CN117209609A - 一种抗人cd64膜蛋白的单克隆抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及肽技术领域，公开了一种抗人CD64膜蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体具有3个重链互补决定区以及3个轻链互补决定区。本申请还公开了其制备方法和应用。本申请提供一种抗人CD64膜蛋白的单克隆抗体，通过流式细胞检测的方法，能够标记人外周血细胞表面CD64分子，评价单核细胞和中性粒细胞上CD64的表达水平，以及诊断脓毒症的早期感染，检测CD64表达水平与感染程度和预后的相关性。
Description
技术领域
本申请涉及肽技术领域，具体而言，涉及一种抗人CD64膜蛋白的单克隆抗体及其应用，特异性识别人外周血细胞表达的膜型CD64，用以评价单核细胞和中性粒细胞上CD64的表达水平。
背景技术
CD64是免疫球蛋白IgG的Fc片段Ⅰ型受体(FcγRⅠ)，识别免疫球蛋白的Fc段，是连接体液免疫和细胞免疫的桥梁。CD64在巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞上表达。在脓毒症引起的炎症反应情况下，中性粒细胞CD64的表达显著增加，已有研究证实CD64指标是成人和新生儿脓毒症诊断和预后评估的重要指标；全身炎症反应综合征(SIRS)和脓毒症患者外周血中，中性粒细胞CD64表达水平高于单独SIRS患者，单核细胞高表达CD64伴随着中性粒细胞CD64表达上调。
因此，筛选出高特异性、高亲和力的抗人CD64单克隆抗体，从中克隆出轻、重链可变区基因，对进一步研制CD64基因工程抗体试剂，可以应用于CD64分子功能机制的研究，以及作为诊断和免疫治疗的重要技术手段，也具有十分重要的实际应用价值。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本申请的主要目的在于提供一种抗人CD64膜蛋白的单克隆抗体及其应用。
为了实现上述目的，第一方面，本申请提供了一种抗人CD64膜蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体具有3个重链互补决定区以及3个轻链互补决定区；
所述重链互补决定区的氨基酸序列分别为：序列表SEQ ID No.1中第26位至第33位氨基酸，序列表SEQ ID No.1中第51位至第58位氨基酸，序列表SEQ ID No.1中第97位至第110位氨基酸；
所述轻链互补决定区的氨基酸序列分别为：序列表SEQ ID No.3中第27位至第38位氨基酸，序列表SEQ ID No.3中第56位至第58位氨基酸，序列表SEQ ID No.3中第95位至第103位氨基酸。
作为优选，所述单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；所述轻链可变区具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。
第二方面，本申请提供了编码基因，用于编码上述的抗人CD64膜蛋白的单克隆抗体。
作为优选，所述编码基因包括如SEQ ID No.2所示的DNA序列，以用于编码所述抗人CD64膜蛋白单克隆抗体的重链可变区；以及包括如SEQ ID No.4所示的DNA序列，以用于编码所述抗人CD64膜蛋白单克隆抗体的轻链可变区。
本申请对所述单克隆抗体的制备方法并没有特殊限定，优选采用杂交瘤细胞和腹水的方法制备。
第三方面，本申请提供一种核酸分子，其含有上述的编码基因。
第四方面，本申请提供一种表达载体，其含有上述的核酸分子。
第五方面，本申请提供一种抗人CD64膜蛋白单克隆抗体的制备方法，其采用上述的表达载体对细胞进行转染，转染后继续培养细胞，收集细胞上清液并纯化，得到所述抗人CD64膜蛋白单克隆抗体。
第六方面，本申请提供上述的抗人CD64膜蛋白单克隆抗体、编码基因、核酸分子或表达载体在制备CD64膜蛋白检测试纸条或试剂盒中的应用。
作为优选，所述试纸条包括胶体金检测试纸条，荧光微球检测试纸条和乳胶微球检测试纸条；
所述试剂盒包括流式检测试剂盒，夹心ELISA抗原检测试剂盒和竞争ELISA抗体检测试剂盒。
上述试纸条和试剂盒均可以按照本领域常用方法来制备，在此不再一一赘述。
第七方面，本申请提供上述的抗人CD64膜蛋白单克隆抗体、编码基因、核酸分子或表达载体作为诊断脓毒症早期感染，或感染程度，或预后评估的标志物的应用。
在本申请实施例中，提供一种抗人CD64膜蛋白的单克隆抗体，通过设定重链互补决定区和轻链互补决定区的氨基酸序列，该单克隆抗体可结合人外周血细胞表面的CD64分子，通过流式细胞术快速简便地对细菌感染指标进行早期检测，进而解决相关技术中没有CD64单克隆抗体的技术问题。
本申请提供一种抗人CD64膜蛋白的单克隆抗体，通过流式细胞检测的方法，能够标记人外周血细胞表面CD64分子，评价单核细胞和中性粒细胞上CD64的表达水平，以及诊断脓毒症的早期感染，检测CD64表达水平与感染程度和预后的相关性。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本申请的进一步理解，使得本申请的其它特征、目的和优点变得更明显。本申请的示意性实施例附图及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1为抗人CD64 10H12单克隆抗体外周血流式检测示意图。
图2为本发明的抗人CD64单克隆抗体检测健康人中性粒细胞的流式检测示意图。
图3为本发明的抗人CD64单克隆抗体检测脓毒症患者中性粒细胞的流式检测示意图。
图4为本发明的抗人CD64单克隆抗体检测健康人单核细胞的流式检测示意图。
图5为本发明的抗人CD64单克隆抗体检测脓毒症患者单核细胞的流式检测示意图。
图6为CD64指数反映脓毒症患者与健康人CD64的表达变化示意图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请。
实施例1制备特异性分泌CD64单克隆抗体的杂交瘤细胞
本发明的抗人CD64单克隆抗体的制备包括以下步骤：
1动物免疫
（1）初次免疫：CD64抗原蛋白（购于上海百英生物科技股份有限公司）40μg/只小鼠皮下多点注射，溶于0.5ml PBS/只小鼠，0.1-0.2ml/点；
（2）第2次免疫：初次免疫间隔21天后进行第2次免疫，免疫方法同步骤（1）；
（3）第3次免疫：第2次免疫间隔21天后进行第三次免疫，免疫方法同步骤（1）；
（4）第4次免疫：第三次免疫间隔21天后进行第四次免疫，免疫方法同步骤（1）；
（5）7-10d后采血检测测小鼠眼眶血效价，融合前3天加强免疫。
2细胞准备
（1）脾细胞：将步骤1免疫的BALB/c小鼠在无菌条件下去除脾脏，准备脾淋巴细胞悬液。
（2）骨髓瘤细胞：SP2/0细胞使用RPMI1640培养基，添加10%小牛血清，细胞密度保持104-105/ml。当细胞处于对数生长的中期时，按1:3-1:10的比例传代，每3-5天传代一次。细胞在传代过程中，部分细胞可能有返祖现象，应定期用8-氮鸟嘌呤处理，保持SP2/0细胞对HAT的敏感性。
3细胞融合
（1）将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:5的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，1200rpm离心10min，弃去上清，用吸管吸净残留液体，轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动；
（2）用吸管取预热至37℃的50% PEG（pH 8.0）1ml，在45s内边加边轻轻搅拌；
（3）用吸管取20ml预热的不完全培养基在90s内滴加完毕终止PEG；室温静置10min，1000rpm离心8min，弃上清；
（4）加入5ml HAT培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加HAT培养基至100ml。将融合细胞平均铺到96孔板内，每孔0.1-0.15ml，培养板置于37℃，5% CO2培养箱内培养；
（5）5天后用新鲜的HAT培养基半量换液，期间经常观察杂交瘤细胞的生长情况，待细胞克隆长至孔底面积1/10以上且培养基微黄时吸出上清供抗体检测。
实施例2特异性分泌CD64抗体的克隆筛选
1杂交瘤细胞株CD64 10H12的获得
用ELISA法筛选产生CD64特异性IgG的杂交瘤克隆的孔，有限稀释法进一步将阳性孔细胞亚克隆，轻轻将阳性杂交瘤细胞吹起并计数，分别稀释至100个细胞/孔铺8个孔、稀释至10个细胞/孔铺8个孔、稀释至1个细胞/孔铺80个孔，每孔100μL，并于第二天在倒置显微镜下观测，挑选含有单个细胞的孔或几个克隆紧挨着的小细胞团。有限稀释法的次数取决于单个杂交瘤细胞的获得，每次亚克隆培养时间需要7-10d。
ELISA成功筛选出产生抗CD64单抗的杂交瘤所在孔，该抗CD64单抗具有针对CD64抗原蛋白构象的高结合活性，将该杂交瘤细胞株命名为CD64 10H12。
2抗人CD64单克隆抗体的制备
（1）Balb/c小鼠腹腔注射0.3~0.5ml降植烷处理15天，将筛选出来的杂交瘤细胞株扩大培养后接种到Balb/c小鼠腹腔内，每只注射0.8~1×10^6杂交瘤细胞；
（2）注射杂交瘤细胞12天左右小鼠腹部肿胀，取小鼠腹水至干净的15ml离心管内，3000rpm离心10min，无色透明液体即为腹水，用3倍体积的无菌PBS稀释腹水；
（3）配制饱和硫酸铵溶液：500g硫酸铵加入500ml蒸馏水中，加热至完全溶解，室温过夜，析出的结晶任其留在瓶中。临用前取所需的量，用2mol/L NaOH调pH至7.8，硫酸铵盐析法进行腹水纯化；
（4）以10ml稀释的腹水为例，边搅拌边滴加饱和硫酸铵溶液5.0ml；继续缓慢搅拌30分钟；10000r/min离心15min；弃去上清液，沉淀物用1/3饱和度硫酸铵悬浮，搅拌作用30min，10000r/min离心15min；重复前一步1-2次；沉淀物溶于1.5ml PBS（0.01mol/LpH7.2），将盐析样品过Sephadex G-50层析柱，以Tris-HCl缓冲液作为平衡液和洗脱液，流速每分钟1ml，第一个蛋白峰即为脱盐的抗体溶液。应用上述方法得到抗人CD64单克隆抗体10H12。
抗人CD64单克隆抗体10H12的IgG亚型的鉴定按Roche IsoStrip™小鼠单克隆抗体分型试剂盒说明书操作。对其分泌的抗体进行Ig亚类测定，鉴定结果为IgG1，k链。
实施例3特异性抗人CD64单克隆抗体10H12轻重链可变区序列的测定
根据每种特异分泌CD64单抗的杂交瘤细胞只含有1个功能性重链可变区DNA序列和1个功能性轻链可变区DNA序列，获得抗体的序列信息。
杂交瘤细胞测序：从杂交瘤细胞中提取RNA进行反转录得到cDNA，通过PCR进行IgG重链可变区和轻链可变区扩增并测序，进而获得抗体重链和轻链的序列信息。EcoRI,XbaI双酶切预处理IgG1重链表达载体，FspI，BmtI双酶切预处理轻链表达载体，这一对重链和轻链可变区序列分别克隆到对应的重轻链表达载体中，瞬时转染到CHO细胞，7天后收获含有抗体的培养基上清。
通过上述方法测得的抗人CD64 10H12单克隆抗体重链可变区的氨基酸序列如下：
EVMLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSSYGMSWVRQTPDKRLELVATINSNGGRTYYPDRMKGRFTISRDNAKNSLNLQMSSLKSEDTAMYYCVREGYGNYFYAMDYWGQGTSVTVSS（SEQ ID No.1）。
其中，加下划线的部分依次为重链互补决定区（即，高变区）CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列。
编码抗人CD64 10H12单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列如下：
gaggtgatgctggtggagtctgggggaggcttagtgcagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagcctctggattcactttcagtagttatggcatgtcatgggttcgccagactccagacaagaggctggaattggtcgcaaccattaatagtaacggtggtaggacctattatccagacagaatgaagggccgattcaccatttccagagacaatgccaagaactccctgaacctgcaaatgagcagtctgaagtctgaggacacagccatgtattactgtgtaagagagggatatggtaattacttctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca（SEQ IDNo.2）。
通过上述方法测得的抗人CD64 10H12单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列如下：
DIVMTQSPSSLAISVGQEVTVSCKSSQSLLNSNNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLVYFASTRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTITTVQAEDLADYFCQQHYGTPPTFGGGTKLEIK（SEQ ID No.3）。
其中，加下划线的部分依次为轻链互补决定区（即，高变区）CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列。
编码抗人CD64 10H12单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列如下：
gacattgtgatgacccagtctccatcctccctggctatctcagttggacaggaggtcactgtgagctgcaagtccagtcagagccttttaaatagtaacaatcaaaagaactatttggcctggtaccagcagaaaccaggacaatctcctaaacttctggtatactttgcatccactagggaatctggggtccctgatcgcttcataggcagtggatctggtacagatttcactcttaccatcaccactgtgcaggctgaagacctggcagattacttctgtcagcaacattatggcactcctccgacgttcggtggaggcaccaagctggaaataaaa（SEQ ID No.4）。
实施例4外周血细胞表达CD64分子的流式检测
准备健康人外周血细胞，未加抗体管作为阴性对照，加入10μg/mL FITC偶联的实施例2制备的抗人CD64单克隆抗体10H12作为一抗，4 ℃避光孵育30 min，加入1ml预冷的PBS终止反应，将细胞2000rpm离心5 min，重复2次，弃去洗涤液后重悬于500µL预冷PBS上机检测。
结果显示，流式检测人外周血中性粒细胞，这株克隆号为10H12的抗人CD64单克隆抗体，结合外周血中性粒细胞表面的CD64抗原分子，显示出较高的荧光强度（图1）。
图1为抗人CD64 10H12单克隆抗体外周血流式检测示意图。其中，A为中性粒细胞圈门，B为阴性对照组中性粒细胞检测结果，C为直标抗体组的中性粒细胞检测结果。
实施例5利用流式细胞术分析脓毒症外周血单核细胞和中性粒细胞CD64表达
（1）收集脓毒症患者外周血全血样本，取50μL血样加入离心管。
（2）加入FITC标记的实施例2制备的抗人CD64单克隆抗体10H12（容量不超过50μL），并充分混匀，室温避光孵育20分钟，以未加抗体管作为阴性对照。
（3）加入200μL常温1×红细胞裂解液，然后颠倒混匀。
（4）40℃水浴孵育10分钟，观察浑浊度评估红细胞裂解程度。当样本变得清澈时表示裂解完全。
（5）裂解之后，立即在室温2000rpm离心5分钟。小心弃去上清。
（6）500 µL PBS重悬细胞，上机检测。
结果显示，健康人中性粒细胞表面低表达CD64。当机体感染脓毒症时，中性粒细胞CD64表达迅速升高；同时检测单核细胞CD64水平，脓毒症患者单核细胞上CD64表达高于健康人（图2）。
图2为本发明的抗人CD64单克隆抗体检测健康人中性粒细胞的流式检测示意图。其中，A为健康人的中性粒细胞圈门，B为健康人的阴性对照组中性粒细胞检测结果，C为健康人的CD64-FITC直标抗体组中性粒细胞检测结果。
图3为本发明的抗人CD64单克隆抗体检测脓毒症患者中性粒细胞的流式检测示意图。其中，A为脓毒症患者的中性粒细胞圈门，B为脓毒症患者的阴性对照组中性粒细胞检测结果，C为脓毒症患者的CD64-FITC直标抗体组中性粒细胞检测结果。
图4为本发明的抗人CD64单克隆抗体检测健康人单核细胞的流式检测示意图。其中，A为健康人的单核细胞圈门，B为健康人的阴性对照组单核细胞检测结果，C为健康人的CD64-FITC直标抗体组单核细胞检测结果。
图5为本发明的抗人CD64单克隆抗体检测脓毒症患者单核细胞的流式检测示意图。其中，A为脓毒症患者的单核细胞圈门，B为脓毒症患者的阴性对照组单核细胞检测结果，C为脓毒症患者的CD64-FITC直标抗体组单核细胞检测结果。
CD64/SS：用CD64区分单核细胞和中性粒细胞。
实施例6中性粒细胞CD64感染指数在脓毒症的临床检测
确诊为脓毒症的患者外周血采样标准：①患者入院第1天，②患者入院后第3天，③患者入院后第7天。
血样处理步骤：向流式管内加入50μL全血样本。加入FITC标记的实施例2制备的抗人CD64单克隆抗体10H12，并充分混匀，室温避光孵育30 min。加入200μL常温1×红细胞裂解液，涡旋混匀，40℃水浴孵育5-10 min。通过观察样本变得清澈时表示裂解完全，立即在2000rpm离心5分钟，小心吸去上清。用500 µL预冷的缓冲液重悬细胞。测定外周血样本中淋巴细胞中性粒细胞上CD64分子表达的平均荧光强度，计算感染指数。CD64感染指数=中性粒细胞CD64与淋巴细胞CD64的平均荧光强度之比。
结果显示，脓毒症患者入院后第1天、第3天CD64指数明显高于正常人。第7天，大部分病人恢复，CD64指数逐渐接近正常人(NC)（图6）。
图6为CD64指数反映脓毒症患者与健康人CD64的表达变化示意图。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种抗人CD64膜蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体具有3个重链互补决定区以及3个轻链互补决定区；
所述重链互补决定区的氨基酸序列分别为：序列表SEQ ID No.1中第26位至第33位氨基酸，序列表SEQ ID No.1中第51位至第58位氨基酸，序列表SEQ ID No.1中第97位至第110位氨基酸；
所述轻链互补决定区的氨基酸序列分别为：序列表SEQ ID No.3中第27位至第38位氨基酸，序列表SEQ ID No.3中第56位至第58位氨基酸，序列表SEQ ID No.3中第95位至第103位氨基酸。
2.如权利要求1所述的抗人CD64膜蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；所述轻链可变区具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。
3.编码基因，其特征在于，用于编码权利要求1或2所述的抗人CD64膜蛋白的单克隆抗体。
4.如权利要求3所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因包括如SEQ ID No.2所示的DNA序列，以用于编码所述抗人CD64膜蛋白单克隆抗体的重链可变区；以及包括如SEQ IDNo.4所示的DNA序列，以用于编码所述抗人CD64膜蛋白单克隆抗体的轻链可变区。
5.一种核酸分子，其特征在于，其含有权利要求3或4所述的编码基因。
6.一种表达载体，其特征在于，其含有权利要求5所述的核酸分子。
7.一种抗人CD64膜蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，其采用权利要求6所述的表达载体对细胞进行转染，转染后继续培养细胞，收集细胞上清液并纯化，得到所述抗人CD64膜蛋白单克隆抗体。
8.权利要求1或2所述的抗人CD64膜蛋白单克隆抗体、权利要求3或4所述的编码基因、权利要求5所述的核酸分子或权利要求6所述的表达载体在制备CD64膜蛋白检测试纸条或试剂盒中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述试纸条包括胶体金检测试纸条，荧光微球检测试纸条和乳胶微球检测试纸条；
所述试剂盒包括流式检测试剂盒，夹心ELISA抗原检测试剂盒和竞争ELISA抗体检测试剂盒。
10.权利要求1或2所述的抗人CD64膜蛋白单克隆抗体、权利要求3或4所述的编码基因、权利要求5所述的核酸分子或权利要求6所述的表达载体作为诊断脓毒症早期感染，或感染程度，或预后评估的标志物的应用。
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| US20110200590A1 (en) * | 2005-06-08 | 2011-08-18 | Pasquale Annunziata | Antibodies Directed Against the Myelin Basic Protein Recognising an Epitope of CD64 and Their Use as Immunosuppressants |
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2023
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