CN117230248A - 用于检测新型冠状病毒ORF1ab基因和N基因的试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种用于检测新型冠状病毒(SARS‑COV‑2)ORF1ab基因和N基因的试剂盒及其使用方法。本申请中，试剂盒包括特异性靶向ORF1ab基因第一引物对和特异性靶向N基因的第二引物对。本申请提供的用于同时检测新型冠状病毒(SARS‑COV‑2)ORF1ab基因和N基因的试剂盒，基于恒温扩增技术，扩增速度快且不需要特殊仪器设备，无须变温，使得检测成本大大降低，适宜设备落后的基层医院或社区大规模检测。
Description
技术领域
本发明及生化检测领域，特别涉及用于检测新型冠状病毒ORF1ab基因和N基因的试剂盒及其使用方法。
背景技术
目前由新型冠状病毒引发的肺炎已成为当今世界最受关注的公共卫生问题，此次的新型冠状病毒(SARS-COV-2)属于冠状病毒亚科β属，是单股正链RNA病毒，具有传染性强、潜伏期长、变异速率快等特点。
新冠病毒的检测方法主要有四类，即基于RT-PCR的RNA核酸检测、基于免疫学原理的抗原抗体检测和基于分子层面的基因测序检测以及恒温扩增技术。基于RT-PCR的RNA核酸检测技术虽然最为常用，但其耗时至少3h,每日检测量受限，实验室交叉污染导致的假阳、漏检等情况也给疫情确诊和控制带来一定困难。抗原抗体检测法是通过”双抗体夹心法”检测新冠病毒病原体本身或血清产生的特异性IgG/IgM抗体,对实验室要求较低。抗原/抗体检测的灵敏度和特异性有限，且抗体检测存在窗口期，检测前期易出现假阴性，因此这类检测更常用于感染后的阳性人群筛查和治疗康复评估。基因测序检测技术需要昂贵的仪器设备，且对病毒的全基因组测序耗时长，结果解读对操作人员的生物信息学能力要求较高，不适合大规模的即时检测。
恒温扩增技术是继PCR技术后发展起来的一门新型的体外核酸扩增技术，具有扩增快速、高效、特异、不需要特殊的仪器设备等优势。恒温扩增反应的最适温度在37℃-42℃之间，无需变性，在常温下即可进行。这大大加快PCR的速度。无需精密设备，仪器便于携带，可以真正实现便携式的快速核酸检测。因此，开发一种基于恒温扩增技术的新型冠状病毒(SARS-COV-2)检测试剂盒对实现低成本快速即时检测十分重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于恒温扩增法的用于检测新型冠状病毒(SARS-COV-2) ORF1ab基因和N基因的试剂盒。
本发明的另一目的在于提供一种基于恒温扩增法的用于检测新型冠状病毒(SARS-COV-2)ORF1ab基因和N基因的试纸条。
本发明的另一目的在于提供一种基于恒温扩增法的用于检测新型冠状病毒(SARS-COV-2)ORF1ab基因和N基因的引物对组。
本发明的另一目的在于提供一种基于恒温扩增法的用于检测新型冠状病毒(SARS-COV-2)ORF1ab基因和N基因的引物探针混合液。
本发明的另一目的在于提供一种基于恒温扩增法的新型冠状病毒(SARS-COV-2)ORF1ab 基因和N基因的检测方法。
为解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一种基于恒温扩增法的用于检测新型冠状病毒(SARS-COV-2)ORF1ab基因和N基因的引物对组，所述引物对组包括：
第一引物对(特异性靶向ORF1ab基因)，所述第一引物对包括如序列SEQ ID NO：1所示的正向引物和如序列SEQ ID NO：2所示的反向引物；
第二引物对(特异性靶向N基因)，所述第二引物对包括如序列SEQ ID NO：3所示的正向引物和如序列SEQ ID NO：4所示的反向引物。
本发明第二方面提供了一种基于恒温扩增法的用于检测新型冠状病毒(SARS-COV-2) ORF1ab基因和N基因的引物探针混合液，所述引物探针混合液包括本发明第一方面所述的引物对组和选自下组的一种或几种探针：
第一探针，特异性靶向ORF1ab基因；和
第二探针，特异性靶向N基因。
在一些优选的方案中，所述第一探针的序列如SEQ ID NO：5所示；和/或
所述第二探针的序列如SEQ ID NO：6所示。
在一些优选的方案中，序列SEQ ID NO：2具有第一标记；
序列SEQ ID NO：4具有第二标记；
序列如SEQ ID NO：5具有第三标记；
序列如SEQ ID NO：6具有第四标记；且
所述第一标记、所述第二标记、所述第三标记和所述第四标记互不相同。
上述SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：6序列信息如下表所示：
上述SEQ ID NO：5中，“G/THF/C”表示第三十位碱基G和第三十一位碱基C之间修饰有THF。
上述SEQ ID NO：6中，“C/THF/A”第三十二位碱基C和第三十三位碱基A之间修饰有THF。
在一些优选的方案中，所述第一标记、所述第二标记、所述第三标记和所述第四标记分别独立地选自生物素、地高辛、异硫氰酸荧光素和罗丹明荧光素。
本发明第三方面提供了一种基于恒温扩增法的用于检测新型冠状病毒(SARS-COV-2) ORF1ab基因和N基因的试剂盒，所述试剂盒包括：第一容器、第二容器和试纸条；
所述第一容器包括本发明第二方面所述的引物探针混合液；
所述第二容器包括扩增反应酶系。
在一些优选的方案中，所述扩增反应酶系包括识别单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。
在一些优选的方案中，所述试纸条包括：底板、固定于所述底板的样品垫、标记垫、层析膜和吸水垫；
所述样品垫、所述标记垫、所述层析膜和所述吸水垫依次排列在底板上且顺次接触。
在一些优选的方案中，所述标记垫上包被有微球和质控试剂；所述微球中至少部分具有第五标记，其中，所述第五标记可与选自所述第一标记和所述第三标记中的任一个特异性结合并不与另一个特异性结合；和
所述微球中至少部分具有与第五标记不相同的第六标记，其中，所述第六标记可与选自所述第二标记和所述第四标记中的任一个特异性结合并不与另一个特异性结合；且
所述微球不同时具有第五标记和第六标记。
在一些优选的方案中，所述层析膜靠近标记垫的一端依次设置有第一检测线和第二检测线；所述第一检测线上包被有第一检测试剂，所述第一检测试剂可与选自所述第一标记和所述第三标记中不与所述第五标记特异性结合的一个特异性结合；且
所述第二检测线上包被有第二检测试剂，所述第二检测试剂可与选自所述第二标记和所述第四标记中不与所述第六标记特异性结合的一个特异性结合。
在一些优选的方案中，所述层析膜远离标记垫的一端设置有质控线。
在一些优选的方案中，所述质控线上包被有质控试剂，所述质控试剂可与第五和/或第六标记特异性结合。
在一些优选的方案中，在所述第一检测线上，所述第一检测试剂的包被量是1mg/mL。
在一些优选的方案中，在所述第二检测线上，所述第二检测试剂的包被量是1mg/mL。
在一些优选的实施方案中，所述第一标记为生物素；所述第二标记为地高辛；所述第三标记为异硫氰酸荧光素；所述第四标记为罗丹明荧光素；所述第五标记为抗异硫氰酸荧光素抗体；所述第六标记为抗罗丹明荧光素抗体；所述第一检测试剂为链霉亲和素；和所述第二检测试剂为抗地高辛抗体。
在一些优选的实施方案中，所述第一标记为地高辛；所述第二标记为生物素；所述第三标记为罗丹明荧光素；所述第四标记为异硫氰酸荧光素；所述第五标记为抗罗丹明荧光素抗体；所述第六标记为抗异硫氰酸荧光素抗体；所述第一检测试剂为抗地高辛抗体；和所述第二检测试剂为链霉亲和素。
在一些优选的实施方案中，所述第一标记为异硫氰酸荧光素；所述第二标记为生物素；所述第三标记为罗丹明荧光素；所述第四标记为地高辛；所述第五标记为抗罗丹明荧光素抗体；所述第六标记为抗地高辛抗体；所述第一检测试剂为抗异硫氰酸荧光素抗体；和所述第二检测试剂为链霉亲和素。
在一些优选的实施方案中，所述第一标记为罗丹明荧光素；所述第二标记为地高辛；所述第三标记为异硫氰酸荧光素；所述第四标记为生物素；所述第五标记为抗异硫氰酸荧光素抗体；所述第六标记为链霉亲和素；所述第一检测试剂为抗罗丹明荧光素抗体；和所述第二检测试剂为抗地高辛抗体。
本发明的第四方面提供了一种使用本发明第三方面所述的试剂盒检测新型冠状病毒 (SARS-COV-2)ORF1ab基因和N基因的方法，所述方法包括步骤：
(i).将待检样本、所述扩增反应酶系和所述引物探针混合液相互接触；和
(ii).将步骤(i)所得混合液与所述样品垫接触进行免疫层析反应；和
(ii).判断所述第一检测线、所述第二检测线和所述质控线的颜色变化。
本发明相对于现有技术而言，至少具有下述优点：
(1)本发明提供的用于同时检测新型冠状病毒(SARS-COV-2)ORF1ab基因和N基因的试剂盒，基于恒温扩增技术，扩增速度快且不需要特殊仪器设备，无须变温，使得检测成本大大降低，适宜设备落后的基层医院或社区大规模检测；
(2)本发明提供的用于同时检测新型冠状病毒(SARS-COV-2)ORF1ab基因和N基因的试剂盒，在恒温扩增技术的基础上，结合免疫层析技术，试纸条可随身携带，大大提高了检测的便利性，5分钟内即可得到结果，节约了检测时间；
(3)本发明提供的用于同时检测新型冠状病毒(SARS-COV-2)ORF1ab基因和N基因的试剂盒，其引物探针序列和反应体系经过大量实验优化，灵敏度和特异性高，假阴性和假阳性率低，检测准确性高。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。
图1是根据本发明实施例中检测试纸条示意图；
图2是根据本发明实施例中判读结果示意图；
图3是根据本发明实施例中SARS假病毒判读结果图；
图4是根据本发明实施例中MERS假病毒判读结果图；
图5是根据本发明实施例中新冠国家标准品1判读结果图；
图6是根据本发明实施例中新冠国家标准品2判读结果图；
图7是根据本发明实施例中新冠国家标准品3判读结果图；
图8是根据本发明实施例中对照品水的判读结果图；
图9是根据本发明实施例中对比例2检测试纸条判读结果图；
图10是根据本发明实施例中对比例2检测试纸条判读结果图；
图11是根据本发明实施例中对比例2检测试纸条判读结果图。
具体实施方式
现有技术中，新型冠状病毒的核酸检测主要的依赖PCR仪器，成本高，检测结果无法实时获取，而实时获取核酸检测结果的抗原检测也存在着假阳性率高的缺陷。本发明人通过广泛而深入的研究，开发了基于恒温核酸扩增技术的新型冠状病毒恒温检测试剂盒，其准确率高，不依赖昂贵的仪器，能够即时获取检测结果，方便社区组织居家自测。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
除非另有指明，本文所用的技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义，需要注意的是，本文所用的术语仅为了描述具体实施方式，而非意图限制本申请的示例性实施方式。
实施例1、基于恒温扩增-免疫层析法的用于检测新型冠状病毒(SARS-COV-2)ORF1ab 基因和N基因的试剂盒的制备及使用方法
(1)引物探针组合
ORF1ab基因：
正向引物：5’-CGTTCTTGAGTGTAATGTGAAAACTACCGA-3’
反向引物：5’-TAGTAAGACTAGAATTGTCTACATAAGCAGC-3’
探针：5’-ATAATAGTTTAAAAATTACAGAAGAGGTTG/THF/CCACACAGATCTAAT-3’
N基因：
正向引物：5’-CCTTGAATACACCAAAAGATCACATTGGCACC-3’
反向引物：5’-CGTGATGAGGAACGAGAAGAGGCTTGACTGC-3’
探针:5’- CAATCCTGCTAACAATGCTGCAATCGTGCTAC/THF/ACTTCCTCAAGGAAC-3’
(2)标记引物探针
采用如下表1中的任一方式对(1)中引物探针进行标记。
表1
(3)反应体系的配制
按照下表2配制反应体系。
表2
| 名称 | 浓度范围 | 最优选浓度 |
| nfo | 20-50U | 30U |
| gp32 | 100-250ng/μL | 200ng/μL |
| UvsX | 5-20pmol/μL | 8pmol/μL |
| UvsY | 5-20pmol/μL | 4pmol/μL |
| Bsu | 2-10U | 3U |
| MMLV | 2-20U | 3U |
| DNTPs | 100-500μM | 200μM |
| Tris-HCl pH 8.8 | 10-150mM | 70mM |
| DTT | 15mM | 15mM |
| ATP | 1-10mM | 3mM |
| Phosphocreatine | 1-50mM | 20mM |
| Creatine kinase | 10-200ng/μL | 150ng/μL |
| PEG | 1-50％ | 10％ |
| 引物探针混合液 | 0.1-1.5pmol/μL | 0.5pmol/μL |
| Mg2+ | 10-17mM | 12.5mM |
注：模板采用达安样本释放剂(货号：DA0940)进行裂解，添加模板及水补足体积至25μL。
(4)试纸条的制备
(4.1)样品垫的制备方法如下：
将样品垫裁成20mm×300mm的大小，浸泡在样品垫缓冲液中，1小时之后取出，于室温干燥16-18小时。
样品垫的缓冲液配方如下：1％BSA、1％蔗糖、0.5％Tween-20溶解于0.01M PBS(pH7.4)缓冲液中。
(4.2)标记垫的制备方法如下：
将聚酯纤维素膜裁为10mm×300mm，将标记了胶体金的兔抗罗丹明抗体和标记了胶体金的兔抗异硫氰酸抗体，分别用喷金划膜仪喷至聚酯纤维素膜上，喷量为1～5μL/cm(优选 3μL/cm)，放入37℃烘箱，干燥12～15小时。
A：胶体金标记兔抗罗丹明抗体，其具体步骤如下：
在1ml 40nm胶体金溶液中加入5μL的0.2M碳酸钾；加入2μL 10mg/mL的兔抗罗丹明抗体溶液，室温震荡反应30min。向其中加入10％牛血清白蛋白100μL，室温震荡反应30min。10000rpm离心30min，弃上清，收集沉淀。加入100μL金标复溶液，充分混匀。所述的金标复溶液为含0.5wt％BSA，10wt％蔗糖，0.5wt％吐温-20和0.1wt％聚乙烯吡咯烷酮的0.05M 的pH9.0的Tris-HCl缓冲液。
B：胶体金标记兔抗异硫氰酸抗体，其具体步骤如下：
在1ml 40nm胶体金溶液中加入5μL的0.2M碳酸钾；加入2μL 10mg/mL的兔抗异硫氰酸抗体溶液，室温震荡反应30min。向其中加入10％牛血清白蛋白100μL，室温震荡反应30min。 10000rpm离心30min，弃上清，收集沉淀。再加入100μL金标复溶液，充分混匀。所述的金标复溶液为含0.5wt％BSA，10wt％蔗糖，0.5wt％吐温-20和0.1wt％聚乙烯吡咯烷酮的0.05M 的pH9.0的Tris-HCl缓冲液。
(4.3)包被膜的制备方法是：
包被：
质控线(C线)：C线与硝酸纤维素膜上缘的距离为8.5mm，用0.01M的PBS(pH7.4)将羊抗兔多克隆抗体稀释到1.0mg/mL包被于C线处，划线浓度为1μL/cm，速度100mm/s。
检测线(T1与T2线)：C线与T2线的距离为4mm、T2线与T1线的距离为4mm，T1线与硝酸纤维素膜下缘的距离为8.5mm，用0.01M的PBS(pH7.4)将多聚链霉亲和素稀释到 1mg/mL进行包被于T1线处，划线浓度为1μL/cm，速度100mm/s；用0.01M的PBS(pH7.4) 将地高辛抗体稀释到1mg/mL包被于T2线处，划线浓度为1μL/cm，速度100mm/s。
干燥：
放入37℃烘箱，干燥12～15小时。检测试纸条的组装方法如下：
如图1所示，检测试纸条包括底板7，固定于底板7上的样品垫1、标记垫2及层析膜3；样品垫1部分覆盖在标记垫2上，样品垫1设有加样区，加样区设置在样品垫1的不与标记垫2重叠的部分。层析膜3部分被标记垫2覆盖，层析膜3上划有第一检测线4a(包被多聚链霉亲和素)和第二检测线4b(包被地高辛抗体)及质控线5(包被羊抗兔IgG)，检测线4 划在靠近层析膜3上靠近标记垫2的一端，质控线5划在层析膜3上背离标记垫2的一端。此外，底板7上固定有吸水纸6，吸水纸6的一端部分覆盖在层析膜3上，用于吸收层析后多余的样品。
使用时，样品从样品垫1的加样区依次流经标记垫2、层析膜3上的第一检测线4a和第二检测线4b及质控线5，流至吸水纸6。
(5)扩增反应及检测
42℃恒温孵育10-30min(优选时间为20min)，开盖加入5-50倍反应体积的水(优选10 倍)，插入步骤(4)中制备好的试纸条读取检测结果。检测结果根据下表3进行判读。判读结果示意图可参考图2。
表3
| 检测线4a | 检测线4b | 质控线 | 结果 |
| 显色 | 显色 | 显色 | 阳性 |
| 显色 | 显色 | 不显色 | 稀释模板浓度复测 |
| 不显色 | 不显色 | 显色 | 阴性 |
| 不显色 | 不显色 | 不显色 | 失效 |
| 显色 | 不显色 | 不显色 | 失效 |
| 不显色 | 显色 | 不显色 | 失效 |
注：“质控线”若不显色，则为失效，需重新复测。
实施例2、试剂盒特异性验证
使用上述体系检测SARS假病毒和MERS假病毒(购自广州邦德盛生物科技有限公司)，与新冠国家标准品(购自中国计量科学研究院)进行对照。检测结果如下表4和图3-8所示。
表4
本发明人在实验过程中还设计了多组引物和探针序列，详见表5，并依次制备成检测试纸条进行检测，结果见图9-11。可见，使用了本发明中的多组引物探针序列后，试纸条准确度更好。
表5
上述SEQ ID NO：11中，“T/THF/A”表示第三十一位碱基T和第三十二位碱基A之间修饰有THF。
上述SEQ ID NO：12中，“G/THF/C”表示第三十一位碱基G和第三十二位碱基C之间修饰有THF。
上述SEQ ID NO：17中，“A/THF/A”表示第三十位碱基A和第三十一位碱基A之间修饰有THF。
上述SEQ ID NO：18中，“A/THF/T”表示第三十位碱基A和第三十一位碱基T之间修饰有THF。
上述SEQ ID NO：23中，“G/THF/A”表示第三十一位碱基G和第三十二位碱基A之间修饰有THF。
上述SEQ ID NO：24中，“A/THF/C”表示第三十位碱基A和第三十一位碱基C之间修饰有THF。
实施例3、灵敏度测试
选取已知浓度的含有2019-nCoV靶基因的假病毒，进行10倍浓度梯度稀释，每个梯度的稀释液单独重复3份，将具有100％阳性检出率的最低稀释度浓度作为估计检测限，估计检测限确定后，将2019-nCoV假病毒稀释到估计检测限浓度值附近，并用试剂盒进行检测，每个浓度检测20次，以对最低检测限浓度进行进一步精确确定(选阳性率在95％以上的稀释度作为本试剂盒检测限灵敏度)。
表6 2019-nCoV假病毒实验结果-检测限的确定
根据以上结果，本发明所述的试剂盒的灵敏度为1×80copies/mL。
实施例4、临床测试
使用本发明试剂盒和参比试剂盒共测定样本1081例，按照本发明试剂盒和参比试剂盒说明书进行检测，结果如下：
表7本发明试剂盒和参比试剂盒检测结果
不一致的样本送医院诊断，结果为医院诊断结果为新型肺炎确诊病例。
临床验证以《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南》、《新型冠状病毒感染的肺炎病例监测方案(第二版)》推荐方法得到的确诊/排除结果做比对，在临床试验中共入组有“临床确诊/排除”结果的病例数为331例，将本发明试剂盒试剂检测结果与临床确诊/排除结果进行统计分析如下：
表8本发明试剂检测结果和临床确诊/排除结果(四格表)
由上述结果可知，对本发明试剂与参比试剂对临床样本测定结果进行比较，通过计数资料的χ2检验表明两种方法的检测结果无差别，阳性符合率、阴性符合率、总符合率都在95％以上，一致性Kappa值在0.75以上，说明本发明试剂盒与参比试剂盒符合性、一致性良好，与临床确诊/排除结果符合性、一致性良好。因此，本发明试剂盒具有良好的临床应用性能。
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州达安基因股份有限公司
<120> 用于检测新型冠状病毒（SARS-COV-2）ORF1ab基因和N基因的试剂盒及其使
用方法
<130> P220009-1CNCNA9
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
cgttcttgag tgtaatgtga aaactaccga 30
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
tagtaagact agaattgtct acataagcag c 31
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
ccttgaatac accaaaagat cacattggca cc 32
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
cgtgatgagg aacgagaaga ggcttgactg c 31
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 5
ataatagttt aaaaattaca gaagaggttg ccacacagat ctaat 45
<210> 6
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 6
caatcctgct aacaatgctg caatcgtgct acacttcctc aaggaac 47
<210> 7
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 7
caacaaactg ttggtcaaca agacggcagt gagg 34
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 8
caatgtctgc atttttaatg tatacattgt cag 33
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 9
actgtcacta agaaatctgc tgctgaggct 30
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 10
tcagttcctt gtctgattag ttcctggtcc 30
<210> 11
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 11
attcaaacaa ttgttgaggt tcaacctcaa tagagatgga acttaca 47
<210> 12
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 12
gcttctaaga agcctcggca aaaacgtact gcactaaagc atacaa 46
<210> 13
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 13
gttagatgat gatagtcaac aaactgttgg tcaac 35
<210> 14
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 14
gtatacattg tcagtaagtt ttaaataacc act 33
<210> 15
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 15
caaggccaaa ctgtcactaa gaaatctgct gc 32
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 16
ccatgccaat gcgcgacatt ccgaagaacg 30
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<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 17
caaacaattg ttgaggttca acctcaatta agatggaact tacac 45
<210> 18
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 18
ctaagaagcc tcggcaaaaa cgtactgcca taaagcatac aatgt 45
<210> 19
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<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 19
aaactgttgg tcaacaagac ggcagtgagg acaat 35
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<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 20
gttttaaata accactaaaa ctattcactt caatag 36
<210> 21
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 21
tgtcactaag aaatctgctg ctgaggcttc taaga 35
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 22
tccttgggtt tgttctggac cacgtctgcc 30
<210> 23
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 23
aattgttgag gttcaacctc aattagagat gaacttacac cagttgt 47
<210> 24
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 24
aaacgtactg ccactaaagc atacaatgta cacaagcttt cggcag 46
Claims (10)
1.一种用于检测新型冠状病毒(SARS-COV-2)ORF1ab基因和N基因的引物对组，其特征在于，所述引物对组包括：
第一引物对(特异性靶向ORF1ab基因)，所述第一引物对包括如序列SEQ ID NO：1所示的正向引物和如序列SEQ ID NO：2所示的反向引物；和
第二引物对(特异性靶向N基因)，所述第二引物对包括如序列SEQ ID NO：3所示的正向引物和如序列SEQ ID NO：4所示的反向引物。
2.一种用于检测新型冠状病毒(SARS-COV-2)ORF1ab基因和N基因的引物探针混合液，其特征在于，所述引物探针混合液包括如权利要求1所述的引物对组，和选自下组的一种或几种探针：
第一探针，特异性靶向ORF1ab基因；和
第二探针，特异性靶向N基因。
3.根据权利要求2所述的引物探针混合液，其特征在于，所述第一探针的序列如SEQ IDNO：5所示；和/或
所述第二探针的序列如SEQ ID NO：6所示。
4.根据权利要求3所述的引物探针混合液，其特征在于，序列SEQ ID NO：2具有第一标记；
序列SEQ ID NO：4具有第二标记；
序列如SEQ ID NO：5具有第三标记；
序列如SEQ ID NO：6具有第四标记；且
所述第一标记、所述第二标记、所述第三标记和所述第四标记互不相同。
5.根据权利要求4所述的引物探针混合液，其特征在于，所述第一标记、所述第二标记、所述第三标记和所述第四标记分别独立地选自生物素、地高辛、异硫氰酸荧光素和罗丹明荧光素。
6.一种用于检测新型冠状病毒(SARS-COV-2)ORF1ab基因和N基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：第一容器、第二容器和试纸条；
所述第一容器包括如权利要求2-5中任一项所述的引物探针混合液；
所述第二容器包括扩增反应酶系。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试纸条包括：底板、固定于所述底板的样品垫、标记垫、层析膜和吸水垫；
所述样品垫、所述标记垫、所述层析膜和所述吸水垫依次排列在底板上且顺次接触；
所述标记垫上包被有微球和质控试剂；所述微球中至少部分具有第五标记，其中，所述第五标记可与选自所述第一标记和所述第三标记中的任一个特异性结合并不与另一个特异性结合；和
所述微球中至少部分具有与第五标记不相同的第六标记，其中，所述第六标记可与选自所述第二标记和所述第四标记中的任一个特异性结合并不与另一个特异性结合；且
所述微球不同时具有第五标记和第六标记。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述层析膜靠近标记垫的一端依次设置有第一检测线和第二检测线；所述第一检测线上包被有第一检测试剂，所述第一检测试剂可与选自所述第一标记和所述第三标记中不与所述第五标记特异性结合的一个特异性结合；且
所述第二检测线上包被有第二检测试剂，所述第二检测试剂可与选自所述第二标记和所述第四标记中不与所述第六标记特异性结合的一个特异性结合。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，在所述第一检测线上，所述第一检测试剂的包被量是1mg/mL；和/或
在所述第二检测线上，所述第二检测试剂的包被量是1mg/mL。
10.一种使用如权利要求6至9中任一项所述的试剂盒检测新型冠状病毒(SARS-COV-2)ORF1ab基因和N基因的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(i).将待检样本、所述扩增反应酶系和所述引物探针混合液相互接触；和
(ii).将步骤(i)所得混合液与所述样品垫接触进行免疫层析反应；和
(ii).判断所述第一检测线、所述第二检测线和所述质控线的颜色变化。
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