CN117210400A - 一种分化培养基、利用分化培养基诱导多功能干细胞分化为间充质干细胞的方法 - Google Patents

一种分化培养基、利用分化培养基诱导多功能干细胞分化为间充质干细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本申请涉及干细胞技术领域，具体公开了一种分化培养基、利用分化培养基诱导多功能干细胞分化为间充质干细胞的方法。本申请公开的分化培养基，包括以下重量份的组分：85‑95份DMEM‑F12、8‑12份HPL、0.7‑1.3份青链霉素双抗、0.001‑0.004份Y‑27632、0.6‑1.4份B27培养基、0.02‑0.08份盐酸硫胺素、0.1‑0.4份普鲁卡因胺、0.01‑0.08份α‑生育酚、0.06‑0.12份N‑乙酰半胱氨酸。本申请还公开了利用该培养基将诱导多功能干细胞分化为间充质干细胞的方法。利用本申请提供的分化培养基能够从诱导性多功能干细胞中成功分化MSC，获得高质量、高产率的MSC。

Description

一种分化培养基、利用分化培养基诱导多功能干细胞分化为 间充质干细胞的方法
技术领域
本申请涉及干细胞技术领域，具体涉及一种分化培养基、利用分化培养基诱导多功能干细胞分化为间充质干细胞的方法。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSC)是一种存在于多种组织器官中的多功能干细胞，具有自我更新和多向分化的潜能，可以广泛应用于多种疾病的治疗和组织工程研究。此外，间充质干细胞的性能稳定、输注方便、便于运输，因此在新医疗领域具有重大的应用价值。间充质干细胞的来源广泛，因供体、组织来源的差异性，间充质干细胞的增殖能力及生物学功能存在一定差异，因此，有必要开发其他获得大量均一MSC的新策略。
利用诱导性多功能干细胞(Induced pluripotent stem cells，iPSC)定向诱导分化获得间充质干细胞，可以为细胞疗法提供一种稳定的种子细胞。目前，该策略已有较多文献报道，并且与组织来源的MSC相比，诱导分化获得的间充质干细胞具有更强的增殖能力、更强的免疫调控能力及神经保护能力及更低的促瘤性。
目前，从iPSC分化获得MSC的策略包括使用共培养OP9细胞以及使用各类细胞因子和生长因子。也有方法首先通过胚状体的自发分化随后通过流式细胞术分选以获得所需的MSC。通过这些方法衍生的细胞通常被测试为MSC表面标记为阳性，并且能够在体外分化成两个或三个间充质谱系，即成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。但上述方面存在明显的局限性，包括处理操作复杂、需要大量的培养时间和人力成本，同时效率低和产量低。
因此，有必要突破相关技术中的局限性，开发一种新的从iPSC中分化获得MSC的方法。
发明内容
为了提高从iPSC中分化MSC的效率，同时获得高质量的MSC，本申请提供一种分化培养基、利用分化培养基诱导多功能干细胞分化为间充质干细胞的方法。
第一方面，本申请提供一种分化培养基，采用如下的技术方案：
一种分化培养基，包括以下重量份的组分：85-95份DMEM-F12、8-12份HPL、0.7-1.5份青链霉素双抗、0.001-0.004份Y-27632、0.6-1.4份B27培养基、0.02-0.08份盐酸硫胺素、0.1-0.4份普鲁卡因胺、0.01-0.08份α-生育酚、0.06-0.12份N-乙酰半胱氨酸。
本申请利用特定重量份的DMEM-F12、HPL、青链霉素双抗、Y-27632、B27培养基、盐酸硫胺素、普鲁卡因胺、α-生育酚、N-乙酰半胱氨酸作为分化培养基的原料组分，用于从诱导性多功能干细胞中分化MSC，处理方法操作简单，可以提高分化效率，同时获得高质量、高产率的MSC。
本申请利用含有血小板裂解液(HPL)替代牛血清的培养液作为分化培养基，可以将iPSC分化为MSC；Y-27632是一种Rho相关蛋白激酶p160ROCK的小分子抑制剂，Y-27632通过靶向结合ROCK-1/2的催化位点，抑制其激酶活性。因此，Y-27632可以作用于Rho介导的应力纤维的形成，抑制G1-S期细胞周期进程和胞质分裂。此外，Y-27632还能够通过调节上皮-间充质过渡样诱导人多功能干细胞(hIPSCs)选择性地分化为间胚层谱系。Y027632是干细胞培养过程中不可或缺的神药。在类器官构建过程中，Y-27632可以阻止干细胞的凋亡，提高克隆形成效率。
盐酸硫胺素是一种水溶性维生素，属于维生素B族，通常作为碳水化合物代谢的生物化学反应的辅酶；普鲁卡因胺一种抗心律失常药；α-生育酚即维生素Eα-生育酚是一种脂溶性的抗氧化剂，可以有效阻止脂肪氧化时活性氧化物的形成；N-乙酰半胱氨酸是细胞内还原性谷胱甘肽的前体，是一种粘液溶解剂，可以减少粘液的厚度。
本申请的发明人发现，将上述原料混合作为分化培养基，从iPSC中分化获得MSC，无需添加细胞因子和生长因子以及生物材料基质如I型胶原蛋白，即可通过施加物理刺激和信号调节，对细胞命运产生强烈影响；进而可以通过整合素介导的信号通路促进间充质干细胞的成骨分化，还可以通过激活上皮-间质转化来刺激间质形态发生。因此，本申请的技术方案中，利用分化培养基在调节iPSC向MSC的分化中发挥积极作用，简化了操作步骤，能够促进扩大规模或利用生产线进行iPSC向MSC的分化在临床中的应用。
优选地，所述分化培养基包括以下重量份的组分：85-95份DMEM-F12、8-10份HPL、1.1-1.3份青链霉素双抗、0.002-0.004份Y-27632、0.08-0.12份氨基酸、0.6-1.4份B27培养基、0.02-0.05份盐酸硫胺素、0.1-0.2份普鲁卡因胺、0.01-0.04份α-生育酚、0.06-0.08份N-乙酰半胱氨酸。
进一步地，所述分化培养基包括以下重量份的组分：90份DMEM-F12、10份HPL、1.1份青链霉素双抗、0.003份Y-27632、0.12份氨基酸、1.0份B27培养基、0.05份盐酸硫胺素、0.1份普鲁卡因胺、0.04份α-生育酚、0.08份N-乙酰半胱氨酸。
本申请的发明人发现，分化培养基中的各成分用量对于iPSC中分化获得MSC的效果具有较大的影响，本申请通过多次试验，优化了各原料的用量为上述添加量，提高了分化培养基的使用效果。
优选地，所述分化培养基还包括0.08-0.16份氨基酸；所述氨基酸选自L-丙氨酸、L-天冬氨酸、L-亮氨酸中的一种或多种。
进一步地，所述氨基酸为重量比为10：(3-7)的L-天冬氨酸和L-亮氨酸。
在一个具体的实施方案中，所述L-天冬氨酸和L-亮氨酸的重量比可以为10:3、10:5、10:7。
在一个具体的实施方案中，所述L-天冬氨酸和L-亮氨酸的重量比还可以为10：(3-5)、10：(5-7)。
经过试验分析可知，本申请选择在分化培养基中添加上述重量比的氨基酸，可以进一步提高诱导多功能干细胞分化为间充质干细胞的分化质量和分化效率。
第二方面，本申请提供了上述分化培养基在诱导多功能干细胞分化为间充质干细胞中的应用。
第三方面，本申请提供了一种诱导多功能干细胞分化为间充质干细胞的方法，利用上述分化培养基诱导多功能干细胞，获得间充质干细胞；具体包括以下步骤：
预处理：利用ROCK抑制剂Y-27632对iPSC细胞进行预处理；
解离：利用解离液Accutase对iPSC细胞进行消化，解离为分散状态的单个细胞；
接种与分化培养：将细胞接种至所述分化培养基中进行分化培养，至细胞融合度达到70％-80％，经过消化解离、即可获得P0代间充质干细胞；
传代培养：将所述P0代间充质干细胞进行传代培养，获得成熟的间充质干细胞。
单个的、分散状态的iPSC会比集落状态的细胞更容易响应信号刺激，进而分化效率会较高。因此，本申请的技术方案中，使用单个的、分散状态的iPSC细胞来进行分化处理，从而提高分化效率。同时，为了保证单个的、分散状态的细胞的活率，本申请中还使用了ROCK抑制剂Y-27632对细胞进行预处理。
优选地，所述细胞接种的接种密度为15000/cm2-45000/cm2。
第四方面，本申请提供了利用上述方法制得的间充质干细胞。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
本申请的方法中，使用的分化培养基通过以下机理促进分化：一方面，诱导多功能干细胞通过生物物理作用利用分化培养基贴附固定在具有相对高弹性模量高硬度的培养板表面，有利有干细胞向间充质谱系分化。另一方面，分化培养基通过与细胞表面整联蛋白相互作用，促进细胞的黏附、迁移、增殖和分化，尤其是通过激活上皮-间质转化机制来刺激细胞向间质形态分化。
本申请利用分化培养基，成功优化出一种成本较低、简易高效地将人iPSC分化为MSC的方法；该方法克服了现有技术的不足，不涉及异种胎牛血清，无需胶原包被细胞载体，无需添加生长因子，无需特殊培养条件，可以简易高效地产生大量适用于临床的iPSC来源的MSC。
利用本申请的方法分化获得的间充质干细胞方法简易，获得的间充质干细胞纯度高、效率高，14d可获得第一代MSC，无需要复杂操作。成本低。无需要昂贵试剂或添加其他成分。
附图说明
图1为实施例3中分化的MSC的形态图。
图2为实施例16中分化的MSC的形态图。
图3为对比例1中分化的MSC的形态图。
图4为对比例2中分化的MSC的形态图。
图5为实施例3制备的分化的MSC的流式细胞检测图。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本申请的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
制备例
制备例1-7
制备例1-7分别提供了一种分化培养基。
上述制备例的不同之处在于：分化培养基中各组分的用量不同，具体如表1所示。
上述分化培养基的制备方法为：按照表1中各组分的添加量，分别称取相应重量各组分，然后均匀混合，即得分化培养基。
表1制备例1-7中分化培养基中各组分的用量
制备例8-17
制备例8-17分别提供了一种分化培养基。
上述制备例与制备例2的不同之处在于：分化培养基中氨基酸的种类具体为：
制备例8中：未添加氨基酸。
制备例9中：氨基酸为L-丙氨酸。
制备例10中：氨基酸为L-天冬氨酸。
制备例11中：氨基酸为L-亮氨酸。
制备例12中：氨基酸为重量比为10：5的L-丙氨酸和L-亮氨酸。
制备例13中：氨基酸为重量比为10：5的L-天冬氨酸和L-丙氨酸。
制备例14中：氨基酸为重量比为10：2的L-天冬氨酸和L-亮氨酸。
制备例15中：氨基酸为重量比为10：3的L-天冬氨酸和L-亮氨酸。
制备例16中：氨基酸为重量比为10：7的L-天冬氨酸和L-亮氨酸。
制备例17中：氨基酸为重量比为10：8的L-天冬氨酸和L-亮氨酸。
上述制备例与制备例2的其余原料及各原料用量和分化培养基的制备方法均与制备例2相同。
制备例18
制备例18提供了一种分化培养基。
本制备例中分化培养基的制备方法为：在基础培养基α-MEM培养基(Gibco)中添加终浓度为5ng/ml的血小板衍生因子(PDGFAB)(PeproTech，AF10014B)和终浓度为100nM的地塞米松(Sigma，D4902)，即得。
制备例19-22
制备例19-22分别提供了一种分化培养基。
上述制备例与与制备例2的不同之处具体为：
制备例19中：以等量的胎牛血清(购自Sigma公司)代替HPL。
制备例20中：以等量的维生素C代替盐酸硫胺素。
制备例21中：以等量的盐酸吡哆醇代替α-生育酚。
制备例22中：以等量的奎尼丁代替普鲁卡因胺。
上述制备例与制备例2的其余原料及各原料用量和分化培养基的制备方法均与制备例2相同。
实施例1
本实施例提供了一种iPSC细胞的培养方法。
本实施例中iPSC细胞为人诱导型多能干细胞KY01ANFB0201 IPSC细胞，接种到基质胶(matrigel)包被的细胞培养板上，利用mTeSR1多能干细胞培养基对iPSC细胞进行培养；以在诱导步骤之前培养iPSC细胞。每天更换培养基以维持iPSC细胞的培养。
实施例2-16
实施例2-16分别提供了一种将iPSC细胞分化为MSC的方法。
上述实施例的不同之处在于：分化培养基的来源不同，具体为：实施例2-16中所使用的分化培养基分别来源于制备例1-5、8-17。
上述实施例中iPSC细胞分化为MSC的方法具体包括以下步骤：
(1)预处理：在分离iPSC细胞之前，在mTeSR1培养基中添加终浓度为10μM的Y-27632，对实施例1提供的iPSC细胞预处理孵育1h；
(2)消化解离：向mTeSR1培养基中加入1ml Accutase消化iPSC细胞，在37℃的孵育箱孵育10min，使细胞解离形成分散状态的单个细胞，加入分化培养基终止消化；将收集的单个细胞离心(300g，5min)、弃上清、然后用分化培养基重悬细胞；
(3)接种：将解离后的单个细胞以30,000/cm2的接种密度接种在细胞培养板上，在CO2培养箱中，孵育48h；
(4)分化培养：更换分化培养基进行正常培养，然后每3-4d更换一次培养液；培养约14d后，至细胞融合度为70％-80％；
(5)P0代间充质干细胞的获得：向培养基中加入1ml Accutase消化细胞，解离成单个细胞，加入分化培养基终止消化；将收集的单个细胞离心(300g，5min)、弃上清、然后用分化培养基重悬细胞，收获细胞并标记为P0传代，即分化获得P0代间充质干细胞；
(6)传代培养：利用传代培养基(含10％ HPL的DMEM-F12培养基)将P0代间充质干细胞进行传代培养进行稳定传代，获得成熟的间充质干细胞。
实施例17
实施例17提供了一种将iPSC细胞分化为MSC的方法。
本实施例与实施例3的不同之处在于：接种密度为15,000/cm2。
实施例18
实施例18提供了一种将iPSC细胞分化为MSC的方法。
本实施例与实施例3的不同之处在于：接种密度为45,000/cm2。
对比例
对比例1-6
对比例1-6分别提供了一种将iPSC细胞分化为MSC的方法。
上述对比例与实施例3的不同之处在于：分化培养基的来源不同，具体为：对比例1-8中所使用的分化培养基分别来源于制备例6-7、18-22。
对比例7
对比例7提供了一种将iPSC细胞分化为MSC的方法。
本对比例与实施例3的不同之处在于：步骤(2)和步骤(3)不同，具体为：
(3)接种：将解离后的单个细胞以20,000/cm2的密度接种在I型胶原蛋白预包被的细胞培养板上，在CO2培养箱中，孵育48h；
(4)分化培养：更换分化培养基进行正常培养，然后每3-4d更换一次培养液；培养约14d后，至细胞融合度为70％-80％。
性能检测试验
(1)细胞形貌
检测方法：显微镜下观察实施例3、实施例16中iPSC细胞分化为MSC的方法过程中的细胞形态。
检测结果：如图1-5所示；图1为实施例3中分化的MSC的形态图(a表示分化培养第1d时的形貌图，b表示分化培养第2d时的形貌图，c表示分化培养第10d时的形貌图，d表示分化培养第14d时的形貌图)；图2为实施例16中分化的MSC的形态图(a表示分化培养第1d时的形貌图，b表示分化培养第2d时的形貌图，c表示分化培养第10d时的形貌图，d表示分化培养第14d时的形貌图)；图3为对比例1中分化的MSC的形态图(a表示分化培养第1d时的形貌图，b表示分化培养第2d时的形貌图，c表示分化培养第10d时的形貌图，d表示分化培养第14d时的形貌图)；图4为对比例2中分化的MSC的形态图(a表示分化培养第1d时的形貌图，b表示分化培养第2d时的形貌图，c表示分化培养第10d时的形貌图，d表示分化培养第14d时的形貌图)。
由图1-4可知，利用本申请实施例提供的分化培养基，从诱导性多功能干细胞中分化成功获得MSC，且MSC形态均一，细胞增殖能力快，可连续传代培养；而对比例中的MSC形态不均，细胞增殖能力弱。
(2)细胞表型与流式分析检测检测方法：取实施例2-18与对比例1-4中P0代间充质干细胞和稳定传代的第三代的MSC，调整细胞密度为1×105个/mL，吸取100μL细胞悬液，分别加入荧光标记的抗体CD90、CD73、CD105，4℃下避光孵育30min。孵育完成后，加入1％牛血清白蛋白，在10000rpm下离心5min，弃上清。加入100μL PBS溶液，涡旋混匀后，在10000rpm下离心5min，弃去上清，重复2次。加入0.2mL PBS溶液涡旋混匀后，使用流式细胞仪上机进行检测相应MSC细胞表面标志物(％)。
检测结果：如表2所示；如图5所示为实施例3稳定传代的第三代(P3)的MSC流式细胞检测图。
由表2可知，利用本申请提供的分化培养基，从诱导性多功能干细胞中分化的MSC流式分析，P0代间充质干细胞的CD90、CD73、CD105表达量均高于83.16％，稳定传代的第三代(P3)的MSC的CD90、CD73、CD105表达量均高于89.04％，表明本申请已将iPSC细胞完全分化为成熟的MSC，且能够进行稳定传代。
由图5可知，实施例3利用本申请提供的分化培养基，从诱导性多功能干细胞中分化的MSC流式分析，CD90、CD73、CD105表达量都高于98.8％，表明本申请已将iPSC细胞完全分化为成熟的MSC。
(3)活细胞密度的测定检测方法：取培养至第14d的P0代间充质干细胞，吸取5ml细胞悬液，使用AO/PI双染试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司)，参照说明书上的方法对细胞进行染色以及细胞计数，并进行或细胞密度的测定。同时测定第3代传代培养(P3)的间充质干细胞进行测试。
检测结果：如表2所示。
表2实施例2-18、对比例1-7的细胞性能检测结果
结合表2的检测结果，可知，利用本申请提供的分化培养配方，同时利用本申请提供的将iPSC细胞分化为MSC的方法，获得了高密度和MSC细胞表面标志物高表达的间充质干细胞，且可以进行稳定传代和增殖。
通过对比实施例3与对比例3-6的检测结果，当选择用胎牛血清代替HPL、维生素C代替盐酸硫胺素时，间充质干细胞的产量和细胞活率的性能均较差；当选择使用盐酸吡哆醇代替α-生育酚、奎尼丁代替普鲁卡因胺时，多功能干细胞未分化成功得到间充质干细胞。因此，本申请中分化培养基中的各组分种类之间具有相互选择性，只有当相互配合使用，才能将iPSC细胞成功分化为MSC，且分化得到的MSC细胞具有高密度、的优势，且MSC细胞表面标志物表达量高。
通过对比实施例2-6与对比例1-2的检测结果，可知，分化培养基中各组分原料的用量对于间充质干细胞的产量和细胞表面标志物的表达量均有较大的影响，因此，本申请合理地控制且优化了各原料组分的用量。
通过对比实施例3与实施例7-16的检测结果，本申请通过对氨基酸的种类进行筛选，选择了重量比为为10：(3-7)的L-天冬氨酸和L-亮氨酸作为氨基酸添加于分化培养基中，进一步提高的MSC细胞的密度和细胞表面标志物的表达量。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种分化培养基，其特征在于，包括以下重量份的组分：85-95份DMEM-F12、8-12份HPL、0.7-1.5份青链霉素双抗、0.001-0.004份Y-27632、0.6-1.4份B27培养基、0.02-0.08份盐酸硫胺素、0.1-0.4份普鲁卡因胺、0.01-0.08份α-生育酚、0.06-0.12份N-乙酰半胱氨酸。
2.根据权利要求1所述的分化培养基，其特征在于，包括以下重量份的组分：85-95份DMEM-F12、8-10份HPL、1.1-1.3份青链霉素双抗、0.002-0.004份Y-27632、0.08-0.12份氨基酸、0.6-1.4份B27培养基、0.02-0.05份盐酸硫胺素、0.1-0.2份普鲁卡因胺、0.01-0.04份α-生育酚、0.06-0.08份N-乙酰半胱氨酸。
3.根据权利要求2所述的分化培养基，其特征在于，包括以下重量份的组分：90份DMEM-F12、10份HPL、1.1份青链霉素双抗、0.003份Y-27632、0.12份氨基酸、1.0份B27培养基、0.05份盐酸硫胺素、0.1份普鲁卡因胺、0.04份α-生育酚、0.08份N-乙酰半胱氨酸。
4.根据权利要求1所述的分化培养基，其特征在于，所述分化培养基还包括0.08-0.16份氨基酸；所述氨基酸选自L-丙氨酸、L-天冬氨酸、L-亮氨酸中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的分化培养基，其特征在于，所述氨基酸为重量比为10：（3-7）的L-天冬氨酸和L-亮氨酸。
6.如权利要求1-5任一项所述的分化培养基在诱导多功能干细胞分化为间充质干细胞中的应用。
7.一种诱导多功能干细胞分化为间充质干细胞的方法，其特征在于，利用权利要求1-5任一项所述的分化培养基诱导多功能干细胞，获得间充质干细胞。
8.如权利要求7所述的诱导多功能干细胞分化为间充质干细胞的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
预处理：利用ROCK抑制剂Y-27632对iPSC细胞进行预处理；
解离：利用解离液Accutase对iPSC细胞进行消化，解离为分散状态的单个细胞；
接种与分化培养：将细胞接种至所述分化培养基中进行分化培养，至细胞融合度达到70%-80%，经过消化解离、即可获得P0代间充质干细胞；
传代培养：将所述P0代间充质干细胞进行传代培养，获得成熟的间充质干细胞。
9.根据权利要求8所述的诱导多功能干细胞分化为间充质干细胞的方法，其特征在于，所述细胞接种的接种密度为15000/cm2-45000/cm2。
10.利用权利要求7-9中任一项所述的方法制得的间充质干细胞。
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