CN117230197A - 一种用于膀胱癌多靶标检测的引物和探针组合物及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于膀胱癌多靶标检测的引物和探针组合物及试剂盒，所述引物和探针组合物包括分别用于检测SEPTIN9基因甲基化、MAL基因甲基化、AIM1基因甲基化的引物和相应探针。本发明应用甲基化特异性荧光定量PCR方法检测疑似膀胱癌患者尿沉渣细胞中SEPTIN‑9、MAL、AIM1基因位点甲基化情况，使血尿且临床怀疑有膀胱癌者的检出率超过93％，而特异性达到93％以上。本发明检测性能与尿液细胞学和FISH检测方法对比有显著优势。同时，本发明甲基化特异性荧光定量PCR的检出结果判断更加客观，更为准确，为临床医生带来了更多便捷和确定性。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及一种用于膀胱癌多靶标检测的引物和探针组合物及试剂盒。
背景技术
膀胱癌(bladder cancer，BC)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，占泌尿系肿瘤的首位，其发病率和复发率有逐年增加的趋势。据统计，我国每年约有145,000例患者死于膀胱肿瘤。膀胱癌多发于五十岁以上，男性发病率为女性的3～4倍。在来源于上皮组织的膀胱癌中，约90％为移行上皮癌；非上皮性膀胱肿瘤较少见，主要包括未分化癌、鳞状细胞癌、腺癌。浅表性膀胱癌早期诊断通常有较好的预后，但膀胱癌的复发率为60％～70％，居所有实体瘤的首位，其中11％的复发患者会发展为浸润性膀胱癌，患者术后通常需每年进行3～4次膀胱镜检查。
目前手术治疗、放疗和化疗的疗效并不令人满意，5年存活率在40％～60％。预后差和易复发是膀胱癌的重要特点，有效的治疗依赖膀胱癌的早期诊断与早期治疗。但膀胱癌发病隐匿，大部分患者都是因为肉眼或镜下血尿才会到医院就诊，而此时往往已是癌症晚期。因此寻找敏感性高特异性好的膀胱癌早期诊断方法具有重要的临床意义。早期发现膀胱癌可以增加手术保留膀胱的机会并提高患者总体生存率，因此，如何早期发现膀胱肿瘤以及术后如何早期检测到膀胱肿瘤的复发具有重要的临床意义和价值。
传统的膀胱癌检查包括肿瘤标志物检测、尿液细胞学检测、FISH检测和膀胱镜检查。在临床上被应用的膀胱癌肿瘤标记物蛋白包括NMP22(Nuclear Matrix ProteinNumber 22)和BTA(bladder tumor antigen)，这两个标记物都存在敏感性和特异性不理想的情况(NMP22敏感性40％，特异性99％；BTA敏感性66％，特异性65％，文献报道结果会有一定程度的差异)。荧光原位杂交(FISH)方法是当前临床较为常用的方法，采用荧光标记的核酸探针检测3、7、17、9p21号染色体上的着丝点，以确定染色体有无与膀胱癌相关的非整倍体。FISH检测的效能同样不够理想(敏感性72％，特异性83％，文献报道有一定程度差异)。膀胱镜检查为有创检查，费用较高且会给患者带来一定的感染风险，而且其结果还会受操作者水平及主观性影响。细胞学活检则存在灵敏度低的缺陷(38％左右)，而且高度依赖检查者的经验和水平。
因此，无创、高敏感性、高特异性的检测方法的开发是膀胱癌检测和监控亟需解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服背景技术的技术缺陷，提供一种一种用于膀胱癌多靶标检测的引物和探针组合物及试剂盒。本发明提供了一种采用尿液无创检测膀胱癌的分子诊断方法及试剂盒，特点是快速、简捷、可自动化、标准化的进行临床诊断。与现有技术相比，本发明的方法及试剂盒具有快速简捷、可标准化、可自动化操作、检测结果准确可靠的特点，且具有较高的临床阳性预测值和阴性预测值。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
一种用于膀胱癌多靶标检测的引物和探针组合物，所述引物和探针组合物包括分别用于检测SEPTIN9基因甲基化、MAL基因甲基化、AIM1基因甲基化的引物和相应探针；
所述用于检测SEPTIN9基因甲基化的正向引物序列为5’-GCGTTGAAGTCGGGTCGG-3’，如SEQ ID NO:1所示，其反向引物序列为5’-CCCGTACTTCGCTAACTTTTTATC-3’，如SEQ IDNO:2所示，其探针序列为5’-ACAAACGCGAACCGAACGACTTAA-3’，如SEQ ID NO:3所示；
所述用于检测MAL基因甲基化的正向引物序列为5’-GAAGGGGCGTGACGCCGATA-3’，如SEQ ID NO:4所示，其反向引物序列为5’-CCGAACAACCCGCCAAGGAC-3’，如SEQ ID NO:5所示，其探针序列为5’-TGACGTCGCGCGGGTTAAGCCT-3’，如SEQ ID NO:6所示；
所述用于检测AIM1基因甲基化的正向引物序列为5’-TTCGGGAGTTAGTTCCAAGGTTA-3’，如SEQ ID NO:7所示，其反向引物序列为5’-ACCGCCGAACATCCCCATTG-3’，如SEQ ID NO:8所示，其探针序列为5’-TCGTCGTTTAGGTTTACCGA-3’，如SEQ ID NO:9所示。
优选地，所述用于检测SEPTIN9基因甲基化的探针5’端添加荧光报告基团CY5，探针3’端添加荧光猝灭基团BHQ-2；
所述用于检测MAL基因甲基化的探针5’端添加荧光报告基团ROX，探针3’端添加荧光猝灭基团BHQ-2；
所述用于检测AIM1基因甲基化的探针5’端添加荧光报告基团FAM，探针3’端添加荧光猝灭基团BHQ-1。
优选地，所述引物和探针组合物包括用于检测β-ACTIN内参基因的引物和相应探针；所述用于检测β-ACTIN内参基因的正向引物序列为5’-TCGTCGTGTACGGTTCCGGA-3’，如SEQ ID NO:10所示，其反向引物序列为5’-ACGACGCGAAACGTATTACCG-3’，如SEQ ID NO:11所示，其探针序列为5’-TCGGGTGAGGGTTTGGTTACG-3’，如SEQ ID NO:12所示。
优选地，所述用于检测β-ACTIN内参基因的探针5’端添加荧光报告基团VIC，探针3’端添加荧光猝灭基团BHQ-1。
本发明用于检测SEPTIN9基因甲基化、MAL基因甲基化、AIM1基因甲基化、β-ACTIN内参基因的引物和相应探针具体如下表所示：
一种用于膀胱癌多靶标检测的试剂盒，包括如上所述的一种用于膀胱癌多靶标检测的引物和探针组合物。
本发明用于膀胱癌多靶标检测的试剂盒包括PCR反应液和Taq酶、以及阳性对照和阴性对照。PCR反应液包括各基因引物和探针组合物、MgCl2、dNTP和缓冲液。各基因引物和探针组合物的工作浓度均为0.25μM，MgCl2的工作浓度为2.5mM，dNTP的工作浓度为0.125mM，Taq酶的工作浓度为0.075U/μl，PCR反应体系总体积为20μl。阳性对照应用阳性细胞株提取DNA，阴性对照应用健康人WBC(白细胞)DNA。各基因扩增时CT值>35，可判定为阴性。
如上所述的一种用于膀胱癌多靶标检测的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
离心尿液收集脱落细胞并提取其核酸，对提取的核酸进行亚硫酸氢盐转化及纯化，然后选取多个特定基因(SEPTIN9、MAL、AIM1)启动子区域CpG岛进行甲基化特异性PCR、MGB TaqMan探针检测，含有人类基因组DNA数量的内参(β-ACTIN)引物探针用作归一化处理，判读特定基因启动子区域CpG岛甲基化程度，超过给定阈值的为高度甲基化，判为阳性，即为膀胱癌高度风险；根据3个靶基因的组合，任一阳性信号可分别用作诊断膀胱癌和膀胱癌转移等预后风险的指标。
本发明的基本原理：
本发明应用甲基化特异性荧光定量PCR技术开发对膀胱癌的早期诊断试剂盒。DNA甲基化是表型修饰的一种方式，与癌症的发生密切相关，尤其是CpG岛区的启动子甲基化通常会导致抑癌基因转录沉默，从而影响肿瘤的发生。由于DNA甲基化几乎在所有癌症中均被证明，而且发生在癌前或者癌症早期阶段，因此已成为癌症早期诊断的理想标志物。
本发明首先将尿沉渣细胞中的DNA抽提成功后，再经亚硫酸盐处理，其中非甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。针对处理后的甲基化链设计引物和探针组合物，在PCR反应时，若处理后的链被扩增出说明检测位点发生了甲基化。
本发明从研究数据中筛选出3条重要的基因(SEPTIN-9、MAL、AIM1)的CpG岛区启动子甲基化位点，对这些位点甲基化进行检测。这3个基因中，只要有一个基因的启动子区域的CpG岛区启动子发生甲基化，就表示膀胱癌的发生。通过用3对引物对疑似膀胱癌患者的尿沉渣细胞DNA进行综合检测，对疑似患者进行辅助性诊断，检测体系以β-ACTIN为内参。经过对这3个基因甲基化位点分析后，本发明对每个位点反复合成和筛选了相关引物，最后得到3对能稳定有效工作的引物和探针，对疑似膀胱癌患者的尿沉渣DNA样本进行检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明应用甲基化特异性荧光定量PCR方法检测疑似膀胱癌患者尿沉渣细胞中SEPTIN-9、MAL、AIM1基因位点甲基化情况，使血尿且临床怀疑有膀胱癌者的检出率超过93％，而特异性达到93％以上。本发明检测性能与尿液细胞学和FISH检测方法对比有显著优势。同时，本发明甲基化特异性荧光定量PCR的检出结果判断更加客观，更为准确，为临床医生带来了更多便捷和确定性。
附图说明
图1为本发明SEP-9敏感度测试结果(线条a：10ng 100％、线条b：10ng 10％、线条c：10ng 1％、线条d：10ng 0％)；
图2为本发明MAL敏感度测试结果(线条a：10ng 100％、线条b：10ng 10％、线条c：10ng 1％、线条d：10ng 0％)；
图3为本发明AIM1敏感度测试结果(线条a：10ng 100％、线条b：10ng 10％、线条c：10ng 1％、线条d：10ng 0％)；
图4为本发明实施例1中的1号患者的荧光定量PCR的检测结果(线条a：SEPTIN-9扩增曲线、线条b：MAL扩增曲线、线条c：AIM1扩增曲线、线条d：β-ACTIN扩增曲线)；
图5为本发明实施例2中的1号患者的荧光定量PCR的检测结果(线条a：SEPTIN-9扩增曲线、线条b：MAL扩增曲线、线条c：AIM1扩增曲线、线条d：β-ACTIN扩增曲线)。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施例和附图作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于对本发明进一步说明，而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明所述的内容后，该领域的技术人员对本发明作出一些非本质的改动或调整，仍属于本发明的保护范围。
本发明提供了一种用于膀胱癌多靶标检测的引物和探针组合物，所述引物和探针组合物包括分别用于检测SEPTIN9基因甲基化、MAL基因甲基化、AIM1基因甲基化、β-ACTIN内参基因的引物和相应探针；
所述用于检测SEPTIN9基因甲基化的正向引物序列为5’-GCGTTGAAGTCGGGTCGG-3’，如SEQ ID NO:1所示，其反向引物序列为5’-CCCGTACTTCGCTAACTTTTTATC-3’，如SEQ IDNO:2所示，其探针序列为5’-ACAAACGCGAACCGAACGACTTAA-3’，如SEQ ID NO:3所示；
所述用于检测MAL基因甲基化的正向引物序列为5’-GAAGGGGCGTGACGCCGATA-3’，如SEQ ID NO:4所示，其反向引物序列为5’-CCGAACAACCCGCCAAGGAC-3’，如SEQ ID NO:5所示，其探针序列为5’-TGACGTCGCGCGGGTTAAGCCT-3’，如SEQ ID NO:6所示；
所述用于检测AIM1基因甲基化的正向引物序列为5’-TTCGGGAGTTAGTTCCAAGGTTA-3’，如SEQ ID NO:7所示，其反向引物序列为5’-ACCGCCGAACATCCCCATTG-3’，如SEQ ID NO:8所示，其探针序列为5’-TCGTCGTTTAGGTTTACCGA-3’，如SEQ ID NO:9所示；
所述用于检测β-ACTIN内参基因的正向引物序列为5’-TCGTCGTGTACGGTTCCGGA-3’，如SEQ ID NO:10所示，其反向引物序列为5’-ACGACGCGAAACGTATTACCG-3’，如SEQ IDNO:11所示，其探针序列为5’-TCGGGTGAGGGTTTGGTTACG-3’，如SEQ ID NO:12所示。
所述用于检测SEPTIN9基因甲基化的探针5’端添加荧光报告基团CY5，探针3’端添加荧光猝灭基团BHQ-2；
所述用于检测MAL基因甲基化的探针5’端添加荧光报告基团ROX，探针3’端添加荧光猝灭基团BHQ-2；
所述用于检测AIM1基因甲基化的探针5’端添加荧光报告基团FAM，探针3’端添加荧光猝灭基团BHQ-1；
所述用于检测β-ACTIN内参基因的探针5’端添加荧光报告基团VIC，探针3’端添加荧光猝灭基团BHQ-1。
本发明提供了一种采用尿液无创检测膀胱癌的分子诊断方法与试剂，应用QIAGEN公司的DNA提取试剂盒进行操作，包括如下步骤：
一、DNA提取
收集疑有膀胱癌患者的晨尿，2小时以内离心留取沉渣-20℃冻存待检；检测时，按照下述流程进行操作：
(1)将不大于5×106的细胞300g(190rpm)离心5分钟，重悬于200μlPBS中，加入20μl K蛋白酶；
(2)加入200μL AL缓冲液，漩涡震荡，充分混匀；(血液样本在56℃孵育10分钟)
(3)加入200μl乙醇(96％～100％)，漩涡混匀；
(4)将上述混合物转移到DNeasy Mini spin柱上，≥6000g(8000rpm)离心1分钟，弃滤液；
(5)加入500μl AW1缓冲液，≥6000g(8000rpm)离心1分钟，弃滤液；
(6)加入500μl AW2缓冲液，≥20000g(14000rpm)离心3分钟，弃滤液及收集管；
(7)将DNeasy Mini spin柱转移至干净的1.5ml EP管中；
(8)加入200μl AE缓冲液洗脱柱膜上的DNA，室温下(15～25℃)孵育1分钟，≥6000xg(8000rpm)离心1分钟。(可重复一次增加产出)
二、DNA硫化
解冻DNA样本后，按照下表配置反应体系：
置于PCR仪上进行DNA重硫酸盐化，程序如下：
| 步骤 | 时间 | 温度 |
| 变性(Denaturation) | 5min | 95℃ |
| 孵育(Incubation) | 25min | 60℃ |
| 变性(Denaturation) | 5min | 95℃ |
| 孵育(Incubation) | 85min | 60℃ |
| 变性(Denaturation) | 5min | 95℃ |
| 孵育(Incubation) | 175min | 60℃ |
| 保持(Hold) | 20℃ |
然后，将上述溶液转移至1.5ml EP管中，加入560μl BL缓冲液，漩涡混匀，简单离心。
接着按如下步骤进行操作：
(1)将得到的溶液转移至EpiTect spin column中，最大转速离心1分钟，弃去滤液；
(2)加入500μl BW缓冲液，最大转速离心一分钟，弃去滤液；
(3)加入500μl BD缓冲液，室温下(15～25℃)15分钟，最大转速离心1分钟，弃滤液；
(4)加入500μl BW缓冲液，最大转速离心一分钟，弃去滤液；(重复一次)
(5)将柱子转移到新的收集管中，最大转速空转1分钟以去除残留液体；
(6)打开盖子，在56℃下培养5分钟以去除残留液体；
(7)将柱子置于新的1.5ml EP管中，加20μl EB缓冲液在柱膜上，15000xg(12000rpm)离心一分钟洗脱DNA。(可重复一次增加产出)
取上述核酸模板，经核酸定量后，加入模板20ng，经SEPTIN-9、MAL、AIM1、β-ACTIN等基因的甲基化特异性荧光定量PCR，根据阳性信号的组合即可判断为膀胱癌及膀胱癌的预后情况等。
通过对细胞株测序，获得SEPTIN-9、MAL、AIM1等基因甲基化位点阳性细胞株，抽提DNA后，配成10ng浓度下不同比例的样本，检测各基因引物的敏感性(图1～图3)。
对于上述4组引物探针，本发明把所有引物探针组合在一起，应用多重PCR方法，对样本进行检测。多重PCR检测时，SEPTIN9-CY5荧光、AIM1-FAM荧光、MAL-ROX荧光、β-ACTIN-VIC荧光，本发明用测序确认的甲基化位点SEPTIN9、AIM1、MAL分别为阳性和阴性的细胞株的DNA混合成不同浓度样本进行检测，并与单组引物探针的检测结果进行了对比，结果相同。经过验证的试剂，用于后续临床样本的检测。
本发明用于膀胱癌多靶标检测的试剂盒包括PCR反应液和Taq酶、以及阳性对照和阴性对照。PCR反应液包括各基因引物和探针组合物、MgCl2、dNTP和缓冲液。各基因引物和探针组合物的工作浓度均为0.25μM，MgCl2的工作浓度为2.5mM，dNTP的工作浓度为0.125mM，Taq酶的工作浓度为0.075U/μl，PCR反应体系总体积为20μl。阳性对照应用阳性细胞株提取DNA，阴性对照应用健康人WBC(白细胞)DNA。各基因扩增时CT值>35，可判定为阴性。
实施例1
来自新疆石河子大学医学院附属医院泌尿科的门诊和住院病人标本32例尿液(不低于20ml)，含16位膀胱癌患者、16例泌尿系统非肿瘤患者如前列腺增生、前列腺炎、尿道炎等患者。
经本发明的技术方案(核酸提取与亚硫酸氢转化用上述的抽提和纯化法)，使用本发明引物探针检测：同管(SEPTIN-9、MAL、AIM1)，在博日FQD-96C上运行程序：95℃5min，95℃15sec，55℃30sec，72℃30sec，循环40次。
检测结果：16例膀胱癌患者中16例检出阳性结果，而16例非肿瘤样本中，有1例腺性膀胱炎病人检测出阳性信号。具体检测结果如下表所示：
其中，上表中的1号患者的荧光定量PCR的检测结果如图4所示。
敏感性＝检测出的膀胱癌例数/总的膀胱癌例数×100％＝16/16×100％＝100％。
特异性＝检测出的非膀胱癌例数/总的非膀胱癌例数×100％＝15/16×100％＝93.8％。
实施例2
来自上海市新华医院泌尿科的门诊和住院病人标本60例尿液(不低于10ml)，含33位膀胱癌患者、27例泌尿系统非肿瘤患者如前列腺增生、前列腺炎、尿道炎等患者。
经本发明的技术方案(核酸提取与亚硫酸氢转化用上述的抽提和纯化法)，使用本发明引物探针检测：同管(SEPTIN-9、MAL、AIM1)，在博日FQD-96C上运行程序：95℃5min，95℃15sec，55℃30sec，72℃30sec，循环40次。
检测结果：33例膀胱癌患者中31例检出阳性结果，而27例非肿瘤样本中，有1例膀胱炎病人检测出阳性信号。具体检测结果如下表所示：
其中，上表中的1号患者的荧光定量PCR的检测结果如图5所示。
敏感性＝检测出的膀胱癌例数/总的膀胱癌例数×100％＝31/33×100％＝93.9％。
特异性＝检测出的非膀胱癌例数/总的非膀胱癌例数×100％＝26/27×100％＝96.3％。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种用于膀胱癌多靶标检测的引物和探针组合物，其特征在于，所述引物和探针组合物包括分别用于检测SEPTIN9基因甲基化、MAL基因甲基化、AIM1基因甲基化的引物和相应探针；
所述用于检测SEPTIN9基因甲基化的正向引物序列为5’-GCGTTGAAGTCGGGTCGG-3’，如SEQ ID NO:1所示，其反向引物序列为5’-CCCGTACTTCGCTAACTTTTTATC-3’，如SEQ ID NO:2所示，其探针序列为5’-ACAAACGCGAACCGAACGACTTAA-3’，如SEQ ID NO:3所示；
所述用于检测MAL基因甲基化的正向引物序列为5’-GAAGGGGCGTGACGCCGATA-3’，如SEQID NO:4所示，其反向引物序列为5’-CCGAACAACCCGCCAAGGAC-3’，如SEQ ID NO:5所示，其探针序列为5’-TGACGTCGCGCGGGTTAAGCCT-3’，如SEQ ID NO:6所示；
所述用于检测AIM1基因甲基化的正向引物序列为5’-TTCGGGAGTTAGTTCCAAGGTTA-3’，如SEQ ID NO:7所示，其反向引物序列为5’-ACCGCCGAACATCCCCATTG-3’，如SEQ ID NO:8所示，其探针序列为5’-TCGTCGTTTAGGTTTACCGA-3’，如SEQ ID NO:9所示。
2.如权利要求1所述的一种用于膀胱癌多靶标检测的引物和探针组合物，其特征在于，所述用于检测SEPTIN9基因甲基化的探针5’端添加荧光报告基团CY5，探针3’端添加荧光猝灭基团BHQ-2；
所述用于检测MAL基因甲基化的探针5’端添加荧光报告基团ROX，探针3’端添加荧光猝灭基团BHQ-2；
所述用于检测AIM1基因甲基化的探针5’端添加荧光报告基团FAM，探针3’端添加荧光猝灭基团BHQ-1。
3.如权利要求1所述的一种用于膀胱癌多靶标检测的引物和探针组合物，其特征在于，所述引物和探针组合物包括用于检测β-ACTIN内参基因的引物和相应探针；所述用于检测β-ACTIN内参基因的正向引物序列为5’-TCGTCGTGTACGGTTCCGGA-3’，如SEQ ID NO:10所示，其反向引物序列为5’-ACGACGCGAAACGTATTACCG-3’，如SEQ ID NO:11所示，其探针序列为5’-TCGGGTGAGGGTTTGGTTACG-3’，如SEQ ID NO:12所示。
4.如权利要求3所述的一种用于膀胱癌多靶标检测的引物和探针组合物，其特征在于，所述用于检测β-ACTIN内参基因的探针5’端添加荧光报告基团VIC，探针3’端添加荧光猝灭基团BHQ-1。
5.一种用于膀胱癌多靶标检测的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1～4任意一项所述的一种用于膀胱癌多靶标检测的引物和探针组合物。
6.如权利要求5所述的一种用于膀胱癌多靶标检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括PCR反应液和Taq酶。
7.如权利要求6所述的一种用于膀胱癌多靶标检测的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括所述引物和探针组合物、MgCl2、dNTP和缓冲液。
8.如权利要求7所述的一种用于膀胱癌多靶标检测的试剂盒，其特征在于，各所述引物和探针组合物的工作浓度均为0.25μM，MgCl2的工作浓度为2.5mM，dNTP的工作浓度为0.125mM，Taq酶的工作浓度为0.075U/μl，PCR反应体系总体积为20μl。
9.如权利要求5所述的一种用于膀胱癌多靶标检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括阳性对照和阴性对照。
10.如权利要求9所述的一种用于膀胱癌多靶标检测的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照应用阳性细胞株提取DNA，所述阴性对照应用健康人白细胞DNA。
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