CN117210329A - 一种病原体细胞的富集方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及医学检测技术领域，提供了一种病原体细胞的富集方法，包括：使用悬浮骨架吸附样本中的病原体细胞，得到一次产物，其中，所述悬浮骨架包括带正电荷的聚合物；对所述一次产物进行固液分离操作，得到病原体细胞的富集沉淀。利用本申请提供的一种病原体细胞的富集方法，能够快速地提取到满足显微镜镜检要求的病原体细胞。

Description

一种病原体细胞的富集方法

技术领域

本申请属于医学检测技术领域，尤其涉及一种病原体细胞的富集方法。

背景技术

血流感染(Blood streaminfections，BSI)，是指细菌、真菌等病原体入侵血流所致的一种全身感染性疾病，具有发病率高、致死率高以及紧迫性高的特点。每延迟治疗1个小时，死亡率增加7.6％；每延迟治疗6个小时，死亡率便会增加58％，如若在感染之初进行快速诊断和恰当的治疗，可以避免80％因脓毒症导致的死亡。当前的诊断方法主要以血培养为主，同时血培养也是诊断BSI病原微生物的“金标准”，但其阳性率低且结果报告周期长，在等到阳性检测结果时患者往往错过最佳的治疗窗口期。因此，需要提高血流感染病原微生物的检测效率，及时为医生用药及治疗提供指导，同时给病人争取到黄金治疗时间，增加病人的生存几率。

发明内容

本申请的目的在于提供一种病原体细胞的富集方法，旨在解决当前血流感染病原微生物检测效率低的问题。

为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：

第一方面，本申请提供一种病原体细胞的富集方法，其特征在于，包括：

使用悬浮骨架吸附样本中的病原体细胞，得到一次产物，其中，所述悬浮骨架包括带正电荷的聚合物；

对所述一次产物进行固液分离操作，得到病原体细胞的富集沉淀。

在一种可能的实现方式中，所述悬浮骨架包括：多羟基聚合物、甘油、络合剂、染色剂和氯化钠。

在一种可能的实现方式中，所述带正电荷的聚合物包括：多聚赖氨酸、聚丙烯酰胺或带正电的蛋白质。

在一种可能的实现方式中，在所述使用悬浮骨架吸附样本中的病原体细胞，得到一次产物的步骤前，还包括：

对样本进行裂解，得到裂解物；

对所述裂解物进行分离处理，得到病原体细胞粗提物；

对病原体细胞粗提物进行重悬处理。

在一种可能的实现方式中，在所述对样本进行裂解的步骤中，使用的裂解液成分包括：表面活性剂、金属离子螯合剂、还原剂、染色剂和氯化钠。

在一种可能的实现方式中，在所述对病原体细胞粗提物进行重悬处理的步骤中，使用的缓冲液成分包括：表面活性剂、染色剂和氯化钠。

在一种可能的实现方式中，在所述对所述一次产物进行固液分离操作，病原体细胞的富集沉淀的步骤之后，还包括：

对所述病原体细胞进行染色处理，并在显微镜下进行观察。

第二方面，本申请提供一种用于病原体细胞富集的富集试剂，所述富集试剂包括如上所述的悬浮骨架。

在一种可能的实现方式中，所述悬浮骨架包括多羟基聚合物、甘油、络合剂、染色剂和氯化钠。

第三方面，本申请提供一种用于富集病原体细胞的试剂盒，包括如上所述的富集试剂。

有益效果

本申请提供的一种病原体细胞的富集方法，通过使用悬浮骨架吸附样本中的病原体细胞，得到一次产物，其中，所述悬浮骨架包括带正电荷的聚合物；并对所述一次产物进行固液分离操作，得到病原体细胞的富集沉淀。由于本申请提供的病原体细胞的富集方法是直接检测样本中已存在的微生物的细胞，不需要培养微生物，因此检测速度远快于培养法；并且由于悬浮骨架包括带正电荷的聚合物，故对微生物有很强的吸附作用，更容易富集病原体细胞，因此，利用本申请提供的方法能够快速的提取到满足显微镜镜检要求的病原体细胞。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本申请实施例提供的一种病原体细胞的富集方法流程示意图；

图2是本申请实施例提供的一种病原体细胞的富集方法操作步骤；

图3是使用一种病原体细胞富集方法检测血液中白色念珠菌感染的实验结果示意图；

图4是培养法检测酵母菌的实验结果示意图；

图5是直接涂片法检测酵母菌的实验结果示意图；

图6是离心涂片法检测酵母菌的实验结果示意图；

图7是聚合酶链式反应法检测酵母菌的实验结果示意图；

图8是使用病原体细胞的富集方法检测酵母菌的实验结果示意图；

图9是本申请提供的富集方法与本领域中其他方法的检测效果对比图。

具体实施方式

为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。

本申请中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

本申请中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a,b,或c中的至少一项(个)”，或，“a,b,和c中的至少一项(个)”，均可以表示：a,b,c,a-b(即a和b),a-c,b-c,或a-b-c，其中a,b,c分别可以是单个，也可以是多个。

应理解，在本申请的各种实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。

在本申请实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。

本申请实施例说明书中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本申请实施例说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本申请实施例说明书公开的范围之内。具体地，本申请实施例说明书中所述的质量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。

术语“第一“、“第二”仅用于描述目的，用来将目的如物质彼此区分开，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。例如，在不脱离本申请实施例范围的情况下，第一XX也可以被称为第二XX，类似地，第二XX也可以被称为第一XX。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。

血流感染(Blood streaminfections，BSI)，是指细菌、真菌等病原体入侵血流所致的一种全身感染性疾病，具有发病率高、致死率高以及紧迫性高的特点。每延迟治疗1个小时，死亡率增加7.6％；每延迟治疗6个小时，死亡率便会增加58％，如若在感染之初进行快速诊断和恰当的治疗，可以避免80％因脓毒症导致的死亡。当前的诊断方法主要以血培养为主，同时血培养也是诊断BSI病原微生物的“金标准”，但其阳性率低且结果报告周期长，在等到阳性检测结果时患者往往错过最佳的治疗窗口期。因此，需要提高血流感染病原微生物的检测效率，及时为医生用药及治疗提供指导，同时给病人争取到黄金治疗时间，增加病人的生存几率。

本申请提供的一种病原体细胞的富集方法，通过使用悬浮骨架吸附样本中的病原体细胞，得到一次产物，其中，所述悬浮骨架包括带正电荷的聚合物；并对所述一次产物进行固液分离操作，得到病原体细胞的富集沉淀。由于本申请提供的病原体细胞的富集方法是直接检测样本中已存在的微生物的细胞，不需要培养微生物，因此检测速度远快于培养法；并且由于悬浮骨架包括带正电荷的聚合物，故对微生物有很强的吸附作用，更容易富集病原体细胞，因此，利用本申请提供的方法能够快速的提取到满足显微镜镜检检测要求的病原体细胞。

本申请实施例第一方面提供一种病原体细胞的富集方法，包括：

步骤S100：使用悬浮骨架吸附样本中的病原体细胞，得到一次产物，其中，所述悬浮骨架包括带正电荷的聚合物；

步骤S200：对所述一次产物进行固液分离操作，得到吸附有病原体细胞的悬浮骨架沉淀。

需要说明的是，由于真菌和细菌在中性pH值的环境中会带负电，故本申请在悬浮骨架中加入带正电荷的聚合物，以此来吸附病原体细胞，并通过固液分离操作，得到病原体细胞的富集沉淀。由于本申请提供的病原体细胞的富集方法是直接检测样本中已存在的微生物的细胞，不需要培养微生物，因此检测速度远快于培养法；并且由于悬浮骨架包括带正电荷的聚合物，故对微生物有很强的吸附作用，更容易富集病原体细胞，因此，利用本申请提供的方法能够快速地提取到满足显微镜镜检要求的病原体细胞。

需要说明的是，本实施例提到的样本包括但不限于血液、尿液、脑脊液、胸腹水、淋巴结脓液、关节液和肺泡灌洗液等来自人体的样本。

需要说明的是，病原体(pathogens)是指可造成人或动植物感染疾病的微生物，包括细菌和真菌。临床上常见的可能感染人体的真菌有白色念珠菌、黄曲霉、新型隐球菌、耳念珠菌、毛霉和根霉等。临床上常见的可能感染人体的细菌有大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、变形杆菌、沙雷菌属、铜绿假单胞菌、肠球菌属、噬血流感杆菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、沙门菌属和宋内志贺菌等。

本申请提供的病原体细胞的富集方法直接检测病原体细胞本身，不需要细胞增长到可观的数量，也不需要提取病原体的DNA并扩增，故过程耗时较短。另外，因为病原体被吸附到悬浮骨架上，压片后面积较小，观察者只需要在显微镜视野中较小的区域内搜索病原体细胞即可，确保了该方法具有较高的灵敏度。

在一种可能的实现方式中，所述悬浮骨架包括：多羟基聚合物、甘油、络合剂、染色剂和氯化钠，所述多羟基聚合物包括从生物中提取的多羟基聚合物或人工合成的多羟基聚合物。

需要说明的是，悬浮骨架包括多羟基聚合物形成的水凝胶，此处所说的多羟基聚合物是指从生物中提取的或人工合成的富含羟基的聚合物，例如瓜尔胶、聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯醇、聚异丙醇等。

在一种可能的实现方式中，络合剂可以是硼酸，染色剂可以是伊文斯蓝，本申请不做限制。

在一种可能的实现方式中，所述带正电荷的聚合物包括：多聚赖氨酸、聚丙烯酰胺或带正电的蛋白质。

需要说明的是，由于真菌和细菌在中性pH值的环境中会带负电，故在悬浮骨架中加入带正电荷的聚合物，比如：多聚赖氨酸、聚丙烯酰胺或带正电的蛋白质，可以将样本中的病原体吸附在悬浮骨架的表面，在高速离心时，病原体细胞会与悬浮骨架发生共沉淀，沉降在离心管的底部，由此得到富集在悬浮骨架上的病原体细胞。

需要说明的是，在步骤S200中，需要对步骤S100的一次产物进行固液分离操作，具体的，可以采用离心机离心的方式，使病原体细胞与悬浮骨架一起沉到离心管底部，取出悬浮骨架(病原体细胞附着其上)，用于下一步检测。

在一种可能的实现方式中，在所述使用悬浮骨架吸附样本中的病原体细胞，得到一次产物的步骤前，还包括：

步骤S001：对样本进行裂解，得到裂解物；

步骤S002：对所述裂解物进行分离处理，得到病原体细胞粗提物；

步骤S003：对病原体细胞粗提物进行重悬处理。

需要说明的是，在步骤S001中，对样本进行裂解，需要在保持病原体细胞形态和结构的情况下，充分裂解样本中的体细胞，以减少干扰。

裂解的具体操作过程包括：将样本加到裂解管中，拧紧盖子，颠倒混匀，使样本中的体细胞充分裂解。

在一种可能的实现方式中，在对样本进行裂解步骤中，使用的裂解液成分包括：表面活性剂、金属离子螯合剂、还原剂、染色剂(如番红)和氯化钠。其中，表面活性剂可以是聚乙二醇辛基苯基醚或十二烷基磺酸纳，金属离子螯合剂可以是乙二胺四乙酸钠，还原剂可以是二硫苏糖醇，染色剂可以是如番红，本申请不做限制。

需要说明的是，在步骤S002中，对步骤S001的裂解物进行分离处理，可以使用离心机离心，使病原体细胞沉到离心管底部，并倒去上清。

需要说明的是，在步骤S003中，需要在步骤S002中得到的病原体细胞粗提物中加入缓冲液，将可能存在的剩余的沉淀充分溶解，并使病原体细胞和杂质重悬。

需要说明的是，重悬是指“重新悬浮”，具体操作是用适当的缓冲液或培养液将离心或沉降等方法得到的固体(沉淀、细胞、活性物质等等)重新悬浮。

在一种可能的实现方式中，在对病原体细胞进行重悬处理的步骤中，使用的缓冲液成分包括：表面活性剂、染色剂和氯化钠。其中，表面活性剂可以是聚乙二醇辛基苯基醚或十二烷基磺酸纳，染色剂可以是亮蓝，本申请不做限制。

在一种可能的实现方式中，在所述对所述一次产物进行固液分离操作，病原体细胞的富集沉淀的步骤之后，还包括：

对所述病原体细胞进行染色处理，并在显微镜下进行观察。

需要说明的是，在对病原体细胞进行染色处理时，用到的染色液包括：革兰氏染色液、棉蓝染色液、抗酸染色液、金胺O染色液、钙荧光白染色液、六胺银染色液、吖啶橙染色液或墨汁染色液中的一种或多种，本申请对染色液的种类不做限制，另外，观察时用到的显微镜包括但不限于生物显微镜和荧光显微镜。

本申请提供一种用于病原体细胞富集的富集试剂，所述富集试剂包括如上所述的悬浮骨架。

本申请提供一种用于富集病原体细胞的试剂盒，包括如上所述的富集试剂。

本发明取得的有益效果如下：

1、可以在15分钟内检测出样本中的微生物，检测速度远快于培养法。能够达到这个速度的原因是该方法是直接检测样本中已存在的微生物的细胞，不需要培养微生物，或者扩增微生物的基因。

2、灵敏度达到5细胞/毫升。能够达到该灵敏度有三个原因：1)、由于悬浮骨架包括带正电荷的聚合物，因此对微生物表面有很强的吸附作用；2)在离心的过程中，微生物细胞被强压在悬浮骨架表面，与悬浮骨架上的阳离子有充分的接触机会；3)在荧光显微镜下观察悬浮骨架时，极小的微生物细胞在暗视野下会表现为一个亮点，容易被观察者发现。

3、可测定病原体细胞的数量。原因如下：1)因为离心的原因，微生物细胞会聚集在一片区域，不容易丢失；2)相机中有软件可以统计微生物细胞的数量；3)悬浮骨架被压平后，面积依然比较小，可以方便遍历整个视野。

4、可以检测的样本包括血液、尿液、脑脊液、胸腹水、关节液、淋巴节脓液、支气管肺泡灌洗液、导管等。这些样本中(除去支气管肺泡灌洗液)，在正常情况下不会有病原体。在其中发现细菌或者真菌时，可以作为感染的病原学证据。这些样本的组分不同，细胞种类有差异，甚至有些样本中会有无机盐的结晶。该方法会通过在裂解液和缓冲液中添加表面活性剂或者去垢剂，使得这些不同的细胞或者结晶可以充分溶解，在显微镜下看不到干扰物的有形成分。

5、可以检测真菌和细菌。因为真菌和细菌在中性pH值的环境中会带负电，均可以与悬浮骨架表面带正电的基团结合。该方法使用的染料可以渗透进真菌和细菌的细胞中，对细胞中的核酸作染色。真菌和细菌在尺寸上有较大的不同，可以在显微镜上明显地区分出来。

下面结合具体实施例进行说明。

实施例1：使用一种病原体细胞的富集方法，用于检测血液中白色念珠菌感染。

一、准备实验组分

1.细胞裂解液：10％(m/v)聚乙二醇辛基苯基醚、10％(m/v)十二烷基磺酸纳、10mM乙二胺四乙酸钠、10mM二硫苏糖醇、0.01％(m/v)番红和0.9％(m/v)氯化钠。

2.缓冲液：1％(m/v)聚乙二醇辛基苯基醚、1％(m/v)十二烷基磺酸纳、0.01％亮蓝和0.9％(m/v)氯化钠。

3.凝胶：5％(m/v)聚乙烯醇、5％(v/v)甘油、0.2％硼砂(m/v)和0.25％(m/v)伊文斯蓝和0.9％(m/v)氯化钠。

4.染色液：0.01％(m/v)吖啶橙、0.005％(m/v)碘化丙啶和0.9％(m/v)氯化钠。

二、仪器及耗材

1.高速离心机；

2.配有荧光模块的生物显微镜，本实验需要的激发光波段为460～490nm，发射波段为520～760nm；

3.生物安全柜；

4.移液器：量程为100～1000ul，0.5～10ul，10～100ul；

5.酒精灯；

6.不锈钢勺；

7.载玻片和盖玻片。

三、操作步骤(参阅图2)：

1.样本裂解：在生物安全柜中，加入1mL裂解液到裂解管中，用无菌的滴管将样本加到裂解管中，拧紧盖子，上下见底颠倒混匀6次，使样本中的体细胞充分裂解。10000g离心5分钟。

2.样本重悬：在生物安全柜中，小心拧开盖子，倒去上清，加入5mL缓冲液，拧紧盖子，上下见底颠倒混匀多次，至看不见沉淀为止。

3.病原体细胞的凝胶共沉淀：在生物安全柜中拧开盖子，加入一粒凝胶，10000g离心5分钟。注意：离心后应尽快将凝胶取出涂片，不可将凝胶置于液体中超过30分钟。

4.染色：用无菌钢勺将凝胶从裂解管中取出，置于洁净的玻片上，悬空滴一滴染色液，盖上盖玻片，压平。注意要确保凝胶在盖玻片的中间，不要将凝胶压出盖玻片。

5.观察：在荧光显微镜下，使用蓝光波段观察凝胶。

四、实验结果(参阅图3)

参见图3A，血液样本中观察到的白色念珠菌，放大倍数为100倍，浓度约为1000CFP/ml。参见图3B，血液样本中观察到的白色念珠菌，放大倍数为400倍，浓度约为1000CFP/ml。故使用本申请提供的富集方法，可以检测到血液样本中浓度极低的真菌。

实施例2：使用一种病原体细胞的富集方法，比较其对样本中微量酵母菌的定量的能力，参与比较的方法有培养法、直接涂片法、离心涂片法、聚合酶链式反应法。

一、准备实验组分

1.面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)浓度参考品：配制一个浓度为100000细胞/ml的酵母菌悬浊液，用生理盐水分别稀释到浓度为10000细胞/ml，1000细胞/ml，1000细胞/ml，100细胞/ml，10细胞/ml，0细胞/ml。

2.缓冲液:1％(m/v)聚乙二醇辛基苯基醚、1％(m/v)十二烷基磺酸纳、0.01％亮蓝和0.9％(m/v)氯化钠。

3.凝胶：5％(m/v)聚乙烯醇、5％(v/v)甘油、0.2％硼砂(m/v)和0.25％(m/v)伊文斯蓝和0.9％(m/v)氯化钠。

4.染色液：0.01％(m/v)吖啶橙、0.005％(m/v)碘化丙啶和0.9％(m/v)氯化钠。

5.PDA培养基

6.真菌基因组DNA提取试剂盒。

7.面包酵母RDN18-2基因PCR扩增引物：

F1序列:5’-GGAGTTGGCACCACCGGAGATTTTCT-3’,

F2序列:5’-CCAGAATGAAACTGCACGGCTGCA-3’,

探针P序列：FAM-5’-GCGAAGCACACAAGTACACGG-3’-TAMRA。

8.PCR反应试剂(Taq酶，PCR反应液，dNTP，MgSO4)。

二、仪器及耗材

1.高速离心机；

2.荧光定量PCR仪器(型号：ABI7500)；

3.配有荧光模块的生物显微镜，本实验需要的激发光波段为460～490nm，发射波段为520～760nm；

4.培养箱；

5.生物安全柜；

6.移液器：量程为100～1000ul，0.5～10ul，10～100ul；

7.酒精灯；

8.不锈钢勺；

9.载玻片和盖玻片；

10.细胞计数板。

三、操作步骤：

参考实施例1。

四、实验结果

参阅图8，酵母菌浓度分别为0细胞/mL(A)，10细胞/mL(B)，100细胞/mL(C)，1000细胞/mL(D)，10000细胞/mL(E)，100000细胞/mL(F)，显微镜放大倍数为100倍。由图8可知，使用本申请提供的富集方法，可以检测到样本中浓度约为10细胞/mL的真菌细胞。

对比例2-1：培养法

操作步骤：取1000μL样本，加入到干净的EP管中，10000g离心5分钟，弃去上清，加入100μL的灭菌的生理盐水，用移液器吹打，混匀重悬，取100μL样本涂于PDA琼脂平板上，静置30分钟，使细胞和生理盐水充分被培养基吸附或吸收，然后倒置于真菌培养箱中，30摄氏度培养48小时，统计平板上形成的真菌菌落。

实验结果：参阅图4，培养法检测酵母菌的效果图，酵母菌浓度分别为0细胞/mL(A)，10细胞/mL(B)，100细胞/mL(C)，1000细胞/mL(D)，10000细胞/mL(E)，100000细胞/mL(F)。由图4可知，使用培养法，可以检测浓度低至10细胞/mL的真菌细胞。

对比例2-2：直接涂片法

操作步骤：将样本充分混匀，用无菌的移液器取10μL样本滴到干净的PE膜上，加入10μL的染色液，充分混匀，取10μL样本涂到细胞计数板上，在荧光显微镜下观察。

实验结果：参阅图5，直接涂片法检测酵母菌的效果图，酵母菌浓度分别为0细胞/mL(A)，10细胞/mL(B)，100细胞/mL(C)，1000细胞/mL(D)，10000细胞/mL(E)，100000细胞/mL(F)。显微镜放大倍数为100倍。由图5可知，使用直接涂片法，最低可以看到样本中浓度约为10000细胞/mL的真菌细胞，低于这个浓度，样本中的真菌将很难被发现。

对比例2-3：离心涂片法

操作步骤：取1000μL样本，加入到干净的EP管中，10000g离心5分钟，弃上清，加入25μL的染色液，用移液器吹打混匀充分，取10μL样本涂到细胞计数板上，在荧光显微镜下观察。

实验结果：参阅图6，离心涂片法检测酵母菌的效果图，酵母菌浓度分别为0细胞/mL(A)，10细胞/mL(B)，100细胞/mL(C)，1000细胞/mL(D)，10000细胞/mL(E)，100000细胞/mL(F)，显微镜放大倍数为100倍。由图6可知，使用离心涂片法，最低可以看到样本中浓度约为1000细胞/mL的真菌细胞，低于这个浓度，样本中的酵母菌将很难被发现。

对比例2-4：聚合酶链式反应法

操作步骤：取1000μL样本，使用真菌基因组提取试剂盒提取其基因组DNA。配制50μL的PCR反应体系，其中模板5μL，引物F1和F2各1μL，探针P1μL，10倍的PCR缓冲液5μL，TaqPCR反应酶1μL，2.5mMdNTP5μL，10mMMgSO42μL，加双蒸水至总体积为50μL。反应条件：94摄氏度5分钟；94摄氏度15秒，60摄氏度15秒，72摄氏度30秒，40个循环；25摄氏度30秒。

实验结果：参阅图7，聚合酶链式反应法检测酵母菌的效果图，酵母菌浓度分别为0细胞/mL(A)，10细胞/mL(B)，100细胞/mL(C)，1000细胞/mL(D)，10000细胞/mL(E)，100000细胞/mL(F)。由图7可知，使用PCR法，样本中的浓度约为100细胞/mL时，荧光定量PCR的Ct值约为38。该浓度处于荧光定量PCR的检测最低限，低于这个浓度将不可被检出。

小结：参阅图9，示出了本申请提供的富集方法与本领域中其他方法的检测效果对比，直接涂片法的检测下限为10000细胞/ml，单个样本的操作时间约为2分钟；离心涂片法的检测下限为1000细胞/ml，单个样本的操作时间约为5分钟；培养法的检测下限为10细胞/ml，单个样本的操作时间大于18小时；PCR法的检测下限为100细胞/ml，单个样本的操作时间大于2小时；本申请提供的富集方法的检测下限为10细胞/ml，单个样本的操作时间约为15分钟，故在综合性能上，本申请提供的富集方法具有灵敏度高，操作时间短的优点。

以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种病原体细胞的富集方法，其特征在于，包括：

使用悬浮骨架吸附样本中的病原体细胞，得到一次产物，其中，所述悬浮骨架包括带正电荷的聚合物；

对所述一次产物进行固液分离操作，得到吸附有病原体细胞的悬浮骨架沉淀。

2.如权利要求1所述的病原体细胞的富集方法，其特征在于，所述悬浮骨架包括：多羟基聚合物、甘油、络合剂、染色剂和氯化钠。

3.如权利要求1所述的病原体细胞的富集方法，其特征在于，所述带正电荷的聚合物包括：多聚赖氨酸、聚丙烯酰胺或带正电的蛋白质。

4.如权利要求1所述的病原体细胞的富集方法，其特征在于，在所述使用悬浮骨架吸附样本中的病原体细胞，得到一次产物的步骤前，还包括：

对样本进行裂解，得到裂解物；

对所述裂解物进行分离处理，得到病原体细胞粗提物；

对病原体细胞粗提物进行重悬处理。

5.如权利要求4所述的病原体细胞的富集方法，其特征在于，在所述对样本进行裂解的步骤中，使用的裂解液成分包括：表面活性剂、金属离子螯合剂、还原剂、染色剂和氯化钠。

6.如权利要求4所述的病原体细胞的富集方法，其特征在于，在所述对病原体细胞粗提物进行重悬处理的步骤中，使用的缓冲液成分包括：表面活性剂、染色剂和氯化钠。

7.如权利要求1所述的病原体细胞的富集方法，其特征在于，在所述对所述一次产物进行固液分离操作，病原体细胞的富集沉淀的步骤之后，还包括：

对所述病原体细胞进行染色处理，并在显微镜下进行观察。

8.一种用于病原体细胞富集的富集试剂，其特征在于，所述富集试剂包括权利要求1所述的悬浮骨架。

9.如权利要求8所述的富集试剂，其特征在于，所述悬浮骨架包括多羟基聚合物、甘油、络合剂、染色剂和氯化钠。

10.一种用于富集病原体细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求8或9所述的富集试剂。