CN117224602A - 中药组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种中药组合物，包含大黄1～2份、黄连1～2份、黄芩1～2份；及其制备方法：包括如下步骤：称取重量份的原料：大黄1～2份、黄连1～2份、黄芩1～2份，加入6～10倍量的水或含乙醇的水溶液浸泡0～30min；回流提取1‑2h，提取1～2次，滤过，滤液减压浓缩得清膏；通过非极性大孔树脂层析柱纯化，用水、5‑10％的乙醇溶液、60‑95％的乙醇溶液作为洗脱剂对树脂柱进行洗脱，收集60‑95％的乙醇洗脱液，干燥，得中药组合物。本发明采用上述特定的组分和配比及其制备方法，具有协同作用，可以有效减轻肝脏的有效减少肝脏脂质蓄积、减轻肝脏的肿胀、降低血清及肝脏转氨酶、改善肝脏病理变化。
Description
技术领域
本发明涉及中药技术领域，尤其是涉及一种中药组合物及其制备方法和应用。
背景技术
非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)系指不具有过量饮酒史并排除药物等其他明确的损伤肝脏原因导致的以肝脏内脂质蓄积，有脂肪沉积在肝中央静脉和肝窦周围，肝细胞多呈气球样或大泡样脂肪变性以及弥漫性肝小叶内轻度炎症反应等为临床特征的慢性病理综合征。NASH是非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fattyliver disease,NAFLD)的严重类型，全球普通成人NAFLD患病率约为25％，其中10％～30％为NASH。NASH会进一步引发肝纤维化、肝硬化及肝细胞癌等严重问题。目前尚无公认的保肝药物可推荐用于NASH的常规治疗。控制饮食和增强锻炼是缓解NASH的重要策略，但难以实现和维持。NASH给患者带来了巨大的经济负担，药物治疗需求的不满足是当代医学面临的新挑战。
目前由于NASH的发病机制十分复杂且尚未阐明，现被广泛认同的观点是Day于1998年通过动物实验所提出的“二次打击”学说。随着研究的不断深入，许多学者提出“多重因素平行打击”概念，认为胰岛素抵抗、氧化应激、炎症反应、遗传学因素和肠道菌群等都可影响其发病过程，并且各因素之间相互影响，这丰富了“二次打击”学说的内容，使NASH的机制讨论更加多元。
非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是现代医学疾病名称，而传统医学中并未有专门记载和描述。中医学多从症状、病因病机等方面命名，将其归属于“胁痛”、“痞满”、“肝胀”、“肝痞”“肝癖”、“积聚”、“痰证”、“痰浊”、“湿阻”、“瘀证”、“肥气”、“积证”等范畴。国家中医药管理局肝病重点专科协作组将其明确命名为“肝癖”。饮食不节、劳逸失度、情志失调、久病体虚和禀赋不足是本病的主要病因诱因。饮食不节已经成为引发脂肪肝的最主要原因，再加上现在人们缺乏运动，造成摄入的精微物质无法消耗，会在体内积聚成为痰湿物质，阻塞机体。肝为将军之官，体阴而用阳，若情志不调则会导致肝失条达，气血运行不畅。久而久之，气滞血瘀，导致肝脏疏泄功能异常，升降不及，从而诱发疾病。本病病位在肝，涉及脾、肾等脏腑。在病机方面，本病以肝体用失调和脾肾亏虚为主要特点，并以痰、湿、浊、瘀、热为主要病理因素。饮食中的饮属于人体中的正常津液，在人体之内化生、转运和输布全凭脾胃功能的正常运行，如果本身脾胃虚弱，或摄入过多，脾胃不能正常运行，其精微物质输布异常，反化为水湿、痰饮，久为浊邪，最终成瘀生热。此外，饮食中的食为精微物质，如果不能很好地通过脾胃运化，则成为浊邪，日久生热生瘀。各种原因产生的痰、湿、浊、瘀、热蕴结于肝体，导致本病的发生。
目前为止，由于NASH的发病机制复杂，并发疾病较多，在现代医学中尚未形成预防和治疗NASH的统一认识，也没有特效药物的出现。近年来，随着中医药在预防和治疗NASH方面的不断深入研究，在临床研究和实验研究方面取得了一些成果，出现了许多防治方法和新兴药物，显示出中医药在预防和治疗NASH方面的独特优势。中医药在脂肪肝的预防和治疗方面具有多重靶点和多种途径的优势，中药复方治疗已成为治疗NASH的重要手段。
中药组合物出自东汉张仲景的《金匮要略》的中药组合物，由大黄，黄芩，黄连三味苦寒中药组成，是经典的“泻心汤”的基础小方。大黄为该方的君药，泻下攻积，凉血解毒，配以黄芩和黄连清上焦之热，泻中焦之火，共为臣药，辅助大黄，达到清热解毒，泻火通便之功效。三药配伍，既相互辅佐又各有侧重，直清上、中、下三焦之火。现代临床应用于急性胃肠炎、胆囊炎、口腔炎、痢疾以及外科疮疡等疾病。
非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的严重类型。本发明拟通过建立高脂高糖高胆固醇饮食诱导的小鼠NASH模型，并运用该模型验证醇提和水提工艺制备的中药组合物富集的部位对NASH的治疗效果。
发明内容
有鉴于此，本发明提供的中药组合物具有治疗非酒精性脂肪性肝炎的功效。
本发明提供了一种中药组合物，包括如下重量份的原料：
大黄1～2份、黄连1～2份、黄芩1～2份。
优选的，所述中药组合物包括如下重量份的原料：
大黄1～2份、黄连1份、黄芩1份。
优选的，所述中药组合物包括如下重量份的原料：
大黄2份、黄连1份、黄芩1份。
本发明提供了一种上述技术方案任意一项所述的中药组合物制备方法，包括：
A)将大黄、黄连和黄芩混合，加溶剂浸泡，回流提取，过滤，得到提取液；
B)将提取液浓缩至适量，相对密度1.03～1.08。
C)浓缩液清膏通过非极性大孔树脂层析柱纯化，用水洗脱至无色；5-10％的乙醇溶液洗脱除杂，60-95％的乙醇溶液作为洗脱剂对树脂柱进行洗脱，收集60-95％的乙醇洗脱部位即可。
D)将上述的60-95％的乙醇洗脱液干燥，即得中药组合物部位干膏。
优选的，步骤A)所述溶剂包括水或乙醇的水溶液；
所述浸泡的时间为0～30min；回流提取的次数为1～2次；提取时间为1～2h；
所述大黄、黄连和黄芩的总量与溶剂的质量比为1：(6～15)；
优选的，步骤C)所述非极性大孔树脂为大孔树脂D101；
优选的，步骤C)所述5-10％的乙醇溶液洗脱4个柱体积(BV)；
优选的，步骤C)所述60-95％的乙醇洗脱液洗脱4BV；
优选的，步骤D)所述60-95％的乙醇洗脱液干燥方式为喷雾干燥。
具体地前述中药组合物部位的制备方法包括：
回流提取：按处方量称取大黄、黄连和黄芩药材，分别加入8倍量和6倍量70％乙醇，回流提取2次，每次1h，滤过，合并滤液；
浓缩：70℃减压浓缩回收乙醇，浓缩至无醇味，得清膏；
精制：采用大孔树脂D101分离，树脂重量:药材重量为1:1，上完样后，先用水对吸附柱进行洗脱至水洗脱液无色，然后，采用浓度为10％乙醇溶液洗脱4BV除杂，收集95％的乙醇溶液洗脱液4BV；
浓缩干燥：减压浓缩回收95％乙醇洗脱液后，再喷雾干燥，得中药组合物；
具体地前述中药组合物部位的制备方法包括：
回流提取：按处方量称取大黄、黄连和黄芩药材，加10倍量的水浸泡30min后回流提取1.5h，自然冷却后，滤过，再加8倍量的水回流提取1h，过滤药渣，合并滤液
浓缩：70℃减压浓缩至适量，得清膏；
精制：采用大孔树脂D101分离，树脂重量:药材重量为1:1，上完样后，先用水对吸附柱进行洗脱至水洗脱液无色，然后，采用浓度为5％乙醇溶液洗脱4BV除杂，再用60％的乙醇溶液洗脱4BV，收集60％的乙醇洗脱液；
浓缩干燥：减压浓缩60％乙醇洗脱液，回收乙醇后，再喷雾干燥，得中药组合物。所述喷雾干燥的参数为入口温度80～90℃，出口温度150～170℃
本发明提供了上述任意一项所述的组合物或上述技术方案任意一项所述的制备方法制备得到的组合物在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎的药物中的应用。
优选的，所述防治包括降低血脂水平、降低肝功能指标和/或改善肝脏组织病理状态。
优选的，所述降低血脂水平包括降低总胆固醇水平或降低低密度脂蛋白胆固醇水平；
所述降低肝功能指标包括降低谷丙转氨酶水平、降低谷草转氨酶水平和降低碱性磷酸酶的水平；
所述改善肝脏组织病理变化包括减轻肝脏脂肪变性、减轻肝小叶炎症或减轻气球样变程度。
本发明提供了一种非酒精性脂肪性肝炎的药物，包括上述技术方案任意一项所述的组合物或上述技术方案任意一项所述的制备方法制备得到的组合物。
该药物包括口服制剂或非肠道给药的剂型。所说的口服制剂选自片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸剂、口服液体制剂当中的一种；所说的非肠道给药剂型选自于注射剂、气雾剂、栓剂或皮下给药剂型当中的一种。本发明药物可加入常规的药物赋形剂，如溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂等。
与现有技术相比，本发明提供了一种中药组合物，包括如下重量份的原料：大黄1～2份、黄连1～2份、黄芩1～2份，加入6～15倍量的水或含乙醇的水溶液浸泡0～30min；回流提取1-2h，提取1～2次，滤过，滤液减压浓缩得清膏；通过非极性大孔树脂层析柱纯化，用水、5-10％的乙醇溶液、60-95％的乙醇溶液作为洗脱剂对树脂柱进行洗脱，收集60-95％的乙醇洗脱液，干燥，得中药组合物。本发明采用上述特定的组分和配比，具有协同作用，可以有效减轻肝脏的有效减少肝脏脂质蓄积、减轻肝脏的肿胀、降低血清及肝脏转氨酶、改善肝脏病理变化；具有治疗非酒精性脂肪性肝炎的功效。
附图说明
图1为正常组、模型组、当飞利肝宁组、中药组合物1低剂量组、中药组合物1中剂量组、中药组合物1高剂量组、中药组合物2低剂量组、中药组合物2中剂量组及中药组合物2高剂量组治疗NASH小鼠血清血脂变化图；
图2为正常组、模型组、当飞利肝宁组、中药组合物1低剂量组、中药组合物1中剂量组、中药组合物1高剂量组、中药组合物2低剂量组、中药组合物2中剂量组及中药组合物2高剂量组治疗NASH小鼠血清肝功能指标变化图；
图3为正常组、模型组、当飞利肝宁组、水提低剂量组、水提中剂量组、水提高剂量组、醇提低剂量组、醇提中剂量组及醇提高剂量组小鼠肝组织HE染色结果图(20×)；A：正常组；B：模型组；C：当飞利肝宁组；D：水提低剂量组；E：水提中剂量组；F：水提高剂量组；G：醇提低剂量组；H：醇提中剂量组；I：醇提高剂量组；
图4为正常组、模型组、中药组合物低剂量组、中药组合物高剂量组、中药煎液低剂量组、中药煎液高剂量组治疗NAFLD小鼠血清血脂变化图；
图5为正常组、模型组、中药组合物低剂量组、中药组合物高剂量组、中药煎液低剂量组、中药煎液高剂量组治疗NAFLD小鼠血清肝功能指标变化图；
图6为正常组、模型组、中药组合物组低剂量组、中药组合物高剂量组、中药煎液低剂量组、中药煎液高剂量组肝组织HE染色结果图(20)×；A：正常组；B：模型组；C：中药组合物低剂量组；D：中药组合物高剂量组；E：中药煎液低剂量组；F：中药煎液高剂量组；
以上各图中，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001表示与正常组相比具有统计学意义；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，####P<0.0001表示与模型组相比具有统计学意义。
具体实施方式
本发明提供了一种中药组合物、其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都属于本发明保护的范围。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了一种中药组合物，包括如下重量份的原料：
大黄1～2份、黄连1～2份、黄芩1～2份。
本发明对于上述中药的来源不进行限定，市售即可。
本发明提供的中药组合物包括大黄1～2重量份；优选包括1重量份或2重量份。
大黄(Rhei Radix et Rhizoma)是我国的一味大宗药材，别名火参、黄良、肤如、将军等。《中华人民共和国药典》2020年版所收载的大黄为蓼科
(Polygonaceae)植物掌叶大黄(Rheumpalmatum L.)、唐古特大黄(R.tanguticumMaxim.ex Balf.)或药用大黄(R.officinale Baill.)的干燥根及根茎。现代药理研究表明，大黄具有泻下，促进胰液分泌，促进胆汁分泌，保肝，清除氧自由基，抗炎等功效。黄连为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch.、三角叶黄连Coptis deltoidea C.Y.Chenget Hsiao或云连Coptis teeta Wall.的干燥根茎。临床上主要用于治疗糖尿病、胃肠道疾病、皮肤损伤等疾病。药理研究表明，黄连有降糖、抗菌、抗氧化、抗炎等作用。
黄芩为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根。
本发明提供的中药组合物包括黄芩1～2重量份；优选包括1重量份或2重量份。
本发明其中一部分优选实施方式中，所述中药组合物包括如下重量份的原料：
大黄1～2份、黄连1份、黄芩1份。
本发明其中一部分优选实施方式中，所述中药组合物包括如下重量份的原料：
大黄2份、黄连1份、黄芩1份。
本发明创造性的将上述3种中药进行合理配伍，使得各组分起到协同调控减少肝脏脂质蓄积、减轻肝脏的肿胀、降低血清及肝脏转氨酶、改善肝脏病理变化。该中药组合物均为药食同源药材或可食用食品，无有毒药材，安全可靠。
本发明提供了一种上述技术方案任意一项所述的中药组合物制备方法，包括：
A)将大黄、黄连和黄芩混合，加溶剂浸泡，回流提取，过滤，得到提取液；
B)将提取液浓缩，浓缩至相对密度为1.03～1.08的清膏；
C)浓缩液清膏通过非极性大孔树脂层析柱纯化，用水、5-10％的乙醇溶液、60-95％的乙醇溶液作为洗脱剂对树脂柱进行洗脱，收集60-95％的乙醇洗脱部位即可。
D)将上述的60-95％的乙醇洗脱液干燥，即得中药组合物干膏。
本发明提供的上述组分和配比已经有了清楚地描述，在此不再赘述。
本发明将大黄、黄连和黄芩混合，加溶剂浸泡，回流提取。
按照本发明，所述溶剂包括水或乙醇的水溶液；具体的，所述乙醇的水溶液优选为60％～80％的乙醇水溶液；更优选为70％的乙醇水溶液。
按照本发明，所述大黄、黄连和黄芩的总量与溶剂的质量比优选为1：(6～15)；更优选为1：(7～14)；最优选为1：(8～13)。
一些实施例中，所述浸泡的时间为0～30min。
具体为，采用醇提时候，无需浸泡；采用水提取时，优选浸泡20～30min。
一些实施例中，所述回流提取的次数为1～2次；提取时间为1～2h。
回流提取完毕后，过滤，得到提取液。
将提取液浓缩,至小体积，无醇味，得浓缩液清膏，相当密度1.03～1.08。
浓缩液清膏通过非极性大孔树脂层析柱纯化，用水洗脱至无色、5-10％的乙醇溶液洗脱、60-95％的乙醇溶液作为洗脱剂对树脂柱进行洗脱，收集60-95％的乙醇洗脱部位即可。将上述的60-95％的乙醇洗脱液干燥，即得中药组合物部位干膏。所述的干燥方式为喷雾干燥；所述喷雾干燥的参数为入口温度80～90℃，出口温度150～170℃。
本发明对于所述过滤的具体操作不进行限定，本领域技术人员熟知的即可。
本发明所述减压浓缩的温度优选为65℃。
本发明提供了上述任意一项所述的组合物或上述技术方案任意一项所述的制备方法制备得到的组合物在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎的药物中的应用。
按照本发明，所述防治包括降低血脂水平、降低肝功能指标和/或改善肝脏组织病理状态。
本发明所述降低血脂水平包括降低总胆固醇水平或降低低密度脂蛋白胆固醇水平；
本发明所述降低肝功能指标包括降低谷丙转氨酶水平、降低谷草转氨酶水平和降低碱性磷酸酶的水平；
本发明所述改善肝脏组织病理变化包括减轻肝脏脂肪变性、减轻肝小叶验证或减轻气球样变程度。
本发明提供了一种非酒精性脂肪性肝炎的药物，包括上述技术方案任意一项所述的组合物或上述技术方案任意一项所述的制备方法制备得到的组合物。
本发明所述药物的剂型为片剂、颗粒剂、胶囊剂或口服液中的一种或几种。
本发明提供了一种中药组合物，包括如下重量份的原料：大黄1～2份、黄连1～2份、黄芩1～2份。本发明采用上述特定的组分和配比，具有协同作用，可以有效减轻肝脏的有效减少肝脏脂质蓄积、减轻肝脏的肿胀、降低血清及肝脏转氨酶、改善肝脏病理变化；具有治疗非酒精性脂肪性肝炎的功效。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种中药组合物、其制备方法和应用进行详细描述。
实施例1：中药组合物的制备1
本发明的中药组合物由包括如下原料药的组分制备得到：大黄2份重量份，黄芩1份重量份，黄连1份重量份。
中药组合物1的制备：按处方比例(大黄：黄芩：黄连＝2:1:1)称取药材3kg，放入圆底烧瓶中，加10倍量的水浸泡30min后回流提取1.5h，自然冷却后，滤过，再加8倍量的水回流提取1h，过滤药渣，合并滤液，70℃减压浓缩至相对密度为1.06(60℃)的清膏，浓缩液清膏通过大孔树脂D101层析柱纯化，先用水对吸附柱进行洗脱至水洗脱液无色，然后，采用浓度为5％的乙醇溶液洗脱4个柱体积进行除杂，再用60％的乙醇溶液洗脱4个柱体积。减压浓缩回收60％乙醇后，再喷雾干燥，入口温度80℃，出口温度150℃，得中药组合物1。
实施例2：中药组合物的制备2
中药组合物2的制备：按处方比例(大黄：黄芩：黄连＝2:1:1)称取药材3kg，放入圆底烧瓶中，用70％乙醇回流提取2次，第一次1h，第二次1h，滤过，合并滤液，减压回收乙醇，60℃浓缩至相对密度为1.04(60℃)的清膏，浓缩液清膏通过大孔树脂D101层析柱纯化，先用水对吸附柱进行洗脱至水洗脱液无色，然后，采用浓度为10％的乙醇溶液洗脱4个柱体积进行除杂，再用95％的乙醇溶液洗脱4个柱体积。减压浓缩回收60％乙醇后，再喷雾干燥，入口温度85℃，出口温度155℃，得中药组合物2。
实施例3：中药组合物对NASH小鼠血清血脂水平的影响
2.1实验动物：SPF级雄性C57BL/6小鼠，4～5周龄，体重18～20g，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，动物许可证号：SCXK(京)2019-0010。饲养条件：温度23±2℃，湿度50±10％，保持12h昼夜节律，自由摄食饮水。
2.2实验方法
2.2.1造模和给药方案：小鼠适应性喂养7天，根据体重随机分组分为正常组和模型组。正常组饲以正常饲料，自由摄食饮水；模型组饲以高脂高糖高胆固醇饲料，饮用果糖水(浓度42g/L，以55％果糖和45％蔗糖按比例混合溶解)。喂养12周后，将小鼠按体重随机分为8组：模型组，当飞利肝宁胶囊组(0.43g/kg，按人临床用剂量折算)，中药组合物1低剂量组(相当于9.1g生药/kg，按人临床用生药量折算)，中药组合物1中剂量组(相当于18.2g生药/kg，按人临床用生药量折算)，中药组合物1高剂量组(相当于36.4g生药/kg，按人临床用生药量折算)，中药组合物2低剂量组(相当于9.1g生药/kg，按人临床用生药量折算)，中药组合物2中剂量组(相当于18.2g生药/kg，按人临床用生药量折算)，中药组合物2高剂量组(相当于36.4g生药/kg，按人临床用生药量折算)，每组10只小鼠。从喂养第13周开始，在每天同一时间段按小鼠体重灌胃给予相应药物，正常组与模型组给予0.5％ CMC-Na溶液，持续给药8周。
2.2.2药物配制：分别将当飞利肝宁胶囊、中药组合物1和中药组合物2用超声处理30min使其分散于0.5％ CMC-Na溶液中，制成灌胃液(每日现用现配)。
2.2.3样品采集与检测：在给药第8周末，小鼠过夜禁食12h，自由饮水。对小鼠进行眼眶静脉采血，将全血收集至1.5mL EP管中，室温静置30min后，4000r/min离心10min，取上清液，存储于-80℃超低温冰箱备用。按照生化试剂盒说明书进行总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)检测。
2.3实验结果：如图1所示，给药终点，模型组小鼠血清中TC和LDL-C水平均显著高于正常组，与模型组相比，中药组合物各给药组TC和LDL-C水平呈剂量依赖性降低，且中药组合物1高剂量组、中药组合物2中剂量组和中药组合物2高剂量组均显著低于模型组。
实施例4：中药组合物对NASH小鼠血清肝功能指标的影响
3.1实验方法：分组及给药方案同实施例2。给药8周后，小鼠过夜禁食12h，自由饮水。对小鼠进行眼眶静脉采血，将全血收集至1.5mL EP管中，室温静置30min后，4000r/min离心10min，取上清液，存储于-80℃超低温冰箱备用。按照生化试剂盒说明书进行谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和碱性磷酸酶(AKP)检测。
3.2实验结果：如图2所示，给药终点，模型组小鼠血清中ALT、AST和AKP水平均显著高于正常组，与模型组相比，中药组合物各给药组ALT、AST和AKP水平呈剂量依赖性降低，且水提高剂量组血清ALT和AKP水平均显著低于模型组，醇提中剂量组和醇提高剂量组血清ALT、AST和AKP水平均显著低于模型组，当飞利肝宁组ALT、AST和AKP水平均低于模型组，但只有ALT具有显著性差异。
实施例5：中药组合物对NASH小鼠肝脏组织病理学的影响
4.1实验方法：给药终点采血完毕后，摘取小鼠肝脏组织，置于10％的中性甲醛溶液中固定。固定完成后乙醇梯度脱水，置于二甲苯中透明，进行石蜡包埋，切片厚度4μm，进行脱蜡等处理后进行HE染色，于切片扫描仪中扫描。
实验结果：如图3所示，正常组小鼠肝脏细胞呈放射状排列，肝索大小正常，肝血窦清晰，未见明显病变。模型组小鼠肝脏可观察到不同程度的肝细胞弥漫性脂肪变性和气球样变，肝索严重紊乱，肝小叶可见大量炎性细胞浸润。与模型组相比，各给药组小鼠肝脏的脂肪变性、肝小叶炎症和气球样变程度有所减轻，其中中药组合物1高剂量组、中药组合物2中剂量组和高剂量组改善较为明显。
上述结果表明，中药组合物对高脂高糖高胆固醇饮食诱导的C57BL/6小鼠NASH模型具有显著的治疗作用，可改善脂质代谢紊乱、肝功能损伤和炎性细胞浸润等多个病理环节。
实施例6：中药组合物与煎液对NAFLD小鼠药效比较实验
1.中药组合物的制备：按处方比例(大黄：黄芩：黄连＝1:2:1)称取药材2kg制备方法同实施例1；
2.三黄泻心汤煎液：按处方比例(大黄：黄芩：黄连＝1:2:1)称取药材2kg加入10倍量的水浸泡1h，然后常温常压下武火煮沸转文火煎煮两次，一煎90min，二煎60min，收集各煎出液，离心分离或沉降滤过后，所得离心分离或沉降滤过后，所得滤液低温浓缩至规定浓度，稠膏的比重热测为1.30；所得稠膏蒸发至比重为1：1，冷后加入稠膏蒸发后等体积的乙醇，充分混匀，放置过夜，使其沉淀，次日取其上清液，沉淀物用60％乙醇洗净，洗液与上清液合并，减压回收乙醇后，待浓缩至1:1时移置放冷处)静置4小时，使沉淀完全，过滤，滤液低温蒸发至稠膏状；浓缩采用真空度1.33kPa(即10mmHg)，温度40℃，干燥，得煎液干膏。
3.药效比较实验
3.1实验动物：SPF级雄性C57BL/6小鼠，4～5周龄，体重18～20g，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，动物许可证号：SCXK(京)2019-0010。饲养条件：温度23±2℃，湿度50±10％，保持12h昼夜节律，自由摄食饮水。
3.2实验方法
3.2.1造模和给药方案：小鼠适应性喂养7天，根据体重随机分组分为正常组和模型组。正常组饲以正常饲料；模型组饲以高脂高糖高胆固醇饲料江苏省协同医药生物工程有限责任公司提供)，正常提供饮用水。喂养8周后，将小鼠按体重随机分为8组：正常组、模型组、中药组合物低剂量组、(相当于18.2g生药/kg，按人临床用生药量折算)，中药组合物中剂量组(相当于36.4g生药/kg，按人临床用生药量折算)，煎液干膏低剂量组(相当于18.2g生药/kg，按人临床用生药量折算)，煎液干膏中剂量组(相当于36.4g生药/kg，按人临床用生药量折算)，每组10只小鼠。从喂养第8周开始，在每天同一时间段按小鼠体重灌胃给予相应药物，正常组与模型组给予0.5％ CMC-Na溶液，持续给药4周。在给药第4周末，小鼠过夜禁食12h，自由饮水。对小鼠进行眼眶静脉采血，将全血收集至1.5mL EP管中，室温静置30min后，4000r/min离心10min，取上清液，存储于-80℃超低温冰箱备用；另取一部分肝组织置于10％中性甲醛溶液中固定，用于肝组织病理学检测，其余肝组织置于-80℃冰箱保存备用。
3.2.2血清血脂指标测定
按照TC测试盒说明书，取2.5μL样本，加入250μL工作液，混匀，37℃孵育10min，波长510nm，酶标仪测定各孔吸光度值，按照说明书计算TC的浓度。
按照LDL-C测试盒说明书，取2.5μL样本，加入180μL试剂R1，轻轻振荡孔板混匀，37℃孵育5min，波长546nm，酶标仪测定各孔吸光度值A1，加入60μL试剂R2，轻轻振荡混匀，37℃孵育5min，波长546nm，酶标仪测定各孔吸光度值A2，按照说明书计算LDL-C浓度。
3.2.3血清肝功能指标测定
按照AST、ALT测试盒说明书，测定孔与对照孔均加入20μL基质液，测定孔加入5μL待测样本，测定孔每吸取一个样本，将吸嘴伸入孔板底部基质液中，反复吸打混匀，37℃反应30min，测定孔和对照孔均加入20μL 2,4-二硝基苯肼显色液，而后对照孔加入5μL待测样本，与上述测定孔一样反复吸打混匀，37℃反应20min，最后测定孔与对照孔均加入200μL0.4mol/L氢氧化钠溶液，轻轻水平摇动96孔板混匀，室温放置15min，波长510nm，酶标仪测定各孔OD值，按照说明书计算AST和ALT的酶活力。
按照AKP测试盒说明书，在空白孔中加入5μL双蒸水，标准孔中加入5μL0.1mg/mL酚标准应用液，测定孔中加入5μL待测样本，在各孔中依次加入50μL缓冲液和50μL基质液，充分混匀37℃水浴15min后，各孔均加入显色剂150μL，轻轻振摇孔板混匀，波长520nm，酶标仪测定各孔吸光度值，按照说明书计算AKP的酶活力。
3.2.4肝组织病理性检测
将固定在10％中性甲醛溶液中的肝组织取出，乙醇梯度脱水，置于二甲苯中透明，进行石蜡包埋，切片厚度4μm，进行脱蜡等处理后进行HE染色，于切片扫描仪中扫描。
3.3实验结果
3.3.1中药组合物和煎液对NAFLD小鼠血清血脂水平的影响
如图4所示，给药终点，模型组小鼠血清中TC和LDL-C水平均显著高于正常组。与模型组相比，中药组合物低和煎液均能显著降低小鼠血清中TC和LDL-C水平具有显著性差异。
3.3.2中药组合物和煎液对NAFLD小鼠血清肝功能指标的影响
如图5所示，给药终点，模型组小鼠血清中ALT、AST和AKP水平均显著高于正常组。与模型组相比，中药组合物低和高组ALT、AST和AKP水平均显著低于模型组；而煎液与模型组比较，AST水平低和高两组均无显著性差异；AKP水平低剂量组均无显著性差异，高剂量组有显著性差异。
如图6所示，实验终点，正常组小鼠肝脏肝小叶结构正常，肝索排列整齐呈放射状，无肝细胞肿胀及脂肪变。模型组小鼠肝细胞内有不同程度大小不等的空泡脂肪变性，并有不同程度的变性与点、灶状坏死，肝小叶界限不清，肝细胞排列不规整，肝索结构紊乱，部分肝细胞肿胀呈气球样变。与模型组相比，中药组合物组两个剂量组小鼠肝脏病变改善较为明显，而煎液对小鼠肝脏病变有改善，但没有发生显著改善。
上述结果表明，中药组合物较煎液对NAFLD的治疗效果更优。
实验例7中药组合物制备不同剂型的方法
本发明中药组合物可以加入制备不同剂型的各种常规辅料，以制备成任何一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂制成的临床上任何可接受的剂型形式，包括口服制剂或非肠道给药的剂型。如片剂、胶囊剂、注射剂、气雾剂、滴丸剂等。
1)胶囊剂的制备：取活性部位浸膏100g，加入淀粉180g，糊精60g，再加入1g硬脂酸镁，混匀，再加入75％乙醇适量，充分搅拌均匀，制成软材，通过20-30目筛，制成颗粒，低温干燥，整粒，定量转入硬胶囊。
2)片剂的制备：取活性部位浸膏100g，加入淀粉80g，糊精50g，微晶纤维素50g，加入适量淀粉浆制成软材，制粒，干燥，过筛，加入微粉硅胶1g，压片，即得。
3)注射剂的制备：活性部位浸膏用25倍注射用水溶解，调节pH至7，活性炭吸附，0.22um滤膜滤过，灌封，高温灭菌即得。
4)滴丸剂的制备：活性部位浸膏100g加入十八醇250g，置蒸发皿中，水浴加热至全部熔融，加入冰片搅拌至溶化，将上述药液于80-85℃保温；冷却柱中加入适量冷却剂PEG6000，外壁通冷水冷却，调节滴管出口与冷却剂间的距离，控制滴速为每分钟30-35滴，每粒重50mg。冷却，干燥，即得。
5)散剂的制备：活性部位浸膏100g，加入糊精200g，微晶纤维素50g，粉粹机粉碎成细粉，过筛，加入适量硬脂酸镁，分剂量包装，即得。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (13)
1.一种中药组合物，其特征在于，包括如下重量份的原料：
大黄1～2份、黄连1～2份、黄芩1～2份。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述中药组合物包括如下重量份的原料：
大黄1～2份、黄连1份、黄芩1份。
3.根据权利要2所述的组合物，其特征在于，所述中药组合物包括如下重量份的原料：
大黄2份、黄连1份、黄芩1份。
4.一种权利要求1～3任意一项所述的中药组合物制备方法，其特征在于，包括：
A)将大黄、黄连和黄芩混合，加溶剂浸泡，回流提取，过滤，得到提取液；
B)将提取液浓缩，干燥，得到提取清膏；
C)浓缩液清膏通过非极性大孔树脂层析柱纯化，用水洗脱至无色，5～10％的乙醇溶液除杂，而后采用60～95％的乙醇溶液作为洗脱剂对树脂柱进行洗脱，收集60～95％的乙醇洗脱部位得到60-95％的乙醇洗脱液；
D)将上述的60-95％的乙醇洗脱液干燥，即得。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤A)所述溶剂包括水或乙醇的水溶液；
所述浸泡的时间为0～30min；回流提取的次数为1～2次；提取时间为1～2h；
所述大黄、黄连和黄芩的总量与溶剂的质量比为1：(6～15)。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤B)所述提取清膏的相对密度为1.03～1.08。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤C)所述非极性大孔树脂选自大孔树脂D101；
所述5-10％的乙醇溶液除杂，洗脱体积为4个柱体积(BV)；步骤C)所述60-95％的乙醇溶液对树脂柱进行洗脱，洗脱体积为4个柱体积(BV)。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤D)所述的干燥方式为喷雾干燥；所述喷雾干燥的参数为入口温度80～90℃，出口温度150～170℃。
9.权利要求1～3任意一项所述的组合物或权利要求4～8任意一项所述的制备方法制备得到的组合物在制备治疗非酒精性脂肪性肝炎的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述防治包括降低血脂水平、降低肝功能指标和/或改善肝脏组织病理状态。
11.根据权利要求10所述的应用，所述降低血脂水平包括降低总胆固醇水平或降低低密度脂蛋白胆固醇水平；
所述降低肝功能指标包括降低谷丙转氨酶水平、降低谷草转氨酶水平和降低碱性磷酸酶的水平；
所述改善肝脏组织病理变化包括减轻肝脏脂肪变性、减轻肝小叶验证或减轻气球样变程度。
12.一种非酒精性脂肪性肝炎的药物，其特征在于，包括权利要求1～3任意一项所述的组合物或权利要求4～8任意一项所述的制备方法制备得到的组合物。
13.根据权利要求12所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型为包括口服制剂或非肠道给药的剂型；所说的口服制剂选自片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸剂、口服液体制剂当中的一种；所说的非肠道给药剂型选自于注射剂、气雾剂、栓剂或皮下给药剂型当中的一种；
所述药物还包括辅料；所述辅料为药物赋形剂；所述药物赋形剂包括溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂或着色剂中的一种或几种。
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