述的多肽为一种高稳定性VPAC2型受体特异激动剂DBAYL,制备方法和氨基酸序列已在专利ZL201210005129.2中公开。
8.根据权利要求1~7任一所述的制备方法,其特征在于:
步骤(4)中所述的多肽与涂布液的质量比为1~2:1~2;
步骤(4)中所述的涂布加入的涂布液的体积与水凝胶微粒核心的体积比为1~2:1~2;
步骤(4)中所述的涂布为从流化床涂布器的加工室的底部向上喷洒;
步骤(4)中所述的涂布的速率为25~35g/min。
9.一种用于治疗糖尿病的舌下含服递送体系,通过权利要求1~8任一所述的制备方法制备得到。
10.权利要求9所述的用于治疗糖尿病的舌下含服递送体系在制备治疗/预防糖尿病的药剂中的应用。
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