CN117230029A - 催化紫杉烷类化合物中c9位羟基化的生物酶、核酸分子、生物材料及其应用 - Google Patents
催化紫杉烷类化合物中c9位羟基化的生物酶、核酸分子、生物材料及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本申请涉及植物代谢生物学与合成生物学技术领域，具体涉及催化紫杉烷类化合物中C9位羟基化的生物酶、核酸分子、生物材料及其应用。该生物酶包括：SEQ ID NO：1～14所示氨基酸序列中的至少一种；和/或，其融合氨基酸序列；和/或，经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；和/或，具有至少60％同一性且具有相同功能的氨基酸序列。本发明生物酶的成功解析，有助于实现紫杉醇的全生物合成，提高巴卡亭III生物合成的产量，解决紫杉醇供不应求的难题。
Description
技术领域
本申请涉及植物代谢生物学与合成生物学技术领域，具体涉及催化紫杉烷类化合物中C9位羟基化的生物酶、核酸分子、生物材料及其应用。
背景技术
紫杉烷类是从植物中分离得到的抗肿瘤活性成分，并对已取得的活性成分的化合物进行结构修饰，合成的一系列衍生物，是重要的一线抗肿瘤药物。紫杉烷类药物主要包括紫杉醇(式III所示化合物)、多西他赛、卡巴他赛，以及具有紫杉烷骨架结构的衍生物。当前，获取紫杉醇类原料药的主要生产方式为半合成法，即首先通过提取天然前体巴卡亭Ⅲ(baccatinⅢ)和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ(10-deacetylbaccatinⅢ,10-DAB)，然后化学合成紫杉醇，但该方法所用的前体物质仍依赖于从红豆杉的树皮或树叶细胞中提取，受制于红豆杉稀缺资源，无法完全解决供应问题。
巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ目前只能依赖于从稀缺红豆杉中提取的原因在于其合成通路中仍有几个关键酶未能解析，其中之一便是催化C9位氧化反应的酶。由于巴卡亭Ⅲ含有7个单氧化位点，氧化顺序未知、氧化底物未知，给催化C9位氧化反应的酶(即C9羟化酶，T9αH)的筛选带来极大的困难，导致该酶在过去三十年中都没能鉴定得到。
基于上述现状，急需全面解析紫杉醇合成的关键酶，尤其是解析天然前体物质巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ合成的关键酶，如C9羟化酶，继而采用合成生物学手段和代谢工程策略，在植物或者微生物底盘中重构紫杉醇合成通路，以期大量生产紫杉醇，彻底解决紫杉醇供不应求的难题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了催化紫杉烷类化合物中C9位羟基化的生物酶、核酸分子、生物材料及其应用。该生物酶(又称C9羟化酶，T9αH)的成功解析，有助于实现紫杉醇的全生物合成，提高巴卡亭III生物合成的产量，解决紫杉醇供不应求的难题。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种生物酶T9αH，其氨基酸序列包括如下序列中的至少一种：
a1)SEQ ID NO：1～14所示氨基酸序列中的至少一种；
a2)SEQ ID NO：1～14所示氨基酸序列中的至少一种的N端和/或C端连接标签得到的融合氨基酸序列；
a3)SEQ ID NO：1～14所示氨基酸序列中的至少一种经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；
a4)与SEQ ID NO：1～14所示氨基酸序列中的至少一种具有至少60％同一性且具有相同功能的氨基酸序列。
任选的，a4)所述的氨基酸序列来源于红豆杉属，包括但不限于欧洲红豆杉Taxusbaccata L.、短叶红豆杉Taxus brevifolia Nutt.、灰岩红豆杉Taxus calcicolaL.M.Gao&Mich.加拿大红豆杉Taxus canadensis Marshall、中国红豆杉Taxuschinensis(Pilg.)Rehd.、密叶红豆杉Taxus contorta Griff.、东北红豆杉Taxuscuspidata Siebold
&Zucc.、佛罗里达红豆杉Taxus floridana Nutt.ex Chapm.、高山红豆杉Taxusflorinii Spjut、中美红豆杉Taxus globosa Schltdl.、南方红豆杉Taxus mairei(Lemée&Lév.)S.Y.Hu、phyton氏红豆杉Taxus phytonii Spjut、苏门达腊红豆杉Taxus sumatrana(Miq.)de Laub.、喜马拉雅红豆杉Taxus wallichiana Zucc.、黄山红豆杉TaxusHuangshan type、峨眉红豆杉Taxus Emei type、秦岭红豆杉Taxus Qinling type.、云南红豆杉Taxus yunnanensis W.C.Cheng&L.K.Fu、曼地亚红豆杉Taxus×media Rehder、欧美红豆杉Taxus×hunnewelliana Rehder。
本申请创造性地从红豆杉中鉴定得到一种具有催化紫杉烷类化合物合成过程中C9位的羟基化反应的生物酶，本申请将其命名为T9αH。功能分析发现，T9αH可以催化具有紫杉醇碳骨架结构、C9位未羟基化的化合物中C9位发生羟基化，从而打通了巴卡亭III或其前体物质等紫杉烷类中间体的生物合成路径，可进一步实现紫杉醇等紫杉烷类的全生物合成。
在本发明具体实施例中，合成紫杉素时，该酶能够催化紫杉二烯-5α,10β,13α-三醇(taxadiene-5α,10β,13α-triol)转化为紫杉二烯-5α,9α,10β,13α-四醇(taxadiene-5α,9α,10β,13α-tetraol)，实现C9位的羟基化反应。
在本发明另一具体实施例中，合成巴卡亭III(紫杉醇前体物质)时，该酶能够催化具有紫杉醇碳骨架结构、C9位未羟基化的化合物中C9位发生羟基化，成功合成了巴卡亭III。
进一步地，本发明获得了T9αH的同源蛋白和突变体，证明同源蛋白和突变体同样能够催化C9位的羟基化。
在本发明实施方式中，a3)中的氨基酸序列为a1)中所示的氨基酸序列中添加、缺失、替换一个或多个(例如可以为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个)氨基酸残基且具有相同功能的氨基酸序列。
在本发明实施方式中，a4)中的氨基酸序列为与a1)中所示的氨基酸序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或者99％同一性且具有相同功能的氨基酸序列。
在本发明的具体实施方式中，上述14条T9αH的氨基酸序列的序列相似度为63.15％-100％，保守域/位点为保守的PSRF基序(氨基酸423-426)、高度保守的结合血红素的PFG元件(氨基酸439-441)、ETMR盐桥(氨基酸369-372)、EXXR基序以及关键的半胱氨酸(氨基酸447)；突变体的关键氨基酸位点包括L75、G128、P129、F132、V136、V142、L228、T231、L232、F305、H308、A309、D312、T313、S316、P376、A377、F378、G379、S380、F381、R382、M402、F485、P486、P487。上述氨基酸是以单字母缩写形式表示的，氨基酸以及英文名、英文缩写见表4。
在本发明的具体实施方式中，上述生物酶为分离的生物酶。
第二方面，本发明提供了编码上述生物酶的核酸分子，其核苷酸序列包括如下序列中的至少一种：
b1)SEQ ID NO：15～28所示核苷酸序列中的至少一种；
b2)SEQ ID NO：15～28所示核苷酸序列中的至少一种的互补序列、简并序列或同源序列，同源序列为与SEQ ID NO：15～28所示核苷酸序列具有至少75％同一性的核苷酸序列；
b3)在严格条件下与b1)或b2)所示的核苷酸序列杂交，且能够编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。
在本发明的实施方式中，互补序列为按照碱基互补配对原则形成的互补序列，互补序列可以为与b1)所示核苷酸序列具有相同功能的不完全互补序列或完全互补序列。
在本发明的实施方式中，简并序列是指改变b1)所示核苷酸序列一个或多个核苷酸后，改变的核苷酸序列位置对应编码的氨基酸种类不变，不会影响核酸分子的功能和表达水平。
在本发明的实施方式中，同源序列为与b1)中所示的核苷酸序列具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或者99％同一性且具有相同功能的核苷酸序列。例如突变基因、等位基因或衍生物。
任选的，b2)所述核酸分子的核苷酸序列来源于红豆杉属，包括但不限于欧洲红豆杉Taxus baccata L.、短叶红豆杉Taxus brevifolia Nutt.、灰岩红豆杉Taxus calcicolaL.M.Gao&Mich.加拿大红豆杉Taxus canadensis Marshall、中国红豆杉Taxuschinensis(Pilg.)Rehd.、密叶红豆杉Taxus contorta Griff.、东北红豆杉Taxuscuspidata Siebold&Zucc.、佛罗里达红豆杉Taxus floridana Nutt.ex Chapm.、高山红豆杉Taxus florinii Spjut、中美红豆杉Taxus globosa Schltdl.、南方红豆杉Taxusmairei(Lemée&Lév.)S.Y.Hu、phyton氏红豆杉Taxus phytonii Spjut、苏门达腊红豆杉Taxus sumatrana(Miq.)de Laub.、喜马拉雅红豆杉Taxus wallichiana Zucc.、黄山红豆杉Taxus Huangshan type、峨眉红豆杉Taxus Emei type、秦岭红豆杉Taxus Qinlingtype.、云南红豆杉Taxus yunnanensis W.C.Cheng&L.K.Fu、曼地亚红豆杉Taxus×mediaRehder、欧美红豆杉Taxus×hunnewelliana Rehder。
任选的，所述核酸分子为合成的和/或分离的核酸分子。
示例性地，“严格条件”是指探针将与其靶序列杂交至可探测程度超过与其它序列杂交(如至少2倍于背景)的条件。严格条件具有序列依赖性，且因环境的不同而不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100％互补的靶序列。可选择地，可以调节严格条件以允许一些序列错配，使得探测到较低程度的相似性。
在本发明的具体实施方式中，编码T9αH的核苷酸序列的序列相似度为75.48％-100％。
第三方面，本发明提供了一种生物材料，该生物材料为下述c1)至c3)中的任一种：
c1)含有上述核酸分子的表达盒；
c2)含有上述核酸分子或c1)所述表达盒的载体；
c3)含有上述核酸分子、c1)所述表达盒、c2)所述载体中的至少一种的宿主细胞。
任选的，宿主细胞包括微生物细胞、植物细胞、动物细胞、藻类细胞中的至少一种。
在本发明的实施方式中，c1)所述表达盒进一步包含一个可操作地与上述核酸分子相连的启动子。
在本发明的实施方式中，c2)的载体中，对于载体的种类不作具体限定，可以根据需要选择适合的载体。例如载体包括但不限于pFastBac1、pYES2、pYES2.1、pESC-Ura、pESC-Trp、pESC-Leu、pESC-His、pGEX2T、pTAex3、pUSA、pYMB0、pHT43、pET28b、pIJ702、pUCP19、pEAQ-HT、pYMB03或pHT43，优选pEAQ-HT。
在本发明的实施方式中，c3)的宿主细胞中，微生物细胞包括但不限于链霉菌、假单孢菌、芽孢杆菌、酵母细胞、大肠杆菌中的至少一种；植物细胞包括但不限于烟草细胞、青蒿细胞、拟南芥细胞、小立碗藓细胞、地钱细胞、番茄细胞、人参细胞、棉花细胞、甘蔗细胞、马铃薯细胞、玉米细胞、小麦细胞、水稻细胞、萝卜细胞、莴苣细胞中的至少一种；动物细胞包括但不限于昆虫细胞、哺乳动物细胞、果蝇细胞、线虫细胞、鱼类细胞中的至少一种；藻类细胞包括但不限于蓝藻细胞、绿藻细胞中的至少一种。
本发明还提供了一种工程菌株，该工程菌株包含上述核酸分子、表达盒、载体中的至少一种。在本发明的实施方式中，该工程菌株可为酵母工程菌株、大肠杆菌工程菌株。
在本发明的实施方式中，植物细胞和/或动物细胞包括非生物性转换(non-biologically transformed)的重组植物细胞和/或重组动物细胞。
任选的，植物细胞或动物细胞可通过细胞培养方式表达生物酶、生产目标产物。
在上述生物材料中，在体内和体外将核酸分子、表达盒、载体转化宿主细胞的方法包括但不限于电穿孔、聚乙二醇(PEG)转化、脂质转染、热休克、磷酸钙沉淀、病毒介导、显微注射。
第四方面，本发明提供了一种用于产生宿主细胞的方法，该方法包括用上述核酸分子、生物材料中的表达盒或载体中的至少一种转化宿主细胞。
第五方面，本发明提供了一种用于产生植物或植物细胞的方法，该方法包括用上述核酸分子、生物材料中的表达盒或载体中的至少一种转化植物或植物细胞。
第六方面，本发明提供了一种产生上述生物酶的方法，包括：将上述核酸分子，或生物材料中的表达盒、载体中的至少一种，转化宿主细胞，使宿主细胞产生所述生物酶。
第七方面，本发明提供了上述生物酶、核酸分子或生物材料中的任一种在如下d1)、d2)、d3)和/或d4)中的应用：
d1)在催化紫杉烷类化合物和/或其中间体的前体物质中的C9位的羟基化；紫杉烷类化合物和/或其中间体的前体物质为C9位未发生羟基化和氧化的前体物质；
d2)在合成紫杉素和/或其中间体中的应用；
d3)在合成巴卡亭III和/或其中间体中的应用；
d4)在合成紫杉烷类化合物和/或其中间体中的应用。
在本发明实施方式中，紫杉烷类化合物包括但不限于紫杉醇及其衍生物、紫杉素及其衍生物、多西他赛及其衍生物、卡巴他赛及其衍生物中的至少一种。
在本发明实施方式中，紫杉烷类化合物中间体包括但不限于紫杉二烯-六醇-六乙酸酯及其衍生物、1-去羟基巴卡亭IV及其衍生物、巴卡亭Ⅲ及其衍生物、10-去乙酰巴卡亭Ⅲ及其衍生物、紫杉醇及其衍生物、巴卡亭IV及其衍生物、巴卡亭VI及其衍生物、巴卡亭VII及其衍生物、巴卡亭IX及其衍生物、巴卡亭V及其衍生物、紫杉素及其衍生物、巴卡亭I及其衍生物、紫杉二烯-2α,5α,7β,9β,10β,13α-六醇-5α-乙酸酯及其衍生物、5α-乙酸酯-Taxuspine F及其衍生物、紫杉二烯-六醇-四乙酸酯及其衍生物、Taxuspine F及其衍生物中的至少一种。
在本发明实施方式中，所述应用包括以下几个方面：(1)本发明所提供的生物酶的氨基酸序列或至少部分序列的多肽可能在去除或替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物学活性，或者提高了产量或优化了蛋白动力学特征或其他致力于得到的性质；(2)本发明所提供的核酸分子的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列被修饰或突变，修饰或突变的途径包括密码子优化、插入、缺失，聚合酶链式反应(PCR)，易错PCR，不同序列的重新连接，序列的不同部分或与其他来源的同源序列进行定向进化，或通过化学试剂诱变等。(3)本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因通过合适的表达体系在外源宿主中表达以得到相应的酶或其他更高的生物活性或产量。(4)在受体宿主细胞中过表达上述多核苷酸或蛋白质，得到目的宿主细胞，与受体宿主相比，所述目的宿主的紫杉醇和/或其中间体的产量增加。过表达受体宿主中上述多核苷酸或蛋白质的方式包括启动子编辑技术、密码子优化、利用强启动子、插入内含子、利用病毒载体、融合蛋白技术中的一种或多种，以及可实现过表达目的的其他方式。(5)本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通过遗传重组来构建重组质粒以获得新型生物合成途径，也可以通过插入、置换、缺失或失活进而获得新型生物合成途径。
第八方面，本发明提供了一种在体内或体外合成紫杉烷类化合物和/或其中间体的方法，以紫杉烷类化合物和/或其中间体的前体物质中的至少一种为底物，在上述生物酶的催化作用下，C9位发生羟基化；紫杉烷类化合物和/或其中间体的前体物质为C9位未发生羟基化和氧化的前体物质。
在本发明实施方式中，紫杉烷类化合物和/或其中间体的前体物质包括如式I和/或式II所示的化合物：
其中，R1、R3、R4各自独立地选自H、-OH、-OAc；R2、R6各自独立地选自H、-OH、-OAc、-OBz；R5、R7各自独立地选自H、-OH、-OAc、＝O。
在本发明具体实施方式中，紫杉烷类化合物和/或其中间体的前体物质包括但不限于taxa-4(5),11(12)-二烯、taxa-4(20),11(12)-二烯-5α-ol、紫杉二烯-5α,10β,13α-三醇和/或其衍生物中的至少一种。
在本发明实施方式中，合成紫杉烷类化合物和/或其中间体的生物酶还包括TXS、TAT、T5αH、T13αH、T2αH、T7βH、TOT、TBT、T10βH、T14βH、DBAT、BAPT、T2’OH、DBTNBT、PAM、CoAligase、TAX9、TAX14、TAX19中的至少一种。
其中，本发明的生物酶(T9αH)、TXS、TAT、T5αH、T13αH、T2αH、T7βH、TOT、TBT为从头开始合成巴卡亭III所需的生物酶；DBAT、BAPT、T2’OH、DBTNBT、PAM、CoA ligase这几种生物酶为从巴卡亭III开始合成紫杉醇等紫杉烷类化合物所需的生物酶。合成其它紫杉烷类的酶包括T10βH、T14βH、TAX9、TAX14、TAX19。
在本发明实施方式中，体内包括微生物细胞内、藻类细胞内、植物细胞内和/或动物细胞内。
在本发明实施方式中，在体内合成紫杉烷类化合物和/或其中间体，包括使上述核酸分子在微生物细胞内、藻类细胞内、植物细胞内和/或动物细胞内表达本发明生物酶；以紫杉烷类化合物和/或其中间体的前体物质为底物，在上述生物酶的催化作用下，合成紫杉烷类化合物和/或其中间体。任选的，所述底物由微生物细胞、藻类细胞内、植物细胞和/或动物细胞生产。任选的，所述底物可人为额外添加。
在本发明实施方式中，在体内合成含氧杂环化合物，包括使上述核酸分子在微生物细胞内、藻类细胞内、植物细胞内和/或动物细胞内表达本发明生物酶；以紫杉烷类化合物和/或其中间体的前体物质为底物，在上述生物酶的催化作用下，合成紫杉烷类化合物和/或其中间体。任选的，所述底物由微生物细胞、藻类细胞内、植物细胞和/或动物细胞生产。任选的，所述底物可人为额外添加。
第九方面，本发明提供了一种植物或其植物部分，植物为如下植物之一：
e1)上述植物细胞生长形成的植物；
e2)上述方法生产获得的植物；
e3)所述e1)-e2)中任一植物自交所形成的后代，以及后代生长形成的植物；
e4)所述e1)-e2)中任一植物与其它品种杂交所形成的后代，以及后代生长形成的植物；
上述的植物部分为根、茎、叶、花、果实、花粉或种子。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：
本申请创造性地从红豆杉中鉴定得到了T9αH，该T9αH可以催化紫杉烷类化合物合成过程中C9位的羟基化反应。例如，合成紫杉醇时，该酶能够催化紫杉二烯-5α,10β,13α-三醇(taxadiene-5α,10β,13α-triol)转化为紫杉二烯-5α,9α,10β,13α-四醇(taxadiene-5α,9α,10β,13α-tetraol)，实现C9位的羟基化反应；
进一步地，本申请将上述T9αH基因，与其他已鉴定的催化酶基因在植物细胞(例如烟草等)或微生物细胞(例如大肠杆菌、酿酒酵母等)等模式生物体系中共同表达，最终能够在植物细胞或微生物细胞中从头合成前体物质巴卡亭III；
进一步地，本申请填补了数十年来关于紫杉醇等紫杉烷类化合物生物合成的最后几步酶促反应，最终解析了紫杉醇等紫杉烷类化合物的完整生物合成通路。这不仅为生产紫杉醇或其他紫杉烷类化合物提供了一个新的工业生产途径，还可以通过对通路酶的改造，利用低价值的前体物质来高效地获得大量的紫杉醇等紫杉烷类，这不仅满足绿色环保的要求，还能够极大地降低紫杉醇相关药物的价格，让更多人的人能够用得起相关的药物，从而降低病患的家庭负担。
附图说明
图1为7个基因的组合(TXS、T5αH、T13αH、T10βH、T9αH1、TAT、TAX19)合成的产物紫杉素的提取离子色谱图，GFP为对照；
图2表示在烟草中对T9αH进行活性表征的结果；
其中，结构式表示紫杉素，柱状图表示已知合成酶的基因与3个T9αH的同源基因(T9αH1/2/3)以及对照(GFP)的活性比较，即不同的羟化酶作用下生成的紫杉素的含量比较，用离子丰度表示；
图3为9个基因的组合(TXS、T5αH、T13αH、T9αH1、T2αH、T7βH、TOT、TAT、TBT)合成的产物巴卡亭III的提取离子色谱图，GFP为对照；
图4表示在T9αH的参与下烟草能够从头合成巴卡亭III；
其中，结构式表示巴卡亭III，柱状图表示已知合成酶的基因与3个T9αH的同源基因(T9αH1/2/3)以及对照(GFP)的活性比较，即不同的羟化酶作用下生成的巴卡亭III的含量比较，用离子丰度表示。
具体实施方式
本发明公开了催化紫杉烷类化合物中C9位羟基化的生物酶、核酸分子、生物材料及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
术语解释：
本发明中，术语“生物酶”或“酶”为具有生物活性的蛋白质(或“多肽”或“肽组合物”)，既包括天然存在的蛋白质，又包括其变体及修饰形式。本文所用的术语“蛋白质”和“多肽”可互换使用，因此术语多肽可用于指全长多肽，也可用于指全长多肽的一个片段。术语“片段”指多肽序列的一部分。“片段”或“生物学活性部分”包括包含足够数目的邻接氨基酸残基以保留生物学活性的多肽，例如N-端的氨基酸被截短的多肽。
“变体”意指基本上相似的序列。如本领域技术人员容易理解的，天然存在的蛋白质在不同物种或者不同样本之间可能存在一些差异，可能是一个或多个内部位点处一个或多个氨基酸的缺失和/或添加和/或在天然多肽的一个或多个位点处一个或多个氨基酸的取代。但这并不影响其发挥相同或相似的作用，这些蛋白质可以称为示例性蛋白质的天然变体。蛋白质的修饰形式包括但不限于不影响目标蛋白的生物活性的适当氨基酸取代/添加/缺失、N-端的氨基酸被截短、适用于宿主细胞偏好的密码子优化、标签的添加、融合等。这些蛋白质可以称为参考蛋白质的人工变体。对于不影响目标蛋白的生物活性的适当氨基酸取代的指导，可见于Dayhoff等(1978)Atlas of Protein Sequence andStructure(蛋白质序列和结构图册)(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington,D.C.)的模型，通过引用结合到本文中。诸如将一个氨基酸取代成具有类似特性的另一个氨基酸的保守取代，可以是最优的。
本发明中，术语“氨基酸”是指任何氨基酸(标准和非标准氨基酸二者)，包括但不限于α-氨基酸、β-氨基酸、γ-氨基酸和δ-氨基酸。适合的氨基酸的实例包括但不限于丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸、精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯基丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸。
本发明中，术语“紫杉烷9α羟基化酶”是指催化紫杉烷环骨架C9位的羟基化的酶，根据本发明实验结果分析，其可能还具有催化紫杉烷环骨架C9位羰基化的功能。在本发明中，术语“T9αH”可以表示紫杉烷9α羟基化酶，或紫杉烷9α羟基化酶，或编码紫杉烷9α羟基化酶的核苷酸分子或序列，具体所指的含义可以结合上下文判断。
在一些实施方案中，本发明相关的生物酶可从来自任何来源的包含给定生物酶的材料中分离出来。任何获得发明相关的生物酶的方法都是与本发明相容的。
本发明中，术语“分离”是指已从其自然环境中移除，或从首次形成化合物时存在的其他化合物中移除。术语“分离的”包括从天然来源分离的材料以及通过在宿主细胞中重组表达制备后回收的材料(如核酸和蛋白质)，或化学合成的化合物，如核酸分子、蛋白质和肽。
本发明中，术语“核酸分子”(或“核酸”或“多核苷酸”)可以指核苷酸的聚合形式，其可以包括RNA、cDNA、基因组DNA的有义和反义链，以及上述的合成形式和混合聚合物。核苷酸可以指核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。本文中使用的“核酸分子”与“核酸”和“多核苷酸”同义。一个核酸分子的长度通常至少有10个碱基，除非另有说明。该术语可以指长度不确定的RNA或DNA分子。这个术语包括单链和双链形式的DNA。核酸分子可以包括通过天然存在和/或非天然存在的核苷酸连接连接在一起的天然存在和修饰的核苷酸中的一种或两者。
如本领域技术人员容易理解的，对于核苷酸序列，可以使用众所周知的分子生物学技术，例如本文概述的聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术来鉴定天然存在的变体，即基本相似的序列。
如本领域技术人员容易理解的，核酸分子可以被化学或生物化学修饰，或者可以包含非天然或衍生的核苷酸碱基这种修饰包括例如标记、甲基化、用类似物取代一种或多种天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰(例如，不带电荷的键：例如膦酸甲酯、磷酸三酯、亚磷酰胺、氨基甲酸酯等；带电荷的键：例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等；悬垂部分：例如肽；嵌入剂：例如吖啶、补骨脂素等。螯合剂；烷基化剂；和修饰的键：例如α异头核酸等。)，术语“核酸分子”也包括任何拓扑构象，包括单链、双链、部分双链、三链、发夹、环状和挂锁构象。
在一些实施方案中，本发明相关的核酸分子可从来自任何来源的包含给定核酸分子的DNA中克隆出来，例如通过PCR扩增和/或限制性酶切。在一些实施方案中，本发明相关的核酸分子是合成的。任何获得发明相关的核酸分子的方法都是与本发明相容的。
本发明中，术语“同一性”指与天然核酸序列或氨基酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
除非另有说明，否则本文提供的序列同一性值是指使用本发明的全长序列通过Jalview 2.11.2.7版(Waterhouse,A.M.,Procter,J.B.,Martin,D.M.A,Clamp,M.andBarton,G.J.(2009)"Jalview Version 2-a multiple sequence alignment editor andanalysis workbench"Bioinformatics 25(9)1189-1191doi:10.1093/bioinformatics/btp033)使用多重比对软件包MUSCLE v3.8.31版("MUSCLE:multiple sequence alignmentwith high accuracy and high throughput"Nucleic Acids Res.32(5):1792(2004))中的默认参数；或其任何等同程序)获得的值。
本发明中，术语“同源性”有时用于指两个或多个核酸或氨基酸序列之间以位置同一性百分比表示的相似性水平(即序列相似性或同一性)。同源性也指进化相关性的概念，通常由共享相似序列的不同核酸或蛋白质之间相似的功能特性来证明。
如本领域技术人员容易理解的，同源性序列可以通过已知序列在进化关系相近的物种样本基因组或转录组数据中比对得到。例如在相同属的不同种之间、相同种的不同株之间，通过已知序列在样本基因组或转录组数据中经比对得到该序列的同源序列，本领域技术人员可以预期其具有相同或相似的功能。
另外的数学算法是本领域中已知的并且可以用于比对两个序列。参见例如Karlinand Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264的算法，如Karlin andAltschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877中改动。这种算法被引入Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403的BLAST程序内。可以用BLASTN程序(针对核苷酸序列搜索的核苷酸查询)执行BLAST核苷酸搜索，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列，或用BLASTX程序(针对蛋白质序列搜索的翻译核苷酸查询)，以获得与本发明的核酸分子同源的蛋白质序列。可以用BLASTP程序(针对蛋白质序列搜索的蛋白质查询)执行BLAST蛋白质搜索，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列，或用TBLASTN程序(针对翻译的核苷酸序列搜索的蛋白质查询)，以获得与本发明的蛋白质分子同源的核苷酸序列。为了获得用于比较目的的缺口比对，Gapped BLAST(在BLAST2.0中)可以如Altschul etal.(1997)Nucleic Acids Res.25:3389中所述利用。可替代地，PSI-Blast可以用于执行迭代搜索，其检测分子之间的遥远关系。参见Altschul et al.(1997)supra。当利用BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast程序时，可以使用相应程序(例如BLASTX和BLASTN)的默认参数。比对也可以通过检查手动执行。
本发明中，术语“合成的”是指通过作为体外过程的化学合成产生的多核苷酸(即DNA或RNA)分子。例如，可以在EppendorfTM管内的反应过程中产生合成DNA，使得合成DNA由天然DNA或RNA链酶促产生。可以利用其他实验室方法来合成多核苷酸序列。寡核苷酸可以通过使用亚磷酰胺的固相合成在寡核苷酸合成器上化学合成。合成的寡核苷酸可以作为复合物彼此退火，从而产生“合成的”多核苷酸。用于化学合成多核苷酸的其他方法在本领域是已知的，并且可以容易地实施用于本公开。
本发明中，术语“基因”是指表达特定蛋白质的核酸片段。“基因”包括编码基因产物的DNA区域，以及调节基因产物产生的所有DNA区域，无论这种调节序列是否与编码和/或转录序列相邻。因此，基因包括但不一定限于启动子序列、终止子、翻译调节序列如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点、增强子、沉默子、绝缘体、边界元件、复制起点、基质附着位点、内含子和基因座控制区。
本发明中，术语“基因产物”是指基因产生的任何产物。例如，基因产物可以是基因的直接转录产物(如mRNA、tRNA、rRNA、反义RNA、干扰RNA、核糖酶、结构RNA或任何其他类型的RNA)，也可以是由mRNA翻译产生的蛋白质。
本发明中，术语“表达盒”是指可以在特定限制性位点或通过同源重组插入核酸或多核苷酸的DNA片段。如本文所用，DNA片段包含编码目的多肽的多核苷酸，并且表达盒和限制性位点被设计成确保表达盒插入到用于转录和翻译的适当阅读框中。在一个实施方案中，表达盒可以包括编码目的多肽的多核苷酸，并且除了多核苷酸之外还具有促进特定宿主细胞转化的元件。在一个实施方案中，表达盒还可以包括允许在宿主细胞中增强编码目的多肽的多核苷酸表达的元件。这些元件可以包括但不限于：启动子、最小启动子、增强子、应答元件、终止子序列、聚腺苷酸化序列等。
本发明中，术语“载体”与“构建体”、“克隆载体”和“表达载体”可互换使用，并且意味着可以将DNA或RNA序列(例如外源基因)引入宿主细胞以转化宿主并促进所引入序列的表达(例如转录和翻译)的载体。“非病毒载体”是指不包含病毒或逆转录病毒的任何载体。在一些实施方案中，“载体”是包含至少一个DNA复制起点和至少一个选择性标记基因的DNA序列。例子包括但不限于携带外源DNA进入细胞的质粒、粘粒、噬菌体、细菌人工染色体(BAC)或病毒。载体还可以包括一个或多个基因、反义分子和/或选择性标记基因和本领域已知的其他遗传元件载体可以转导、转化或感染细胞，从而导致细胞表达由载体编码的核酸分子和/或蛋白质。
在本发明中，术语“表达”是指基因产物的生物合成，包括所述基因产物的转录和/或翻译。从DNA分子“表达”或“产生”蛋白质或多肽是指转录和翻译编码序列以产生蛋白质或多肽，而从RNA分子“表达”或“产生”蛋白质或多肽是指翻译RNA编码序列以产生蛋白质或多肽。
包含所有必需表达元件的表达载体是市售的，而且是本领域技术人员熟知的。例如见Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989。通过将外源性DNA(RNA)导入细胞而对细胞进行遗传工程。该外源性DNA(RNA)被置于转录元件的有效控制下，以允许外源性DNA在宿主细胞中表达。
本发明中，术语“转化”包括可将核酸分子引入这种细胞的所有技术。例子包括但不限于：用病毒载体转染；质粒载体转化；电穿孔；脂肪感染；显微注射；农杆菌介导的转移；直接DNA摄取；WHISKERSTM介导的转化；和微射弹轰击。这些技术可用于植物细胞的稳定转化和瞬时转化。“稳定转化”是指将核酸片段引入宿主生物的基因组，导致遗传稳定。一旦稳定转化，核酸片段就稳定地整合到宿主生物和任何后续世代的基因组中。含有转化核酸片段的宿主生物被称为“转基因”生物。“瞬时转化”是指将核酸片段引入宿主生物的细胞核或含DNA的细胞器，导致基因表达而没有遗传稳定的遗传。
在一些实施方案中，为了转化宿主和宿主细胞，可以使用标准技术将本发明的核苷酸序列插入本领域已知的适合于在宿主或宿主细胞中表达核苷酸序列的任何载体中。载体的选择取决于优选的转化技术和待转化的目标宿主物种。转化方法取决于待转化的宿主细胞、所用载体的稳定性、基因产物的表达水平和其他参数。
本发明中，所述的“严格条件”可为低严格条件、中严格条件、高严格条件中的任一种。“低严格条件”，例如，为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、32℃的条件。“中严格条件”，例如，为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、42℃的条件。“高严格条件”，例如，为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、50℃的条件。在上述条件中，越提高温度，越能期待高效地获得具有高同源性的DNA。影响杂交严格性的因素可为温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多种因素，本领域技术人员通过适宜选择这些因素，可实现同样的严格条件。
表1中英文对照表
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表2生物酶的氨基酸序列相似度
| 生物酶名称 | 序列编号 | 与T9αH1的相似度 | 来源 |
| T9αH1(或T9H1) | 1 | 100％ | 南方红豆杉 |
| T9αH2(或T9H2) | 2 | 83.86％ | 南方红豆杉 |
| T9αH3(或T9H3) | 3 | 67.27％ | 南方红豆杉 |
| T9αH4(或T9H4) | 4 | 99.60％ | 南方红豆杉 |
| T9αH5(或T9H5) | 5 | 67.47％ | 南方红豆杉 |
| T9αH6(或T9H6) | 6 | 99.60％ | 东北红豆杉 |
| T9αH7(或T9H7) | 7 | 67.66％ | 东北红豆杉 |
| T9αH8(或T9H8) | 8 | 99.00％ | 云南红豆杉 |
| T9αH9(或T9H9) | 9 | 67.27％ | 云南红豆杉 |
| T9αH10(或T9H10) | 10 | 65.67％ | 云南红豆杉 |
| T9αH11(或T9H11) | 11 | 65.07％ | 云南红豆杉 |
| T9αH12(或T9H12) | 12 | 99.00％ | 欧洲红豆杉 |
| T9αH13(或T9H13) | 13 | 63.75％ | 欧洲红豆杉 |
| T9αH14(或T9H14) | 14 | 63.15％ | 欧洲红豆杉 |
表3生物酶的核苷酸序列相似度
表4氨基酸以及英文名、英文缩写
本发明中所用试剂、仪器或生物材料等均可通过商业渠道获得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1.紫杉烷C9羟化酶T9αH基因的烟草表达
1.cDNA获取
红豆杉为实验室保存，采集幼嫩叶片后，立即置于液氮中速冻，取部分样品，利用研钵研磨，取100mg加入1.5mL离心管中，加入裂解液，抽提RNA(Plant Total RNAIsolation Kit Plus,FOREGENE,China)。利用逆转录试剂盒(HiScript III 1st StrandcDNA Synthesis Kit,Vazyme,China)将mRNA逆转录为cDNA。
2.紫杉烷C9羟化酶T9αH的克隆
对南方红豆杉基因组进行分析，T9αH读码框氨基酸序列和核苷酸序列分别为SEQID NO：1(其同源序列见序列表中SEQ ID NO：2～14)和SEQ ID NO：15(其同源序列见序列表中SEQ ID NO：16～28)所示序列。
T9αH1读码框氨基酸序列(SEQ ID NO：1)：
MDSLSFLKSMEAKFGQVIHRDQSSSTALLSLAFTAALAIFLVLLFRFKSRPSTNFPPGNFGFPFIGETIQFLRALRSESPHMFFDERLKKFGRVFKTSLTGHPTAVFCGPAGNRFIYSNEHKLVQSSGPNSFVKLVGQQSIVTKTGEEHRIFRGVLNEFLGPHALQSYTPKMSSKIQENINKHWKGKDEVNMLPSIRQLVFSISSSLFFDINDEDQQEQLKTLLETILVGTLSVPLDIPGSNFRKALRARSKLDEILSRLIESRRKDMRSGIASTSKNLLSVLLAFKDERGNPLTDTEILDNFSFMLHASYDTTVSPTVCIFKLLSANPECYEKVVQEQLGILGNKKDGEEICWNDLKAMKYTWQAAQETMRLFPPAFGSFRKVIADIHHDGYIIPKGWKAMVTNYSTSRKEEYFDEPDKFKPSRFGDGKYVAPYTFLPFGAGIRICPGWEFAKLEMLLFIHHFVKNFSGYLPLDTKEKISGDPFPPLPKNGFPIKLFPRT
T9αH1读码框核苷酸序列(SEQ ID NO：15)：
ATGGATTCCTTAAGTTTTCTAAAAAGCATGGAAGCGAAATTCGGCCAAGTCATACACCGGGATCAGTCTTCCAGTACTGCTCTTCTGTCCCTCGCATTCACAGCTGCTCTTGCCATTTTTCTTGTGTTGCTCTTTCGATTTAAAAGCCGGCCCTCTACTAATTTCCCTCCAGGAAATTTTGGCTTCCCTTTCATTGGAGAGACGATACAGTTCTTGCGGGCACTTCGATCAGAATCGCCTCATATGTTTTTTGATGAGAGATTGAAGAAATTTGGGCGTGTATTCAAGACGTCATTAACTGGGCATCCCACAGCTGTGTTCTGCGGGCCTGCGGGAAACCGGTTTATTTACTCGAATGAGCACAAGCTGGTGCAGTCGTCTGGGCCCAACTCCTTCGTCAAACTGGTTGGGCAGCAATCCATCGTGACCAAAACAGGAGAGGAGCACCGCATCTTTCGTGGTGTCCTGAACGAGTTTCTGGGGCCTCATGCCTTACAGAGTTATACGCCTAAAATGAGTTCCAAAATCCAGGAGAATATCAATAAGCATTGGAAGGGTAAAGATGAAGTGAACATGCTTCCTTCGATAAGACAGCTCGTCTTCTCCATTTCAAGCAGCTTGTTTTTTGATATTAATGATGAGGATCAACAGGAACAACTTAAAACTCTTTTAGAAACTATTCTTGTTGGAACTTTGTCGGTTCCCCTCGACATTCCAGGATCTAATTTTCGTAAAGCTCTTCGGGCGCGTTCCAAGCTGGATGAAATTCTGTCTCGTTTAATCGAAAGCAGAAGAAAAGATATGCGTTCTGGGATAGCTTCTACCAGTAAAAATCTACTGTCGGTGCTGCTCGCCTTCAAAGATGAAAGAGGGAATCCATTGACGGACACGGAGATCCTCGACAACTTTTCTTTTATGCTTCACGCCTCATACGACACCACCGTTTCGCCCACGGTTTGTATATTTAAGCTGCTCTCCGCCAATCCAGAATGCTATGAAAAAGTAGTTCAAGAACAATTGGGAATACTTGGCAATAAAAAGGACGGTGAAGAAATCTGTTGGAACGATCTGAAAGCTATGAAATATACATGGCAAGCAGCTCAAGAAACAATGAGGCTTTTCCCTCCAGCGTTTGGATCATTTCGCAAGGTCATCGCCGATATTCATCATGATGGCTATATAATTCCCAAAGGATGGAAAGCTATGGTGACAAATTACAGTACAAGTAGGAAAGAAGAGTACTTCGATGAACCAGACAAATTCAAGCCTTCAAGATTTGGGGATGGAAAGTATGTGGCTCCGTACACGTTCTTACCTTTCGGGGCAGGAATACGCATATGCCCAGGATGGGAGTTCGCTAAGTTGGAGATGTTACTGTTCATCCATCATTTTGTCAAAAATTTCAGCGGATACCTCCCACTTGACACCAAGGAAAAGATTTCCGGAGATCCATTCCCTCCTCTCCCCAAAAATGGATTTCCCATTAAACTATTTCCCAGAACCTAA
以T9αH1基因的核苷酸序列为依据，设计扩增T9αH1基因的引物P1和P2，引物包含部分烟草表达载体pEAQ-HT的序列。以南方红豆杉叶片的cDNA为模板，采用PCR方法扩增T9αH1基因，PCR目的产物经切胶回收后，与经RruI和XhoI双酶切的线性pEAQ-HT载体重组连接，采用ClonExpress一步克隆试剂盒(诺唯赞)克隆并测序，阳性重组质粒命名为pEAQ-HT-T9αH1。
采用相同的方法，获得pEAQ-HT-T9αH2和pEAQ-HT-T9αH3。
所用引物中，P1和P2用于扩增T9αH1，P3和P4用于扩增T9αH2，P5和P6用于扩增T9αH3，引物序列见表5。
表5引物序列
注：小写序列为载体序列，大写序列为T9αH特异引物序列。
3.紫杉烷C9羟化酶T9αH基因在烟草中进行功能验证
将构建好的表达载体pEAQ-HT-T9αH转入农杆菌GV3101中，获得GV3101/pEAQ-HT-T9αH转基因菌株；挑取阳性单克隆接种于LB培养基中(含50μg/mL卡那霉素和25μg/mL利福平)，28℃培养24h；取培养好的菌液按1:100的比例于10mL LB培养基中(含50μg/mL卡那霉素和25μg/mL利福平)，28℃过夜培养至OD600值为0.8-1.0；加入重悬液MMA(10mM MES,10mMMgCl2,150μM乙酰丁香酮)至最终OD600为0.8-1.0，室温静置1-2h。
用去掉针头的1mL注射器将重悬后的农杆菌组合(已知基因+T9αH同源基因或GFP)注射于4-6周本式烟(Nicotiana benthamiana)的叶背，光下晾干1-2h后转移至黑暗处培养24h，后转至正常光照下培养，注射农杆菌5天后，收集样品，以注射含有GFP的叶片作为对照。上述已知基因包括TXS(U48796)、T5αH(AY289209)、T13αH(AY056019)、TAX19(AY628434)、TAT(AF190130)、T10βH(AF318211)。
将烟草样品用研磨机研磨，后将样品粉末转移至5mL离心管中，经冷冻干燥后，加入1mL甲醇，超声提取30min，13000rpm离心15min后，将上清转移至新离心管，再以13000rpm离心15min，从中取出200μL至进样瓶中，于LC-MS中检测，通过与紫杉素标准品进行对比发现，能够从烟草中检测到与紫杉素具有相同保留时间和分子量的物质。
如图1、图2所示，在含有T9αH的组合中，烟草叶片中能够从头合成紫杉素，而且其同源基因的活性具有一定的差异。
实施例2.紫杉烷C9羟化酶T9αH基因参与巴卡亭III的合成
1.紫杉烷C9羟化酶T9αH基因在烟草中参与巴卡亭III的从头合成
将构建好的表达载体pEAQ-HT-T9αH转入农杆菌GV3101中，获得GV3101/pEAQ-HT-T9αH转基因菌株；挑取阳性单克隆接种于LB培养基中(含50μg/mL卡那霉素和25μg/mL利福平)，28℃培养24h；取培养好的菌液按1:100的比例于10mL LB培养基中(含50μg/mL卡那霉素和25μg/mL利福平)，28℃过夜培养至OD600值为0.8-1.0；加入重悬液MMA(10mM MES,10mMMgCl2,150μM乙酰丁香酮)至最终OD600为0.8-1.0，室温静置1-2h。
以同样的方式将分别含有TXS(U48796)、TAT(AF190130)、T5αH(AY289209)、T13αH(AY056019)、T2αH(AY518383)、T7βH(AY307951)、TOT(SEQ ID NO：29)、TBT(AF297618)等基因的CV3101农杆菌进行培养，并在MMA中重悬至OD600值为0.8-1.0，然后与含有T9αH的农杆菌按照1:1的比例进行混合，其中包含荧光蛋白GFP的农杆菌作为对照。
用去掉针头的1mL注射器将重悬后的农杆菌组合注射4-6周本式烟(Nicotianabenthamiana)的叶背，光下晾干1-2h后转移至黑暗处培养24h，后转至正常光照下培养，注射农杆菌5天后，收集样品，以注射含有GFP的叶片作为对照。
将烟草样品用研磨机研磨，后将样品粉末转移至5mL离心管中，经冷冻干燥后，加入1mL甲醇，超声提取30min，13000rpm离心15min后，将上清转移至新离心管，再以13000rpm离心15min，从中取出200μL至进样瓶中，于LC-MS中检测，通过与巴卡亭III标准品进行对比发现，能够从烟草中检测到与巴卡亭III具有相同保留时间和分子量的物质。
如图3、图4所示，在含有T9αH的组合中，烟草叶片中能够从头合成巴卡亭III，而且其同源基因的活性具有一定的差异。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (12)
1.一种生物酶，其特征在于，其氨基酸序列包括如下序列中的至少一种：
a1)SEQ ID NO：1～14所示氨基酸序列中的至少一种；
a2)SEQ ID NO：1～14所示氨基酸序列中的至少一种的N端和/或C端连接标签得到的融合氨基酸序列；
a3)SEQ ID NO：1～14所示氨基酸序列中的至少一种经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；
a4)与SEQ ID NO：1～14所示氨基酸序列中的至少一种具有至少60％同一性且具有相同功能的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述生物酶的核酸分子，其特征在于，其核苷酸序列包括如下序列中的至少一种：
b1)SEQ ID NO：15～28所示核苷酸序列中的至少一种；
b2)SEQ ID NO：15～28所示核苷酸序列中的至少一种的互补序列、简并序列或同源序列，所述同源序列为与SEQ ID NO：15～28所示核苷酸序列具有至少75％同一性的核苷酸序列；
b3)在严格条件下与b1)或b2)所示的核苷酸序列杂交，且能够编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。
3.一种生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述c1)至c3)中的任一种：
c1)含有权利要求2所述核酸分子的表达盒；
c2)含有权利要求2所述核酸分子或c1)所述表达盒的载体；
c3)含有权利要求2所述核酸分子、c1)所述表达盒、c2)所述载体中的至少一种的宿主细胞；
任选的，所述宿主细胞包括微生物细胞、植物细胞、动物细胞、藻类细胞中的至少一种。
4.一种用于产生宿主细胞的方法，所述方法包括用权利要求2所述核酸分子、权利要求3所述生物材料中的表达盒或载体中的至少一种转化所述宿主细胞。
5.一种用于产生植物或植物细胞的方法，所述方法包括用权利要求2所述核酸分子、权利要求3所述生物材料中的表达盒或载体中的至少一种转化所述植物或植物细胞。
6.一种产生权利要求1所述生物酶的方法，其特征在于，将权利要求2所述核酸分子，或权利要求3所述生物材料中的表达盒、载体中的至少一种，转化宿主细胞，使宿主细胞产生所述生物酶。
7.如权利要求1所述生物酶、权利要求2所述核酸分子或权利要求3所述生物材料中的任一种在如下d1)、d2)、d3)和/或d4)中的应用：
d1)在催化紫杉烷类化合物和/或其中间体的前体物质中的C9位的羟基化；所述紫杉烷类化合物和/或其中间体的前体物质为C9位未发生羟基化和氧化的前体物质；
d2)在合成紫杉素和/或其中间体中的应用；
d3)在合成巴卡亭III和/或其中间体中的应用；
d4)在合成紫杉烷类化合物和/或其中间体中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述紫杉烷类化合物包括紫杉醇及其衍生物、紫杉素及其衍生物、多西他赛及其衍生物、卡巴他赛及其衍生物中的至少一种；
和/或，所述紫杉烷类化合物中间体包括紫杉二烯-六醇-六乙酸酯及其衍生物、1-去羟基巴卡亭IV及其衍生物、巴卡亭Ⅲ及其衍生物、10-去乙酰巴卡亭Ⅲ及其衍生物、紫杉醇及其衍生物、巴卡亭IV及其衍生物、巴卡亭VI及其衍生物、巴卡亭VII及其衍生物、巴卡亭IX及其衍生物、巴卡亭V及其衍生物、紫杉素及其衍生物、巴卡亭I及其衍生物、紫杉二烯-2α,5α,7β,9β,10β,13α-六醇-5α-乙酸酯及其衍生物、5α-乙酸酯-Taxuspine F及其衍生物、紫杉二烯-六醇-四乙酸酯及其衍生物、Taxuspine F及其衍生物中的至少一种。
9.一种在体内或体外合成紫杉烷类化合物和/或其中间体的方法，其特征在于，以紫杉烷类化合物和/或其中间体的前体物质中的至少一种为底物，在权利要求1所述生物酶和/或权利要求6所述方法产生的生物酶的催化作用下，C9位发生羟基化；所述紫杉烷类化合物和/或其中间体的前体物质为C9位未发生羟基化和氧化的前体物质。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述紫杉烷类化合物和/或其中间体的前体物质包括如式I和/或式II所示的化合物：
其中，R1、R3、R4各自独立地选自H、-OH、-OAc；R2、R6各自独立地选自H、-OH、-OAc、-OBz；R5、R7各自独立地选自H、-OH、-OAc、＝O。
11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述合成紫杉烷类化合物和/或其中间体的生物酶还包括TXS、TAT、T5αH、T13αH、T2αH、T7βH、TOT、TBT、T10βH、T14βH、DBAT、BAPT、T2’OH、DBTNBT、PAM、CoA ligase、TAX9、TAX14、TAX19中的至少一种。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的方法，其特征在于，所述体内包括微生物细胞内、藻类细胞内、植物细胞内和/或动物细胞内。
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