CN117209610A - 一种抗百草枯纳米抗体及其应用 - Google Patents
一种抗百草枯纳米抗体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抗百草枯的纳米抗体及其应用，本发明通过百草枯半抗原PH‑Q与ConA(刀豆球蛋白A)偶联得到的人工抗原作为免疫原免疫骆驼，构建一种噬菌体展示纳米抗体文库，并从噬菌体展示纳米抗体文库中筛选得到一种针对百草枯农药的纳米抗体Nb‑2‑34。在抗百草枯纳米抗体Nb‑2‑34的基础上，本发明进一步提供一种检测百草枯的NHS磁珠‑微流控免疫检测方法，该方法操作简单，快速，结果准确可靠，灵敏度高，对百草枯的检测限为0.0028ng/mL，线性范围为0.064～1000ng/mL，可实现国家标准中最大残留限量浓度范围的广泛检测。
Description
技术领域
本发明属于免疫学技术领域，更具体地，涉及一种抗百草枯纳米抗体及其应用。
背景技术
百草枯(Paraquat,PH)是一种水溶性的高效、非选择性的季铵盐除草剂，自1962年以来被广泛用于农业。据报道，PH具有神经毒性，会对多巴胺能神经元造成不可逆的损伤；这种损伤与神经退行性疾病的风险增加有关，如帕金森病、阿尔茨海默病。此外，动物研究表明PH可能导致线粒体功能障碍，这是由线粒体电子运输中断引起的。百草枯的滥用提高了其在土壤、水、食品中的含量，自2007年7月起，欧盟禁止使用PH，但在非欧洲国家仍广泛使用PH，中国对农产品中百草枯的最大残留量进行了规定，《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》(GB 2763—2021)对各类食品中百草枯的最大限量范围为0.005～2mg/kg。中国是PH的最大生产国，每年生产超过10万吨PH，其产量每年都在增加。为了保护人类免受PH暴露，迫切需要开发可靠、快速的分析方法。
目前，用于识别和检测PH的分析方法，如分光光度法、气相色谱法、液相色谱法、薄层色谱法、质谱法、电化学法和电泳法。虽然这些技术可以有效地用于PH检测，并具有高选择性和高灵敏度，但它们都需要借助精密设备开展监测，无法现场出具检测结果，不利于执法监督。由于快速，操作简单、低成本等优势，酶联免疫吸附测定分析方法(ELISA)和胶体金免疫分析方法(GICA)、时间分辨荧光微球(TRFMS)被广泛应用于PH快速检测。虽然ELISA灵敏度高、特异性强、重复性好，但需要借助光学仪器判读结果、抗原抗体孵育时间较长、操作步骤繁琐，限制了其在现场快速检测的应用。胶体金(Colloidal Gold)是目前最常用的层析方法，具有CG具有制备简单、颜色鲜艳、成本低的优点，然而，纳米粒子在生物分析过程中也会遇到一些关键问题，例如它们容易聚集、在复杂溶液中不稳定以及缺乏生物相容性，导致检测灵敏度低，容易出现假阴性。由于上述的免疫分析方法在检测范围方面存在一定的限制，无法满足国家最大残留限量浓度宽范围的需求，这无异于会增加样品前处理的难度和降低方法的准确度。因此，探索一种简单、快速、可实现宽线性范围的免疫分析方法用于百草枯检测是必要的和紧迫的。
微流控芯片是芯片实验室重要组成成分之一，是一种能在宽度为微米级的通道内精确处理微量液体的技术，具有试剂微量化、高敏感、高通量、自动化等优势。微流控芯片多通道和多反应的结构特点为芯片上免疫反应提供了优越平台，有望在其的基础上开发新方法满足简单、快速、宽线性范围的检测需求。免疫检测技术关键仍在于抗原与抗体的特异性结合，因此提供一种适合应用于微流控芯片的抗体对提高微流控免疫检测的效果也十分重要。目前未见有适用于百草枯微流控免疫检测技术的抗体，亟需提供一种用于百草枯微流控免疫检测的抗百草枯抗体以及基于该抗体建立的微流控免疫检测方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种抗百草枯纳米抗体及其应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
本发明首先提供一种抗百草枯的纳米抗体，所述纳米抗体Nb2-34的VHH的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述纳米抗体是以百草枯人工抗原作为免疫原免疫动物得到的。
进一步地，所述纳米抗体为将通过合成百草枯半抗原PH-Q，制备百草枯人工抗原，将其作为免疫原免疫骆驼，通过羊驼免疫后，经过羊驼血清鉴定，分离淋巴细胞，提取RNA，扩增目的基因，进行酶切与酶联反应，将酶联产物经过多次电转至感受态E.coli TG1，获得纳米抗体基因文库，经辅助噬菌体救援后，得到的噬菌体展示纳米抗体文库。通过生物淘筛，从羊驼免疫抗体文库中筛选得到能与百草枯特异性结合的纳米抗体，将其命名为Nb2-34。
进一步地，所述百草枯半抗原PH-Q结构式如式(I)所示：
本发明提供所述百草枯半抗原在制备百草枯人工抗原或抗体中的应用。
进一步地，所述百草枯人工抗原结构式如式(Ⅱ)所示：
进一步地，所述百草枯人工抗原的制备方法，由上述百草枯半抗原PH-Q与载体蛋白偶联制备得到。
优选地，所述载体蛋白为卵清白蛋白(OVA)、刀豆球蛋白A(ConA)。
进一步优选地，所述载体蛋白为ConA。
进一步地，所述百草枯人工抗原的制备方法为采用活泼酯法将半抗原PH-Q与载体蛋白偶联制备得到，所述制备方法为：先将百草枯半抗原PH-Q溶于DMF中，加入EDC和NHS搅拌反应活化，记为A液，再将载体蛋白溶解于磷酸盐缓冲液中，记为B液，A、B液混合搅拌反应，反应后于4℃下透析3天，得到人工抗原PH-Q-OVA、PH-Q-Con A。
优选地，所述半抗原与载体蛋白的摩尔比均为60：1。
优选地，半抗原PH-Q、NHS和EDC的投料摩尔比为1：1.5：1.5。
本发明提供所述人工抗原在制备抗百草枯抗体中的应用。
进一步地，所述抗百草枯抗体可为纳米抗体、多克隆抗体或纳米抗体等。
优选地，所述抗百草枯抗体为纳米抗体。
进一步地，编码所述纳米抗体Nb2-34的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
因此，本发明还提供一种重组载体，所述重组载体含有上述基因。
本发明还提供一种重组细胞，所述细胞含有上述重组载体。
由于本发明已给出了纳米抗体Nb2-34的氨基酸序列和编码该纳米抗体的基因序列，本领域技术人员可在此基础上通过已知的重组DNA技术得到本申请所述纳米抗体。因此，任何可用于制备本发明所述纳米抗体的重组载体或重组细胞等也应在本发明的保护范围之内。
本发明还提供所述纳米抗体在检测百草枯中的应用。
本发明还提供所述纳米抗体、所述基因、所述重组载体或所述重组细胞在制备检测百草枯产品中的应用。
本发明还提供一种检测百草枯的方法，所述方法为百草枯半抗原与载体蛋白偶联得到的人工抗原PH-Q-OVA做包被原，用所述纳米抗体作为检测抗体进行检测。
进一步地，所述载体蛋白为卵清蛋白。
本发明还提供一种检测百草枯的开放式液滴阵列微流控芯片，包括上述百草枯人工抗原和上述抗百草枯的纳米抗体作为检测抗原和抗体。
进一步地，所述开放式液滴阵列微流控芯片包括芯片基底和位于芯片基底上的若干个平行通道，每个平行通道设有通过微流控通道狭缝依次相连的第一反应腔室、第二反应腔室、第三反应腔室和尾腔室，每个腔室均具有凹陷微结构；所述第一反应腔室用于装载待测样品、磁珠抗原和酶标抗体混合溶液；所述第二反应腔室用于装载缓冲盐溶液；所述第三反应腔室用于装载荧光探针溶液。
进一步地，所述磁珠抗原为上述百草枯人工抗原与磁珠偶联物；所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的上述抗百草枯的纳米抗体；所述缓冲盐溶液为PBS溶液；所述荧光探针溶液为Amplex Red/H2O2。
优选地，所述磁珠抗原为百草枯人工抗原与NHS磁珠偶联物。
优选地，所述百草枯人工抗原中的载体蛋白为卵清白蛋白(OVA)，所述抗原为PH-Q-OVA。
优选地，所述平行通道为15个。
优选地，所述平行通道间距离为5.0mm；连接反应腔室的微流控通道狭缝宽0.5mm。
本发明还提供所述开放式液滴阵列微流控芯片在检测百草枯中的应用。
本发明还提供一种用于检测百草枯的微流控免疫检测试剂盒，所述试剂盒含有上述所述磁珠抗原和上述所述酶标抗体。
进一步地，所述试剂盒还包括上述开放式液滴阵列微流控芯片。
进一步地，所述试剂盒还包括PBS溶液、Amplex Red/H2O2液。
本发明还提供一种检测百草枯的微流控免疫检测方法，通过将酶标抗体与磁珠抗原混合，再加入待测溶液，利用直接竞争法，结合凝胶成像，实现对标志物的特异性识别。
进一步地，所述方法为：将游离的待检溶液与磁珠抗原、酶标抗体混合在上述开放式液滴阵列微流控芯片的的第一反应腔室中，在磁铁的牵引下，结合了酶标抗体的磁珠抗原与未结合的磁珠抗原依次进入第二、三反应腔室，在第三反应腔室中结合了酶标抗体的磁珠抗原催化H2O2与底物Amplex Red反应生成荧光物质试卤灵(Resorufin)产生信号输出，根据凝胶成像仪(520nm)和image J软件处理荧光信号进行定量检测。经检验，基于NHS磁珠-微流控的免疫检测方法对百草枯的检测限为0.0028ng/mL，线性范围为0.064～1000ng/mL。
因此，本发明还提供上述检测方法在农药残留检测领域的应用。
优选地，所述农药为百草枯。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供一种抗百草枯纳米抗体，首先通过人工合成百草枯半抗原PH-Q，利用该百草枯半抗原与ConA偶联得到的人工抗原作为免疫原免疫骆驼，通过羊驼免疫后，获得纳米抗体基因文库，经辅助噬菌体救援后，得到的噬菌体展示纳米抗体文库。通过生物淘筛，从羊驼免疫抗体文库中筛选得到能与百草枯特异性结合的纳米抗体Nb2-34，在抗百草枯纳米抗体Nb2-34基础上，本发明进一步提供一种检测百草枯的NHS磁珠-微流控免疫检测方法，该方法操作简单，快速，结果准确可靠，灵敏度高，对百草枯的检测限为0.0028ng/mL，线性范围为0.064～1000ng/mL，可实现国家标准中最大残留限量浓度范围的广泛检测。
附图说明
图1为载体蛋白(OVA、ConA)、PH-Q以及人工抗原PH-Q-OVA和PH-Q-ConA的紫外扫描图。
图2是纳米抗体Nb2-34的氨基酸编号及结构域示意图。
图3为基于抗百草枯纳米抗体Nb-2-34建立的间接竞争ELISA标准曲线图。
图4为开放式液滴阵列微流控芯片示意图；A为芯片制作流程，B为芯片详细尺寸图。
图5为基于NHS磁珠-微流控免疫检测方法检测百草枯建立的标准曲线图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1百草枯人工抗原的制备
1、实验方法
本发明所用半抗原的结构式如式(Ⅰ)所示：
采用活泼酯法将百草枯半抗原PH-Q与载体蛋白偶联卵清白蛋白(OVA)、刀豆球蛋白A(Con A)制备得到，所述制备方法为：
将百草枯半抗原PH-Q溶于DMF中，加入EDC和NHS EDC(摩尔比PH-Q：NHS：EDC＝1：1.5：1.5)搅拌反应活化8h，记为A液，再将载体蛋白溶解于磷酸盐缓冲液中，记为B液，A、B液混合搅拌反应8h，反应后于4℃下透析3天，透析后得到人工抗原PH-Q-OVA、PH-Q-ConA，其结构式如式(Ⅱ)所示：
其中，载体蛋白为卵清白蛋白(OVA)、刀豆球蛋白A(Con A)。
2、实验结果
对载体蛋白(OVA、ConA)、PH-Q以及人工抗原PH-Q-OVA和PH-Q-ConA进行紫外扫描鉴定(150～450nm)，结果如图1所示，制备得到的人工抗原与载体蛋白(OVA、ConA)、PH-Q相比特征吸收峰有明显的蓝移，且人工抗原具备半抗原PH-Q和载体蛋白(OVA、ConA)的特征吸收峰，说明人工抗原制备成功。
实施例2抗百草枯纳米抗体的制备
1、实验方法
(1)动物免疫：用健康的羊驼作为实验动物，以PH-Q-ConA作为免疫原，在羊驼背颈部进行皮下注射，每次免疫剂量为0.5mL(其中含有0.5mg免疫原)。首次免疫用0.5mL完全弗氏佐剂与抗原乳化后用于免疫，4周后用0.5mL不完全弗氏佐剂与抗原乳化后加强免疫，之后每间隔2周加强免疫一次。免疫前取10mL血分离血清作为阴性对照。从第二次免疫开始，每次取免疫一周后的血液10mL进行血清效价以及竞争反应检测。当出现较好的免疫应答效果时，取血100mL外周血进行淋巴细胞的分离，用于构建纳米抗体文库。
(2)羊驼淋巴细胞的分离：取羊驼全血与等体积生理盐水混合成1:1稀释血液，常温放置。在无菌的50mL离心管中加入20mL的淋巴分离液，用无菌巴氏滴管沿着试管壁缓慢加入20mL的稀释血液。500g离心30min。取淋巴细胞层到新的50mL离心管，用生理盐水稀释2倍，4℃条件下2000g离心10min，弃上清。用5mL生理盐水吹散淋巴细胞，再次2000g离心10min，弃上清，以充分洗涤淋巴细胞。每份淋巴细胞中加入裂解液(TRNsol)，1mL一份分装到2mL离心管中，于-80℃保存备用。
(3)总RNA的提取：总RNA的提取依据Invitrogen公司的Trizol试剂方法进行。具体方法如下：
将上述裂解液每1mL加入0.2mL的氯仿。盖上离心管盖子，剧烈震荡15秒，在冰上孵育5min。室温下12000rpm离心10min。转移不多于80％上层水相至新的离心管，缓慢加入0.7倍体积的无水乙醇，混匀；将得到溶液和沉淀一起转入GBC吸附柱中，12000rpm离心30秒，弃废液；向GBC吸附柱中加入500μLWash Buffer I离心1min，弃废液；向GBC吸附柱中加入600μL Wash Buffer II，12000rpm，离心30秒，弃废液。12000rpm离心1min，弃废液，室温打开盖子晾干吸附柱中残留漂洗液。将GBC吸附柱转入一个新的离心管中，加入30～100μL ddH2O，室温放置2min，4℃，12000rpm离心1min。收集管内液体，于-80℃保存。
(4)cDNA的合成：以RNA为模板，参照Takara公司第一链反转录试剂盒说明书进行cDNA第一链的合成。具体方法为：
A.按照表1所示的cDNA合成的第一步反应体系，将试剂在无核酸酶的离心管中混合，在冰浴下操作；
表1 cDNA合成的第一步反应体系
| Total RNA | 3μg |
| Oligo(dT)18 primer | 1μL |
| RNase free ddH2O | Up to12μL |
| Total | 12μL |
B.上述反应体系65℃孵育5min，冰浴冷却2min；
C.按照表2所示的cDNA合成的第二步反应体系，在步骤A反应后的体系中加入试剂；
表2cDNA合成的第二步反应体系
| 步骤A反应后的体系 | 12μL |
| 5×Reaction Buffer | 4μL |
| RiboLock RNase Inhibitor(20U/μL) | 1μL |
| 10mM dNTP Mix | 2μL |
| RevertAid M-MiLVRT(200U/μL) | 1μL |
| Total | 20μL |
D.42℃孵育60min，70℃孵育5min。反转录产物cDNA于-80℃保存。
(5)纳米抗体VHH目的基因的扩增
第一轮PCR：将步骤(5)得到的反转录产物cDNA作为模板，利用引物Q1/Q2进行第一轮PCR反应，引物Q1/Q2的核苷酸序列如表5中的SEQ ID NO.10～11所示，第一轮PCR的反应体系如表3所示。
表3第一轮PCR的反应体系
第一轮PCR的反应条件为：94℃5min；94℃30s；55℃30s；72℃1min 30cycle；72℃10min。
第二轮PCR：采用试剂盒回收第一轮PCR反应产物，适当稀释后作为第二轮PCR的模板，利用引物Q3/Q4或引物Q3/Q5进行第二轮PCR反应，引物Q3/Q4的核苷酸序列如表5中的SEQ ID No.12～13所示，引物Q3/Q5的核苷酸序列如表5中的SEQ ID No.12和SEQ ID No.14所示，第二轮PCR的反应体系如表4所示。
表4第二轮PCR的反应体系
第二轮PCR的反应条件为：94℃5min；94℃30s；55℃30s；72℃1min 30cycle；72℃10min。
表5纳米抗体VHH目的基因的扩增所用的引物及其核苷酸序列
| Q1(SEQ ID No.10) | 5′-gtcctggctgctcttctacaagg-3′ |
| Q2(SEQ ID No.11) | 5′-ggtacgtgctgttgaactgttcc-3′ |
| Q3(SEQ ID No.12) | 5′-catgccatgactgtggcccaggcggcccagktgcagctcgtggagtc-3′ |
| Q4(SEQ ID No.13) | 5′-catgccatgactcgcggccggcctggccatgggggtcttcgctgtggtgcg-3′ |
| Q5(SEQ ID No.14) | 5′-catgccatgactcgcggccggcctggccgtcttgtggttttggtgtcttggg-3′ |
(6)文库构建
A.VHH目的基因及载体的酶切
采用Sfi I酶对VHH目的基因及pComb3xss载体进行酶切。酶切条件：50℃水浴锅反应16h。
B.酶切产物的连接
将载体pComb3xss和VHH片段混匀(摩尔比1：3)，于16℃连接反应16h后用试剂盒清洁回收。
C.电转化
取5μL连接产物加至50μL电转感受态E.coil TG1中，轻轻混匀后转入0.1cm的电转杯中电击转化(电压为1.8kv)，立即向电转杯加入950μL SOC培养基，37℃，250rpm培养1h，将菌液涂布于LB-Amp平板，37℃倒置培养过夜。
(7)文库的救援
接种超过10倍库容量的细胞于200mL LB(Amp)中37℃，250rpm培养至OD600约0.4～0.6；加入辅助噬菌体M13K07(20:1感染复数)，37℃静置30min后，250rpm培养1h，加入卡那抗生素(1：1000)37℃，250rpm培养过夜。12000rpm 4℃15min离心，取上清，加入1/5体积的PEG/NaCl，冰浴2～3h。12000rpm 4℃15min离心，弃上清，沉淀用1mL TBS重悬，转移到2mL离心管，12000rpm 4℃5min离心，过0.22μm聚醚砜滤膜，取10μL测定库容，其余加入终浓度50％甘油，-80℃保存。
实施例3纳米抗体的亲和淘选及其鉴定
(1)纳米抗体的亲和淘选
首先，以PH-Q-OVA作为包被原，用包被液将PH-Q-OVA包被原稀释至终浓度10μg/mL，37℃包被过夜。第二天用PBST(0.01M PBS，0.06％Tween-20(v/v))洗两次后，加入1％鱼胶蛋白37℃封闭2h。甩干孔内液体并拍干，每孔加入100μL噬菌体文库(文库滴度约为1012cfu/mL)，37℃孵育1h。弃去未结合的噬菌体，用PBST(0.01M PBS，0.05％Tween-20(v/v))洗涤5次，PBS(pH 7.0)洗涤15次，加入Gly-HCl(0.2M，pH 2.2)37℃洗脱10min，立即用10μL Tris-HCl(1M，pH 9.0)中和。取10μL洗脱噬菌体测定滴度，其余的用于感染4mL生长至对数期的E.coil TG1菌株进行扩增。第三天用PEG/NaCl沉淀扩增后噬菌体，并测定噬菌体的滴度。
在第二、三、四轮的淘选过程中，包被的PH-Q-OVA包被原浓度为2μg/mL、0.4μg/mL、0.25μg/mL，加入噬菌体孵育1h，用PBST(0.01M PBS，0.05％Tween-20(v/v))与PBS洗涤后，采用药物竞争洗脱方式，即加入一定浓度的药物，37℃孵育1h，吸出孔内液体，即为洗脱下来的噬菌体。其余步骤同上。药物洗脱浓度分别1000ng/mL、400ng/mL、100ng/mL。
(2)阳性噬菌体克隆的鉴定
采用间接酶联免疫吸附法进行阳性噬菌体克隆的鉴定，具体方法为：
A.包板：用包被液将PH-Q-OVA包被原稀释至1μg/mL，37℃包被过夜。第二天用PBST(0.01M PBS，0.06％Tween-20(v/v))洗两次后，加入2％的脱脂奶粉，每孔120μL，37℃封闭3h，弃封闭液，37℃烘干60min，用密封袋装于4℃待用。
B.从第三、四轮淘选后测定滴度的平板上随机挑选30个克隆于加有Amp抗性的LB培养基的96孔深孔板中，同时接种一个TG1单克隆作为阴性对照，37℃培养过夜。第二天从96孔深孔板中取出10μL菌液加入到另一块96孔深孔板，37℃，180rpm培养2h，每孔加入IPTG(1：1000比例，v/v)37℃，180rpm培养过夜。第三天4000rpm离心取上清100μL，加入到已经包被好的酶标板中，37℃孵育40min，用PBST(0.01M PBS，0.06％Tween-20(v/v))洗五次，拍干孔内液体，加入1:5000稀释HRP标记的抗HA二抗100μL，37℃孵育40min，用PBST(0.01M PBS，0.06％Tween-20(v/v))洗五次，拍干孔内液体，加入100μLTMB底物液，37℃避光显色10min；加入50μL终止液(2M H2SO4)终止反应；用酶标仪测定450nm处的吸收值。选取OD450大于阴性3倍的噬菌体克隆为阳性克隆。
(3)纳米抗体的鉴定
采用间接竞争ELISA的方法进行阳性纳米抗体的鉴定，具体方法为：
用包被液将PH-Q-OVA包被原稀释至1μg/mL，37℃包被过夜。第二天用PBST(0.01MPBS，0.06％Tween-20(v/v))洗两次后，加入2％的脱脂奶粉，每孔120μL，37℃封闭3h，弃封闭液，37℃烘干60min，用密封袋装于4℃待用。加入效价组：50μL经间接ELISA鉴定为阳性克隆的上清液和50μL的PBS；抑制组：50μL经间接ELISA鉴定为阳性克隆的上清液和50μL的百草枯标准品(浓度为1μg/mL)，37℃孵育40min，用PBST(0.01M PBS，0.06％Tween-20(v/v))洗五次，拍干孔内液体，加入1:5000稀释HRP标记的抗HA二抗100μL，37℃孵育40min，用PBST(0.01M PBS，0.06％Tween-20(v/v))洗五次，拍干孔内液体，加入100μL TMB底物液，37℃避光显色10min；加入50μL终止液(2MH2SO4)终止反应；用酶标仪测定450nm处的吸收值。
结果显示：获得了一株能够特异性识别百草枯的纳米抗体，命名为Nb2-34。
实施例4纳米抗体Nb2-34编码基因的测序及其氨基酸序列的确定
1、实验方法
将经过间接竞争ELISA鉴定获得的纳米抗体Nb2-34的菌株送到测序公司进行测序，获得纳米抗体Nb2-34的核苷酸序列；根据DNA测序结果及密码子表，获得纳米抗体Nb2-34的氨基酸序列。
2、实验结果
纳米抗体Nb2-34的VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：
EVQLVESGGALVQPGGSLRLSCEVSVEISSANTMGWYRRAPGKQIELVAAIDSNGRAAYPDSVTGRFTISRDNANNVIDLQMNSLRPSDTAVYYCNVWWDLLRDYWGRGTQVTVSSAHHSEDPH
编码所述纳米抗体Nb2-34的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGTGGAGCATTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTTTGAGACTCTCCTGTGAGGTCTCTGTGGAGATATCGAGTGCCAACACTATGGGCTGGTACCGCCGGGCTCCGGGGAAGCAGATTGAGCTGGTCGCGGCCATTGATAGTAACGGAAGAGCGGCCTATCCGGACTCCGTGACGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCTAACAACGTGATCGATCTGCAAATGAACAGCCTGAGACCATCAGACACGGCCGTCTATTATTGTAATGTCTGGTGGGATCTCTTGAGGGACTACTGGGGCCGGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGCGCACCACAGCGAAGACCCCCAT
纳米抗体Nb2-34的氨基酸编号及结构域示意图如图2所示，可以看出，该纳米抗体Nb2-34包括4个框架区(Framework region,FR)和3个互补决定区(Complementarity-determining region,CDR)；框架区(FR1-FR4)分别选自SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ IDNo.5，SEQ ID No.6；互补决定区(CDR1-CDR3)分别选自SEQ ID No.7，SEQ ID No.8，SEQ IDNo.9。
其中，第1-25位氨基酸序列为FR1，其氨基酸如SEQ ID No.3所示：EVQLVESGGALVQPGGSLRLSCEVS；第26-33位氨基酸序列为CDR1，其氨基酸如SEQ ID No.7所示：VEISSANT；第34-50位氨基酸序列为FR2，其氨基酸如SEQ ID No.4所示：MGWYRRAPGKQIELVAA；第51-57位氨基酸序列为CDR2，其氨基酸如SEQ ID No.8所示：IDSNGRA；第58-95位氨基酸序列为FR3，其氨基酸如SEQ ID No.5所示：AYPDSVTGRFTISRDNANNVIDLQMNSLRPSDTAVYYC；第96-105位氨基酸序列为CDR3，其氨基酸如SEQ ID No.9所示：NVWWDLLRDY；第106-124位氨基酸序列为FR4，其氨基酸如SEQ ID No.6所示：WGRGTQVTVSSAHHSEDPH。
实施例5纳米抗体Nb2-34的大量制备
以蛋白表达的形式进行制备纳米抗体Nb2-34，具体方法为：
将所获得的纳米抗体Nb2-34的菌株，用试剂盒提取其质粒，将质粒用化学转化的方法转入E.coil BL21中。从转化平板上挑一单菌落接种于10mL LB(Amp)培养基中，37℃，250rpm培养过夜。将过夜培养物按1：100的比例接种于1000mL LB(Amp)培养基中，37℃，250rpm培养至OD600约为0.4～0.6时，加入IPTG(1:1000比例，v/v)，37℃，250rpm培养过夜。第二天4℃，12000rpm离心5min，收集菌体沉淀，用蔗糖渗透压冻融法，12000rpm离心10min，取上清，将上清进行亲和层析纯化，即得表达的纳米抗体Nb2-34。
实施例6利用纳米抗体Nb-2-34检测百草枯
1、包被及封闭
用包被液将PH-Q-OVA包被原稀释至1μg/mL，37℃包被过夜。第二天用PBST(0.01MPBS，0.05％Tween-20(v/v))洗板两次后，加入1％鱼胶蛋白溶液，每孔120μL，37℃封闭3h，弃封闭液，37℃烘干1h，用密封袋装于4℃待用。
2、检测百草枯
(1)实验方法
用包被液将PH-Q-OVA包被原稀释至1μg/mL，37℃包被过夜。第二天用PBST(0.01MPBS，0.05％Tween-20(v/v))洗板两次后，加入120μL/孔2％的脱脂奶粉溶液，37℃封闭3h，弃封闭液，37℃烘干1h。每孔加入50μL纳米抗体和一系列不同浓度的50μL的百草枯标准品，37℃条件下孵育40min，用PBST洗板五次，拍干孔内液体，加入1:5000稀释的HRP标记的抗VHH二抗100μL，37℃孵育30min，用PBST洗板五次，拍干孔内液体，加入100μL TMB底物液，37℃避光显色10min；加入50μL的终止液(10％ H2SO4，v/v)终止反应；用酶标仪读取450nm处的吸收值。以百草枯标准品的浓度为横坐标，B/B0(百草枯)的孔的OD450/未加入百草枯的孔的OD450为纵坐标，建立间接竞争标准曲线。
(2)实验结果
基于纳米抗体Nb-2-34建立的间接竞争ELISA标准曲线图如图3所示，由图可以看出，标准曲线呈S型，线性相关性较好，针对百草枯的半数抑制(IC50)分别为1.23ng/mL，线性范围分别为0.17～8.66ng/mL。
实施例7一种检测百草枯的开放式液滴阵列微流控芯片
本发明所述开放式液滴阵列微流控芯片的制作，具体方法为：
所述芯片设计图如图4A，采用铸模工艺制得。首先，利用Auto CAD设计液滴阵列微流控芯片，并将其转换成计算机数控加工合金模具。PDMS前驱体以1:10比例的交联剂-碱制备(Sylgard 180，道康宁公司)。随后将其倒入该模具中，经真空泵排气泡后，放入烘箱在60℃条件下烘制3h，再在高温下进行疏水涂层处理，从而得到液滴阵列微流控芯片。
所述芯片如图4B包括芯片基底和位于芯片基底上的若干个平行通道，每个平行通道通过微流控通道狭缝设有依次相连的3个反应腔室和1个尾腔室，每个腔室均具有凹陷微结构；所述芯片平行通道为15个；平行通道间距离为5.0mm；连接反应腔室的微流控通道狭缝宽0.5mm；第一反应腔室加入待测溶液、磁珠抗原和酶标抗体的混合溶液，第二反应腔室中加入PBS液滴，第三反应腔室中加入有显色底物Amplex Red/H2O2液滴；所述磁珠抗原为百草枯人工抗原PH-Q-OVA与NHS磁珠偶联物；所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记实施例3所述的抗百草枯纳米抗体Nb-2-34。
实施例8基于NHS磁珠的百草枯抗原-磁珠偶联物的制备
根据Beaver Beads Mag NHS的使用说明制备抗原-磁珠偶联物，具体方法为：
1、磁珠清洗：取500μL NHS磁珠于1.5mL离心管中，再将离心管置于磁性分离架内，富集磁珠，去除上清液；加入少量预冷的1mM盐酸溶液，混合均匀；将离心管置于磁性分离架内，富集磁珠，去除上清液。
2、生物配体固定：加500μL抗原溶液(PH-Q-OVA，200μg/mL)于上述离心管中与磁珠混合均匀。置于垂直混合仪上混合反应1～2h；采用磁性分离架富集磁珠，保存流穿液。
3、磁珠封闭：加500μL 3M乙醇胺于上述离心管中，洗涤磁珠4次。随后，加入500μL3M乙醇胺，500μL 5％BSA于上述离心管中，于垂直混合仪中封闭反应2h；然后加少量超纯水于离心管中，充分混合，用磁力分离架富集磁珠，弃上清液。
4、保存：加入少量含0.05％叠氮化钠的PBS缓冲溶液于离心管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，弃上清液；加入少量0.05％叠氮化钠的PBS缓冲溶液于离心管中，4℃保存备用。
实施例9酶标抗体的制备
本发明所述酶标抗体的制备，具体方法为：
采用改良的过碘酸钠法制备酶标抗体HRP-PH-Nb，具体步骤为：称取5mg HRP，溶解于500μL醋酸盐缓冲液(pH 5.6)中。滴加100μL高碘酸钠溶液，低温避光搅拌30min。随后，依次向混合物中加入500μL乙二醇和60μL纳米抗体PH-Nb(6.96mg/mL)，各30min。反应结束后取出并在CBS溶液(pH 9.6)中透析过夜。将上述混合物与少量硼氢化钠溶液(5mg/mL)混合并反应2h。添加等量的饱和硫酸铵溶液以沉淀缀合物。反应30min，静置1h，低温离心20min(4500r/min)，留下沉淀。将沉淀用少量PBS(pH 7.4)溶解，装入透析袋中，在PBS溶液中透析过夜，收集上清即为HRP-PH-Nb。
实施例10一种用于检测百草枯的NHS磁珠-微流控免疫检测方法
1、检测步骤
首先，向每个液滴阵列微流控芯片中注入400μL矿物油。然后，待测溶液与酶标抗体(1:1，v/v))的混合液30μL，PBS(0.1mol/L)与HRP-PH-Nb的混合液(1:1，v/v))的混合液30μL分别添加到两个平行通道的第一反应腔室中；将1.5μL制备好的磁珠抗原加入上述反应腔室中，37℃孵育30min；在第二反应室和第三反应腔室中分别加入30μL PBS和30μL显色液(15μL H2O2和15μL Amplex Red)；将反应后的探针在磁力牵引下依次拉入第二、第三反应腔室，最后牵引至第三反应腔室于37℃孵育5min，完成免疫测定。通过凝胶成像仪(520nm)采集荧光信号，并利用image J软件对信号进行定量计算分析。
2、标准曲线的建立
首先按照检测步骤测定系列梯度浓度(1000、200、40、8、1.6、0.32、0.064、0ng/mL)的PH标准溶液。根据各标准品稀释液的浓度和灰度值拟合标准曲线，以浓度为横坐标，灰度值的差值为纵坐标。
3、定量分析
使用凝胶成像仪采集荧光信号，并利用image J软件转换成灰度值分析信号强度，代入建立的标准曲线计算得到待测溶液中百草枯的含量。
4、实验结果
本发明用于检测百草枯的NHS磁珠-微流控免疫检测方法对对百草枯的检测限为0.0028ng/mL，线性范围为0.064～1000ng/mL，标准曲线如图5所示。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种抗百草枯的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的VHH的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。
2.一种编码权利要求1所述纳米抗体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求2所述基因。
4.一种重组细胞，其特征在于，含有权利要求3所述重组载体。
5.权利要求1所述纳米抗体在检测百草枯中的应用。
6.权利要求1所述纳米抗体、权利要求2所述基因、权利要求3所述重组载体或权利要求4所述重组细胞在制备百草枯检测产品中的应用。
7.一种检测百草枯的方法，其特征在于，以百草枯半抗原与载体蛋白偶联得到的人工抗原做包被原，以权利要求1所述纳米抗体作为检测抗体进行检测。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述百草枯半抗原的结构，如式如式(I)所示：
9.一种检测百草枯的开放式液滴阵列微流控芯片，其特征在于，包括芯片基底和位于芯片基底上的若干个平行通道，每个平行通道设有通过微流控通道狭缝依次相连的第一反应腔室、第二反应腔室、第三反应腔室和尾腔室，每个腔室均具有凹陷微结构；所述第一反应腔室用于装载待测样品、磁珠抗原和酶标抗体混合溶液；所述第二反应腔室用于装载缓冲盐溶液；所述第三反应腔室用于装载荧光探针溶液；所述磁珠抗原为权利要求8中所述百草枯半抗原制备得到的人工抗原与磁珠偶联物；所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的权利要求1所述的百草枯纳米抗体；所述缓冲盐溶液为PBS溶液；所述荧光探针溶液为AmplexRed/H2O2。
10.权利要求9所述的开放式液滴阵列微流控芯片在制备检测百草枯的微流控免疫检测试剂盒中的应用。
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