CN117202791A - 高品质蛋白浓缩物作为水生有壳动物抗菌剂的用途 - Google Patents

Abstract

本发明描述了通过有氧孵育将植物来源的纤维素和碳水化合物转化为生物可利用的蛋白来产生高品质蛋白浓缩物(HQPC)的基于生物的方法，包括将如此产生的这样的HQPC用作抗菌剂以及将所述HQPC用于水生有壳动物(shellfish)水产养殖食物的饲料配方中。

Description

高品质蛋白浓缩物作为水生有壳动物抗菌剂的用途

发明背景

发明领域

本发明总体上涉及基于植物的蛋白浓缩物，并且特别是对水生有壳动物(shellfish)具有抗微生物特性的高品质蛋白浓缩物，包括治疗水生有壳动物抗弧菌(Vibrio)物种感染的方法。

背景信息

急性肝胰腺坏死综合征(Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome，AHPND)，正式名称为“早期死亡综合征”，是养殖虾的一种破坏性疾病。该疾病与副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)有关，副溶血弧菌传播到西半球并于2013年初在墨西哥出现。自2009年在中国南方报告首例病例以来，亚洲和美洲其他地区的养虾场也观察到了AHPND，并且该疾病爆发对全球虾养殖行业造成了严重损害，每年损失超过10亿美元。2017年，厄瓜多尔报告了首例AHPND病例，副溶血弧菌和创伤弧菌(V.vulnificus)水平为3x10⁴CFU并且死亡率高达100％，同时报告了幼虾在放养后的前20-30天，30％-40％的死亡率。

高密度虾池塘的弧菌流行率较高。先前的缓解策略包括改变动物管理，维持pH水平和定期去除有机物沉积物。

另外，抵消高死亡率的其他手段包括在食物中使用补充剂，包括各种各样的益生菌，以及诸如有机酸、精油、生物分子的产品，并且在一些情况下，还使用了抗生素。另一方面，近年来开发的分子诊断技术使得通过PCR使用特异性引物检测AP4毒素来确定弧菌负荷的存在和定量成为可能。另外，还开发了更特异性的培养基(ChromAgar)来区分各种弧菌菌株的生长。

需要上述缓解策略的更有效的替代来抵消如此高的死亡率，包括开发实用的食物来维持虾的健康。

发明概述

本公开内容涉及一种基于有机的、微生物增强的蛋白的食物，其抑制/减轻虾幼体中的弧菌感染，包括用含有所述微生物增强的蛋白的食物作为预防/减少弧菌感染的手段来治疗虾的方法。

在实施方案中，公开了一种包含发酵农业生物质的饲料组合物，其中该饲料组合物与缺乏发酵农业生物质的相同饲料组合物相比改善了水生有壳动物对与急性肝胰腺坏死综合征(AHPND)/早期死亡综合征(EMS)相关的弧菌物种的抗性。

在一方面，农业生物质是来自选自由以下组成的组的农业生物质的高品质蛋白浓缩物(HQPC)：大豆(soybeans)、高粱(sorghum)、花生(peanuts)、豆类(pulses)、油菜籽(Rapeseeds)、燕麦(oats)、大麦(barley)、黑麦(rye)、羽扇豆(lupins)、蚕豆(favabeans)、油菜(canola)、豌豆(peas)、芝麻(sesame seeds)、棉籽(cottonseeds)、棕榈仁(palm kernels)、大麦(barley)、葡萄籽(grape seeds)、橄榄(olives)、红花(safflowers)、向日葵(sunflowers)、椰干(copra)、玉米(corn)、椰子(coconuts)、亚麻籽(linseed)、榛子(hazelnuts)、小麦(wheat)、水稻(rice)、马铃薯(potatoes)、木薯(cassavas)、豆科植物(legumes)、亚麻荠籽(camelina seeds)、菥蓂籽(pennycressseeds)、芥菜籽(mustard seeds)、小麦胚芽粉(wheat germ meal)、玉米面筋粉(corngluten meal)、玉米面筋饲料(corn gluten feed)、蒸馏/酿酒副产物(distillery/brewery by-products)及其组合，并且其中所述发酵农业生物质在1％和10％(dmb)之间的包含率表现出改善的抗性特性。

在另一方面，农业生物质通过深层发酵用选自由以下组成的组的生物发酵：出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)、克鲁维酵母属物种(Kluyveromyces spp.)、毕赤酵母属物种(Pichia spp.)、乳酸菌、里氏木霉(Trichoderma reesei)、平菇(Pleurotusostreatus)、根霉属物种(Rhizopus spp.)及其组合。

在一方面，生物是真菌。在相关方面，真菌是出芽短梗霉。

在另一方面，农业生物质来自大豆。

在一方面，弧菌物种包括溶藻弧菌(V.alginolyticus)、副溶血弧菌、哈维氏弧菌(V.harveyi)、创伤弧菌、魔鬼弧菌(V.diabolicus)、海鱼弧菌(V.damsella)、费氏弧菌(V.fischeri)、鳗弧菌(V.anguillarum)、坎氏弧菌(V.campbelli)、V.pelagicus、东方弧菌(V.orientalis)、奥氏弧菌(V.ordalii)、地中海弧菌(V.mediterranei)和火神弧菌(V.logei)。

在另一方面，组合物中的发酵农业生物质含量为饲料组合物的干重的约1％和10％之间。

在相关方面，水生有壳动物包括Kadal虾、奋进虾(endeavour shrimp)、油背虾(greasyback shrimp)、斑点虾(greasyback shrimp)、北方褐虾(northern brownshrimp)、肉质对虾(fleshy prawn)、褐虎对虾(brown tiger prawn)、印度明对虾(Indianwhite prawn)、日本囊对虾(Kuruma prawn)、caramote对虾、香蕉对虾(banana prawn)、巨虎对虾(giant tiger prawn)、南方粉红虾(southern pink shrimp)、圣保罗虾(Sao Pauloshrimp)、红尾对虾(redtail prawn)、南方白虾(southern white shrimp)、绿虎对虾(Green tiger prawn)、北方白虾(Northern white shrimp)、蓝虾(Blue shrimp)、南方褐虾(Southern brown shrimp)、白脚虾(Whiteleg shrimp)、Atlantic seabob、秋酱虾(Akiami paste shrimp)、季风河对虾(Monsoon river prawn)、巨河对虾(giant riverprawn)、普通对虾(common prawn)、美洲龙虾(American lobster)、欧洲龙虾(Europeanlobster)、贵族螯虾(noble crayfish)、多瑙河螯虾(Danube crayfish)、信号螯虾(signalcrayfish)、红沼泽螯虾(red swamp crawfish)、yabby螯虾、红爪螯虾(red clawcrayfish)、马龙螯虾(marron crayfish)、长腿多刺龙虾(longlegged spiny lobster)、三疣梭子蟹(gazami crab)、锯缘青蟹(Indo-Pacific swamp crab)、中国河蟹(Chineseriver crab)及其组合。

在另外的相关方面，所述水生有壳动物是虾，并且其中所述虾是中南美白对虾(Litopenaeus vannamei)。

在实施方案中，公开了一种预防(preventing)、治疗水生有壳动物中由弧菌物种引起的急性肝胰腺坏死综合征(AHPND)/早期死亡综合征(EMS)或针对水生有壳动物中由弧菌物种引起的急性肝胰腺坏死综合征(AHPND)/早期死亡综合征(EMS)提供预防(providinga prophylactic)的方法，包括在水产养殖池塘或水箱进行放养后20-30天内给虾幼体饲喂包含高品质蛋白浓缩物(HQPC)的饲料组合物。

在一方面，饲料组合物的HQPC含量为饲料组合物的干重的1％和10％之间，并且其中水生有壳动物以高放养密度或超密集放养密度存在。

在相关方面，方法还包括从饲喂的水生有壳动物中选择样品，并分离虾幼体浸渍物(macerates)，其中评价浸渍物中弧菌物种的存在。

在另外的相关方面，通过PCR经由AP4毒素的检测或通过确定表现出与AHPND/EMS相关的疾病体征的水生有壳动物幼体中的细菌减少来评价所述浸渍物。在仍另外的相关方面，其中用于PCR的引物包括SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24中列出的序列。

在一方面，饲料包含与HQPC混合的以下中的一种或更多种：鱼粉、家禽副产物粉、干酒糟和可溶物、玉米面筋粉和大豆粉，其中所述HQPC包含含有低短梗霉聚糖产率的出芽短梗霉的发酵植物产物和至少约65％至约75％的蛋白含量(dmb)，其中所述HQPC表现出包括以下的一种或更多种特性：至少约2％的水解度(DH)、至多约4％的灰分含量或小于约0.1ppm的钾和镁含量。

在一方面，弧菌物种包括溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、魔鬼弧菌、海鱼弧菌、费氏弧菌、鳗弧菌、坎氏弧菌、V.pelagicus、东方弧菌、奥氏弧菌、地中海弧菌和火神弧菌。

在另一方面，水生有壳动物包括Kadal虾、奋进虾、油背虾、斑点虾、北方褐虾、肉质对虾、褐虎对虾、印度明对虾、日本囊对虾、caramote对虾、香蕉对虾、巨虎对虾、南方粉红虾、圣保罗虾、红尾对虾、南方白虾、绿虎对虾、北方白虾、蓝虾、南方褐虾、白脚虾、Atlanticseabob、秋酱虾、季风河对虾、巨河对虾、普通对虾、美洲龙虾、欧洲龙虾、贵族螯虾、多瑙河螯虾、信号螯虾、红沼泽螯虾、yabby螯虾、红爪螯虾、马龙螯虾、长腿多刺龙虾、三疣梭子蟹、锯缘青蟹、中国河蟹及其组合。在相关方面，所述水生有壳动物是虾，并且其中所述虾是中南美白对虾。

在实施方案中，公开了HQPC在产生预防、治疗水生有壳动物中急性肝胰腺坏死综合征(AHPND)/早期死亡综合征(EMS)或针对水生有壳动物中急性肝胰腺坏死综合征(AHPND)/早期死亡综合征(EMS)提供预防的药物饲料中的用途，其中药物饲料包含与HQPC混合的以下中的一种或更多种：鱼粉、家禽副产物粉、干酒糟和可溶物、玉米面筋粉和大豆粉，其中HQPC包含通过深层发酵获得的含有低短梗霉聚糖产率的出芽短梗霉的发酵植物产物和至少约65％至约75％的蛋白含量(dmb)，并且其中HQPC表现出包括以下的一种或更多种特性：至少约2％的水解度(DH)、至多约4％的灰分含量或小于约0.1ppm的钾和镁含量。

在一方面，HQPC相对于产生它的饲料原料表现出原始NIR光谱在4664cm^-1和4836cm^-1之间的向下迁移。

附图简述

图1示出了HQSPC转化方法的流程图。

图2示出了用于水产饲料的HQSPC转化方法的流程图。

图3示出了评价HQSPC组成和产率的工作台规模、扩展的孵育试验。

图4示出了用于水产饲料的HP-DDGS转化方法的流程图。

图5示出了在100℃挤压HP-DDGS后水分含量和挤压速度对葡萄糖回收率的作用。

图6示出了本文公开的单独HQPC方法的概述。

图7示出了离心液1的详细信息。

图8示出了离心液4的详细信息。

图9示出了图6中概述的增值产物。

图10示出了不同SBM饲料原料样品的原始光谱。x轴是波数，并且y轴是以吸光度单位(AU)计的强度。

图11示出了从图10的SBM样品制成的不同HQPC产物的原始光谱。x轴是波数，并且y轴是以AU计的强度。

图12：饲喂包含HQPC(25％)的食物与鱼粉食物的虹鳟鱼的最终体重(g)。

图13a：饲喂HQPC的银鲑(Coho salmon)的周生长率(g)表现。

图13b：饲喂HQPC的银鲑的饲料转化率(FCR)。

图14：饲喂包含HQPC的人工饲料的首次饲喂的中南美白对虾(L.vannamei)幼体(Z3-PL13)的存活率。

图15：饲喂包含HQPC的人工饲料的中南美白对虾幼体的平均体重(g)。

图16：在EMS攻击后第10天饲喂包含HQPC的人工饲料的中南美白对虾幼体的存活率(％)。共享相同上标的平均值彼此之间没有显著差异(Tukey’s HSD，P<0.05)。

图17：示出了HQPC对副溶血弧菌的抑制活性。

图18：示出了使用TCBS和虾幼体浸渍物，在1％和2％的HQPC活性加对照的照片。

图19：示出了使用ChromAgar和虾幼体浸渍物，在0.5％的HQPC活性加对照的照片。

图20：示出了在HQPC以1％和2％的包含水平存在的情况下；在ChromAgar Vibrio中孵育0hr、6hr、12hr、18hr、24hr的副溶血弧菌的抑制(％)的图。

图21：示出了在HQPC以5％、10％和15％的包含水平存在的情况下；在ChromAgarVibrio中孵育的副溶血弧菌的抑制(％)的图。

图22：示出了副溶血弧菌PCR扩增的照片。泳道1，MPM；泳道2、3(PCR阳性)；泳道4-6(PCR，阴性)；泳道7，Cext；泳道8，C+PCR；泳道9，CPCR。

图23：是示出在存在1％和2％包含水平的HQPC的情况下在TSB中孵育的三种商业益生菌的抑制(％)的图。

图24：是示出来自虾饲喂试验的存活率的图。

发明详述

在描述本发明组合物、方法和方法论之前，应理解本发明不限于所描述的特定组合物、方法和实验条件，因为这样的组合物、方法和条件可以变化。还应理解本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并非旨在限制，因为本发明的范围将仅在所附的权利要求书中限定。

除非上下文另外清楚地指明，否则如本说明书和所附的权利要求书中使用的单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指示物。因此，例如，提及“制剂”包括一种或更多种本文描述的类型的制剂和/或组合物，其对本领域技术人员而言在阅读本公开内容等后将变得明显。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域内的普通技术人员通常理解的相同含义。与本文所描述的那些方法和材料相似或等价的任何方法和材料可被用于本发明的实践或测试，因为应该理解，修改和变化被包括在本公开内容的精神和范围内。

如本文所用，“约”、“大约”、“实质上(substantially)”和“显著”将被本领域普通技术人员理解，并将根据其中使用它们的上下文而在一定程度上变化。如果存在考虑其中使用该术语的上下文，对于本领域普通技术人员来说不清楚的该术语的使用，则“约”和“大约”将意指特定术语的加或减<10％，并且“实质上”和“显著”将意指特定术语的加或减>10％。

使用如描述的微生物增强的蛋白开发用于RAS运行的实际的食物的内部研究显示，如本文公开的HQPC是用于生产生态友好型水产养殖饲料的有前景的解决方案。除了具有超过70％的粗蛋白含量和高可用磷含量之外，本文公开的HQPC可以由非GM大豆制备，这使其成为欧洲水产行业的完美匹配。

来自大量内部饲喂试验的结果显示，本文公开的HQPC可以维持鱼和虾的健康、高性能生长和饲料功效，其包含水平处于高达食物中成分总量的70％的超剂量水平。使用虹鳟鱼、尖吻鲈(Barramundi)和银鲑的饲喂试验显示，饲喂所公开的基于HQPC的饲料的鱼始终比饲喂对照饲料的鱼更高效地利用饲料。当饲喂包含高达25％水平的如公开的HQPC的食物时，使用在RAS系统中饲养的那些物种进行的试验显示良好的生长速率以及减少的饲料转化率。

可持续RAS面临的一个核心问题涉及两个相互关联的限制，经营者必须平衡这两个限制，以成功经营水产养殖运行。第一个限制涉及对限制鱼或虾生产的当今水再利用系统的理解。第二个限制集中在可持续的鱼饲料上，其中在这样的当今的水再利用系统中使用基于大豆的饲料使它们的管理更加困难。由此产生的情况要求当今的水产养殖者平衡每个限制的风险-利益，以便实现盈利以及满足其客户的需求。

尽管急性肝胰腺坏死综合征(AHPND)/早期死亡综合征(EMS)疾病已被鉴定，并且通过摄入传播，但似乎以下状况包括在疾病的发病和流行中：

1.高放养密度；

2.物种敏感性；

3.近海区域中水的高盐度；

4.养虾场缺乏储库池塘和水处理；

5.缺乏对池塘准备过程的关注；

6.虾后期幼体在运输或储存期间的应激；

7.低氧条件；以及

8.饲料管理不善。

如本文公开的，饲料组合物中低水平的HQPC包含(例如，在约1％至约10％之间)可以用作针对弧菌的有效抗菌剂来保护水生有壳动物，即使在高放养密度下也是如此。

为RAS系统配制低鱼粉水产养殖饲料需要使用几种成分的组合，因为大多数饲料已显示具有显著的营养和功能限制。植物成分发酵可以减少抗营养因子，并增强消化率。虽然不受理论约束，但在本公开内容中观察到的饲喂HQPC的鱼和虾的生长表现的显著差异可能是由于抗营养因子的消除和增加的成分消化率。如本文示出的结果表明，至少80％的食物鱼粉可以直接由商业饲料中描述的HQPC替代，用于尤其是虾幼体和几种幼鱼和成鱼物种。

如本文所用，术语“动物”意指属于动物界的任何生物体，且包括但不限于，人类、鸟类(例如家禽)、哺乳动物(例如人类、牛、猪、山羊、绵羊、猫、狗、小鼠和马)以及水产养殖生物，诸如鱼(例如鳟鱼、鲑鱼、鲈鱼)、软体动物(例如蛤)和甲壳类动物(例如螃蟹、龙虾、对虾和虾)。

术语“鱼”的使用包括所有脊椎动物鱼，其可以是硬骨鱼或软骨鱼。

如本文所用，“弧菌物种”包括但不限于，溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、魔鬼弧菌、海鱼弧菌、费氏弧菌、鳗弧菌、坎氏弧菌、V.pelagicus、东方弧菌、奥氏弧菌、地中海弧菌和火神弧菌。

如本文所用，“基于非动物的蛋白”意指该物质包含至少0.81g粗纤维/100g组合物(基于干物质)，其中粗纤维主要是作为植物物质的化学分析的残渣获得的纤维素和木质素材料。

如本文所用，虾的“低放养密度”意指在池塘或水产养殖水箱中5个至25个个体/m²。

如本文所用，虾的“中等放养密度”意指在池塘或水产养殖水箱中25个至100个个体/m²。

如本文所用，虾的“高放养密度”意指在池塘或水产养殖水箱中100个至500个个体/m²。

如本文所用，虾的“超密集放养密度”意指在池塘或水产养殖水箱中大于500个个体/m²。

如本文所用，“孵育方法”意指用于细菌或细胞的生长和发育的适当条件的提供，其中这样的细菌或细胞使用生物合成途径以代谢各种饲料原料。在实施方案中，孵育方法可以在例如有氧条件下进行。在其他实施方案中，孵育方法可以包括发酵。

如本文所用，“深层发酵(submerged fermentation)”意指其中酶和其他反应性化合物浸没在液体诸如醇、油或营养培养液中的制造生物分子的方法。

如本文所用，术语“孵育产物”意指由孵育方法/反应直接得到的任何残余物质。在一些情况下，孵育产物包含微生物使得其相比缺乏这样的微生物的孵育产物具有增强的营养物含量。孵育产物可以包含来自孵育培养液(incubation broth)的合适成分。例如，孵育产物可以包括来自孵育培养液的溶解的和/或悬浮的成分。悬浮的成分可以包括未溶解的可溶成分(例如，其中溶液是含有一种或更多种组分(诸如蛋白)的超饱和的)和/或存在于孵育培养液中的不溶性物质。孵育产物可以包括在孵育结束时存在的基本上全部的干固体(例如，通过喷雾干燥孵育培养液和通过孵育产生的生物质)，或可以包括它们的一部分。孵育产物可以包括来自孵育的粗物质，其中微生物/固体/离心液/块状物可以被分级和/或部分纯化以增加物质的营养物含量。

如本文所用，“转化培养物(conversion culture)”意指包含在培养基中的微生物培养物，培养基包含足以使微生物生长的物质，例如水和营养物。术语“营养物”意指任何具有营养价值的物质。营养物可以是动物饲料、用于动物的食品或食品补充剂的一部分。示例性营养物包括但不限于蛋白、肽、脂肪、脂肪酸、核酸、脂质、水溶性和脂溶性维生素、必需氨基酸、碳水化合物、甾醇、酶和微量矿物质，诸如磷、铁、铜、锌、锰、镁、钴、碘、硒、钼、镍、氟、钒、锡、硅及其组合。

转化是在适于将蛋白/碳水化合物/多糖物质(例如大豆成分)转化为高品质蛋白浓缩物的条件下，在转化培养物中培养微生物的过程。充分转化包括但不限于利用90％或更多的特定碳水化合物来产生微生物细胞物质(cell mass)和/或胞外多糖、酶和微生物代谢物，特定的寡糖浓度降低，实现蛋白的选定水解度，观察到NIR光谱中在4664cm^-1和4836cm^-1或其组合之间特定的变化％。在实施方案中，转化可以是有氧或无氧的或其组合。

如本文所用，“絮凝剂”或“清除剂”是促进胶体通过聚集从悬浮液中分离的化学物质，并且包括但不限于多价离子和聚合物。在实施方案中，这样的絮凝剂/清除剂可以包括生物絮凝剂，诸如胞外多糖(例如短梗霉聚糖(pullulan))。

如本文所用，“制剂”意指根据特定处方制备的物质或混合物。

如本文所用，“食品”意指适于作为人类或动物食用或饮用或植物吸收以维持生命和生长的营养组合物来消耗的物质。

如本文所用，“离心液(centrate)”意指在取出大部分固体后离开流体动力应用的液体，所得的干产物称为“块状物(cake)”。

如本文所用，“悬浮液”意指包含足够大以供沉降的固体颗粒的非均质混合物。

如本文所用，“蒸发”意指从液体转变成蒸汽的过程。蒸发和蒸馏之间的主要区别在于，蒸发是涉及物质状态变化的过程，而蒸馏是分离过程。这两种过程都可以用于各种目的。蒸发中的汽化发生在沸点以下，而蒸馏中的汽化发生在沸点。

如本文所用，“胞外多糖”意指由微生物产生并释放到周围环境中的包含糖残基的高分子量聚合物，高分子量聚合物包括合成代谢产物和代谢产物。

如本文所用，“水解度(DH)”意指蛋白水解物中裂解的肽键的比例。存在几种确定DH的方法；其中最常用的包括pH-stat、三硝基苯磺酸(TNBS)，o-邻苯二甲醛(OPA)、三氯乙酸可溶性氮(SN-TCA)和甲醛滴定方法。

如本文所用，“胰蛋白酶抑制剂单位(TIU)”意指样品中胰蛋白酶抑制剂的量。例如，方法可以使用N-苯甲酰基-DL-精氨酸对硝基苯胺作为胰蛋白酶的显色底物，并且利用大豆粉提取物的等分试样抑制胰蛋白酶对该底物的活性的能力来估计大豆粉样品中胰蛋白酶抑制剂的量。在10分钟孵育期间形成的对硝基苯胺的量通过分光光度法测量，并且在存在和不存在大豆提取物的情况下的吸光度值用于计算，给出每克原始大豆样品的胰蛋白酶抑制剂单位(TIU)的数值。

如本文所用，“AP4毒素”是指Pir^vpA基因产物(参见例如GenBank登录号A0551083.1)。

如本文所用，“肉类替代品”或“肉类类似物”意指接近特定肉类的某些美学品质(主要是质地、风味和外观)或化学特征的组合物。在实施方案中，这样的替代品或类似物包括但不限于，基于乳品的：坡尼尔奶酪、格拉摩根香肠、坡尼尔；真菌来源的：可食用蘑菇、真菌蛋白、牛舌菌(fistulina hepatica)、荷叶离褶伞(lyophyllum decastes)；基于水果的：天贝、面包果、椰子汉堡、绿色菠萝蜜果肉、茄子、菠萝蜜；豆科植物：缅甸豆腐、炸豆丸、雁拟豆腐、高野豆腐(koya-dofu)、盎康(红色盎康和黑色盎康)、天贝汉堡、纹理植物蛋白、豆腐火鸡或人造火鸡、素食培根、素食热狗、素食香肠和素食汉堡。在一方面，本文公开的蛋白浓缩物与肉类替代品组合。

如本文所用，“NIR(近红外光谱法)”是用于确定蛋白含量的非侵入性检测方法。材料的原始NIR光谱是由衍生自光谱的IR区域中的基本振动的组合和谐波(overtone)条带产生的，并且可以被认为是材料的独特指纹。

如本文所用，“流体动力”意指作用在浸没在流体中并相对于所述流体运动的固体上的能量。在相关方面，这样的力可以通过处理(包括但不限于离心和过滤)施加。

如本文所用，“纤维素解构酶”意指通过水解尤其是线性葡萄糖β-1,4-连接聚合物的糖苷键产生葡萄糖和其他简单糖(simple sugar)或复合糖(complex sugar)的酶。

如本文所用，“消泡剂(antifomate)”或“消泡剂(defoamer)”，包括其语法变化，是减少和阻止工业过程液体中泡沫形成的化学添加剂。在相关方面，这样的化学物质包括但不限于基于油的消泡剂；粉末消泡剂；基于水的消泡剂、基于硅的消泡剂；基于EO/PO的消泡剂和烷基聚丙烯酸酯。在相关方面，这样的消泡剂包括设计成控制含水食品罐装过程中的泡沫的基于水的食品级乳液、利用消泡聚合物和可生物降解油的非含水无硅酮消泡剂、以及设计成破坏含水环境(包括食品制造、发酵、农业和工业级过程)中的泡沫的食品级100％活性食品级kosher消泡剂。

如本文所用，“预测表观蛋白消化率(PPD)”是对不同饲料成分，体内表观蛋白消化率(APD)与消化酶的体外蛋白消化(例如水解度)之间的回归计算的量度。

如本文所用，“室温”在标准压力下为约25℃。

如本文所用，“APD”是摄入氮和粪便氮之差与摄入氮之间的比值的量度，以百分比表示。

如本文所用，“发酵农业生物质”意指由已经与一种或更多种微生物(包括但不限于细菌和真菌)一起孵育的基于植物的材料产生的产物。

如本文所用，“HQPC”意指来自一种或更多种发酵的基于植物的材料的高品质蛋白浓缩物。这样的HQPC可以单独或与其他饲料或饲料原料成分、益生菌或其成分组合用作饲料、原料，包括用作向动物递送营养制品和/或药物的手段。在实施方案中，HQPC的蛋白含量可为约60％至约65％、约65％至约70％、约70％至约75％或更高(基于干物质(dmb))。

如本文所用，“溶剂”意指其他物质溶解在其中形成溶液的物质，通常是液体。极性溶剂(例如水、水溶液)有利于离子的形成；非极性溶剂(例如碳氢化合物)不会。溶剂可以主要是酸性的、主要是碱性的、两性的或非质子的。用作溶剂的有机化合物包括但不限于芳香族化合物和其他烃类、醇类、酯类、醚类、酮类、胺类以及硝化和卤代烃类。

植物蛋白来源

大量植物蛋白来源可以结合本公开内容用作用于转化的饲料原料。在饲料行业中使用植物蛋白的主要原因是为了替代更昂贵的蛋白来源，如动物蛋白来源。另一个重要因素是通过向相同物种的动物饲喂动物蛋白而传播疾病的危险。

植物蛋白来源的实例包括，但不限于，来自以下的蛋白：豆科(Fabaceae)植物，如大豆和花生所示例的；十字花科(Brassiciaceae)植物，如油菜所示例的；棉籽；菊科(Asteraceae)植物，包括但不限于向日葵，和棕榈科(Arecaceae)植物，包括椰干。这些蛋白来源，通常也被定义为油籽蛋白，可以整个饲喂，但它们更常见的是作为取出油后的副产物饲喂。其它植物蛋白来源包括来自以下的植物蛋白来源：禾本科(Poaceae)，也被称为禾本科(Gramineae)，像谷类和谷物特别是玉米、小麦和水稻，或其它主要作物诸如马铃薯、木薯和豆科植物(豌豆类(peas)和菜豆属植物(beans))，一些碾磨副产物包括胚芽粉或玉米面筋粉、或蒸馏/酿酒副产物。在实施方案中，蛋白的饲料原料包括但不限于来自以下的植物材料：大豆、高粱、花生、豆类、油菜籽、燕麦、大麦、黑麦、油菜、芝麻、棉籽、棕榈仁、葡萄籽、橄榄、红花、向日葵、椰干、玉米、椰子、亚麻籽、榛子、小麦、水稻、马铃薯、木薯、豆科植物、菥蓂籽、亚麻荠籽、芥菜籽、小麦胚芽粉、玉米面筋粉、玉米面筋饲料、蒸馏/酿酒副产物及其组合。

据报道，在养殖业中使用的主要植物来源的蛋白包括但不限于大豆粉(SBM)、玉米面筋粉、油菜籽/油菜(芸苔属物种(Brassica sp.))粉、羽扇豆(羽扇豆属物种(Lupinussp.))，例如，去壳的白羽扇豆(白羽扇豆(Lupinus albus))、甜羽扇豆(狭叶羽扇豆(L.angustifolius))和黄羽扇豆(黄羽扇豆(L.luteus))的豆仁粉中的蛋白、向日葵(Helianthus annuus)种子粉、结晶氨基酸；以及豌豆粉(豌豆(Pisum sativum))、棉籽(棉属物种(Gossypium sp.))粉、浮萍亚科(Lemnoidae)(浮萍或水扁豆)、花生(groundnut；Arachis hypogaea)粉和油渣饼、大豆蛋白浓缩物(SPC)、大豆蛋白分离物(SPI)、玉米(Zeamays)面筋粉和小麦(Triticum aestivum)面筋、马铃薯(Solanum tuberosum L.)蛋白浓缩物以及其它植物饲料如辣木(Moringa oleifera Lam.)叶，全部以各种浓度和组合。

蛋白来源可以呈未经处理的植物材料的形式和处理和/或提取的植物蛋白的形式。作为实例，热处理的大豆产物具有较高的蛋白消化率。

蛋白材料包括任何类型的蛋白或肽。在实施方案中，可以使用大豆材料或类似材料，诸如全大豆。全大豆可以是标准的、商品化的大豆；以某种方式已被遗传修饰(GM)的大豆；或非GM身份保留(IP)的大豆。示例性的GM大豆包括，例如，被工程化以产生除了水苏糖和棉子糖外的碳水化合物的大豆。示例性的非转GM大豆包括，例如，为了低碳水化合物和低胰蛋白酶抑制而品系选育的Schillinger品种。高蛋白品种包括但不限于N2358(BensonHill Inc.,St.Louis,MO)。

其他类型的大豆材料包括大豆蛋白粉、大豆蛋白浓缩物、大豆粉和大豆蛋白分离物或其混合物。全大豆向其它形式的大豆蛋白(诸如大豆蛋白粉、大豆蛋白浓缩物、大豆粉、和大豆蛋白分离物)的传统加工，包括使清洁的、生的全大豆破裂为数块，典型地六(6)至八(8)块，以产生大豆片和壳，然后将壳去除。然后将大豆片置于约60℃的条件，并切为约0.25毫米厚度。然后用惰性溶剂，诸如烃类溶剂，通常是己烷，在几种类型的逆流提取系统之一中提取所得到的粕，以取出大豆油。对于大豆蛋白粉、大豆蛋白浓缩物、和大豆蛋白分离物，重要的是，以使大豆蛋白的蒸煮(cooking)或烘烤的量最小化的方式将粕脱溶剂，以保持水溶性大豆蛋白的高含量。这通常是通过使用蒸气脱溶装置或闪蒸脱溶装置(flashdesolventizer)完成的。从该方法获得的粕，一般称为“可食用脱脂粕”或“白大豆(豆)粕”。

白大豆粕是大豆蛋白粉、大豆蛋白浓缩物、和大豆蛋白分离物的起始原料，具有大约50％的蛋白含量。白大豆粕然后被碾磨，通常在开环研磨系统中，通过锤式碾磨机、级分碾磨机、滚筒碾磨机或冲击销碾磨机首先碾磨成粗粉(grit)，并以另外的研磨，成为具有期望的粒径的大豆粉。通常使用筛选以将产物尺寸调节至均匀的粒径范围，并可以以振动筛或圆筒状离心筛完成。其它油籽可以以类似的方式被加工。

除了大豆球蛋白(glycinin)和β-伴大豆球蛋白外，大豆还包含少量但非常重要的2S白蛋白储存蛋白。大豆还包含生物活性或代谢蛋白，诸如酶、胰蛋白酶抑制剂、血凝素和与木瓜蛋白酶非常相似的半胱氨酸蛋白酶。

虽然大豆产物具有高的蛋白消化率，但是，即使消除了热不稳定的抗营养物质，例如用于肉食性鱼类的食物中包含的全脂或脱脂大豆粉的上限包含水平在20％-30％的包含水平之间。在鱼类中，大豆蛋白已经显示，用超过30％的蛋白浓度包含水平饲喂鱼类造成肠道损伤，且通常降低不同的鱼类物种的生长表现。事实上，由于这些影响，大多数养殖者不愿意在总食物中使用多于10％的植物蛋白。

本发明解决了这个问题，并允许植物蛋白包含水平高达40％或甚至50％，取决于，除了其他因素以外，被饲喂的动物物种、植物蛋白来源的来源、不同植物蛋白来源的比例、蛋白浓度、和葡聚糖和/或甘露聚糖的量、来源、分子结构和浓度。在实施方案中，植物蛋白包含水平高达40％、优选高达20％或30％。通常，存在于食物中的植物蛋白是在5％和40％之间，优选在1％和2％之间，1％和5％之间，5％和10％之间，10％至15％之间，或15％和30％之间。这些百分比界定在动物饲料或食物中的总植物蛋白来源的百分比量，这包括脂肪、灰分等，并且可以为不同的目的而配制。在实施方案中，纯蛋白水平高达50％、典型地高达45％、在实施方案中为5％-95％。

在总饲料或食物中的植物蛋白与其它蛋白的比例可以是5:95至95:5、15:85至50:50或25:75至45:55。

除了饲料食物之外，本文公开的HQPC可以被配制从而与肉类替代品一起使用。在实施方案中，HQPC可以与发酵的基于大豆的产物组合。发酵的基于大豆的产物的实例包括但不限于解冻和切片的冷冻豆腐；盎康，印度尼西亚西爪哇(巽他)烹饪的传统主食之一，存在两种类型：红色盎康和黑色盎康(盎康与天贝密切相关；两者都是使用霉菌发酵的食品)；大豆蛋白；豆渣(soy pulp)，用于素食汉堡和炸丸子)；天贝，一种由发酵大豆制成的传统印度尼西亚大豆产品；纹理植物蛋白，一种脱脂大豆粉产品，是提取大豆油的副产物(常常用作肉类类似物或肉类增量剂，蛋白含量与某些肉类相当)；豆腐(虽然在亚洲传统上不被视为肉类替代品，但在西半球广泛用于该目的)；和豆腐火鸡，人造火鸡，一种素食蛋白条(loaf)或炖烧菜(casserole)形式的肉类替代品，通常由豆腐(大豆蛋白)或面筋(seitan)(小麦蛋白)制成，具有由谷物或面包制成的馅料，用肉汤调味，并用香草和香料调味；坡尼尔奶酪；格拉摩根香肠；蘑菇，包括但不限于牛舌菌、绚孔菌(Laetiporus)和荷叶离褶伞；面包果；椰子汉堡(由传统椰奶提取的椰子肉副产品sapal制成)；茄子；菠萝蜜；炸豆丸；以及雁拟豆腐。

在实施方案中，所公开的HQPC组合的发酵大豆产物可以单独用作肉类替代品，或可以与其他肉类替代品或肉类类似物组合以产生供人类食用的各种产品，包括包含以上实例的各种组合。在一方面，HQPC的添加与各种肉类替代品和/或肉类类似物组合，以改善所述肉类替代品和/或肉类类似物的质地、香气、口感、咬嚼感、松脆度、风味或外观。这样的美学可以例如使用Caswell的食品质量分类来确定(参见例如Caswell，J Agr Res Econ(1998)42:409-474)。

微生物

公开的微生物必须能够在本文公开的方法中将碳水化合物和其他营养物转化为高品质蛋白浓缩物。在实施方案中，微生物是酵母样真菌。酵母样真菌的实例是出芽短梗霉。其他实例微生物包括酵母，诸如克鲁维酵母(Kluyveromyces)和毕赤酵母属物种(Pichia spp)，乳酸菌，里氏木霉(Trichoderma reesei)、平菇(Pleurotus ostreatus)、根霉属物种(Rhizopus spp)以及许多类型的木质纤维素降解微生物。通常，示例性微生物包括那些可以代谢水苏糖、棉子糖、淀粉、葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、木糖和其他糖类的微生物。然而，基于所公开的方法，在本领域技术人员的能力范围内，无需过多的实验，就可以选择其他适当的微生物。

在实施方案中，微生物表现出低的胞外多糖(例如，短梗霉聚糖)产生，例如，当在包含酵母提取物(YE)的培养基(其中YE(作为氮源)以0.35g/L和0.5g/L之间存在)中生长时，低的短梗霉聚糖产率被认为小于约3.0g/L(参见例如Leathers等人，J Indus Micro(1988)3：231-239；第232页，第2栏，第三段，和表3，通过引用并入本文)。虽然不受理论约束，但高的胞外多糖生产者产生可能难以干燥(例如，延长干燥时间)的最终产物和/或在干燥后产生粘性产物。可以使用如Leathers等人((1988)，在第232页第1栏，第三段桥接到第2栏，第一段；通过引用并入本文)公开的确定短梗霉聚糖含量的方法，然而，本领域技术人员将认识到替代方法是可用的。

在实施方案中，出芽短梗霉适应转化期间遇到的各种环境/应激。在一方面，出芽短梗霉菌株选自NRRL保藏号Y-2311-1、Y-6754a、YB-4026、YB-4588、Y-6992、Y-17000或Y-17001及其组合。在相关方面，如本文所公开的，可以使用由NRRL保藏号Y-2311-1表示的出芽短梗霉菌株。

在相关方面，可以使用PCR鉴定微生物。在实施方案中，可以通过将引物导向以下编码α-阿拉伯呋喃糖苷酶(Genbank登录号：AY495375)的核酸序列来靶向生物体：

(SEQ ID NO:1)：

在相关方面，可以使用下列引物：

/>

在一方面，引物对可以单独使用或与彼此或与其他引物对组合使用。在另一方面，引物对可以用于追踪和鉴定通过本文描述的方法制成的产物的来源。PCR可以通过标准方法进行(参见，例如，美国专利第4,800,159号，通过引用并入本文)，尽管替代PCR方法对于本领域技术人员来说将是明显的。

虽然不受理论约束，但已经观察到，最终产物的粘度似乎取决于作为发酵结果产生的新物质，例如，仅在植物材料包含被产生高粘度产生性的、依赖于基于植物的底物发酵的非短梗霉聚糖产物(新型粘度增加性胞外多糖)的微生物代谢的底物的情况下才存在的胞外多糖。因此，低胞外多糖/短梗霉聚糖生产生物体可以可选地通过使用不产生新型粘度增加性胞外多糖的生物体来替代。

生产方法

在示例性实施方案中，在任选的预处理(例如，为了增加营养物对细胞的可用性，去除糖等)之后，基于植物的材料可以在一个或更多个混合罐中以至少5％的固体加载率与水和/或离心液混合以形成糊状物，其中pH被调节至4.5-4.9。在一方面，pH为4.8。可以用硫酸和/或消泡剂处理糊状物，然后施加流体动力以将悬浮液分离成块状物和离心液。可以用一种或更多种溶剂(例如，水或离心液)进一步洗涤块状物，然后转移到蒸煮管-冷却器串联装置，其中在蒸煮管中的驻留时间可以变化。蒸煮管中的温度可变化至高达121.1℃，并且驻留时间可以从0分钟至长达2分钟变化。在一方面，驻留时间为约1.5min。

冷却至约30℃后，将冷却的糊状物转移至一个或更多个发酵罐容器中，并且接种物出芽短梗霉可以添加到糊状物中，其中所得的接种的糊状物可以孵育约7h至约10h、约10h至约14h、约14h至约20h、或约7h至约24h，或直至实现2％至80％蛋白的水解度(DH)。虽然不受理论约束，但DH基本上是由于酶水解而不是热解，包括DH可以随着来自培养液罐的离心液的另外循环利用而更大。接种体积(例如，来自60hr接种培养物，大约在约1×10¹至约100×10⁹CFU/ml之间)可以是一个或更多个发酵罐容器的工作体积的约1％。在相关方面，接种的细胞可以具有基本上单细胞的形态，并且虽然不受理论约束，但使用基本上丝状形态的细胞可以导致对氧和其他营养物的获取减少。在孵育期间，无菌空气可以以0.5-1L/L/h的流量引入反应器中。在实施方案中，转化培养物通过与基于植物的材料一起孵育小于约12小时而经历转化。在实施方案中，转化培养物将孵育约7小时和约14小时之间。转化培养物可以在约24℃-35℃孵育。

在实施方案中，转化培养物在经历发酵时的pH可为约4.5至约5.5。在实施方案中，转化培养物的pH可为约4.8。在实施方案中，转化培养物被主动曝气(aerate)。

将发酵的植物材料从一个或更多个孵育容器转移到培养液罐中，在培养液罐中可加热至约60℃，约30min至2hr。流体动力被施加到加热发酵的植物材料上，这产生了发酵块状物和发酵离心液。然后在约37.8℃至约149℃的温度将发酵的块状物干燥至低于约7％的水分。发酵的离心液可以转移到一个或更多个先前采用的混合罐中(例如，以保存水和循环利用水，增加产率和蛋白含量，包含可溶性蛋白)，以与进入的基于植物的材料混合，包括发酵的离心液可以转移到蒸发器以产生液体蛋白浓缩物。

运往蒸发器的发酵离心液可以经历两个或更多个蒸发步骤，其中蒸发进行足够的时间和温度，以获得具有约10％至约60％的固体百分比的液体蛋白浓缩物。可选地，可以将液体蛋白浓缩物转移回一个或更多个混合罐，以最后形成一个或更多个用于处理的另外的离心液/块状物。在一方面，块状物/离心液可以用乙醇洗涤和/或沉淀。

在实施方案中，最终蛋白浓缩固体回收率可以通过基于植物的饲料原料、孵育条件、pH、干燥时间和温度来调节。例如，对于具有14hr孵育的最后的干燥块状物，可以获得约70％或更多的蛋白，其中获得约76.59％至约99.65％之间的固体含量。所述块状物中的蛋白含量可为约65％至约70％，约70％至约75％，或约75％至约80％(dmb)。

在实施方案中，饲料原料可以用一种或更多种抗生素(例如，但不限于，四环素、青霉素、红霉素、泰乐菌素、维吉霉素(virginiamycin)、及其组合)处理，然后接种转化微生物，以避免，例如，被不想要的细菌菌株污染。

在孵育期间，可以在处理期间定期取出样品(例如，确定氨基酸、DH、寡糖浓度、短梗霉聚糖含量等)。例如，用于HPLC分析的样品可被煮沸、离心、过滤(例如，通过0.22μm过滤器)、置于自动采样瓶中、并冷冻直到分析。在实施方案中，样品可以使用WATERS HPLC系统测定碳水化合物和有机溶剂，虽然可以使用其它HPLC系统。本领域技术人员将认识到，可以使用其他方法(例如，UPLC)。可以对样品进行平板或血细胞计数器计数，以评估微生物种群。本领域技术人员将认识到，可以使用其他方法(例如，荧光显微术、流式细胞术等)。样品也可使用美国国家可再生能源实验室(National Renewable Energy Laboratory)程序测定纤维素、半纤维素、木质素、淀粉和果胶的水平。

图6-图9说明了可用于产生如本文公开的HQPC的生产方法100、100(a)、100(b)、100(c)。参考图6，对于实施方案，基于植物的材料首先经受碾磨装置101并随后转移到第一混合罐102(a)，其中将其与一种或更多种第一溶剂混合，该第一溶剂可包含酸、碱、酶、消泡剂和/或来自下游分离步骤的离心液(例如，在连续循环期间的离心液2)。酶包括非纤维素解构酶(例如植酸酶、蛋白酶等)。通过流体动力装置(例如，倾析离心机)103(a)将所得糊状物与一种或更多种第一溶剂分离以产生第一离心液和第一块状物。第一离心液可被转移至蒸发器107以产生大豆可溶物108(即液体蛋白浓缩物)。将第一块状物转移到第二混合罐102(b)，其中第一块状物用一种或更多种第二溶剂和/或下游离心液(例如，离心液3，用于连续循环)洗涤。通过流体动力装置103(b)将经洗涤的第一块状物与一种或更多种第二溶剂分离以产生第二离心液和经洗涤的第二块状物。在连续循环期间可以将第二离心液转移至第一混合罐102(a)。经洗涤的第二块状物被转移到第三混合罐102(c)，其中经洗涤的第二块状物用一种或更多种第三溶剂和/或下游离心液(例如，离心液3，用于连续循环)洗涤。通过流体动力装置103(c)将经洗涤的第二块状物与一种或更多种第三溶剂分离以产生第三离心液和经洗涤的第三块状物。在连续循环期间可以将第三离心液转移至第二混合罐102(b)。经洗涤的第三块状物被转移到第四混合罐102(d)，其中经洗涤的第三块状物用一种或更多种第三溶剂和/或来自蒸发器107的浓缩物洗涤以形成悬浮液，将该悬浮液转移到一个或更多个发酵罐104中用于由接种系列(seed train)105接种。在孵育之前，悬浮液可以在蒸煮管/冷却器串联装置(未示出)中加热和冷却，其中可以调节所述蒸煮管中的驻留时间和温度以改变最终产物的特征(例如，增加蛋白含量)。在实施方案中，驻留时间可以是0至约5秒、约5秒至约10秒、约10秒至约15秒、约20秒至约30秒或约30秒至1分钟。在相关方面，在蒸煮管中以至少约95℃、约105℃、约110℃、约120℃、约130℃或约140℃的温度加热悬浮液，其中悬浮液在与接种系列105一起孵育之前被冷却至约30℃至32℃之间。

从图6继续，在孵育之后，通过应用流体动力装置(例如，倾析离心机/碟式离心机)103(d)将所得的发酵悬浮液分离成第四离心液和最终块状物。悬浮液可以在培养液罐(未示出)中加热到至少约60℃，持续约30min至约2hr，然后施加流体动力。从103(d)和/或将培养液罐(未示出)所得的块状物被转移到干燥器106。通过将干燥器106加热至约150℃进行干燥，直到最后的块状物具有含量小于约7％的水分。

参考图7，该图提供了生产方法100(a)的第一步骤的详细信息(离心液1)。基于植物的材料首先经受碾磨装置101并随后转移到第一混合罐102(a)，其中将其与一种或更多种第一溶剂混合。通过流体动力装置103(a)将所得的糊状物与一种或更多种第一溶剂分离以产生第一离心液和第一块状物。第一离心液可被转移至蒸发器107以产生大豆可溶物108。

参考图8，该图提供了离心液4的生产方法100(b)详细信息。经洗涤的第三块状物被转移到第四混合罐102(d)，其中经洗涤的第三块状物用一种或更多种第三溶剂和/或来自蒸发器107的浓缩物洗涤以形成悬浮液，将该悬浮液转移到一个或更多个发酵罐104中用于接种。孵育后，通过应用流体动力装置103(d)将所得的发酵悬浮液分离成第四离心液和最终块状物，其中将离心液4转移到上游混合罐(例如，102(c))。

参考图9，生产方法100(c)提供了与离心液4和离心液1相关的详细信息，其中离心液4经受碟式离心109和/或超滤110，然后转移到混合罐3 102(c)，包括：离心液1可以经受去污和脱油、用于蛋白分离的超滤110和/或用于糖分离的纳滤111。在实施方案中，这样的分离方法可用于去除发酵中使用的微生物。

在实施方案中，参考图6-图9，生产方法100、100(a)、100(b)、100(c)可以是分批的或连续的，并且至少包含一个洗涤循环(从碾磨机101至干燥器106)，和至少两种离心液，其中一种离心液被进一步处理以浓缩大豆可溶物108。

在实施方案中，通过NIR光谱法分析碾磨前的饲料原料和最终产物(最后的干燥块状物)。在一方面，相对于饲料原料(即基本上“平坦的”)，最终产物(即“谷”)的原始光谱在4664cm^-1和4836cm^-1之间应该存在显著的向下迁移(参见图10和图11)。在相关方面，向下迁移应该是至少约10％的变化，在约10％至约15％之间的变化，或在约15％的变化和约20％的变化之间或更大，使用等式计算：

(V₂－V₁)|V₁|×100＝变化百分比

例如，如在图10和图11之间示出的，对于SBM样品和由其产生的最终ME-(HSPQ产物)样品，向下迁移的百分比变化为约16.7％。虽然不受理论约束，但这样的迁移指示增加的蛋白含量(参见，例如，Fan等人，PLoS ONE(2016)11(9):e0163145。doi:10.1371/journal.pone.0163145)。可以使用Fan等人((2016)；通过引用以其整体并入本文)公开的方法产生NIR光谱数据，然而，技术人员将认识到，包括任何相关硬件和软件的其他合适的方法是可用的。

食物制剂

在示例性实施方案中，从已经经历转化的转化培养物中回收的HQPC用在食物制剂中。在实施方案中，回收的HQPC可以是食物制剂中唯一的蛋白来源。食物制剂中的蛋白来源百分比并不意味着是限制性的，并且可以包括24％至80％的蛋白浓缩物。在实施方案中，HQPC将是大于约50％、大于约60％或大于约70％的总食物制剂蛋白来源。回收的HQPC可以替代/补充蛋白来源，诸如鱼粉、大豆粉、小麦和玉米粉和面筋和浓缩物，以及动物副产物，诸如血液、家禽、肉类替代品、肉类类似物和羽毛粉。使用HQPC的食物制剂也可以包括补充剂，诸如矿物质和维生素预混物，以适当满足剩余的营养需求。

在某些实施方案中，HQPC的表现可以通过比较饲喂高品质蛋白浓缩物食物制剂的动物与饲喂对照食物制剂的动物的生长、饲料转化率、蛋白功效、DH、APD、PPD和存活率来测量，对照食物制剂包括用于人类食用的食品的美学(aesthetics)。在实施方案中，测试制剂包含一致的蛋白、脂质和能量含量。例如，当动物是鱼时，可以测量内脏(脂肪沉积)和器官(肝和脾)的特征、出肉(dress-out)百分比、和鱼片近似分析(fillet proximateanalysis)、以及肠道组织学(肠炎)，以评估食物响应。在实施方案中，对于幼虾制剂，可以测量体外DH、PPD和ADP以评估食物响应。在实施方案中，对于仔猪，以腹泻为特征的肠道感染是断奶后猪生长表现降低以及发病率和死亡率增加的主要原因，因此，可以测量腹泻的减少以评估食物响应。

如所理解的，包含回收的HQPC的单独食物制剂可以被优化用于不同种类的动物。在实施方案中，动物包括但不限于有鳍鱼类、甲壳类动物(例如，虾、蟹、对虾和龙虾)、家养动物(例如，狗、猫、鸟)和农场动物(例如，牛、猪和鸡)。在相关方面，动物是在商业水产养殖中生长的有鳍鱼类和甲壳类动物。在另一相关方面，甲壳类动物包括幼虾。食物制剂优化的方法是熟知的，且本领域技术人员易于确定而无需过度实验。

全价生长食物(Complete grower diets)可以根据各种动物物种已知的营养需求使用HQPC配制。在实施方案中，制剂可以用于黄鲈(例如，42％蛋白，8％脂质)。在实施方案中，制剂可以用于虹鳟鱼(35％蛋白，16％脂质)。在实施方案中，制剂可以用于上文提及的任一种动物。

可以使用用于基于植物食物的基础矿物质和维生素预混物，以确保微营养需求将得到满足。任何补充剂(如通过分析认为必要)可以通过比较无补充的相同制剂来评价；因此，饲喂试验可以在析因设计中完成以考虑到补充作用。在实施方案中，饲喂试验可以包括基于鱼粉的对照食物及基于ESPC和LSPC的参考食物[传统的SPC(TSPC)是从溶剂洗涤大豆粕以去除可溶性碳水化合物产生的；组织化(texturized)SPC(ESPC)是由在潮湿、高温下挤压TSPC产生的；及低抗原SPC(LSPC)是从TSPC通过改变加工期间溶剂洗涤和温度产生的]。可以使用单螺杆挤压机(例如，BRABENDERPLASTI-CORDER EXTRUDER Model PL2000)产生用于饲喂试验的小粒。

饲喂试验

在实施方案中，每个处理(即，每个实验组和对照食物混合物)可以使用四个实验单元的重复(例如，各约60天至120天)。试验可以在110-L圆形水箱(20条鱼/水箱)进行，该水箱并联至由离心泵驱动并由固体贮槽、和生物反应器、过滤器(100μm袋，碳和紫外线)组成的闭环再循环系统。可以根据需要使用热泵以维持物种特异性生长的最佳温度。水质(例如，溶解氧、pH、温度、氨和亚硝酸盐)可以在所有系统中被监测。

在实施方案中，实验食物可以根据鱼的大小被递送，并分成二到五个每天饲养量。生长表现可以通过在一至四个星期(取决于鱼的大小和试验持续时间)获取总质量测量来确定；配给可以根据增重进行调整，以允许饱食饲喂和减少废物流。消耗可从来自个体水箱的未食用的饲料的收集每两周进行评价。未食用的饲料可以干燥至恒定的温度，冷却并称重以估计饲料转化率。蛋白和能量的消化率可从每个实验的中点期间手动剥离的排泄物材料，或经由饲喂试验结束时从下部肠道的剖检确定。存活率、体重增加、生长速率、健康指标、饲料转化率、蛋白和能量的消化率、和蛋白功效可以在各处理组之间进行比较。可进行剖检鱼的近似分析以比较各食物处理之间鱼片的组成。根据饲喂试验目标，如对鱼片成分需要的，可进行氨基酸和脂肪酸的分析。食物处理的饲喂试验响应可以与对照(例如鱼粉)食物响应比较，以确定HQPC食物的性能是否达到或超过对照响应。

对于虾，试验可以在900加仑水箱或半方形190L水箱中进行，每个水箱都配备有从次表层抽水的循环排水管和固定至水箱中心底部最低点的排污管。RAS测试系统可以由康奈尔式双排水水箱、固体沉降水箱、机械鼓型过滤、移动床生物反应器(MBBR)、紫外线灭菌、冷却和氧气注射组成。可以每天监测水质，以确保所有参数都在可接受的范围内(参见，例如，White等人，Aqua Mar Bio Eco(2020)JAMBE:105，通过引用并入本文)。

此外，可以分析虾以确定HQPC的直接作用，诸如提供显著量的生物活性因子，这些生物活性因子可以增加肠道微生物群、减少肠道炎症和促进代谢过程以改善动物健康，这尤其依赖于饲料干物质向体重的转化，其中消化率的确定起着关键作用。在相关方面，可以使用从虾回收的标准化消化酶进行体外蛋白消化，包括使用来自这样的分析的数据来确定DH、PPD和APD以及总体存活率。

食物和饲喂试验响应的统计分析可以以先验α＝0.05完成。根据需要，在处理之间的表现参数的分析可以通过对方差或协方差(Proc Mixed)和事后多重比较的适当分析来进行。动物表现和组织响应的分析可以通过非线性模型评估。

在实施方案中，本公开内容提出使用，例如，GRAS状态微生物，将基于植物的材料中的纤维和其它碳水化合物转化为另外的蛋白。还可以产生微生物胞外多糖(例如葡聚糖)，其可以有助于挤压的饲料小粒形成，省去粘合剂的需求。这种微生物胶还可以提供免疫刺激活性，以激活先天防御机制，保护动物免于由应激物产生的常见病原体。免疫预防性物质，诸如β-葡聚糖、细菌产物、和植物成分，在商业饲料中的使用正在逐渐增加，以减少由于感染性疾病引起的经济损失，并最小化抗生素的使用。本公开内容的微生物还产生胞外肽酶，其将增加代谢期间蛋白的消化率和吸收，提供更高的饲料功效和产率。如本文所公开，此微生物孵育方法提供了有价值的、可持续的基于植物蛋白的饲料，其每单位蛋白比SBM、SPC和动物饲料更便宜。在实施方案中，然后可以对离心液组分进行进一步的蒸发步骤，该步骤可以将可溶性副产物(诸如糖、甘油、蛋白、肽和氨基酸)浓缩成称为糖浆(syrup)或浓缩的基于植物的可溶物(plant based solubles，PBS)的材料。

如所公开的，本发明的微生物可以代谢基于植物的材料中的个体碳水化合物，产生细胞物质(蛋白)、微生物胶(例如短梗霉聚糖)两者，产生酶产物、微生物代谢物产物和益生元。这些微生物的各种菌株还增强纤维解构。本发明的微生物还可以将基于植物的材料蛋白转化成更易消化的肽和氨基酸(此处为图12)。在实施方案中，可以执行以下操作：1)确定使用本公开内容的选定微生物转化基于植物的材料，以至少在约65％至约70％之间或更大的蛋白浓度产生高品质蛋白浓缩物(HQPC)的有效性，及2)评估HQPC替代基于动物的蛋白的有效性。在实施方案中，可以对方法/转化条件进行优化，以改善微生物的表现和稳健性，对一系列商业上重要的动物测试所得的生长饲料，验证商业化的工艺成本和能量需求。在实施方案中，本公开内容的HQPC可以能够替代至少50％的动物蛋白，同时提供增加的生长速率和转化效率。例如，生产成本将低于商业大豆蛋白浓缩物(SPC)且大幅低于鱼粉。

图1、图2和图6-图9示出了本公开内容的各种方法：基于植物产物的预处理，将糖类转化成细胞物质(蛋白)和胶，回收HQSPC并产生水产饲料，并在鱼饲喂测试中测试所得的水产饲料。

虽然不是本文公开的所有方法都需要，但可以评价纤维素解构酶/短梗霉多糖酶产生糖类的效能，本公开内容的微生物可以将所述糖类转化为蛋白、胞外多糖和胶。在实施方案中，可以使用这些酶的连续省略(sequential omission)和对与纤维素分解微生物共培养的评价。可以评价乙醇洗涤各种块状物，沉淀胶并提高蛋白可溶物回收率的效能，所述蛋白可溶物可以通过处理悬浮在各种离心液中以产生HQPC。干燥后，HQPC可以被掺入到实际的食物制剂中。在实施方案中，可以配制(与矿物质和维生素预混物一起)测试生长食物，并可以用商业上重要的动物在饲喂试验中与动物蛋白对照和商业上基于植物的蛋白浓缩物/分离物基食物(plant-based protein concentrate/isolate based diets)进行比较。可以检查表现(例如生长、饲料转化率、蛋白功效、存活率)、内脏特征、肠道影响和肠道组织学，以评估响应。

在其他实施方案中，可以通过以下来进行HQPC生产方法优化：确定最佳转化条件，同时使方法输入最小化，改善微生物的表现和稳健性，针对一系列商业上重要的动物测试所得的生长饲料，以及验证/更新方法成本和能量需求。

在过去的几年中，少数设施已安装了在乙醇生产方法之前去除玉米壳和胚芽的干磨机。这种干法分提方法产生具有高达42％的蛋白的DDGS(以下称为干法分提DDGS(dryfrac DDGS))。在一些实施方案中，低油DDGS可以用作转化的底物，其中这样的低油DDGS具有比常规的DDGS更高的蛋白水平。在相关的方面，相比传统DDGS，低油DDGS增加出芽短梗霉的生长率。

几个小组正在评价用植物来源蛋白部分替代基于动物的蛋白。然而，较低的蛋白含量、不充分的氨基酸平衡、及抗营养因子的存在将替代水平限制至20％-40％。例如，初步生长试验表明，没有现有的基于DDGS或SPC的食物提供类似于鱼粉对照食物的表现。在商业化生产的DDGS和SPC之中一些缺陷已被鉴定，主要是在蛋白和氨基酸组成方面，这赋予生长表现的变化性。但是，如本文公开的包含营养补充剂(配制以满足或超过所有的需求)的包含基于植物的蛋白的食物提供类似于或超过基于动物蛋白的对照的生长结果。因此，如本文公开的方法及由此开发的产物提供了更高品质的HQSPC(相对于营养需求)，并支持等同于或优于包含基于动物的蛋白的食物(包括包含各种SPC/SPI的食物)的生长表现。

在实施方案中，可以饲喂本公开内容的鱼饲料组合物的鱼包括，但不限于，西伯利亚鲟(Siberian sturgeon)、小体鲟(Sterlet sturgeon)、闪光鲟(Starry sturgeon)、白鲟(White sturgeon)、巨骨舌鱼(Arapaima)、日本鳗(Japanese eel)、美洲鳗(Americaneel)、短鳍鳗(Short-finned eel)、长鳍鳗(Long-finned eel)、欧洲鳗(European eel)、遮目鱼(Chanos chanos)、遮目鱼(Milkfish)、蓝鳃太阳鱼(Bluegill sunfish)、蓝绿鳞鳃太阳鱼(Green sunfish)、白莓鲈(White crappie)、黑莓鲈(Black crappie)、Asp、卡特拉魮(Catla)、金鱼(Goldfish)、鲫鱼(Crucian carp)、鲮鱼(Mud carp)、麦瑞加拉鲮鱼(Mrigalcarp)、草鱼(Grass carp)、鲤鱼(Common carp)、鲢鱼(Silver carp)、鳙鱼(Bigheadcarp)、Orangefin labeo、Roho labeo、红万鲤鱼(Hoven’s carp)、武昌鱼(Wuchangbream)、青鱼(Black carp)、金体美洲鳊(Golden shiner)、Nilem carp、白阿穆尔鳊鱼(White amur bream)、泰银魮(Thai silver barb)、Java、斜齿鳊(Roach)、丁鲷(Tench)、池塘泥鳅(Pond loach)、Bocachico、金头鲷(Dorada)、Cachama、Cachama Blanca、Paco、黑鮰(Black bullhead)、斑点叉尾鮰(Channel catfish)、鲿科鲶鱼(Bagrid catfish)、蓝鲶鱼(Blue catfish)、六须鲶鱼(Wels catfish)、巨鲶(Pangasius(Swai,Tra,Basa)catfish)、条纹鲶鱼(Striped catfish)、泥鳅(Mudfish)、菲律宾鲶鱼(Philippine catfish)、香港鲶鱼(Hong Kong catfish)、北非鲶鱼(North African catfish)、大头鲶鱼(Bigheadcatfish)、Sampa、南美鲶鱼(South American catfish)、Atipa、白斑狗鱼(Northernpike)、香鱼(Ayu sweetfish)、白鳟(Vendace)、白鲑(Whitefish)、粉红鲑(Pink salmon)、大马哈鱼(Chum salmon)、银大马哈鱼(Coho salmon)、樱鲑(Masu salmon)、虹鳟鱼(Rainbow trout)、红大马哈鱼(Sockeye salmon)、大鳞大马哈鱼(Chinook salmon)、大西洋鲑鱼(Atlantic salmon)、海鳟(Sea trout)、北极红点鲑(Arctic char)、溪红点鲑(Brook trout)、湖红点鲑(Lake trout)、大西洋鳕鱼(Atlantic cod)、银汉鱼(Pejerrey)、Lai、锯盖鱼(Common snook)、尖吻鲈/亚洲海鲈鱼(Barramundi/Asian sea bass)、尼罗河鲈鱼(Nile perch)、虫纹石斑鱼(Murray cod)、金鲈鱼(Golden perch)、条纹鲈鱼(Stripedbass)、白鲈(White bass)、欧洲鲈鱼(European seabass)、香港石斑鱼(Hong Konggrouper)、宝石石斑鱼(Areolate grouper)、鲈滑石斑鱼(Greasy grouper)、斑点东星斑(Spotted coralgrouper)、银鲈(Silver perch)、白鲈(White perch)、宝石鲈(Jadeperch)、大口黑鲈(Largemouth bass)、小口黑鲈(Smallmouth bass)、欧洲鲈(Europeanperch)、梭鲈(Zander，Pike-perch)、黄鲈(Yellow Perch)、加拿大梭鲈(Sauger)、大眼梭鲈(Walleye)、竹荚鱼(Bluefish)、红魽(Greater amberjack)、青魽鰺(Japaneseamberjack)、卵形鲳鲹(Snubnose pompano)、佛罗里达州鲳(Florida pompano)、谷氏鲳(Palometa pompano)、日本竹荚鱼(Japanese jack mackerel)、军曹鱼(Cobia)、红树林红鲷鱼(Mangrove red snapper)、黄尾笛鲷(Yellowtail snapper)、黑鲷(Dark seabream)、白鲷鱼(White seabream)、深红鲷鱼(Crimson seabream)、红鲷鱼(Red seabream)、真鲷(Red porgy)、金丝鲷(Goldlined seabream)、金头鲷(Gilthead seabream)、红鼓鱼(Reddrum)、绿宝丽鱼(Green terror)、黑带鲷(Blackbelt cichlid)、淡水石斑鱼(Jaguarguapote)、墨西哥银鲈(Mexican mojarra)、Pearlspot、三斑罗非鱼(Three spottedtilapia)、蓝罗非鱼(Blue tilapia)、长鳍罗非鱼(Longfin tilapia)、莫桑比克罗非鱼(Mozambique tilapia)、尼罗罗非鱼(Nile tilapia)、罗非鱼(Tilapia)、荷那龙罗非鱼(Wami tilapia)、黑颚罗非鱼(Blackchin tilapia)、伦氏非鲫(Redbreast tilapia)、福寿鱼(Redbelly tilapia)、金鮻(Golden grey mullet)、大鳞鮻(Largescale mullet)、Gold-spot mullet、Thinlip grey mullet、跳鮻(Leaping mullet)、Tade mullet、乌鲻(Flathead grey mullet)、白鲻鱼(White mullet)、梭状鲻(Lebranche mullet)、太平洋脂塘鳢(Pacific fat sleeper)、尖塘鳢(Marble goby)、白斑臭都鱼(White-spottedspinefoot)、点蓝子鱼(Goldlined spinefoot)、刺蓝子鱼(Marbled spinefoot)、南方黑鲔(Southern bluefin tuna)、北方黑鲔鱼(Northern bluefin tuna)、攀鲈(Climbingperch)、Snakeskin gourami、接吻鲈(Kissing gourami)、巨鲈(Giant gourami)、黑鱼(Snakehead)、印尼黑鱼(Indonesian snakehead)、斑点黑鱼(Spotted snakehead)、条纹黑鱼(Striped snakehead)、大菱鲆(Turbot)、大比目鱼(Bastard halibut)(日本牙鲽(Japanese flounder))、夏日鲆(Summer Flounder)、漠斑牙鲆(Southern flounder)、北美黄盖鲽(Winter flounder)、大西洋大比目鱼(Atlantic Halibut)、绿背鲆(Greenbackflounder)、欧鳎(Common sole)、及其组合。

在实施方案中，可以饲喂本公开内容的饲料组合物的甲壳类动物包括，但不限于，Kadal虾、奋进虾(endeavour shrimp)、油背虾(greasyback shrimp)、斑点虾(greasybackshrimp)、北方褐虾(northern brown shrimp)、肉质对虾(fleshy prawn)、褐虎对虾(browntiger prawn)、印度明对虾(Indian white prawn)、日本囊对虾(Kuruma prawn)、caramote对虾、香蕉对虾(banana prawn)、巨虎对虾(giant tiger prawn)、南方粉红虾(southernpink shrimp)、圣保罗虾(Sao Paulo shrimp)、红尾对虾(redtail prawn)、南方白虾(southern white shrimp)、绿虎对虾(Green tiger prawn)、北方白虾(Northern whiteshrimp)、蓝虾(Blue shrimp)、南方褐虾(Southern brown shrimp)、白脚虾(Whitelegshrimp)、Atlantic seabob、秋酱虾(Akiami paste shrimp)、季风河对虾(Monsoon riverprawn)、巨河对虾(giant river prawn)、普通对虾(common prawn)、美洲龙虾(Americanlobster)、欧洲龙虾(European lobster)、贵族螯虾(noble crayfish)、多瑙河螯虾(Danube crayfish)、信号螯虾(signal crayfish)、红沼泽螯虾(red swamp crawfish)、yabby螯虾、红爪螯虾(red claw crayfish)、马龙螯虾(marron crayfish)、长腿多刺龙虾(longlegged spiny lobster)、三疣梭子蟹(gazami crab)、锯缘青蟹(Indo-Pacificswamp crab)、中国河蟹(Chinese river crab)及其组合。

在实施方案中，可以饲喂本公开内容的饲料组合物的农场动物包括但不限于牛、绵羊、山羊、鹿、马、鸡、猪、兔、鸭、羊驼、鸸鹋、火鸡、野牛和骆驼。

在实施方案中，可以饲喂本公开内容的饲料组合物的家养动物包括但不限于狗、猫、鹦鹉、金鱼、龟、长尾小鹦鹉、仓鼠、实验室大鼠、豚鼠和实验室小鼠。

技术人员将理解，本公开内容的饲料组合物可以用作药物活性物质的方便载体，包括但不限于抗生素、化学治疗剂、抗炎剂、NSAID、抗微生物剂以及包括抗细菌或病毒感染的疫苗的免疫活性物质，以及它们的任何组合。

根据本公开内容的饲料组合物可以以液体、可倾倒的乳剂、或糊状的形式、或以干燥的形式，例如作为颗粒、粉末、或作为粕被提供。当饲料组合物作为乳剂，即水包脂的乳剂被提供时，其可以以相对浓缩的形式。这样浓缩的乳剂形式，也可以被称为预乳剂，因为它可以以一个或更多个步骤在含水介质中稀释，以提供用于生物体的最终的富集培养基(enrichment medium)。

在实施方案中，如公开的用于基于微生物的方法的包含纤维素的起始材料是玉米。玉米的约三分之二是淀粉，淀粉在发酵和蒸馏过程中转化为乙醇和二氧化碳。剩余的营养物或发酵产物可以产生浓缩的蒸馏可溶物(distiller's soluble)或酒糟(distiller'sgrain)诸如DDGS，其可以在饲料产物中使用。通常，该方法包括玉米的干磨或研磨的初始准备步骤。然后对加工的玉米进行水解并添加酶以在糖化步骤分解主要淀粉组分。允许随后的发酵步骤在添加了根据本公开内容的实施方案提供的微生物(例如酵母)后继续进行以产生气态产物诸如二氧化碳。进行发酵用于生产乙醇，其可以从发酵液(fermentationbroth)中被蒸馏。然后可以干燥发酵培养基的剩余物，以产生包括DDGS的发酵产物。这个步骤通常包括通过离心进行的固/液分离方法，其中固相组分可以被收集。包括过滤和喷雾干燥技术的其它的方法可以被采用来实现这样的分离。然后可以对液相组分进行进一步的蒸发步骤，该步骤可以将可溶性副产物(诸如糖、甘油、蛋白、肽和氨基酸)浓缩成称为糖浆或浓缩的玉米可溶物(CCS)的材料。CCS然后可以与固相组分重组，干燥为孵育产物(DDGS)。应当理解，本发明组合物可以应用于基于干磨的新的或现有的乙醇工厂，以提供集成的乙醇生产方法，其还生产具有增加的价值的发酵产物。

在实施方案中，根据本公开内容产生的孵育产物具有比常规发酵产物更高的商业价值。例如，孵育产物可以包括具有改善的氨基酸和微量营养元素含量的增强的干燥固体。因此可以提供“黄金色”产物，其相比于深色的HQSP通常指示较高的氨基酸消化率。例如，根据本文的实施方案，可产生浅色的HQSP，其相比于通常具有较少的营养价值的相对较深色的产物具有增加的赖氨酸浓度。产物的颜色可以是发酵产物或HQSP的品质和营养物质消化率的评估中的重要因素或指标。颜色作为干燥过程中暴露于过量的热的指标使用，过量的热引起游离氨基基团和糖的焦糖化和美拉德反应(Maillard reaction)，降低了一些氨基酸的品质。

本发明另一方面涉及具有增强的浓度的营养物并包含微生物的全价饲料组合物，其特征在于增强的浓度的营养物，该营养物诸如，但不限于，脂肪、脂肪酸、脂质诸如磷脂、维生素、必需氨基酸、肽、蛋白、碳水化合物、甾醇、酶、和微量矿物质诸如铁、铜、锌、锰、钴、碘、硒、钼、镍、氟、钒、锡、硅、及其组合。在一方面，该方法使得能够以不导致废水大量污染的方式向动物提供更大量的磷。

在孵育方法之后获得的孵育产物通常具有更高的商业价值。在实施方案中，相比缺乏微生物的那些产物，包含微生物的孵育产物具有增强的营养物含量。微生物可存在于孵育系统、孵育培养液和/或孵育生物质中。孵育培养液和/或生物质可以被干燥(例如，喷雾干燥)，以产生具有增强含量的营养物含量的孵育产物。

例如，根据本公开内容，在孵育方法后回收的耗尽、干燥的固体是增强的。这些孵育产物通常是无毒的、可生物降解、容易得到、价格低廉、且营养物丰富。微生物的选择和孵育条件对产生作为饲料或营养补充剂使用的低毒性或无毒性的孵育产物是重要的，包括选择不产生浓度会对方法产生负面影响的代谢物的微生物。虽然葡萄糖是从谷物淀粉的水解产生的主要的糖，通常它不是碳水化合物产生的唯一的糖。不同于由传统的干磨乙醇生产方法产生的SPC或DDG，其包含了大量的非淀粉的碳水化合物(例如，作为中性洗涤剂纤维测量的多达35％的纤维素和阿拉伯木聚糖，按干重计算)，本发明的由非淀粉的碳水化合物的酶水解(通过微生物的代谢)产生的富含营养物的孵育产物对非反刍动物更适口和可消化。

本公开内容的富含营养物的孵育产物可以具有以重量计从至少约1％至约95％的营养物含量。营养物含量优选在以重量计至少约10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、和70％-80％的范围内。可用的营养物含量可以取决于其所饲喂的动物，和其余食物的背景，及在动物的生命周期的阶段。例如，肉牛比泌乳奶牛需要更少的组氨酸。为饲喂动物选择合适的营养物含量是本领域技术人员所熟知的。

孵育产物可制备为喷雾干燥的生物质产物。任选地，生物质可以通过已知的方法，诸如离心、过滤、分离、倾析、分离和倾析的组合、超滤或微滤被分离。生物质孵育产物可被进一步处理以促进过瘤胃(rumen bypass)。在实施方案中，生物质产物可以从孵育培养基中分离，喷雾干燥，并任选的处理，以调节过瘤胃，并添加到饲料中作为营养源。除了在包含微生物的孵育方法中产生营养富含的孵育产物，营养富含的孵育产物也可以在转基因植物系统中产生。用于产生转基因植物系统的方法是本领域已知的。可选地，当微生物宿主分泌营养内容时，可以从通过孵育产生的生物质分离富含营养物的培养液，且澄清的培养液可被用作动物饲料成分，例如，以液体形式或喷雾干燥形式。

使用微生物的孵育方法后获得的孵育产物可以作为动物饲料或作为人的食品补充剂。孵育产物包括至少一种成分，其具有来自非动物来源(例如，细菌、酵母、和/或植物)的增强的营养物含量。特别地，孵育产物富含以下的至少一种或更多种：脂肪、脂肪酸、脂质诸如磷脂、维生素、必需氨基酸、肽、蛋白、碳水化合物、甾醇、酶、和微量矿物质诸如铁、铜、锌、锰、钴、碘、硒、钼、镍、氟、钒、锡和硅。在实施方案中，肽包含至少一种必需氨基酸。在其它实施方案中，必需氨基酸被包封在孵育反应中使用的本发明的修饰的微生物内。在实施方案中，必需氨基酸包含在由微生物表达的异源多肽中。当需要时，在合适的微生物中(例如，真菌)表达异源多肽，并储存在包涵体中。

在实施方案中，孵育产物具有高的营养物含量。结果是，可以在全价动物饲料中使用较高百分比的孵育产物。在实施方案中，饲料组合物包括按重量计至少约15％的孵育产物。在全价饲料、或食物中，这种材料将与其它材料一起饲喂。根据其它材料的营养物含量、和/或被提供该饲料的动物的营养需求，修改的孵育产物的范围可以从饲料的15％至饲料的100％。在实施方案中，由于高营养含量，本发明孵育产物可以提供较低百分比的混合。在其它实施方案中，本发明的孵育产物可提供非常高比例的饲养，例如超过75％。在合适的实施方案中，饲料组合物包括至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％或至少约75％的本发明的孵育产物。通常，饲料组合物包含按重量计至少约1％至2％、或5％至10％或20％的孵育产物。更常见地，饲料组合物包含按重量计至少约1％至2％、或5％至10％、10-15％、15-25％、25-20％、20-25％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、或60％-70％的孵育产物。当需要时，本发明的孵育产物可以作为饲料的唯一来源使用。

在实施方案中，为了多种目的，例如，为了增加体重和动物健康的总体改善，本文公开的食物制剂可以具有关于一种或更多种必需氨基酸的增强的氨基酸含量。因为在孵育产物中游离氨基酸的存在和/或包含必需氨基酸的蛋白或肽的存在，制剂可以具有增强的氨基酸含量。必需氨基酸可以包括组氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、牛磺酸、异亮氨酸和/或色氨酸，其可以作为游离氨基酸或作为富含所选择的氨基酸的蛋白或肽的一部分存在于制剂中。富含至少一种必需氨基酸的肽或蛋白在肽或蛋白中可以具有至少1％的必需氨基酸残基/总氨基酸残基、在肽或蛋白中至少5％的必需氨基酸残基/总氨基酸残基、或在肽或蛋白中至少10％的必需氨基酸残基/总氨基酸残基。通过向动物饲喂营养平衡的食物，进行营养物含量的最大利用，实现可比较的生长率、牛奶生产需要较少的饲料，或减少存在于排泄物的营养物，减少废物的生物负载(例如，减少废物流中的磷)。

本文公开的制剂可以包含增强的含量的必需氨基酸，可以具有相对于粗蛋白和总氨基酸含量的重量的至少2.0wt％的必需氨基酸含量(包括游离的必需氨基酸和存在于蛋白或肽中的必需氨基酸)，且更适宜地，相对于粗蛋白和总氨基酸含量的重量的至少5.0wt％。本文公开的饲料制剂包括来源于微生物的其它营养物，包括但不限于，脂肪、脂肪酸、脂质诸如磷脂、维生素、碳水化合物、甾醇、酶及微量矿物质。

本文公开的饲料制剂可以包括全价饲料形式组合物、浓缩物形式组合物、掺合物形式组合物及基础形式组合物。如果制剂是以全价饲料的形式，营养物水平百分比可以是约10％至约25％，更适宜地约14％至约24％，其中营养物获得自孵育产物中的微生物；然而，如果制剂是以浓缩物的形式，营养物水平可以是约30％至约50％，更适宜地约32％至约48％。如果制剂是以掺合物的形式，组合物中的营养物水平可以是约20％至约30％，更适宜地约24％至约26％；并且如果制剂是以基本混合物的形式，制剂中的营养物水平可以是约55％至约65％。除在本文另有说明外，百分比是基于重量百分比计。如果HQPC的单一营养物例如Lys是高的，它将以低比例用作补充剂；如果它的氨基酸和维生素例如维生素A和E是平衡的，它将是更全价的饲料且将以更高的比例饲喂并补充有低蛋白、低营养饲料原料，如玉米秸秆。

本文公开的饲料制剂可以包括存在于孵育产物中的具有至少约2％的必需氨基酸含量的肽或粗蛋白级分。在实施方案中，肽或粗蛋白级分可以具有至少约3％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约40％的必需氨基酸含量，和在实施方案中，至少约50％。在实施方案中，肽可以是100％的必需氨基酸。例如，鱼粉制剂可以包括存在于孵育产物中的具有高达约10％的必需氨基酸含量的肽或粗蛋白级分。更常见地，鱼粉制剂可以包括存在于孵育产物中的具有约2％-10％、3.0％-8.0％、或4.0％-6.0％的必需氨基酸含量的肽或粗蛋白级分。

本文公开的制剂可以包括存在于孵育产物中的具有至少约2％的赖氨酸含量的肽或粗蛋白级分。在实施方案中，肽或粗蛋白级分可以具有至少约3％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约40％的赖氨酸含量，和在实施方案中，至少约50％。例如，鱼粉制剂可以包括具有高达约10％的赖氨酸含量的肽或粗蛋白级分。如果需要，鱼粉制剂可以包括具有约2％-10％、3.0％-8.0％、或4.0％-6.0％的赖氨酸含量的肽或粗蛋白级分。

本文公开的制剂可以包括孵育产物中从约1g/Kg的干固体至900g/Kg的干固体的营养物。例如，鱼粉制剂中的营养物可以以至少约2g/Kg的干固体、5g/Kg的干固体、10g/Kg的干固体、50g/Kg的干固体、100g/Kg干固体、200g/Kg的干固体、及约300g/Kg的干固体存在。在实施方案中，营养物可以以至少约400g/Kg的干固体、至少约500g/Kg的干固体、至少约600g/Kg的干固体、至少约700g/Kg的干固体、至少约800g/Kg的干固体、和/或至少约900g/Kg的干固体存在。

本文公开的制剂可以包括存在于孵育产物中的具有约1g/Kg干固体至900g/Kg的干固体含量的必需氨基酸或包含至少一种必需氨基酸的肽。例如，在鱼粉组合物中的必需氨基酸或包含至少一种必需氨基酸的肽可以以至少约2g/Kg的干固体、5g/Kg的干固体、10g/Kg干固体、50g/Kg的干固体、100g/Kg的干固体、200g/Kg的干固体、及约300g/Kg的干固体存在。在实施方案中，必需氨基酸或包含至少一种必需氨基酸的肽可以以至少约400g/Kg的干固体、至少约500g/Kg的干固体、至少约600g/Kg的干固体、至少约700g/Kg的干固体、至少约800g/Kg的干固体、和/或至少约900g/Kg的干固体存在。

本文公开的制剂可以包含在孵育期间形成的以生物质的形式的富含营养物的孵育产物和至少一种另外的营养组分。在另一个实例中，制剂包含从孵育期间形成的孵育培养液溶解和悬浮的富含营养物的孵育产物和至少一种另外的营养组分。在进一步的实施方案中，制剂具有粗蛋白级分，其包括富含至少一种必需氨基酸的蛋白。制剂可以被配制以便提供必需氨基酸的改善的平衡。

对于其他制剂，全价制剂可以包含HQPC和一种或更多种成分，诸如麦麸(“wheatmids”)、玉米、大豆粉、玉米面筋粉、酒糟或酒糟及可溶物、盐，常量矿物质、微量矿物质和维生素，在发酵或不发酵的情况下产生。其他潜在的成分通常可以包括但不限于向日葵粉、麦芽和大豆壳。掺合物制剂可以包含麦麸、玉米面筋粉、酒糟或酒糟及可溶物、盐、常量矿物质、微量矿物质和维生素。可选的成分可以通常包括，但不限于，玉米、大豆粉、向日葵粉、棉籽粉、麦芽和大豆壳。基础形式制剂可以包含麦麸、玉米蛋白粉、和酒糟或酒糟及可溶物。可选的成分可以通常包括，但不限于，大豆粉、向日葵粉、麦芽、常量矿物质、微量矿物质和维生素。

微生物中的高度不饱和脂肪酸(HUFA)，当暴露于氧化条件下可转化成为不期望的不饱和脂肪酸或成为饱和脂肪酸。然而，通过向饲料中引入合成的抗氧化剂或天然存在的抗氧化剂，诸如β-胡萝卜素、维生素E和维生素C，ω-3HUFA的饱和可以被减少或阻止。合成的抗氧化剂，诸如BHT、BHA、TBHQ或乙氧喹，或天然抗氧化剂诸如生育酚，可以通过将它们添加到产物中来掺入到食品或饲料产物，或它们可以通过在合适的生物中原位产生而被掺入。以这种方式掺入的抗氧化剂的量取决于，例如，随后的使用需求，诸如产物配制、包装方法和期望的保质期。

本公开内容的孵育产物也可以用作用于人类食用的营养补充剂，其中该方法从人类级输入材料开始，并且在整个方法中遵守人类食品质量标准。如本文公开的，孵育产物或制剂是高营养物含量的。营养物诸如蛋白和纤维与健康食物相关。可开发在食品中利用本公开内容的孵育产物或全价饲料的食谱，该食品诸如谷类食品、薄脆饼干、馅饼、饼干、糕饼、披萨饼皮、熏香肠、肉丸、奶昔，并以可食用食品的任何形式。另一种选择可以是开发本公开内容的孵育产物或全价饲料为零食或零食棒，类似于燕麦棒(granola bar)，其可以容易地进食，方便分发。零食棒可以包括来自谷物的蛋白、纤维、胚芽、维生素、矿物质，以及营养制品，诸如葡萄糖胺、HUFA、或辅因子，诸如维生素Q-10。

包含本发明孵育产物的制剂还可以补充香料。具体香料的选择将取决于被提供饲料的动物。天然和人工的香料和芳香剂，可以用于使得饲料更容易接受和适口。这些补充剂可以与所有的成分良好地混合，且可以作为液体或干产物的形式获得。将在动物饲料中补充的合适的香料、引诱剂、和芳香剂，包括但不限于鱼信息素、胡芦巴、香蕉、樱桃、迷迭香、小茴香、胡萝卜、薄荷、牛至、香草，茴香、加朗姆、枫树、焦糖、柑橘油、丁酸乙酯、薄荷醇、苹果、肉桂，其任何天然或人工的组合。香料和芳香剂可以在不同的动物之间互换。类似地，人工的或天然的各种水果香料，可以添加到用于人类食用的包括本发明的孵育产物的食品补充剂。

在实施方案中，HQPC可以是用于生成各种制剂的试剂盒的一部分，所述试剂盒包括HQPC、标签、至少一个容器和根据动物来产生制剂的说明。此外，这样的说明可以通过网络链接获得。

本公开内容的孵育产物或全价饲料的保质期通常可以比缺乏微生物的孵育产物的保质期更长。保质期可以取决于因素，诸如，产物的水分含量、多少空气可以流过饲料块、环境条件和防腐剂的使用。可以向全价饲料添加防腐剂以使保质期增加至几周和几个月。其它增加保质期的方法包括类似青贮饲料管理的管理，诸如与其它饲料混合和包装，以塑料覆盖或装袋。凉爽的环境，防腐剂和从饲料块排出空气均延长湿副产物的保质期。全价饲料可以在仓(bunker)或青贮窖袋中储存。将湿的孵育产物或全价饲料干燥也可以增加产物的保质期，并改善一致性和品质。

本公开内容的全价饲料可以被长时期储存。保质期可以通过青贮、添加防腐剂诸如有机酸、或与其它饲料诸如大豆壳混合而延长。货物桶(Commodity bins)或大容量存储仓库可用于储存全价饲料。在相关方面，本文公开的HQPC可以具有至少2年的保质期。

下面的实施例是说明性的，并不意图限制本公开的主题的范围。

实施例

实施例1.高品质蛋白浓缩物(HQPC)(沉淀方法)

图1示出了预处理白粕(white flake)，将糖转化为细胞物质(蛋白性物质)和胶(例如胞外多糖)，回收HQSPC和产生水产饲料(图2和图4)以及在鱼饲喂试验中测试产生的水产饲料的工艺方法。首先在15％的水分含量，50℃，及75rpm对白粕进行挤压预处理(BRABENDER PLASTI-CORDER SINGLE SCREW EXTRUDER Model PL2000,Hackensack,NJ)以破坏结构，并允许在随后的糖化期间增加水解酶的侵入。这些条件提供了针对在筒两侧的脊形通道(rigged channels)的剪切作用，且先前已经观察到，这导致了酶水解后50％-70％更大的糖释放。然后将挤压的白粕通过3mm锤磨机筛进行研磨，与水混合以达到10％的固体加载率，并调节至pH 5。加热以对糊状物进行巴氏灭菌或消毒后，将糊状物冷却到约50℃，并添加纤维素和寡糖解构酶(共15ml/kg白粕)以将聚合物水解为简单糖(4-24h水解)。包括的具体剂量是6％CELLIC CTEK(每克葡聚糖)、0.3％ CELLIC HTEK(每克总固体)、0.015％ NOVOZYME 960(每克固体)。然后将所得的糊状物冷却至30℃，调节pH至3-5，接种出芽短梗霉(1％v/v)，并在50rpm至200rpm的搅拌和0.5L/L/min的曝气速率孵育4-5天以将糖转化为蛋白和胶。在孵育期间，定期取出样品，并分析糖、细胞计数和胶生产。孵育后，将pH提高到6.5，并添加乙醇(0.6L/L培养液)以便将胶沉淀。蛋白、短梗霉聚糖和微生物物质(microbial mass)(HQSPC)通过离心回收并干燥，同时将上清液蒸馏以回收乙醇，且化学测定残余的液体用于将来在过程的起始进行循环利用。图5示出使用ppt方法的葡萄糖回收率。

使用大豆白粕并用出芽短梗霉微生物转化的HQSPC，用于HQSPC生产的试验性规模系统。

该系统包含675L生物反应器、变速螺杆泵(variable speed progressive cavitypump)、连续流离心机和1x4米的干燥台。用于675L生物反应器的接种物在两个5L NEWBRUNSWICK BIOFLO 3生物反应器中制备。对于每个试验，通过如描述地培养出芽短梗霉2-3天制备8-10L量的接种物。该材料用于接种在675L生物反应器中制备的较大量的挤压并糖化的白粕。孵育后，添加乙醇，将糊状物离心以回收湿固体，然后干燥湿固体，并在鱼饲喂试验中使用。通过监测转化方法的表现、HQSPC的产率和组成，观察到显著影响固体回收率的若干参数。在大规模试验中，参数如表1所示变化。

表1.预试规模试验变量和关键表现参数。

参数	试验1	试验2	试验3	试验4	试验5	试验6
							挤压	是	是	否	否	否	是
糖化时间(h)	3	3.5	4	7	5	5
							孵育pH	4.2	5.1	4.3	4.6	3.05	3.15
孵育温度(C)	29-30	29-30	29-30	26-27	29-30	29-30
							曝气(L/L/min)	0.25	0.25	0.25	0.5	0.5	0.5
孵育时间(天)	16	15	3.5	4.5	2	2.5
							固体回收率(％)	20	16	48	48	60	64
固体的蛋白％	75.18	75.04	63.93	61.5	61.61	56.86
							胰蛋白酶抑制剂(TIU)	0	0	NA	NA	16,750	6,538
上清液的固体％	2.5	5	2.1	3.89	2.39	3.4
							上清液的蛋白％	78.16	80	71.66	61.47	NA	NA

从HQSPC产率和蛋白水平，注意到以下：1)3-3.5的孵育pH和30-32℃的温度，以及高曝气，使出芽短梗霉的生长最大化并且使短梗霉聚糖的生产最小化，2)4-5天的孵育时间对于蛋白含量和固体回收率是最佳的，3)较长的孵育时间增加蛋白含量，但显著减少固体回收率，4)较短的孵育时间保持高的固体回收率，但限制蛋白含量，及5)由于在终产物中缺乏水苏糖和棉子糖，挤压和/或减少(省略)酶促糖化可能是可行的。

在5L生物反应器中进行初步工作台规模的试验以优化方法条件。挤压的白粕以10％的固体加载率使用并糖化24h，随后接种出芽短梗霉，并在pH 5、0.5L/L/min曝气、200rpm搅拌下孵育10天。测试了延长的孵育时间，以确定使固体回收率百分比和固体中的蛋白含量两者最大化的最佳收获窗。每日取出样品(100ml)，并且在隔日对其进行以下操作：

用乙醇沉淀所有的固体，离心并干燥固体，测量所得的上清液中的残余固体。

首先离心培养液以回收固体，干燥固体，从所得的上清液沉淀短梗霉聚糖并干燥。

使用实验室离心机(10,000g)，首先乙醇沉淀方法回收约97％的固体(大豆固体、细胞和胶)，并且约3％的固体剩余在液相中。首先离心方法回收约81.7％的固体(大豆固体和细胞)，并且上清液的乙醇沉淀回收约14.8％的固体(胞外多糖)，以及约3.5％的固体剩余在液体中。

通过这些工作台规模的试验，测量了每天可被回收的蛋白、短梗霉聚糖及总固体的水平。预计随着孵育的进行，蛋白和短梗霉聚糖水平会增加，但回收的总固体会减少，因为一些营养物被分解代谢为水和CO₂。来自三次重复的固体的平均蛋白水平示出在图3中。在第3-5天蛋白水平达到70％，而回收的总固体在第5-6天开始下降。因此，看起来4-5天的孵育时间可能是最佳的。

实施例2.沉淀(ppt)方法、3x洗涤方法和1x洗涤方法之间的产物比较

来自大豆的HQPC通过基本上如上所述的方法获得，并如图6-图9中说明的3x洗涤和1x洗涤循环两种方法获得。表2示出了ppt方法(HQSPC试验5和试验6)、3x洗涤和1x(HQPC)洗涤所得组合物的比较。

表2.来自ppt方法、3x和1x洗涤方法的所得蛋白浓缩物的组成(g/100g，基于干物质(dmb))。

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实施例3.通过温度水解大豆粉。

使用经己烷提取的大豆粉在水中制备10％(w/v)的大豆粉浆料。将浆料的pH设定为4.5，并搅拌浆料以获得混合。在发酵前将大豆浆料在100℃的温度加热。将加热糊状物与发酵生物一起孵育。用(来自黑曲霉(Aspergillus niger)的蛋白酶，购自Sigma)以30mg/g大豆粉的加载率处理不含发酵生物的加热糊状物，并用作对照。将样品在30℃孵育12小时。孵育后，将样品在80℃加热2分钟以灭活蛋白酶。

将糊状物加热至100℃，持续1.5分钟。将样品以4000rpm离心10秒。在硼酸缓冲液(0.12M和pH 10.4)中制备N-乙酰半胱氨酸(3.33％w/v)。将16.67μL样品上清液添加到1000mL N-乙酰半胱氨酸中。在340nm处测量吸光度。在96％(v/v)乙醇溶液中制备6％(w/v)OPA溶液。向305μL样品中添加10μL OPA溶液。含有OPA溶液的样品在室温孵育15分钟。在340nm处测量吸光度。以下计算用于计算相对水解度(％)[A340_测试(15)-A340_测试(0)]×100/[A340_对照(15)-A340_对照(0)]。参见表3。

表3.通过温度水解的大豆粉浆料的相对水解度。

实施例4.通过发酵水解大豆粉浆料。

使用经己烷提取的大豆粉在水中制备10％(w/v)的大豆粉浆料。将浆料的pH设定为4.5，并搅拌浆料以获得混合。在发酵前将大豆浆料在100℃的温度加热。将加热糊状物与发酵生物一起孵育。用以30mg/g大豆粉的加载率处理不含发酵生物的加热糊状物，并用作对照。将样品在30℃孵育12小时。孵育后，将样品在80℃加热2分钟以灭活蛋白酶。

在0小时、2小时、4小时、6小时、8小时、10小时和12小时采集发酵样品。将样品以4000rpm离心10秒。在硼酸缓冲液(0.12M和pH 10.4)中制备N-乙酰半胱氨酸(3.33％w/v)。将16.67μL样品上清液添加到1000mL N-乙酰半胱氨酸中。在340nm处测量吸光度。在96％(v/v)乙醇溶液中制备6％(w/v)OPA溶液。向305μL样品中添加10μL OPA溶液。含有OPA溶液的样品在室温孵育15分钟。在340nm处测量吸光度。以下计算用于计算相对水解度(％)[A340_测试(15)-A340_测试(0)]×100/[A340_对照(15)-A340_对照(0)]。参见表4。

表4.通过发酵水解的大豆粉浆料的相对水解度。

实施例5.通过发酵水解在离心液中制备的大豆粉浆料。

使用经己烷提取的大豆粉在来自固液分离的离心液中制备10％(w/v)的大豆粉浆料。将浆料的pH设定为4.5，并搅拌浆料以获得混合。在发酵前将大豆浆料在100℃的温度加热。将加热糊状物与发酵生物一起孵育。用以30mg/g大豆粉的加载率处理不含发酵生物的加热糊状物，并用作对照。将样品在30℃孵育12小时。孵育后，将样品在80℃加热2分钟以灭活蛋白酶。

在0小时、2小时、4小时、6小时、8小时、10小时和12小时采集发酵样品。将样品以4000rpm离心10秒。在硼酸缓冲液(0.12M和pH 10.4)中制备N-乙酰半胱氨酸(3.34％w/v)。将16.67μL样品上清液添加到1000mL N-乙酰半胱氨酸中。在340nm处测量吸光度。在96％(v/v)乙醇溶液中制备6％(w/v)OPA溶液。向305μL溶液A中添加10μL OPA溶液。含有OPA溶液的样品在室温孵育15分钟。在340nm处测量吸光度。以下计算用于计算相对水解度(％)[A340_测试(15)-A340_测试(0)]×100/[A340_对照(15)-A340_对照(0)]。参见表5。

表5.通过发酵水解的在离心液中的大豆粉浆料的相对水解度。

实施例5:通过发酵水解添加植酸酶的大豆粉浆料。

使用经己烷提取的大豆粉在水中制备10％(w/v)的大豆粉浆料。将浆料的pH设定为4.5，并搅拌浆料以获得混合。在发酵前将大豆浆料在100℃的温度加热。将加热糊状物与发酵生物一起孵育。用以30mg/g大豆粉的加载率处理不含发酵生物的加热糊状物，并用作对照。将样品在30℃孵育12小时。孵育后，将样品在80℃加热2分钟以灭活蛋白酶。

在0小时、2小时、4小时、6小时、8小时、10小时和12小时采集发酵样品。8小时、10小时和12小时的样品还用植酸酶处理。将样品以4000rpm离心10秒。在硼酸缓冲液(0.12M和pH10.4)中制备N-乙酰半胱氨酸(3.34％w/v)。将16.67μL样品上清液添加到1000mL N-乙酰半胱氨酸中。在340nm处测量吸光度。在96％(v/v)乙醇溶液中制备6％(w/v)OPA溶液。向305μL溶液A中添加10μL OPA溶液。含有OPA溶液的样品在室温孵育15分钟。在340nm处测量吸光度。以下计算用于计算相对水解度(％)[A340_测试(15)-A340_测试(0)]×100/[A340_对照(15)-A340_对照(0)]。参见表6。

表6.反映了通过发酵水解的含有植酸酶的大豆粉浆料的相对水解度。

实施例6.虹鳟鱼、尖吻鲈和银鲑饲喂试验。

使用多个批次的虹鳟鱼(Rainbow trout，Oncorhynchus mykiss)、尖吻鲈(Barramundi，Lates calcarifer)和银鲑(Coho Salmon，Oncorhynchus kisutch)完成了长期和短期饲喂试验。在所有试验中给鱼饲喂商业对照饲料，或利用如实施例2(3x洗涤)中描述制备的HQPC的高含量(25％-35％)饲料。所有饲料都使用商业饲料配制软件配制，并使用商业挤压方法制造。使用第3方实验室(Midwest Laboratories，Omaha，NE)分析饲料的所有化学分析(近似分析和矿物质组成)。

使用包含3.41m³(900加仑)水箱的RAS进行生长试验(～平均个体初始体重185g-1000g收获体重)。RAS由康奈尔式双排水水箱、固体沉降水箱、机械鼓型过滤、移动床生物反应器(MBBR)、紫外线灭菌、冷却和氧气注射组成。每天监测水质，以确保所有参数在可接受的范围内。

在第0天开始取样时，所有鱼都按水箱进行组称重以确定生物量，并且使用80mg/LMS-222麻醉每个处理的1个水箱中的所有鱼的样品，并测量叉长(fork length)和体重。在整个27周的试验中，以3周的间隔完成组重量和相同个体鱼的取样。在第16周进行取样，每水箱1条鱼(每个处理6条鱼)，进行一般健康评价，包括脾、肝、内脏脂肪和血细胞比容。

实施例7.虾饲喂试验

幼体发育试验

在Choluteca,Honduras的Sumacua孵化场生产了大约9000万只白脚虾(中南美白对虾(Litopenaeus vannamei))的无节幼体(第5期)，并将其转移到包含20公吨盐水(28ppt)的水箱中，在其中进行所有实验试验。从蚤状幼体3到仔虾13(Postlarval 13，PL13)，虾幼体被饲喂四种包含HQPC(包含水平高达70％)的饲料中的一种。存活率(％)是从对试验结束时所有存活的幼体进行计数的等分试样的推断确定的。

生长试验

太平洋白脚虾(中南美白对虾)(平均1.6g)以每水箱20只动物的密度随机放养(n＝700)。每个处理被随机分配到5个重复水箱。实验食物每天提供3次(0800hr、1200hr和1600hr)，持续42天。在试验开始前，给所有虾饲喂相同比例的对照食物。在试验开始时(第1天)，给虾提供实验食物，并饲喂至明显饱食。总饲料消耗用于估计饲料转化比率(feedconversion ratio)。当虾的放养发生时(第0天)记录水箱生物量，并以3周的间隔再次记录，直到试验完成。总水箱生物量测量值用于计算试验过程中的相对生长(RG)、比生长速率(SGR)和生物量增加。

实验在8,246L循环水产养殖系统(RAS)中进行。该系统配备有35个190L半方形水箱，每个水箱配备有从次表层抽水的循环排水管和固定至水箱中心底部最低点的排污管。每个水箱都有由鼓风机供给的强制空气扩散器、控制水流方向的进水口流杆(flow bar)、以及为水箱的一半提供黑暗的盖子和允许光线穿透水箱另一半的网。RAS还配备了离心水泵、珠过滤器、紫外线过滤器、生物过滤器、3个固体沉降池、澄清池、进水浮阀和加热器/冷却器单元。RAS置换水来源于井水。至每个水箱的水流量维持在6L min^-1至7L min^-1，并且水温维持在28℃和30℃之间。在整个研究中，溶解氧维持在5.0mg L^-1以上，pH保持在7和8之间，并且盐度维持在22ppt。每天(0800hr)监测温度、溶解氧和pH，而每周监测氨(NH₃)和亚硝酸盐(NO₂)。

攻击试验

进行试验，以确定包含HQPC的食物在减轻虾早期死亡综合征/急性肝胰腺坏死病(EMS/AHPND)的严重性和影响方面的有效性。该试验在Ho Chi Minh City,Vietnam的ShrimpVet实验室进行，并持续33天，包括1天的适应期、21天的饲喂期、1天的攻击和攻击后的随后10天。

试验在120L塑料水箱中进行。所有水箱都配备了活性珊瑚生物过滤器、曝气装置，并盖上塑料盖，以减少交叉污染的风险。在每次试验中使用盐度为千分之20(ppt)的微咸水(brackish water)。在试验期间，虾自由进食各自的食物，每天四餐。在试验期间记录饲料消耗。测试食物包括一种基础食物和六种包含HQPC的处理食物(包含水平10％-30％)。饲喂量根据生物量和实际饲料消耗进行调整。每天测量水质参数诸如溶解氧(DO)、pH和温度。每周测量总氨氮、亚硝酸盐和碱度两次。

该试验中利用了无特定病原体(SPF)虾(中南美白对虾)，其原始遗传学是从夏威夷亲虾(Hawaii broodstock)获得的，使用PCR技术检查了其重要的病原体，包括虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaeid，EHP)、白斑综合征病毒(WSSV)、托拉综合征病毒(Taura syndrome virus，TSV)、感染性肌肉坏死病毒(Infectious myonecrosis virus，IMNV)和EMS/AHPND病。无节幼体在严格的生物安全设施中饲养。还使用PCR技术再次检查了后期幼体的重要病原体，包括EHP、WSSV、TSV、IMNV和EMS/AHPND病。仔虾在生物安全条件下生长。在开始研究的前一天，将虾进行按组称重，以确定初始体重。初始平均虾体重为0.56±0.04克。

在这项试验中还使用了浸没攻击(immersion challenge)方法。处理水箱和阳性对照共28个水箱经受浸没攻击。将胰蛋白酶大豆培养液+2％氯化钠(TSB+)接种副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的持续毒力株，孵育24小时。将细菌悬浮液添加到水箱中，以达到通过光密度吸光度(OD600 nm)测量的密度处于预计在10天内杀死阳性对照的90％(LD90)的细菌密度。阴性对照(共4个水箱)用直接添加到水箱中的无菌TSB+处理。攻击剂量为3.25×10⁵CFU/mL，其为致死剂量90％(LD90)。在虾组织中进行标准组织病理学、H&F染色。

实施例8.鱼饲喂试验

多于一项试验的ANOVA结果指示，对照鱼显著更小，并受到处理(P＝0.002)和周(P<0.001)两者的影响。另外，处理或周之间的FCR不存在显著差异(图12)。协方差分析(处理x周)揭示，绝大多数差异来自周，而不是处理饲料。然而，处理(P＝0.046)和周(P<0.001)两者的每条鱼的平均体重存在显著差异，指示饲喂基于HQPC的饲料的鱼始终大于饲喂对照饲料的鱼。处理(P＝0.001)和周(P<0.001)两者的FCR也存在显著差异，指示饲喂基于HQPC的饲料的鱼始终比饲喂对照饲料的鱼更高效地利用饲料。该研究的总体结果与用发酵大豆粉饲喂虹鳟鱼的其他实验相似。类似地，在这些研究中没有观察到肠炎，并且在饲喂基于HQPC的饲料的虹鳟鱼的远端肠中没有发现负面作用。

在第二项和类似的试验中，饲喂基于HQPC的饲料的鱼具有比对照饲料(～1.25)显著且始终更低的FCR(～1.0)(图13a、图13b)。ANCOVA揭示了处理(P<0.001)以及周(P<0.001)的显著影响。每条鱼的平均体重差异归因于周(P<0.001)，并且在处理之间没有差异(P＝0.305)。K值(P＝0.758)、脾体指数(splenosomatic index)(P＝0.998)、肝体指数(hepatosomatic index)(P＝0.475)或内脏体指数(viscerosomatic index)(P＝0.411)不存在显著差异。饲喂基于HQPC的饲料的鱼具有显著更大的内脏体指数(P＝0.040)和更低的血细胞比容(P＝0.005)。

实施例9.虾饲喂试验

幼体发育试验

在孵化场食物中包含不同百分比的HQPC显示出有前景的结果，改善了几个生产力参数，包括幼体阶段的存活率(图14)。

生长试验

以高达50％水平的HQPC饲喂的虾的周生长率与饲喂商业饲料的虾没有显著差异(图15)。虽然虾的生长可以受到许多其他因素(诸如水质条件和遗传)的影响，但基于从试验中观察到的虾的响应，HQPC处理之间不存在差异，证实了HQPC在商业饲料制剂中的用途。生长试验结果揭示，HQPC较高的表观消化系数和较高的氨基酸消化率导致动物更好的生长。

攻击试验

获得的结果指示，不同包含水平的应用对改善EMS感染的虾的存活率具有积极作用。基于这些结果，在用包含HQPC的食物的所有处理中观察到存活率的改善。试验指示，30％的HQPC的应用对改善EMS感染的虾的存活率具有积极作用。(图16)。

水质

配制饲料是允许生产集约化的主要驱动力，但也是RAS中N和P的主要来源。另外，在为RAS项目配制水产养殖饲料时，磷是最关键的矿物质之一。平均而言，HQPC包含0.4％的磷(表7)，并且最终产物的植酸浓度平均低于0.12(g/100g)。

表7.磷含量(％干物质)、磷可用性(％)和磷排放(％干物质)的比较。

在连续使用包含HQPC的饲料18个月后，在商业鳟鱼经营中采集的数据显示，磷的排放减少了69％，初始磷排放水平0.21mg/L降至0.065mg/L。在虾生长和攻击试验期间，每天记录水质参数。展示了水质参数的值(温度、DO、pH、TAN、亚硝酸盐和碱度)(表8)。

表8.水质参数。同一行内共享共同上标的值(表示为平均值±SE)没有显著差异(P>0.05)。

比较鱼类试验测试HQPC和鱼粉水质测量显示出特定的差异。HQPC和鱼粉处理的RAS水中的总溶解固体分别为774ppm和822ppm。在系统水箱中测量的浊度(NTU)显示，HQPC(0.4)略好于鱼粉对照(0.6)。

消化率研究在圣保罗大学海洋研究所(Oceanographic Institute,UniversityofPaulo，USP；/>Paulo,Brazil)水产养殖实验室(Aquaculture Laboratory，LAM)进行。两种大豆产物的样品由Prairie AquaTech(South Dakota,USA)提供。大豆产物的样品(非GMO大豆粉、SBM(46.8％粗蛋白(CP))和HQPC(74.6％ CP))具有合适的粒径(>150微米)，并被分析以确定它们的蛋白水解度(DH，百分比)。

用从池塘养殖的太平洋白虾(平均体重10克)的肝胰腺中回收的标准化消化酶测试这些样品的体外蛋白消化。用虾的酶水解包括将80mg成分蛋白悬浮在蒸馏水中，在添加用于水解的肝胰腺酶提取物后，悬浮液的pH设置为8.0。

pH变化和水解监测由商业软件控制的电位滴定仪在温度控制装置(30±0.6℃)中自动进行。在该反应pH(＝8.0)，成分肽键的酶促断裂产生反应pH的轻微降低，反应pH被滴定仪记录并通过氢氧化钠(NaOH)的添加自动中和。在反应结束时，消耗的滴定剂(NaOH)的量与裂解的肽键数量和提供的定量值成正比。

分析中没有使用缓冲液或其他化学物质。如果确定显著，则计算空白DH值以计算成分蛋白的净DH。

研究结果显示出虾消化酶对测试成分的水解度(DH)的显著差异(表9)，其中对HQPC获得的DH值表现出可水解蛋白比大豆粉的可水解蛋白多42％，并且比大豆蛋白浓缩物的可水解蛋白多33％。

对于脱壳或未脱壳样品，SBM的典型DH值分别在4.0％和4.2％之间。对来自主要生产国(印度、阿根廷、美国和巴西)的一组超过40个SBM样品的可比较pH stat研究的结果显示，DH值在3.74％和4.43％之间。

需要对新成分进行适当的筛选，以评估其潜在的营养价值和可变性。各种研究显示，来自目标虾类物种或鱼类物种的酶对成分的体外消化与表观蛋白消化率(APD)相关。近半个世纪以来，pH-stat方法被用于监测热处理对大豆蛋白胰蛋白酶蛋白水解初始速率的作用。先前的研究也显示了幼体太平洋白虾的表观蛋白消化率(APD)和体外DH之间的关系。

中南美白对虾对粗蛋白的平均体内表观消化系数为85％至90％。在进行的试验中，HQPC的水解度(DH)估计为7.18％，并且预测表观蛋白消化率(PPD)为93.1％。当与其他研究相比时，HQPC的DH和PPD的值是测试的超过150种成分中确定的最高的，高于各种鱼粉、大豆蛋白浓缩物和非GM大豆粉(表9)。

表9.用太平洋白虾(中南美白对虾)消化酶提取物对成分样品进行体外蛋白消化(DH，蛋白水解度)。

*发现具有不同上标的平均值显著不同(P<0.05)。

**对不同饲料成分，通过体内表观蛋白消化率和太平洋白虾消化酶的体外蛋白消化(DH)之间的回归计算预测表观蛋白消化率(PPD)。

除了先前的多项研究之外，该评价显示出商业产品HQPC在体外消化率方面在水产养殖食物中作为鱼粉替代成分的潜力。结果显示，该成分产品比各种大豆粉成分具有显著更高水平的可水解蛋白，并且还具有更高的预测表观蛋白消化率。

实施例10.HQPC对弧菌的作用

材料和方法

HQPC样品(例如ME-)从Prairie AquaTech(Brookings，South Dakota)获得。将子样品以测试剂量重悬于蒸馏水中。

为了获得细菌分离株，制备了具有疾病症状的完整中南美白对虾幼体的浸渍物。

TCBS琼脂：对于总弧菌的分析，制备了补充有2％氯化钠的Difco TCBS琼脂，并在35℃孵育24小时。将1升溶液的pH调节至8.6，并在频繁搅拌的情况下加热至沸腾，持续2分钟。然后将溶液放置在无菌平板上，直到琼脂凝固，并在2-8℃储存，直到使用。

ChromAgar Vibrio：对于副溶血弧菌和创伤弧菌，使用ChromAgar Vibrio培养基。将粉末状琼脂(74.7g)溶解在1升蒸馏水，均质化并在100℃加热至沸腾。

TSA琼脂(胰蛋白胨大豆琼脂)：对于益生菌菌株的分离、纯化和生长测试，使用Difco TSA培养基。将粉末状琼脂(40g)溶解在1升蒸馏水中。将溶液均质化2分钟，并且随后铺板并在121℃高压灭菌15分钟。

TSB(Trypticase Soy Broth，Trypticase大豆培养液)：Difco TBS培养基用于副溶血弧菌、创伤弧菌和几种商业益生菌菌株的分离、纯化和生长测试。将粉末状琼脂(30g)溶解在1升蒸馏水中。将溶液均质化2分钟，并且随后铺板并在121℃高压灭菌15分钟。

以三种浓度：5％、10％和15％向所有琼脂和液体培养基中添加HQPC。培养基中所有指定浓度的包含均用于测量针对副溶血弧菌和来自三个公司的商业益生菌的作用。

琼脂接种：虾后期幼体(0.1g)称重、浸渍并重悬于200μl无菌蒸馏水中。将50μl样品接种在TCBS琼脂和ChromAgar中。将所有弧菌和益生菌重悬于TSB培养基中。在益生菌的情况下，将50μl样品接种在TSA琼脂平板中，并且对于弧菌物种，将50μl样品接种在ChromAgar中。

琼脂中细菌生长计数的结果表示为每g幼体浸渍物和每ml重悬液的菌落形成单位(CFU)。弧菌物种和益生菌的生长曲线使用Photometer 9300(Xylem Analytics,Norway)从600nm处的OD读数产生，并且将它们表示为细胞/ml。

PCR方法：使用裂解缓冲液和PCR技术完成DNA提取和评价方案(参见，例如，PCRProtocols-A Guide to Methods and Applications(Innis等人编著)，1990，AcademicPress,Inc.,San Diego,CA)。使用的引物遵循AP4方法(Dongtip等人，AquacultureReports(2015)2:158-162，通过引用并入本文)，使用三(3)种序列：F1(SEQ ID NO:22,5’ATGAGTAACAATATAAAACATGAAAC 3’)、R1(SEQ ID NO:23,5’ACGATTTCGACGTTCCCCAA 3’)和F2(SEQ ID NO:24,5’TTGAGAATACGGGACGTGGG 3’)。MINIAMP^TM Plus热循环仪(Thermo Fisher,Waltham,MA)中的扩增条件为：对于变性为94℃x 0:30sec；杂交55℃x 0:30sec；和聚合72℃x 1:45min，对于第一和第二PCR测试均为25个循环。

结果

HQSP以在培养基ChromAgar Vibrio和硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂(TCBS)中的0.5％、1％和2％包含水平对虾幼体浸渍物中存在的弧菌型细菌的抑制能力。

对虾幼体样品进行评价以确定副溶血弧菌和创伤弧菌的存在，这是为从孵化场购买虾幼体时评价动物健康而建立的常规方案。连续七(7)天，每天从商业孵化场(怀疑感染了AHPND)收集和处理五(5)份活幼体样品。将掺入TCBS和ChromAgar培养基中。从该评价获得的结果指示，HQSP显示出对弧菌类型1的抑制活性分别在38％、48％和57％之间。对于类型2弧菌，1％和2％剂量的抑制率分别为78％和100％，并且对于副溶血弧菌的抑制率分别为38％、45％和62％(图17)。

使用TCBS琼脂对虾幼体浸渍物的评价指示HQPC的存在对弧菌的抑制活性(图18)。类似地，在ChromAgar中，当以0.5％使用HQPC时，发生副溶血弧菌减少(图19)。

实施例11.HQPC以在TBS培养基中的1％和2％包含水平对虾幼体浸渍物中存在的副溶血弧菌的抑制能力

从幼体样品中分离出三种EMS相关菌株，在ChromAgar和TCBS上生长，并使用PCR测试。另外，将副溶血弧菌菌株在包含1％和2％ HQPC的液体TSB培养基中进行培养。每6小时一次接种培养皿，以验证细菌动态和对细菌生长的作用。结果显示，1％和2％的HQPC在时间零点有27％的抑制作用。对于两种剂量，在培养的前6小时后，副溶血弧菌的生长均受到削弱，生长减少了40％。在12小时有轻微的恢复，并且在18小时，重新激活的细菌生长恢复正常(图20)。

实施例12.HQPC以在TSB培养基的5％、10％和15％包含水平对虾幼体浸渍物中存在的副溶血弧菌和创伤弧菌的抑制能力

从具有疾病体征的幼体样品中分离出创伤弧菌菌株并用于本实施例。在厄瓜多尔，副溶血弧菌和创伤弧菌在10⁴CFU水平的关联已被确定是导致高死亡率的原因。

将副溶血弧菌和创伤弧菌菌株重悬并在包含5％、10％和15％ HQPC的TSB培养基中于32℃孵育1小时以重新激活。立即在ChromAgar Vibrio中进行孵育以确定对细菌生长的作用。结果显示，10％包含水平的HQPC可以强烈影响创伤弧菌的生长。在18hr时细菌群体减少率为72％。在15％的包含水平，副溶血弧菌的生长率显著降低多达63％(图21)。

实施例13.使用PCR检测暴露于1％和2％包含水平的HQPC时的副溶血弧菌

对于本实施例，使用先前通过PCR鉴定的菌株VPQB020(副溶血弧菌)。细菌在HQPC包含水平为1％和2％的ChromAgar Vibrio中生长。在平板中对CFU计数，并在不同的包含水平对培养基中生长的每种细菌进行PCR。

使用AP4毒素引物的PCR扩增结果用于检测样品1和样品2中的AHNPD。然而样品3-5为阴性。还呈现了提取对照、PCR和阳性PCR对照(图22)。

细菌CFU计数的结果确定2％包含水平的HQPC抑制副溶血弧菌负荷的生长高达50％，由针对AP4毒素的阴性PCR证实(表10)。

表10.在HQPC以1％和2％的包含水平存在的情况下副溶血弧菌的生长。使用PCR检测细菌的存在。

实施例14.HQPC在1％和2％的包含水平对三(3)株商业益生菌的抑制活性的评价

三(3)种商业益生菌用于该测试。在包含1％和2％ HQPC的TSB培养基中重新激活菌株，并在30℃孵育24小时。随后，每六(6)小时在无盐的TSA培养基中孵育样品。示出的结果来自琼脂平板中计数的细菌水平的CFU读数相比于从对照中获得的CFU计数。该比例用于发现HQPC抑制与益生菌活性之间的关系。商业益生菌在HQPC为1％时显示出71％、38％和6％的抑制，并且在HQPC为2％时显示出72％、44％和8％的抑制(图23)。

实施例15：HQPC对高放养密度的虾的作用

在本实施例中使用无病原体虾(如通过PCR确定的)。使用了容量为350L的水箱，并且所有水箱都配备了活性珊瑚过滤器、曝气装置并覆盖有塑料薄膜盖，以减少交叉污染的风险。使用盐度为千分之20(ppt)的半咸水(Brackish water)。

如表11中叙述，提供了七种食物。

表11.试验食物。

该试验被设置为完全随机设计(CRD)。处理在表12中描述。

表12.试验的处理定义

虾每天按各自的食物自由饲喂6-8次。试验期间记录饲料消耗量。

生长表现参数包括平均体重增加(MWG)、平均日生长(ADG)、比生长速率(SGR)、饲料转化率和存活率根据如下公式计算：

MWG(g)＝W2-W1

其中，W₁和W₂分别是时间t₁和t₂时的体重，t₁和t₂分别是饲喂时间段的第一天和最后一天。N代表虾的数量，N_i代表虾的初始数量，并且N_f代表虾的最终数量。

结果以平均值±标准偏差表示。使用SPSS软件版本20的统计方差分析(ANOVA)，通过邓肯检验(duncan test)分析水质参数、存活率和生长表现参数的平均值，在显著性水平方面为5％。

结果

在试验期间，每天对所有存活者计数，以评估存活率。试验中虾的存活率在图24中示出。从图中可以观察到，在61天的试验后，在存活率方面，各处理之间不存在显著差异(P>0.05)。

生长表现参数的结果在表3中示出。

表13.生长表现。

值表示为平均值(n＝4)±标准偏差。列上相同字母表示无显著差异(P>0.05)。

试验指示，在最终平均体重(FW)、平均体重增加、平均日生长(ADG)、比生长速率(SGR)和饲料转化率(FCR)方面，施用61天食物A后的虾生长表现与其他食物相比具有显著更好的结果。

然而，从表13可以观察到，(a)与商业饲料相比，所有包含HQPC的处理都给出了相当的结果，即使商业饲料试验是低放养密度的，并且包含HQPC的食物是在高放养密度试验的，以及(b)在大部分时间(即，40天)，在食物中包含10％ HQPC没有显示出生长表现的降低(参见表12和表13)，其中人们期望针对弧菌的抗菌活性(参见实施例12)。因此，在水产养殖池塘或水箱中，添加10％ HQPC对于高放养密度的养殖虾的有效生长表现应该是足够的，其中期望保护这样的养殖虾免受弧菌物种感染。

结论

使用HQPC的不同包含水平确定针对几种虾细菌病原体(包括创伤弧菌和副溶血弧菌(AHPND菌株))的抗菌活性。

实施例中的评估指示，在低至1％的包含水平，HQPC改善了对与虾水产养殖中的高死亡率相关的创伤弧菌和副溶血弧菌的抗性。结果证实，将本公开内容的HQPC添加到白虾(中南美白对虾)的食物中，将赋予虾抵抗与EMS相关的弧菌物种的保护作用。

此外，HQPC的这种抗菌特性(即，以低至饲料中1％和10％之间的包含率水平抑制弧菌的能力)应该在高放养密度和超密集放养密度有效。

本文引用的所有参考文献通过引用以其整体并入。

根据以上讨论，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不脱离其精神和范围的情况下，可以对实施方案进行各种改变和修改，以使其适应各种用途和条件。因此，除了本文所示出和描述的那些之外，实施方案的各种修改对于本领域普通技术人员而言从前述描述将是明显的。这样的修改也预期落入所附权利要求书的范围之内。

序列表

<110> 普莱瑞水产技术有限责任公司

<120> 高品质蛋白浓缩物作为水生有壳动物抗菌剂的用途

<130> PRAT-A-VIBRIO-PCT

<150> US 17/093,557

<151> 2020-11-09

<150> US 63/052,745

<151> 2020-07-16

<150> US 63/039,694

<151> 2020-06-16

<150> US 63/036,274

<151> 2020-06-08

<150> US 63/035,797

<151> 2020-06-07

<150> US 62/932,684

<151> 2019-11-08

<150> US 63/145,738

<151> 2021-02-04

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1876

<212> DNA

<213> 出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)

<400> 1

gatcccgccg gattacggaa aataacagag cgagttcgta tgcgatgatc ttcgctggag 60

atgtgctaca tccacagctc gaacataaat agagaagaca atgccgcctg gctgtccaac 120

atcaactcct ctcatatccg caagcttcct gtcaaccctc ctcacagttc gctcatcact 180

caaacatgcg ttccaggacg aacatcgctc ttggcctagc tgccactggt tccctagtcg 240

ctgccgcgcc ttgcgatatc tatcagaatg gcggtactcc ttgcgtagct gctcacggca 300

caactcgcgc attgtatgat tcctacactg gtcctctcta ccaacttaag agaggctcag 360

atggcactac gaccgatatt tctcctttgt ctgctggtgg tgttgccaat gctgctgctc 420

aggactcttt ctgcaagggt actacctgtc ttatcagtat tatctacgat cagtctgggc 480

gtgcaaacca tctttatcag gcccagaaag gtgctttcag cggaccagat gtcaacggaa 540

acgacaactt ggcaggcgct attggagcac cagtgacttt gaatggcaag aaggcatatg 600

gcgtgttcat ctcgcccggc actgggtaca gaaacgacga agtcagcggc acggccactg 660

gaaacgaacc tgagggcatg tatgctgttc ttgacggcac tcattacaac gatgcttgct 720

gctttgacta cggaaacgcg gaaatcagca acacggatac tggtaacgga catatggagg 780

ccgtctacta tggtaacaac acgatttggg gcagtggctc tggcagcggt ccttggctca 840

tggccgacct tgagaacggt ttgttctctg gccagggtac caagcagaac actgcagacc 900

cttcaatctc caacagattc ttcaccggaa tggtcaaggg agagcctaac cagtgggcgc 960

ttcgcggtag caatgccgcg tccggttcct tgtcgaccta ctacagtggc gctcgtccca 1020

ccgtcggcgg ttacaacccc atgagcctcg agggcgccat cattcttggc atcggtggcg 1080

ataacagcaa tggcgctcag ggcactttct atgagggggt catgacctcg ggctacccgt 1140

ctgatgccac tgaagcctcg gtgcaggcca acattgtggc tgcgaagtac gctaccacat 1200

ctttgaacac agcaccactc actgtcggca acaagatttc gatcaaggtg accacccccg 1260

gctacgacac ccgctatctg gcacacaccg gagccaccgt caacacgcag gttgtctctt 1320

catctagcgc gactagcctc aagcagcagg ccagctggac tgttcgcaca ggcctcggta 1380

acagcggctg ttactctttc gagtcggttg atacacctgg aagcttcatc agacactaca 1440

acttccagct ccagctcaac gcgaatgaca acaccaaggc tttcaaggaa gacgcgactt 1500

tctgctctca gaccggtctt gttaccggca acactttcaa ctcgtggagc taccctgcca 1560

agttcatccg tcactacaac aatgttggat acatcgccag caacggtggt gttcacgact 1620

ttgactctgc tacaggcttc aacaacgatg tcagctttgt ggttggaagc agctttgctt 1680

agatgtaaaa ggtcaggatg aatatgatgg atgtttatga caaaagaagt tatgagtttg 1740

tagttatgga atcttagctg tagcttttga aagcctttgg gatatcagat gtttgtctct 1800

tgttcatgtg ccgttgcaaa gaagaaaaga aggagcagca agcagtgagg ctcttatcgg 1860

gcgatagggc tagatc 1876

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 正向PCR引物

<400> 2

tgactacgga aacgcggaaa 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 反向引物

<400> 3

cattgctgtt atcgccaccg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 正向引物

<400> 4

gcttcctgtc aaccctcctc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 反向引物

<400> 5

cacgccatat gccttcttgc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 正向引物

<400> 6

ttgactacgg aaacgcggaa 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 反向引物

<400> 7

aggcttcagt ggcatcagac 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 正向引物

<400> 8

tcagcggacc agatgtcaac 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 反向引物

<400> 9

tttccgcgtt tccgtagtca 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 正向引物

<400> 10

caacacgatt tggggcagtg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 反向引物

<400> 11

gagcgccatt gctgttatcg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 正向引物

<400> 12

cggaaacgac aacttggcag 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 反向引物

<400> 13

gtgttgctga tttccgcgtt 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 正向引物

<400> 14

cgataacagc aatggcgctc 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 反向引物

<400> 15

gaggctagtc gcgctagatg 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 正向引物

<400> 16

ggaatggtca agggagagcc 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 反向引物

<400> 17

gagcgccact gtagtaggtc 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 正向引物

<400> 18

ccggcaacac tttcaactcg 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 反向引物

<400> 19

cctatcgccc gataagagcc 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 正向引物

<400> 20

cactggttcc ctagtcgctg 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 反向引物

<400> 21

ggctctccct tgaccattcc 20

<210> 22

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 正向引物 1

<400> 22

atgagtaaca atataaaaca tgaaac 26

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 反向引物 1

<400> 23

acgatttcga cgttccccaa 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 正向引物 2

<400> 24

ttgagaatac gggacgtggg 20

Claims (20)

1.一种饲料组合物，所述饲料组合物包含发酵农业生物质，其中所述饲料组合物与缺乏所述发酵农业生物质的相同饲料组合物相比改善了水生有壳动物对与急性肝胰腺坏死综合征(AHPND)/早期死亡综合征(EMS)相关的弧菌(Vibrio)物种的抗性。

2.根据权利要求1所述的饲料组合物，其中所述农业生物质是来自选自由以下组成的组的农业生物质的高品质蛋白浓缩物：大豆、高粱、花生、豆类、油菜籽、燕麦、大麦、黑麦、羽扇豆、蚕豆、油菜、豌豆、芝麻、棉籽、棕榈仁、大麦、葡萄籽、橄榄、红花、向日葵、椰干、玉米、椰子、亚麻籽、榛子、小麦、水稻、马铃薯、木薯、豆科植物、亚麻荠籽、菥蓂籽、芥菜籽、小麦胚芽粉、玉米面筋粉、玉米面筋饲料、蒸馏/酿酒副产物及其组合，并且其中所述发酵农业生物质在1％和10％(dmb)之间的包含率表现出改善的抗性特性。

3.根据权利要求1所述的饲料组合物，其中所述农业生物质通过深层发酵用选自由以下组成的组的生物发酵：出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)、克鲁维酵母属物种(Kluyveromyces spp.)、毕赤酵母属物种(Pichia spp.)、乳酸菌、里氏木霉(Trichodermareesei)、平菇(Pleurotus ostreatus)、根霉属物种(Rhizopus spp.)及其组合。

4.根据权利要求3所述的饲料组合物，其中所述生物是真菌。

5.根据权利要求4所述的饲料组合物，其中所述真菌是出芽短梗霉。

6.根据权利要求2所述的饲料组合物，其中所述农业生物质来自大豆。

7.根据权利要求1所述的饲料组合物，其中所述弧菌物种选自由以下组成的组：溶藻弧菌(V.alginolyticus)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、哈维氏弧菌(V.harveyi)、创伤弧菌(V.vulnificus)、魔鬼弧菌(V.diabolicus)、海鱼弧菌(V.damsella)、费氏弧菌(V.fischeri)、鳗弧菌(V.anguillarum)、坎氏弧菌(V.campbelli)、V.pelagicus、东方弧菌(V.orientalis)、奥氏弧菌(V.ordalii)、地中海弧菌(V.mediterranei)和火神弧菌(V.logei)。

8.根据权利要求1所述的饲料组合物，其中所述组合物中的发酵农业生物质含量为所述饲料组合物的干重的约1％和10％之间。

9.根据权利要求1所述的饲料组合物，其中所述水生有壳动物选自由以下组成的组：Kadal虾、奋进虾、油背虾、斑点虾、北方褐虾、肉质对虾、褐虎对虾、印度明对虾、日本囊对虾、caramote对虾、香蕉对虾、巨虎对虾、南方粉红虾、圣保罗虾、红尾对虾、南方白虾、绿虎对虾、北方白虾、蓝虾、南方褐虾、白脚虾、Atlantic seabob、秋酱虾、季风河对虾、巨河对虾、普通对虾、美洲龙虾、欧洲龙虾、贵族螯虾、多瑙河螯虾、信号螯虾、红沼泽螯虾、yabby螯虾、红爪螯虾、马龙螯虾、长腿多刺龙虾、三疣梭子蟹、锯缘青蟹、中国河蟹及其组合。

10.根据权利要求9所述的饲料组合物，其中所述水生有壳动物是虾，并且其中所述虾是中南美白对虾(Litopenaeus vannamei)。

11.一种预防、治疗水生有壳动物中由弧菌物种引起的急性肝胰腺坏死综合征(AHPND)/早期死亡综合征(EMS)或针对水生有壳动物中由弧菌物种引起的急性肝胰腺坏死综合征(AHPND)/早期死亡综合征(EMS)提供预防的方法，包括在水产养殖池塘和/或水产养殖水箱进行放养后20-30天内给虾幼体饲喂包含高品质蛋白浓缩物(HQPC)的饲料组合物。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述饲料组合物的HQPC含量为所述饲料组合物的干重的1％和10％之间，并且其中所述水生有壳动物以高放养密度或超密集放养密度存在。

13.根据权利要求11所述的方法，还包括从饲喂的水生有壳动物中选择样品，并分离虾幼体浸渍物，其中评价所述浸渍物中弧菌物种的存在。

14.根据权利要求13所述的方法，其中通过PCR经由AP4毒素的检测或通过确定表现出与AHPND/EMS相关的疾病体征的水生有壳动物幼体中的细菌减少来评价所述浸渍物。

15.根据权利要求14所述的方法，其中用于PCR的引物包括SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24中列出的序列。

16.根据权利要求11所述的方法，其中所述饲料包含与HQPC混合的以下中的一种或更多种：鱼粉、家禽副产物粉、干酒糟和可溶物、玉米面筋粉和大豆粉，其中所述HQPC包含含有低短梗霉聚糖产率的出芽短梗霉(A.pullulans)的发酵植物产物和至少约65％至约75％的蛋白含量(dmb)，其中所述HQPC表现出选自以下的一种或更多种特性：至少约2％的水解度(DH)、至多约4％的灰分含量或小于约0.1ppm的钾和镁含量。

17.根据权利要求11所述的方法，其中所述弧菌物种选自由以下组成的组：溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、魔鬼弧菌、海鱼弧菌、费氏弧菌、鳗弧菌、坎氏弧菌、V.pelagicus、东方弧菌、奥氏弧菌、地中海弧菌和火神弧菌。

18.根据权利要求11所述的方法，其中所述水生有壳动物选自由以下组成的组：Kadal虾、奋进虾、油背虾、斑点虾、北方褐虾、肉质对虾、褐虎对虾、印度明对虾、日本囊对虾、caramote对虾、香蕉对虾、巨虎对虾、南方粉红虾、圣保罗虾、红尾对虾、南方白虾、绿虎对虾、北方白虾、蓝虾、南方褐虾、白脚虾、Atlantic seabob、秋酱虾、季风河对虾、巨河对虾、普通对虾、美洲龙虾、欧洲龙虾、贵族螯虾、多瑙河螯虾、信号螯虾、红沼泽螯虾、yabby螯虾、红爪螯虾、马龙螯虾、长腿多刺龙虾、三疣梭子蟹、锯缘青蟹、中国河蟹及其组合。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述水生有壳动物是虾，并且其中所述虾是中南美白对虾。

20.HQPC在产生预防、治疗水生有壳动物中急性肝胰腺坏死综合征(AHPND)/早期死亡综合征(EMS)或针对水生有壳动物中急性肝胰腺坏死综合征(AHPND)/早期死亡综合征(EMS)提供预防的药物饲料中的用途，其中所述药物饲料包含与HQPC混合的以下中的一种或更多种：鱼粉、家禽副产物粉、干酒糟和可溶物、玉米面筋粉和大豆粉，其中HQPC包含通过深层发酵获得的含有低短梗霉聚糖产率的出芽短梗霉的发酵植物产物和至少约65％至约75％的蛋白含量(dmb)，并且其中其中所述HQPC表现出选自以下的一种或更多种特性：至少约2％的水解度(DH)、至多约4％的灰分含量、小于约0.1ppm的钾和镁含量、或相对于产生它的饲料原料，原始NIR光谱在4664cm^-1和4836cm^-1之间的向下迁移。