CN117205224A - 甘草甜素在制备用于预防和治疗不明原因复发性流产药物中的应用 - Google Patents
甘草甜素在制备用于预防和治疗不明原因复发性流产药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及甘草甜素在制备用于预防和治疗不明原因复发性流产药物中的应用。本发明在不明原因复发性流产小鼠的饮用水中添加小剂量的甘草甜素，不仅降低了胚胎吸收率，而且改善了小鼠蜕膜组织的炎症反应，降低了小鼠血清和蜕膜组织的HMGB1水平，防止不明原因复发性流产小鼠高水平的HMGB1进一步引发促炎反应，进而有效地保护和治疗不明原因复发性流产小鼠的妊娠率。
Description
技术领域
本发明涉及甘草甜素在制备用于预防和治疗不明原因复发性流产药物中的应用，属于药物技术领域。
背景技术
复发性自然流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)是育龄期妇女中常见的并发症，指的是出现两次或两次以上临床妊娠失败的情况，其发病率高达1-5％。RSA的发病因素多种多样，包括染色体异常、年龄、抗磷脂综合征、子宫畸形、血栓形成、激素或代谢紊乱、感染、自身免疫、精子质量和生活方式问题等[1]。在50-75％的RSA患者中，无法明确病因，被称为不明原因复发性自然流产(unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)。由于URSA的病因和发病机制尚未完全明确，目前国际上还没有统一的诊断标准可以用于判断该病。同时，针对URSA的治疗方法也不明确，缺乏针对性强、疗效明确的治疗方案。目前主要是根据病因进行针对性的预防治疗。对于有高危风险的女性，常用的干预措施包括淋巴细胞主动免疫治疗、静脉免疫球蛋白、糖皮质激素、环袍素A、G-CSF、孕激素、TNF-α抑制剂以及抗凝治疗等。然而，在现有的流产相关指南或专家共识中，并不推荐常规使用这些治疗方式[2]。因此，对于URSA的研究仍然十分重要。深入了解URSA的发病原因和致病机制，开发出新的针对性治疗方法，对于降低URSA的发病率，促进健康妊娠具有重要意义。
近年来，大量研究表明，不明原因复发性自然流产的发生与母体与胎儿免疫耐受失衡密切相关[3]。与正常妊娠相比，URSA患者表现出母胎界面破坏，细胞排列不规则，核破裂率较高，绒毛膜绒毛和蜕膜内浸润细胞增加。一种名为高迁移率组框1(high mobilitygroup box 1，HMGB1)的蛋白质在这方面发挥了重要作用[4]。HMGB1是一种人体细胞核内的非组蛋白DNA结合蛋白。它通常存在于细胞核内，但在炎症或损伤时，可以释放到细胞外，作为损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)分子，被免疫系统识别并激活炎症反应[5]。URSA患者的血清HMGB1水平高于健康孕妇。研究发现，在小鼠模型和人蜕膜组织中，URSA组蜕膜中HMGB1及其受体RAGE、TLR2和TLR4的表达升高，炎症小体NLRP3也随之升高[6,7]。这表明母胎界面及循环系统内HMGB1表达异常升高可能显著影响妊娠过程，增加了URSA发生的可能性。因此，开发针对HMGB1并能抑制其表达的药物可能是减轻促炎反应和保护不明原因复发性流产患者的有效方法。
甘草甜素(Glycyrrhizin，GL)是一种天然存在的化合物，主要存在于甘草的根和根茎中。根据甘草甜素的化学结构，它被归类为三萜二醇[8]。
甘草甜素是从甘草植物的根中提取的植物糖苷。其比蔗糖甜30-50倍，但不被代谢，对血糖指数没有影响。其作为糖替代品的用途受到其强烈的甘草风味的限制。甘草甜素已经在传统医学中用作咳嗽糖浆中的祛痰剂和用作治疗胃溃疡和便秘的草药药物。另外，甘草甜素通过直接与HMGB1蛋白质发生作用来发挥其作用。具体来说，甘草甜素与HMGB1蛋白质上的两个HMG盒臂形成的两个浅凹表面相互作用，从而使甘草甜素与HMGB1之间形成稳定的键[9]。通过分子对接实验还证实了甘草甜素与HMGB1和TLR4之间存在物理相互作用[10]。HMGB1-TLR4-NF-κB信号通路的激活会参与触发体内的炎症反应，甘草甜素的一个重要作用就是能够抑制HMGB1-TLR4-NF-κB信号通路。正是因为具备这些特性，甘草甜素已成为治疗与HMGB1相关的各种疾病的有价值的治疗工具。
甘草甜素主要用于治疗慢性肝炎，在减轻慢性肝炎患者的肝损伤和炎症方面已被证明有效[11]。在目前的研究中，已经有几篇文献报道了甘草甜素在妊娠期并发症中的作用。在子痫前期模型中，胎盘存在缺陷，滋养细胞在缺氧的情况下分泌了大量的HMGB1，而HMGB1通过TLR4/caveolin-1通路诱导内皮细胞高通透性，导致全身性水肿和多尿的症状。Jiang等人的研究发现，浓度为200mg/ml的甘草甜素可以降低内皮细胞通透性，这提示甘草甜素可能有助于减轻子痫前期症状[12]。但目前尚未有关于甘草甜素在临床上用于治疗不明原因复发性流产的相关报道，我们的研究旨在证明甘草甜素有治疗不明原因复发性流产的能力。
发明内容
本发明涉及一种新药的开发，该药物可作为HMGB1的抑制剂，对小鼠不明原因复发性流产具有预防和治疗作用。具体而言，通过在不明原因复发性流产模型小鼠的饮用水中添加小剂量的甘草甜素(Glycyrrhizin)，可以实现该药物的治疗作用。实验证明，这种处理不仅降低了小鼠的胚胎吸收率，还能够减少母胎界面蜕膜组织炎症的发生。此外，该药物还降低了HMGB1在血清和蜕膜组织中的表达水平，从而有效地保护了不明原因复发性流产小鼠的妊娠率。这意味着该药物对于治疗和预防不明原因复发性流产具有重要的临床应用前景。
本发明所述的甘草甜素是一种具有药物特性的天然化合物，可以用于制备用于预防和治疗不明原因复发性流产的药物。所述药物是一种包含甘草甜素的制剂，其中甘草甜素的含量为100、200、400ppm。当所述含有甘草甜素的制剂是固体时，甘草甜素的含量为100、200、400ug/g；当所述含有甘草甜素的制剂是液体时，甘草甜素的含量为100、200、400ug/ml。优选的药物形式是甘草甜素制剂，例如口服水溶液制剂、注射剂等，其剂量为100、200、400ug/ml。甘草甜素固体制剂，尤其是肠溶片，不易溶解于水，因此在小鼠喂食时操作不方便，因此本发明采用了水溶液的形式进行喂食。所述甘草甜素液体制剂的制备方法是将100、200、400mg的甘草甜素粉末(sigma-aldrich)溶解于1L经高压灭菌处理的水中，使其溶解即可。一只小鼠的日进水量为4-7ml，故按照一只小鼠日进水量为5ml计算，则对应甘草甜素给药剂量为25、50、100mg/kg/d。本发明所述的甘草甜素制剂是一种低剂量制剂，但并不局限于特定的剂型，也就是说本发明所述低剂量的甘草甜素制剂都具备预防和治疗无明确原因的复发性流产的作用，这一点是显而易见的，并应该属于本发明的技术保护范围。
本发明针对母胎免疫耐受异常这一问题，提出了一种新的解决方案，这在解决不明原因复发性流产中起到了关键作用。在正常的怀孕过程中，母体免疫系统将胚胎识别为半同种异体移植物，而不是攻击目标，从而在母胎界面建立免疫耐受。然而，如果出现强烈的炎症反应，可能会破坏这种免疫耐受的平衡，进而可能导致流产。如何调节炎症以达到免疫平衡，一直是免疫学和生殖医学领域的重大挑战。不明原因复发性流产背后的具体病理机制尚不完全明了，可能有多个因素可能导致母胎免疫耐受异常。在临床实践中，虽然免疫疗法显示出一些希望，但在诊断和治疗不明原因复发性流产方面的进展仍然有限。本发明提出了一种创新的方法，将低剂量的甘草甜素添加到了经历不明原因复发性流产的小鼠的饮用水中。这种干预措施已经显示出显著的效果。首先，它降低了胚胎的吸收率，从而有助于预防流产；其次，改善了小鼠蜕膜组织的炎症反应，有效降低了血清和蜕膜组织中的HMGB1(一种与炎症相关的蛋白质)水平。通过降低HMGB1水平，这种干预措施可以防止进一步的炎症反应，最终提高了不明原因复发性流产小鼠的妊娠率。
总的来说，本发明使用低剂量甘草甜素作为HMGB1分子的特异性抑制剂，为解决母胎免疫耐受异常和预防不明原因复发性流产提供了一条新的、有希望的途径。虽然这种干预措施的确切作用机制尚需进一步研究，但其在临床前研究中已经显示出积极的结果，有望在临床实践中得到应用。
附图说明
图1：干预组在合笼前后分别给予小剂量甘草甜素喂养，对照组和URSA组给予同浓度的生理盐水喂养，妊娠第14天解剖小鼠取组织。(A)正常妊娠小鼠、流产小鼠和不同剂量(25、50、100mg/kg/d)的药物治疗小鼠的左右子宫角、胎儿和胎盘。(B)各组胚胎数量统计图。
图2：正常妊娠小鼠、流产小鼠和剂量为50mg/kg/d的药物治疗小鼠的蜕膜组织病理情况。
图3：正常妊娠小鼠、流产小鼠和剂量为50mg/kg/d的药物治疗小鼠血清中HMGB1表达水平。***代表组间差异有显著性(P＜0.001)，**代表组间差异有显著性(P＜0.01)。
图4：正常妊娠小鼠、流产小鼠和剂量为50mg/kg/d的药物治疗小鼠蜕膜组织中HMGB1蛋白表达情况。(A)通过蛋白质印迹分析鉴定HMGB1的蛋白质水平(B)小鼠蜕膜组织中HMGB1的定量数据分析。**代表组间差异有显著性(P＜0.01)，*代表组间差异有显著性(P＜0.05)。图A为造模组蛋白表达增加，治疗组蛋白表达下降。图B是对于图A蛋白表达定量分析的统计数值。
图5：正常妊娠小鼠、流产小鼠和剂量为50mg/kg/d的药物治疗小鼠蜕膜组织HMGB1蛋白分布情况。
具体实施方式
下述实施例是对于本发明内容的进一步说明以作为对本发明技术内容的阐释，但本发明的实质内容并不仅限于下述实施例所述，本领域的普通技术人员可以且应当知晓任何基于本发明实质精神的简单变化或替换均应属于本发明所要求的保护范围。
实施例1
本发明小剂量甘草甜素基于HMGB1分子保护不明原因复发性流产的试验如下：
(1)小剂量甘草甜素靶向HMGB1分子保护不明原因复发性流产技术的实施如下：
从北京华阜康生物科技有限公司购买8-10周龄的雌性CBA/J小鼠和雄性DBA/2J小鼠，同时从安徽医科大学实验动物中心购买8-10周龄的雄性BALB/c小鼠。所有小鼠均在恒温21-23℃、湿度50-60％的标准环境下适应性饲养1周，给予高压灭菌的水和食物。
适应性饲养一周后，将所有的雌性CBA/J小鼠随机分为三组，分别为对照组(Control组，CBA/J♀×BALB/c♂)，造模组(URSA组，CBA/J♀×DBA/2J♂)和治疗组(URSA+GL组，CBA/J♀×DBA/2J♂)，每组6只，然后给每只雌鼠右耳打耳标进行标记，再次适应性喂养一周。(造模组是CBA/J雌鼠与雄性DBA/2J雄鼠其交配易于流产，且原因不明，故常作为URSA小鼠模型。在孕期可观察到雌鼠阴道口有流血现象，在妊娠第14天处死小鼠时可观察有吸收胎，为流产表现)。随后对照组和造模组小鼠均给予高压灭菌的自来水喂养，治疗组中在高压灭菌的自来水中添加100、200、400ug/ml的甘草甜素喂养(对应剂量为25、50、100mg/kg/d，甘草甜素预处理，用于预防)，所有的饮用水每隔两天更换一次，直至小鼠怀孕后一周更换为正常饮水(甘草甜素处理组，用于治疗)。连续喂养7日后，晚上18：00将对照组每两只雌性CBA/J小鼠与一只雄性BALB/c小鼠合笼，造模组每两只雌性CBA/J小鼠与一只雄性DBA/2J小鼠合笼，治疗组每两只雌性CBA/J小鼠与一只雄性DBA/2J小鼠合笼。第二天早上8：00前检查所有雌性小鼠并进行分笼，检测到阴道栓的雌性小鼠记录为妊娠第0天(GD0)。随后，每天观察并记录各组小鼠的食物摄入量、活动、阴道出血和体重情况。所有小鼠在妊娠第14天(GD14)实行安乐死，摘眼球取静脉血室温放置两小时后于4度离心机里3000转离心10分钟吸取上清置于-80摄氏度冰箱备用，同时分离出小鼠子宫、胚胎、胎盘和蜕膜，所有组织分别用4％多聚甲醛固定和-80℃保存。同时统计总胎数和活胎数，吸收胎是胎儿小而黑且伴有坏死和出血。胚胎吸收率计算为吸收胚胎数/总胚胎数×100％。
(2)甘草甜素对不明原因复发性流产小鼠保护效果实施检测如下：
吸收胎检测：
小鼠饲养到妊娠第14天时，使用颈椎脱臼法处死孕鼠，快速摘眼球取血，打开腹腔取出子宫拍照。然后分离出胎儿、胎盘、吸收胎及蜕膜，计数成活的胚胎数和吸收胎数。
H&E染色检测：
小鼠的蜕膜组织用4％多聚甲醛固定24-48小时后，将所有样品分别进行70％、80％、90％、100％的酒精梯度脱水，之后酒精与二甲苯混合液及二甲苯浸泡后进行石蜡包埋，并将蜡块切成3μm厚的石蜡切片。石蜡切片用二甲苯侵泡20分钟，重复一次，之后在100％、90％、80％、70％酒精侵泡2分钟，蒸馏水洗涤两次，苏木精染色3分钟，显微镜下观察颜色适当后流水冲洗5分钟再进行伊红染色2分钟，梯度酒精脱水后显微镜下观察染色效果，然后二甲苯透化30分钟，随后用树脂封片全自动高分辨全景成像分析系统观察所有切片。
血清中HMGB1蛋白含量检测：
摘眼球取小鼠血，室温静置2小时，3000rpm离心10分钟，吸出上清液，-80℃保存备用。然后根据制造商的说明通过ELISA检测试剂盒(武汉云克隆，中国)进一步检测小鼠血清中的HMGB1浓度。
蜕膜组织HMGB1蛋白表达检测：
用裂解缓冲液提取小鼠蜕膜组织，用BCA蛋白定量试剂盒(碧云天，中国)检测蛋白浓度。总裂解物通过10％-12％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。将膜与HMGB1(1:10000稀释)抗体(Abcam，UK)在4℃的振荡器中过夜，β-actin(1:1000稀释，Abcam，UK)用作内参对照。第二天洗涤后用二抗(武汉伊莱瑞特，中国)孵育膜2小时，然后使用ECL检测试剂盒(兰杰柯，中国)进行信号检测。
蜕膜组织HMGB1蛋白分布检测：
将之前做好的小鼠蜕膜石蜡切片，在60℃的烘箱中烘烤2小时，然后用二甲苯和梯度酒精脱蜡。之后切片用2％Triton溶液(生工生物工程，中国，破膜剂，起核上打孔作用)穿透20分钟，然后用柠檬酸钠抗原修复溶液修复。用正常山羊血清工作液(中杉金桥，中国)封闭30分钟后，将切片与HMGB1(1:400稀释)一起在4℃过夜。然后将所有样品与链霉亲和素/过氧化物酶HistostainTM-Plus试剂盒(中杉金桥，中国)一起孵育，并用DAB显色试剂盒(二氨基联苯胺，中杉金桥，中国)染色。切片用树脂密封后，在蔡司显微镜下观察阳性细胞。DAB是辣根过氧化物酶的常用底物。在辣根过氧化物酶的催化下，DAB会产生棕色沉淀。
目前，本发明相关实验在国家卫生健康委配子及生殖道异常研究重点实验室完成。实验研究及结果如下：
对照组小鼠共5只，妊娠小鼠5只，成活胚胎数为34个，吸收胎数为6个，胚胎吸收率为15.00％。
造模组小鼠共5只，妊娠小鼠5只，成活胚胎数为21个，吸收胎数为23个，胚胎吸收率为52.27％。
甘草甜素剂量为25mg/kg/d的治疗组小鼠共5只，妊娠小鼠5只，成活胚胎数为35个，吸收胎数为6个，胚胎吸收率为14.63％。
甘草甜素剂量为50mg/kg/d的治疗组小鼠共5只，妊娠小鼠5只，成活胚胎数为40个，吸收胎数为2个，胚胎吸收率为4.76％。
甘草甜素剂量为100mg/kg/d的治疗组小鼠共5只，妊娠小鼠5只，成活胚胎数为33个，吸收胎数为18个，胚胎吸收率为35.29％。
如图1所示：对照组、造模组及25、50、100mg/kg/d剂量的药物干预组的子宫及胎盘/胎儿情况。其中，对照组小鼠胚胎大小基本一致，颜色红润。在造模组中，有的胚胎及胎盘较小，甚至没有胚胎形成。在三个治疗组中，出现吸收胎的情况较少。与对照组相比，造模组的胚胎吸收率为20.00％，差异有统计学意义(P＜0.001)。与造模组相比，经过甘草甜素治疗后，三组治疗组胚胎吸收率明显下降，分别为14.63％、4.76％、35.29％，差异有统计学意义(P＜0.001)。其中以50mg/kg/d为给药剂量的甘草甜素治疗组的胚胎吸收率下降最为明显，故后续实验中治疗组选择该组小鼠。
如图2所示：URSA小鼠母胎界面有更多免疫细胞浸润。其中，造模组小鼠蜕膜浸润细胞数明显多于对照组，在蜕膜组织中URSA组与对照组相比，细胞密集，排列不规则，细胞核破碎弥漫。然而经过给甘草甜素干预的治疗组明显得到改善。
如图3所示：三组小鼠血清中HMGB1表达水平有差异。其中，造模组小鼠血清HMGB1表达水平高于对照组小鼠，差异有显著统计学差异(P＜0.001)。而经过甘草甜素治疗后HMGB1水平降低，且具有显著统计学意义(P＜0.01)。
如图4所示：三组小鼠蜕膜组织中HMGB1蛋白表达情况有差异。其中，造模组小鼠蜕膜组织中HMGB1表达高于对照组，有显著统计学意义(P＜0.01)。通过给予甘草甜素治疗后，蜕膜组织中HMGB1表达水平明显降低，且有显著统计学意义(P＜0.05)。
如图5所示：三组小鼠蜕膜组织中HMGB1蛋白分布情况有差异。其中，造模组小鼠蜕膜组织中HMGB1分布于细胞核、细胞质以及细胞外，而对照组和治疗组中HMGB1的表达主要集中于细胞核中。
以上结果表明，不明原因复发性流产小鼠在流产模型中血清HMGB1水平升高，小鼠母胎界面的蜕膜组织结果紊乱，有多数细胞浸润，并且HMGB1蛋白由细胞核分布到细胞质及细胞外。通过给予甘草甜素(GL)治疗后，可以下调HMGB1蛋白水平，改善母胎界面环境，进而有效地证明了HMGB1可作为甘草甜素的预防、保护、治疗的靶点在URSA疾病中应用，可为临床URSA患者的预防治疗提供理论依据。
应当说明的是，本发明的上述所述之技术内容仅为使本领域技术人员能够获知本发明技术实质而进行的解释与阐明，故所述之技术内容并非用以限制本发明的实质保护范围。本发明的实质保护范围应以权利要求书所述之为准。本领域技术人员应当知晓，凡基于本发明的实质精神所作出的任何修改、等同替换和改进等，均应在本发明的实质保护范围之内。
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Claims (10)
1.甘草甜素在制备用于预防或治疗不明原因复发性流产药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物中至少含有甘草甜素。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为至少含有甘草甜素的制剂。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述制剂为固体制剂，其中甘草甜素含量为100-400ug/g。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述制剂为液体制剂，其中甘草甜素含量为100-400ug/ml。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述制剂为甘草甜素口服水溶液制剂。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述甘草甜素口服水溶液制剂的配置方法是称取甘草甜素粉末溶于1L高压灭菌水中，使其溶解即可。
8.如权利要求1-7任一项所述的应用，其特征在于，甘草甜素药物给药剂量为25-100mg/kg/d。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，甘草甜素药物给药剂量为50mg/kg/d。
10.如权利要求1-7任一项所述的应用，其特征在于，甘草甜素含量为200ug/ml口服水溶液制剂，给药剂量为50mg/kg/d。
Priority Applications (1)
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| CN202311418047.5A CN117205224A (zh) | 2023-10-30 | 2023-10-30 | 甘草甜素在制备用于预防和治疗不明原因复发性流产药物中的应用 |
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2023
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