CN117178188A - 通过质谱法对胰岛素样生长因子-i变体的识别和定量 - Google Patents

通过质谱法对胰岛素样生长因子-i变体的识别和定量 Download PDF

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Abstract

本公开提供了用于检测样品中的胰岛素样生长因子‑I(IGF‑I)变体的方法。本文所提供的方法进一步涉及使用所检测的一个或多个离子来确定所述样品中IGF 1变体的存在。

Description

通过质谱法对胰岛素样生长因子-I变体的识别和定量
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年3月19日提交的美国临时申请第63/163,502号的优先权，该临时申请的内容以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
本发明涉及使用质谱法对胰岛素样生长因子1变体的识别和定量。
背景技术
IGF-I是一种具有与胰岛素相似的分子结构的激素。它是一种由肝脏产生的肽，并且在具有三个分子内二硫桥的单链中含有70个氨基酸。IGF-I具有约7,649Da的分子量，并且在血清中与蛋白质高度结合。产生受生长激素刺激，并且可能因营养不良、生长激素不敏感、缺乏生长激素受体或下游信号通路故障而受阻。IGF-I在儿童生长中发挥重要作用，并且在成人中继续发挥合成代谢作用。
基于高分辨率LC-MS的方法对于来自大多数患者的样品中的肽的定量是有效的；然而，由于多态性引起的氨基酸取代可以导致质量的改变，本质上“隐藏”了多态性变体。当监测具有较多氨基酸残基的较大多肽时，具有多态性的可能性增加。
由于蛋白质定量是基于野生型(WT)蛋白质的特定质荷比(m/z)下的峰强度，因此IGF-1定量仅包括WT，并且不包括多态性。例如，IGF-1变体的存在可以指示WT浓度仅表示杂合子个体的循环IGF-1的一半，或者野生型IGF-1的不存在可以通过个体对于一个变体是纯合子或对于2个不同变体是杂合子来解释。据报告，一些变体具有致病性，而大多数其他变体的临床意义尚不清楚。临床医生当临床医生为其患者解释IGF-1测试结果时，此信息对其非常重要。另外，了解具有特定表型的患者中存在哪些变体将有助于扩大我们对基因型-表型关系和其临床意义的理解。
需要一种有效的方法来识别IGF-1变体。
发明内容
本文所提供的方法包括同位素峰指数(ISI)，其允许通过使用4个m/z比同时监测15个IGF-1变体。本文还提供了相对保留时间(RRT)参数，其允许区分先前未解析的变体。本文还提供了一种利用串联质谱法(MS/MS)来在最常见的变体对：同量异位A67T与A70T之间进行区分的方法。
本文所描述的方法包括增强的自动化，避免容易出现人为错误的详细手动计算，以及监测更多IGF-1变体和发现新的IGF-1变体的能力。该方法从ExAC数据库识别出6个变体：P66A、A67S、S34N、A38V、A67T和A70T；2个先前报告的V44M和A67V变体；并且发现了6个未报告的变体：Y31H、S33P、R50Q、R56K、T41I和A62T。本文所提供的方法包括患者的IGF-1状态的概况，并且可以用于探索IGF-1变体的基因型-表型关系。
本文所描述的方法用于使用4个质量/电荷(m/z)比同时监测群中的15个IGF-1变体，而不影响WT的定量。每个群内的大多数变体通过其同位素分布和相对保留时间来区分，而通过MS/MS进行的重新分析将A67T与A70T区分开。LC-MS数据的计算和解释使用商业仪器软件而自动化，几乎不需要操作员干预，从而保护工作流程免受解释结果时的人为错误的影响。
在一些实施例中，方法包括检测感兴趣的变体中的每一者的以下质量/电荷(m/z)比：
在一些实施例中，本文所提供的方法是用于检测样品中的胰岛素样生长因子-I(IGF-I)变体的方法，该方法包括：电离样品中的IGF-I以产生可通过质谱法检测的一个或多个离子；通过质谱法检测离子中的一者或多者，这些离子包括具有选自由以下组成的组的质荷比的离子：1093.5±0.5、1089.8±0.5、1095±0.5、1097.09±0.5、1098.09±0.5；以及使用所检测的一个或多个离子来确定样品中IGF1变体的存在。
在一些实施例中，m/z 1093.5±0.5的检测确定WT4或P66T1的存在。
在一些实施例中，m/z 1089.8±0.5的检测确定P66A4、R55K6或R36Q6的存在。
在一些实施例中，m/z 1095.8±0.5的检测确定A67S4或T29I8的存在。
在一些实施例中，m/z 1097.09±0.5的检测确定S34N2、A70P3、A38V1、M59R4或A67S13的存在。
在一些实施例中，m/z 1098.09±0.5的检测确定S34N9、A70P10、A38V8、M59R11、V17/44M4、R50W6、T4M6或A67/70T6的存在。
在一些实施例中，本文所提供的方法包括在电离之前通过高效液相色谱法(HPLC)纯化蛋白质。
在一些实施例中，其中样品包括血浆或血清。
在一些实施例中，样品可以在电离之前通过高效液相色谱法(HPLC)纯化。在相关实施例中，使用配备有在线提取的多重高效液相色谱法(HPLC)系统(Aria TLX-4)来提取和解析IGF-1和其变体。
在一些实施例中，样品可以在电离之前通过固相提取(SPE)纯化。
在一些实施例中，质谱法包括Q精确聚焦混合四极轨道阱(Q Exactive FocusHybrid Quadrupole-Orbitrap)仪器。
在一些实施例中，高分辨率/高准确度质谱法以大于或等于约10,000，诸如大于或等于约15,000，诸如大于或等于约20,000，诸如大于或等于约25,000的分辨能力(FWHM)进行。在一些实施例中，高分辨率/高准确度质谱法以小于或等于约50ppm，诸如小于或等于约20ppm，诸如小于或等于约10ppm，诸如小于或等于约5ppm；诸如小于或等于约3ppm的准确度进行。在一些实施例中，高分辨率/高准确度质谱法以大于或等于约10,000的分辨能力(FWHM)以及小于或等于约50ppm的准确度进行。在一些实施例中，分辨能力大于约15,000，并且准确度小于或等于约20ppm。在一些实施例中，分辨能力大于或等于约20,000，并且准确度小于或等于约10ppm；优选地，分辨能力大于或等于约25,000，并且准确度小于或等于约5ppm，诸如小于或等于约3ppm。
在一些实施例中，高分辨率/高准确度质谱法可以用轨道阱质谱仪、飞行时间(TOF)质谱仪或傅里叶变换离子回旋共振质谱仪(有时称为傅里叶变换质谱仪)进行。在一些实施例中，样品可以包括生物样品；优选地血浆或血清。
在一些实施例中，使通过质谱法检测到的一个或多个IGF-I离子的量与样品中的IGF-I蛋白质的量相关包括与内标物进行比较；诸如人或非人IGF-I蛋白质(例如，完整的重组小鼠重组小鼠IGF-I)。内标物可以任选地被同位素标记。
上文列出的实施例的特征可以组合而不受限制地用于本发明的方法中。
在某些优选实施例中，质谱法在正离子模式中进行。替代地，质谱法在负离子模式中进行。本文中所描述的方法中使用的优选电离技术是电喷雾电离(ESI)。电喷雾电离可以例如加热电离源进行。在一些实施例中，本文中所提供的方法包括加热电喷雾电离(HESI)。在一些实施例中，本文中所提供的方法包括在正离子模式中的加热电喷雾电离(HESI)。
在优选实施例中，在样品中提供一个或多个可单独检测的内标物，其量也在样品中确定。在这些实施例中，感兴趣的分析物和一个或多个内标物两者的全部或一部分被电离以产生在质谱仪中可检测的多个离子，并且通过质谱法检测由每一者产生的一个或多个离子。内标物可以选自由以下组成的组：完整的非人IGF-I(例如，同位素标记的或未标记的完整重组小鼠IGF-I)、同位素标记的完整人IGF-I蛋白质。
在其他实施例中，可以通过与一个或多个外部参考标准进行比较来确定样品中的完整IGF-I蛋白质的量。示例性外部参考标准物包括掺有同位素标记或未标记的完整人或非人IGF-I(例如，同位素标记或未标记的完整重组小鼠IGF-I)的空白血浆或血清。
在一些实施例中，包括来自分析物的两种或更多种分子同位素形式的质谱峰的同位素特征可以用于确认所研究的分析物的身份。在其他实施例中，来自一种或多种同位素形式的质谱峰可以用于定量感兴趣的分析物。在一些相关实施例中，来自一种同位素形式的单个质谱峰可以用于定量感兴趣的分析物。在其他相关实施例中，多个同位素峰可以用于定量分析物。可以对多个峰进行任何适当的数学处理。若干种数学处理是本领域中已知的，并且包括但不限于对多个峰下的面积求和，或者对来自多个峰的响应求平均。
如本文中所使用，除非另有说明，否则单数形式“一种(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数参考。因此，例如，对“蛋白质”的参考包括多个蛋白质分子。
如本文中所使用，术语“IGF-I蛋白质”是指全长IGF-I多肽或其片段，以及全长IGF-I变体多肽或其片段。IGF-I变体包括例如长R3IGF-I，其是IGF-I的含83个氨基酸的类似物，包括完整的人IGF-I序列，其中在位置3处用Arg(R)取代Glu(E)(因此为R3)，并且在N末端处有含13个氨基酸的延伸肽。这种IGF-I类似物的生产目的是提高IGF-I肽的生物活性。这种类似物的质量为约9111.4道尔顿，因此可以观察到具有约1014.1±1、1140.7±1、1303.5±1和1520.6±1的m/z比的多电荷长R3IGF-I离子。其他IGF-I变体多肽是本领域技术人员容易辨识的，包括例如经化学修饰的全长IGF-I多肽或其片段。示例性化学修饰可以包括一个或多个二硫键的还原或者一个或多个胱氨酸的烷基化。这些示例性化学修饰导致IGF-I变体多肽的质量相对于对应的未经修饰IGF-I多肽的质量增加。一个或多个二硫键的还原导致分子的质量的相对微小改变，其中所得质荷比落入本文中所描述的质荷比范围内。导致与未经修饰IGF-I多肽的质量偏差的其他化学修饰也被涵盖在IGF-I蛋白质的含义内。本领域技术人员理解，通过化学修饰向IGF-I蛋白质添加原子将导致在质谱法期间观察到质荷比的增加。因此，由化学修饰产生的IGF-I蛋白质变体包括在IGF-I蛋白质的含义内并且可根据本发明的方法检测。
如本文中所使用，描述多肽时的术语“完整的”是指全长(即，未片段化的)多肽。例如，完整的IGF-I是含有70个氨基酸残基的多肽，并且完整的长R3IGF-I是IGF-I的含83个氨基酸的类似物，包括完整的人IGF-I序列，其中在位置3处用Arg(R)取代GLu(E)(因此为R3)，并且在N末端处有含13个氨基酸的延伸肽。不完整形式的IGF-I(即，片段)也可以通过本文中所描述的方法来检测。例如，具有约1,000道尔顿或更大，诸如约1500道尔顿或更大，诸如约2000道尔顿或更大，诸如约2500道尔顿或更大，诸如约3000道尔顿或更大，诸如约4000道尔顿或更大，诸如约5000道尔顿或更大，诸如约6000道尔顿或更大，诸如约7000道尔顿或更大的分子量的IGF-I蛋白质片段可以通过本文中所描述的方法检测。
术语“纯化(purification)”或“纯化(purifying)”是指相对于样品中可能干扰感兴趣的分析物的检测的其他组分富集一种或多种感兴趣的分析物的量的程序。尽管不是必需的，但“纯化”可以完全去除所有干扰组分，或者甚至去除除感兴趣的分析物之外的所有材料。通过各种方式纯化样品可以允许相对减少一种或多种干扰物质，例如，可能或可能不干扰通过质谱法检测所选择母离子或子离子的一种或多种物质。使用该术语时的相对还原不需要通过纯化来完全去除与待纯化材料中的感兴趣的分析物一起存在的任何物质。
术语“样品”是指可能含有感兴趣的分析物的任何样品。如本文中所使用，术语“体液”是指可以从个体的身体分离的任何流体。例如，“体液”可以包括血液、血浆、血清、胆汁、唾液、尿液、眼泪、汗液等。在优选实施例中，样品包括体液样品；优选地血浆或血清。
术语“固相提取”或“SPE”是指其中化学混合物由于溶解或悬浮在溶液(即，流动相)中的组分对溶液穿过或围绕的固体(即，固相)的亲和力而分离成组分的过程。在一些情况下，当流动相穿过或围绕固相时，流动相的不需要的组分可能被固相保留，从而引起流动相中的分析物的纯化。在其他情况下，分析物可能被固相保留，从而允许流动相中不需要的组分穿过或围绕固相。在这些情况下，然后使用第二流动相将保留的分析物从固相中洗脱出，以进行进一步处理或分析。SPE可以经由单一或混合模式机制进行操作。如本文中所使用，可以用提取柱或柱筒(诸如，例如湍流液相色谱(TFLC)柱)进行SPE。混合模式机制利用同一柱中的离子交换和疏水保留；例如，混合模式SPE柱的固相可能展现出强的阴离子交换和疏水保留；或者可以展现出强的阳离子交换和疏水保留。
术语“色谱法”是指其中由液体或气体携带的化学混合物由于化学实体流过固定固相时的差异分布而分离成组分的过程。
术语“液相色谱法”或“LC”意指当流体均匀地渗透通过细碎物质柱或通过毛细管通道时选择性地阻滞流体溶液的一种或多种组分的过程。阻滞是由一种或多种固定相与本体流体(即，流动相)之间的混合物的组分的分布引起的，因为该流体相对于固定相移动。采用“液相色谱法”的分离技术的示例包括反相液相色谱法(RPLC)、高效液相色谱法(HPLC)和湍流液相色谱法(TFLC)(有时称为高湍流液相色谱法(HTLC)或高通量液相色谱法)。在一些实施例中，SPE柱可以与LC柱组合使用。例如，可以用TFLC提取柱纯化样品，然后用HPLC分析柱进行额外纯化。
术语“高效液相色谱法”或“HPLC”(有时称为“高压液相色谱法”)是指其中通过迫使流动相在压力下通过固定相(通常是密集柱)来增加分离程度的液相色谱法。
术语“湍流液相色谱法”或“TFLC”(有时称为高湍流液相色谱法或高通量液相色谱法)是指利用通过柱填料的待测定材料的湍流作为进行分离的基础的色谱法形式。TFLC已应用于在通过质谱法进行分析之前制备含有两种未命名药物的样品。参见例如Zimmer等人，J ChromatogrA854：23-35(1999)；还参见美国专利第5,968,367号、第5，919,368号、第5,795,469号和第5,772,874号，它们进一步解释了TFLC。本领域普通技术人员理解“湍流”。当流体缓慢而平稳地流动时，该流称为“层流”。例如，以低流速移动通过HPLC柱的流体是层流的。在层流中，流体颗粒的运动是有序的，其中颗粒通常沿直线移动。在更快的速度下，水的惯性克服了流体摩擦力，并且产生湍流。不与不规则边界接触的流体“超过”因摩擦而减慢或因不平坦表面而偏转的流体。当流体湍流流动时，它会以涡流和旋涡(或涡旋)形式流动，与该流是层流的时相比具有更多的“阻力”。许多参考文献可用于帮助确定流体流何时为层流的或湍流的(例如，Turbulent Flow Analysis：Measurement and Prediction，P.S.Bernard&J.M.Wallace，John Wiley&Sons，inc.，(2000)；An IntroductiontoTurbulentFlow，Jean Mathieu&Julian Scott，Cambridge UniversityPress(2001))。
术语“气相色谱法”或“GC”是指其中将样品混合物蒸发并注射到移动通过含有由液体或颗粒固体构成的固定相的柱的载气流(如氮气或氦气)中并根据化合物对固定相的亲和力将其分离成其组分化合物的色谱法。
例如在“在线自动化方式”或“在线提取”中使用的术语“在线”和“内联”是指无需操作员干预而执行的程序。相反，本文中所使用的术语“离线”是指需要操作员手动干预的程序。因此，如果对样品进行沉淀，然后将上清液手动装载到自动采样器中，则沉淀和装载步骤与后续步骤离线。在该方法的各种实施例中，可以以在线自动化方式执行一个或多个步骤。
术语“质谱法”或“MS”是指通过其质量来识别化合物的分析技术。MS是指基于其质荷比或“m/z”而过滤、检测和测量离子的方法。MS技术通常包括：(1)电离化合物以形成带电化合物；以及(2)检测带电化合物的分子量并计算质荷比。化合物可以通过任何合适的方式电离和检测。“质谱仪”通常包括电离器和离子检测器。通常，一个或多个感兴趣的分子被电离，并且这些离子随后被引入质谱仪器中，其中由于磁场和电场的组合，离子沿着取决于质量(“m”)和电荷(“z”)的空间中的路径。参见例如标题为“表面质谱法(Mass SpectrometryFrom Surfaces)”的美国专利第6,204,500号；标题为“用于串联质谱法的方法和设备(Methods andApparatus for Tandem Mass Spectrometry)”的美国专利第6，107,623号；标题为“基于质谱法的DNA诊断(DNA Diagnostics Based OnMass Spectrometry)”的美国专利第6,268，144号；标题为“用于分析物的解吸和检测的表面增强的光不稳定附着和释放(Surface-Enhanced Photolabile Attachment And Release For Desorption AndDetection OfAnalytes)”的美国专利第6，124，137号；Wright等人，Prostate Cancer andProstatic Diseases 1999，2：264-76；以及Merchant和Weinberger，Electrophoresis2000，21：1164-67。
如本文中所使用，“高分辨率/高准确度质谱法”是指用能够以足够的精确度和准确度测量带电物质的质荷比以确认独特的化学离子的质量分析器进行的质谱法。当一个离子的个别同位素峰易于辨别时，就可以确认该离子的独特化学离子。确认独特的化学离子所需的特定的分辨能力和质量准确度随离子的质量和电荷态而变化。
如本文中所使用，术语“分辨能力”或“分辨能力(FWHM)”(本领域中也称为“m/Δm50％”)是指观察到的质荷比除以50％最大高度处的质量峰的宽度(全宽半最大值，“FWHM”)。分辨能力的差异的影响如图1A至图1C所示，其中展示了具有约1093的m/z的离子的理论质谱。图1A展示了具有约3000的分辨能力(常规四极质量分析仪的典型操作条件)的质量分析仪的理论质谱。如图1A所见，没有可辨别的个别同位素峰。相比之下，图1B展示了具有约10,000的分辨能力的质量分析仪的理论质谱，具有清晰可辨别的个别同位素峰。图1C展示了具有约12,000的分辨能力的质量分析仪的理论质谱。在此最高分辨能力下，个别同位素峰所包含的贡献率低于基线的1％。
如本文中所使用，关于质谱法的“独特的化学离子”是指具有单个原子组成的单个离子。单个离子可以带单电荷或多电荷。
如本文中所使用，关于质谱法的术语“准确度”(或“质量准确度”)是指仪器响应与所研究的离子的真实m/z的潜在偏差。准确度通常以百万分之一(ppm)表示。质量准确度的差异的影响如图2A至图2D所示，这些图展示了针对1093.52094的m/z的理论峰的所检测m/z与实际m/z之间的潜在差异的边界。图2A展示了以120ppm的准确度检测到的m/z的潜在范围。相比之下，图2B展示了以50ppm的准确度检测到的m/z的潜在范围。图2C和图2D展示了以20ppm和10ppm的准确度检测到的m/z的更窄潜在范围。
本发明的高分辨率/高准确度质谱方法可以在能够以大于10,000、15,000、20,000、25,000、50,000、100,000或甚至更大的FWHM执行质量分析的仪器上进行。同样，本发明的方法可以在能够以小于50ppm、20ppm、15ppm、10ppm、5ppm、3ppm或甚至更低的准确度执行质量分析的仪器上进行。具有这些性能特征的仪器可以结合某些轨道阱质量分析仪、飞行时间(“TOF”)质量分析仪或傅里叶变换离子回旋共振质量分析仪。在优选实施例中，用包括轨道阱质量分析仪或TOF质量分析仪的仪器来进行该方法。
术语“轨道阱”描述了由外筒状电极和同轴内电极组成的离子阱。离子切向注射到电极之间的电场中并被捕获，因为当离子绕同轴内电极运行时，离子与电极之间的静电相互作用通过离心力平衡。当离子绕同轴内电极运行时，捕获离子的轨道路径沿着中心电极的轴以相对于离子的质荷比的谐波频率振荡。轨道振荡频率的检测允许轨道阱用作具有高准确度(低至1-2ppm)和高分辨能力(FWHM)(高达约200,000)的质量分析仪。基于轨道阱的质量分析仪详细描述于美国专利第6,995,364号中，其以全文引用的方式并入本文中。据报告，轨道阱分析仪可以用于各种分析物的定性和定量分析。参见例如美国专利申请公开案第2008/0118932号(2007年11月9日提交)；等人，Rapid Commun.MassSpectrom.，2008，22：477-485；Le Breton等人，Rapid Commun.Mass Spectrom.，2008，22：3130-36；Thevis等人，Mass Spectrom.Reviews，2008，27：35-50；Thomas等人，J.MassSpectrom.，2008，43：908-15；Schenk等人，BMC Medical Genomics，2008，1：41；以及Olsen等人，Nature Methods，2007，4：709-12。
术语“在负离子模式中操作”是指其中生成和检测负离子的那些质谱方法。如本文中所使用，术语“在正离子模式中操作”是指生成和检测正离子的那些质谱方法。
术语“电离(ionization)”或“电离(ionizing)”是指生成具有等于一个或多个电子单位的净电荷的离子的过程。负离子是具有一个或多个电子单位的净负电荷的离子，而正离子是具有一个或多个电子单位的净正电荷的离子。
术语“选择性离子监测”是质谱仪器的一种检测模式，其中仅检测相对较窄的质量范围(通常约为一个质量单位或更小)内的离子。
“多反应模式”，有时称为“所选择反应监测”，是质谱仪器的一种检测模式，其中选择性地检测前体离子和一个或多个片段离子。
术语“量化下限”、“定量下限”或“LLOQ”是指测量变得具有定量意义的点。此LLOQ下的分析物响应是可识别的、离散的和可重现的，其中相对标准偏差(RSD％)小于20％，准确度为85％至115％。
术语“检测限”或“LOD”是测量值大于与其测量相关的不确定度的点。LOD被定义为零浓度下的平均值RSD的四倍。
应用于同时检测来自样品的两种或更多种分析物的量的术语“同时”是指从同一样品注射获取反映样品中的两种或更多种分析物的量的数据。每种分析物的数据可以顺序或并行获取，取决于所采用的仪器技术。例如，含有两种分析物(诸如完整的IGF-I和IGF-II蛋白质)的单个样品可以被注射到HPLC柱中，然后该柱可以依次洗脱每种分析物，从而将分析物顺序地引入到质谱仪中。出于本文的目的，同时确定这两种分析物中的每一种的量，因为这两种分析物由注射到HPLC中的同一样品产生。
体液样品中的分析物的“量”通常是指反映样品体积中可检测的分析物的质量的绝对值。然而，量还涵盖与另一分析物量相比的相对量。例如，样品中的分析物的量可以是大于样品中通常存在的分析物的对照或正常水平的量。
本文中所使用的参考不包括离子的质量的测量的定量测量的术语“约”是指加减10％的所指示值。质谱仪器在确定给定分析物的质量时可能略有不同。在离子的质量或离子的质荷比的上下文中的术语“约”是指+/-0.50原子质量单位。
上文所描述的本发明的概述是非限制性的，并且本发明的其他特征和优点将从本发明的以下详细描述和权利要求中变得显而易见。
附图说明
图1展示IPi概念的原理，其中同位素峰指数与同位素峰相对强度结合。在任何电荷态下，IGF-1WT和所有变体都将遵循此指数强度分布。IPrI是相对于用于WT IGF-1的定量的IP4峰的强度计算的。
图2展示来自两名不同患者的试样的LC-MS数据，其包含VG4峰。A患者1的WT4的EIC；B患者1的VG4的EIC；C患者1的变体同位素包络，矩形指示IP6在VG4下被检测到；D患者2的WT4的EIC；E患者2的VG4的EIC；F患者2的变体同位素包络，矩形指示IP4在VG4下被检测到。
图3展示自动IGF-1变体检测。使用TraceFinder 5.0Clinical生成报告。变体报告仅显示被怀疑含有IGF-1变体的试样。IGF-1定量报告标记可疑的纯合变体。
图4展示提取泵和分析泵的LC梯度。流动相A是含有0.1％甲酸的水，并且流动相B是含有0.1％甲酸的20％异丙醇、80％乙腈。
图5展示SIM扫描与各种能量的源内CID(SID)和HCD的比较。红色矩形勾勒出最高灵敏度。
图6展示来自VG2的未知变体。VG2m/z处的峰对应于IP10或IP11，这与该群中的任何已知变体(IP4或IP8)不匹配。DNA测序揭露了变体S33P，与S33P10的所计算m/z1095.8130一致(与VG2m/z不同的6ppm)。
图7展示串联MS/MS之后的所选择y离子的提取离子色谱图，指示患者试样A中存在WT和变体A67T，并且患者试样B中存在WT和变体A70T。
图8展示同时的IGF-1定量和IGF-1变体的检测。MS实验被设计为具有低(10)和高(30)NCE的两次循环宽隔离窗口PRM扫描。低能量扫描可以用于检测和定量IGF-1，而高能量扫描可以用于提取重复使用的y离子，以区分A67T与A70T变体。在这种情况下，每定量峰的扫描次数为13，该次数可以通过更快的仪器或更低的检测器分辨率进一步增加。
图9展示IGF-1测定的定量限和检测限。浓度(x轴)和SD(y轴)的值以ng/mL为单位。
图10展示IGF-2测定的定量限和检测限。浓度(x轴)和SD(y轴)的值以ng/mL为单位。
图11展示LC-MS与RIA的IGF-1测定分割样品比较。
具体实施方式
用于本发明的方法中的合适的测试样品包括可能含有感兴趣的分析物的任何测试样品。在一些优选实施例中，样品是生物样品；即，从任何生物来源获得的样品，诸如动物、细胞培养物、器官培养物等。在某些优选实施例中，从诸如狗、猫、马等哺乳动物获得样品。特别优选的哺乳动物是灵长类动物，最优选地男性或女性人类。优选样品包括体液，诸如血液、血浆、血清、唾液、脑脊液或组织样品；优选地血浆和血清。此类样品可以例如从患者获得；即，一个活着的人，无论男性还是女性，在临床环境中出现以用于疾病或病况的诊断、预后或治疗。
用于本发明的实施例中的具有已知浓度的质量控制(QC)池优选地使用与预期样品基质类似的基质来制备。
用于质谱分析的样品制备
在质谱分析的制备中，可以通过本领域已知的各种方法，包括例如固相提取(SPE)、LC、过滤、离心、薄层色谱法(TLC)、包括毛细管电泳的电泳、包括免疫亲和力分离的亲和力分离、包括乙酸乙酯或甲醇提取的提取方法以及离液剂的使用或上述任何组合等，相对于样品(例如其他蛋白质)中的一种或多种其他组分富集IGF-I蛋白质。在一些实施例中，液相色谱法和/或SPE和/或蛋白质沉淀可以组合使用。
蛋白质沉淀是制备测试样品，尤其是生物样品，诸如血清或血浆的一种方法。蛋白质纯化方法是本领域众所周知的，例如，Polson等人，Journal of Chromatography B2003，785：263-275描述了适用于本发明的方法中的蛋白质沉淀技术。蛋白质沉淀可以用于从样品去除大部分蛋白质，从而将IGF-I和/或IGF-II蛋白质留在上清液中。可以将样品离心以将液体上清液与沉淀蛋白质分离；替代地，可以过滤样品以去除沉淀蛋白质。所得上清液或滤液可以直接应用于质谱分析；或者替代地，固相提取和/或液相色谱法和后续质谱分析。在某些实施例中，使用蛋白质沉淀，诸如例如酸性乙醇蛋白质沉淀，可以消除在质谱法或者HPLC和质谱法之前对TFLC、SPE或其他在线提取的需要。
在优选实施例中，液-液提取方法(诸如酸性乙醇提取)用于从样品提取天然完整的IGF-I和/或IGF-II。在这些实施例中，将10μl与500μl之间，诸如25μl与250μl之间，诸如约100μl的样品添加至一部分提取溶剂中。提取溶剂的量与样品体积相当，并且可以根据所使用的提取溶剂而变化，但优选地在约50μl与1000μl之间。将样品/溶剂混合物混合并离心，并且取出一部分上清液或有机相(取决于所使用的溶剂)用于进一步分析。可以例如在氮气流下从取出部分去除溶剂，并且将残余物在与用于液-液提取的溶剂不同的溶剂中重构。然后，在质谱法之前，可以对所得溶液的至少一部分进行额外的处理步骤，诸如SPE和/或LC。
可以在质谱法之前使用的另一样品纯化方法是液相色谱法(LC)。某些液相色谱方法(包括HPLC)依赖于相对较慢的层流技术。传统的HPLC分析依赖于柱填充，其中样品的通过柱的层流是从样品分离感兴趣的分析物的基础。技术人员将理解，在此类柱中的分离是扩散过程，并且可以选择适合与IGF-I和/或IGF-II一起使用的LC(包括HPLC)、仪器和柱。色谱柱通常包括介质(即，填充材料)以促进化学部分的分离(即，分馏)。介质可以包括微小颗粒，或者可以包括具有多孔通道的整体材料。介质的表面通常包括与各种化学部分相互作用以促进化学部分的分离的键合表面。一种合适的键合表面是疏水性键合表面，诸如烷基键合或氰基键合表面。烷基键合表面可以包括C-4、C-8、C-12或C-18键合烷基。在优选实施例中，该柱是C-18烷基键合柱(诸如Phenomenex Onyx整体C-18柱)。色谱柱包括用于接收样品的入口端口和用于排出包括分馏样品的流出物的出口端口。样品可以直接被供应到入口端口，或者从SPE柱供应，诸如在线SPE保护柱筒或TFLC柱。
在一个实施例中，样品可以在入口端口处施加至LC柱，用溶剂或溶剂混合物洗脱，并且在出口端口处排出。可以选择不同的溶剂模式来洗脱感兴趣的分析物。例如，可以使用梯度模式、等度模式或多型(即混合)模式执行液相色谱法。在色谱法期间，材料的分离受到诸如洗脱剂(也称为“流动相”)的选择、洗脱模式、梯度条件、温度等变量的影响。
在某些实施例中，可以通过在感兴趣的分析物被柱填充材料可逆地保留而一种或多种其他材料不被保留的条件下将样品施加至柱来纯化分析物。在这些实施例中，可以采用第一流动相条件，其中感兴趣的分析物被柱保留，并且一旦非保留材料被洗过，随后就可以采用第二流动相条件从柱去除保留材料。替代地，可以通过在流动相条件下将样品施加至柱来纯化分析物，其中感兴趣的分析物与一种或多种其他材料相比以不同的速率洗脱。此类程序可以相对于样品的一种或多种其他组分富集一种或多种感兴趣的分析物的量。
在一些实施例中，用烷基键合分析柱色谱系统进行HPLC。在某些实施例中，使用C-18分析柱(例如，Phenomenex Onyx Monolithic C18或等同物)。在某些实施例中，使用HPLC级0.2％甲酸水溶液作为流动相A和0.2％甲酸乙腈溶液作为流动相B执行HPLC和/或TFLC。
通过仔细选择阀和连接器管道，可以根据需要连接两个或更多个色谱柱，以便材料从一个色谱柱传递到下一个色谱柱，而不需要任何手动步骤。在优选实施例中，阀和管道的选择由预先编程的计算机控制以执行必要的步骤。最优选地，色谱系统还以此类在线方式连接至检测器系统，例如MS系统。因此，操作员可以将样品的托盘放入自动采样器中，并且其余操作在计算机控制下执行，从而对所有所选择的样品进行纯化和分析。
在一些实施例中，TFLC可以用于在质谱法之前纯化IGF-I蛋白质或片段。在此类实施例中，可以使用捕获分析物的TFLC柱来提取样品，然后在电离之前在第二TFLC柱或分析HPLC柱上进行洗脱和色谱分析。例如，使用TFLC提取柱进行样品提取可以用大粒径(50μm)填充柱来完成。然后，从该柱洗脱的样品可以被转移至HPLC分析柱，以用于在质谱法之前进一步纯化。因为这些色谱程序中涉及的步骤可以以自动化方式连接，所以可以使分析物的纯化期间操作员参与的需求最小化。此功能可以节省时间和成本，并且消除操作员出错的机会。
在一些实施例中，蛋白质沉淀是用从血清进行的酸性乙醇提取来完成的，并且所得溶液经受SPE，优选地用C-18提取柱(例如，Phenomenex Onyx C-18保护柱筒，或等同物)在线进行。然后，在质谱分析之前，可以将来自SPE柱的洗脱液施加至分析LC柱，诸如以在线方式施加至HPLC柱。
质谱检测和定量
质谱法是使用质谱仪执行的，该质谱仪包括用于电离样品并产生带电分子以供进一步分析的离子源。在各种实施例中，IGF-I和/或IGF-II蛋白质可以通过本领域技术人员已知的任何合适的方法电离。例如，样品的电离可以通过电子电离、化学电离、电喷雾电离(ESI)、光子电离、大气压化学电离(APCI)、光电离、大气压光电离(APPI)、快原子轰击(FAB)、液体二次电离(LSI)、基质辅助激光解吸电离(MALDI)、场电离、场解吸、热喷雾/等离子体喷雾电离、表面增强激光解吸电离(SELDI)、电感耦合等离子体(ICP)和粒子束电离执行。技术人员将理解，电离方法的选择可以基于待测量的分析物、样品类型、检测器的类型、正模式与负模式的选择等而确定。取决于所采用的特定电离方法和条件，IGF-I和IGF-II蛋白质可以被电离成多种不同的电荷态。可以选择电离源以使所生成的电荷态的分散最小化。在一些实施例中，ESI(任选地加热)用作电离源，并且优化电离条件以使观察到的多电荷IGF-I和/或IGF-II蛋白质离子的分布最小化。
IGF-I和/或IGF-II蛋白质可以在正或负模式中被电离。在优选实施例中，一个或多个IGF-I和/或IGF-II蛋白质在正模式中被电离。在一些实施例中，生成具有在约850.8±2、957.1±2、1093.7±2和1275.8±2的范围内的m/z比的多电荷完整IGF-I离子。在一些实施例中，生成具有在约934.69±2、1068.07±2、1245.92±2和1494.89±2的范围内的m/z比的多电荷完整IGF-II离子。这些范围内生成的大多数多电荷离子可能落入较窄的子范围内，诸如所指示m/z±1。
通常在质谱技术中，在样品被电离之后，可以分析由此产生的带正电或带负电的离子以确定质荷比(m/z)。用于确定m/z的各种分析仪包括四极分析仪、离子阱分析仪、飞行时间分析仪和轨道阱分析仪。根据本发明的方法，高分辨率/高准确度质谱法用于IGF-I和/或IGF-II蛋白质的定量分析。即，用能够展现出至少10,000的分辨能力(FWHM)的质谱仪进行质谱法，其中对于感兴趣的离子，准确度为约50ppm或更低；优选地，质谱仪展现出20,000或更好的分辨能力(FWHM)以及约20ppm或更低的准确度；诸如25,000或更好的分辨能力(FWHM)以及约5ppm或更低的准确度；诸如25,000或更好的分辨能力(FWHM)以及约3ppm或更低的准确度。能够展现出IGF-I和/或IGF-II蛋白质离子的必要性能水平的三个示例性质谱仪是包括轨道阱质量分析仪、某些TOF质量分析仪或傅里叶变换离子回旋共振质量分析仪的那些分析仪。
生物活性分子中发现的元素，诸如碳、氧和氮，天然以多种不同的同位素形式存在。例如，大多数碳以12C形式存在，但所有天然存在的碳中约有1％以13C形式存在。因此，天然存在的含碳分子的一部分将含有至少一个13C原子。分子中包括天然存在的元素同位素会产生多种分子同位素形式。分子同位素形式的质量差异为至少1个原子质量单位(amu)。这是因为元素同位素至少有一个中子不同(一个中子的质量≈1amu)。当分子同位素形式被电离成多个电荷态时，同位素形式之间的质量差异可能变得难以辨别，因为质谱检测是基于质荷比(m/z)。例如，质量相差1amu的两种同位素形式都被电离成5+态，将展现出其m/z仅为0.2的差异(1amu/电荷态5的差异)。高分辨率/高准确度质谱仪能够辨别高倍电荷离子(诸如带±5、±6、±7、±8、±9或更高电荷的离子)的同位素形式。
由于天然存在的元素同位素，每个分子离子通常存在多个同位素形式(如果用足够灵敏的质谱仪器进行分析，每个同位素形式都可能产生单独可检测的光谱峰)。多个同位素形式的m/z比和相对丰度共同构成分子离子的同位素特征。在一些实施例中，两个或更多个分子同位素形式的m/z比和相对丰度可以用于确认所研究的分子离子的身份。在一些实施例中，来自一个或多个同位素形式的质谱峰用于定量分子离子。在一些相关实施例中，来自一个同位素形式的单个质谱峰用于定量分子离子。在其他相关实施例中，多个同位素峰用于定量分子离子。在这些稍后的实施例中，可以对多个同位素峰进行任何适当的数学处理。若干种数学处理是本领域中已知的，并且包括但不限于对多个峰下的面积求和或者对来自多个峰的响应求平均。
通常，在质谱技术中，可以使用若干种检测模式来检测离子。例如，可以检测所选择离子，即使用选择性离子监测模式(SIM)，或者替代地，可以使用扫描模式检测离子。当在扫描模式中操作时，质谱仪通常向用户提供离子扫描；即，在给定范围(例如100amu至1000amu)内具有特定质量/电荷的每种离子的相对丰度。此外，当使用能够进行多个质谱事件的仪器，诸如某些离子阱或三重四极仪器时，由碰撞引起的解离或中性丢失引起的质量转变可以被监测，例如，多反应监测(MRM)或所选择反应监测(SRM)。
分析物测定的结果，即质谱，可以通过本领域已知的多种方法与原始样品中的分析物的量相关。例如，假设仔细控制采样和分析参数，则可以将给定离子的相对丰度与将该相对丰度转换成原始分子的绝对量的表进行比较。替代地，内标物或外标物可以与样品一起运行，并且基于从这些标准物生成的离子构造标准曲线。使用此类标准曲线，给定离子的相对丰度可以被转换成原始分子的绝对量。在某些优选实施例中，一个或多个标准物用于生成标准曲线以用于计算IGF-I和/或IGF-II蛋白质的量。生成和使用此类标准曲线的方法是本领域众所周知的，并且普通技术人员能够选择适当的内标物。例如，在优选实施例中，同位素标记的或未标记的完整非人IGF-I和/或IGF-II(例如，重组小鼠IGF-I和/或IGF-II)或同位素标记的完整人IGF-I和/或IGF-II可以被用作标准物。用于使离子的量与原始分子的量相关的许多其他方法对于本领域普通技术人员来说将是众所周知的。
如本文中所使用，当通过质谱技术分析时，“同位素标记”在标记的分子中相对于未标记的分子产生质量偏移。合适的标记的示例包括氘(2H)、13C和15N。同位素标记可以并入在分子中的一个或多个位置处，并且一个或多个种类的同位素标记可以在同一同位素标记的分子上使用。
该方法的一个或多个步骤可以使用自动化机器来执行。在某些实施例中，一个或多个纯化步骤在线执行，并且更优选地，所有纯化和质谱步骤可以以在线方式执行。
在一些实施例中，使用如下MS检测和/或定量样品中的完整的IGF-I和/或IGF-II。对样品进行液相色谱法，优选地HPLC；来自色谱柱的液体溶剂流进入ESI电离源的加热雾化器接口；并且溶剂/分析物混合物在接口的加热充电管中被转化成蒸气。通过将大电压施加至溶剂/分析物混合物，溶剂中所含的分析物(例如，完整的IGF-I和/或IGF-II)被电离。当分析物离开接口的带电管道时，溶剂/分析物混合物雾化并且溶剂蒸发，从而留下处于各种电荷态的分析物离子。然后，收集一个或多个离子的强度的定量数据。然后，收集一个或多个离子的信号强度的定量数据，并且使其与样品中的完整的IGF-I和/或IGF-II的量相关。
对于完整IGF-I，可以观察到处于各种电荷态的离子，其m/z在约850.8±2(9+)、957.1±2(8+)、1093.7±2(7+)和1275.8±2(6+)的范围内。在一些实施例中，来自具有在约1093.7±2的范围内的m/z的一个或多个IGF-I离子的数据被收集并用于定量。该m/z范围内的示例性离子包括具有约1091.9±0.1、1092.8±0.1、1092.9±0.1、1093.1±0.1、1093.2±0.1、1093.4±0.1、1093.5±0.1、1093.7±0.1、1093.8±0.1、1093.9±0.1、1094.1±0.1、1094.2±0.1、1094.4±0.1、1094.5±0.1、1094.7±0.1和1095.4±0.1的m/z的IGF-I离子。该列表并不意味着限制。许多其他离子可能适用于本发明的方法中，如图3所示的光谱所示(其表明了检测处于约828.0509±2、850.7373±2、871.8730±2、920.5544±2、939.6930±2、956.9532±2、975.4576±2、1034.8128±2、1051.6337±2、1073.9335±2、1093.6597±2、1114.5219±2、1207.9401±2、1226.5705±2、1252.5871±2和1275.6019±2的m/z的同位素离子的群；然而，需注意，如上所述，这些范围内的个别同位素的离子将主要落入所指示m/z±1的范围内。而且，在这种精确度水平下，观察到的任何离子的质量可能会因仪器差异而略有不同，例如±0.1)。
对于完整IGF-II，可以观察到处于各种电荷态的离子，其m/z在约934.69±2(8+)、1068.07±2(7+)、1245.92±2(6+)和1494.89±2(5+)的范围内。在一些实施例中，来自具有在约1068.07±2的范围内的m/z的一个或多个IGF-II离子的数据被收集并用于定量。该m/z范围内的示例性离子包括具有约1067.36±0.1、1067.51±0.1、1067.65±0.1、1067.80±0.1、1067.94±0.1、1068.08±0.1、1068.23±0.1、1068.37±0.1、1068.51±0.1、1068.65±0.1、1068.80±0.1、1068.94±0.1和1069.08±0.1的m/z的IGF-II。在一些实施例中，一个或多个IGF-II离子选自由以下组成的组：具有约1067.94±0.1和1068.08±0.1的m/z的IGF-II离子。该列表并不意味着限制，并且其他离子可能适用于本发明方法中。
在一些实施例中，高分辨率/高准确度质谱仪的使用可以允许来自单个离子的单个同位素形式的峰的信号强度(诸如图4中所示的在约1093.66的m/z下的单个IGF-I离子峰，或图12中所示的在约1067.80的m/z下的单个IGF-II峰)被选择用于数据获取。替代地，来自单个离子的一个或多个同位素形式(诸如，如图4和图12所示的一个或多个IGF-I或IGF-II同位素形式)的信号强度的定量数据，或跨窄m/z范围的信号强度(诸如约1093.7±1的m/z范围的所有IGF-I信号强度，或约1068.2±1的m/z范围的所有IGF-II信号强度)，可以被收集并且与样品中的完整的IGF-I和/或IGF-II的量相关。
在一些实施例中，收集来自至少两种不同电荷态的一个或多个IGF-I和/或IGF-II离子的信号强度的定量数据。然后，这些离子的强度可以用于定量评定样品中的完整的IGF-I和/或IGF-II。例如，IGF-I可以用来自处于8+电荷态的一个或多个IGF-I离子(即，在具有约957.1±2的m/z范围内的IGF-I离子)和处于7+电荷态的一个或多个IGF-I离子(即在m/z范围1093.7±2内的IGF-I离子)的信号强度来定量。在收集两个或更多个离子的信号强度的定量数据的实施例中，可以通过本领域已知的任何数学方法(诸如求和或对曲线下面积求平均)组合强度以定量评定样品中的完整的IGF-I和/或IGF-II。
当离子与检测器碰撞时，它们会产生电子脉冲，该电子脉冲被转换成数字信号。所获取数据被中继到计算机，该计算机绘制出收集到的离子的计数与时间的曲线图。所得的质量色谱图与传统的HPLC-MS方法中生成的色谱图相似。对应于特定离子的峰下面积或此类峰的幅度可以被测量，并且与感兴趣的分析物的量相关联。在某些实施例中，测量曲线下面积或峰的幅度以确定IGF-I和/或IGF-II蛋白质或片段的量。如上所述，可以使用基于内部分子标准物的一个或多个离子的峰的校准标准曲线将给定离子的相对丰度转换成原始分析物的绝对量。
在一些实施例中，IGF-I和IGF-II同时被定量。在这些实施例中，每个IGF-I和IGF-II各自可以通过上文所提供的任何方法进行定量。
在某些优选实施例中，IGF-I的定量下限(LLOQ)在约15.0ng/mL至200ng/dL的范围内(包括端值)；优选地在约15.0ng/dL至100ng/mL的范围内(包括端值)；优选地在约15.0ng/mL至50ng/mL的范围内(包括端值)；优选地在约15.0ng/mL至25ng/mL的范围内(包括端值)；优选地在约15.0ng/mL至15ng/mL的范围内(包括端值)；优选地在约15.0ng/mL至10ng/mL的范围内(包括端值)；优选地约15.0ng/mL。
在某些优选实施例中，IGF-II的定量下限(LLOQ)在约30.0ng/mL至200ng/dL的范围内(包括端值)；优选地在约30.0ng/dL至100ng/mL的范围内(包括端值)；优选地在约30.0ng/mL至50ng/mL的范围内(包括端值)；优选地在约30.0ng/mL至25ng/mL的范围内(包括端值)；优选地在约30.0ng/mL至15ng/mL的范围内(包括端值)；优选地在约30.0ng/mL至10ng/mL的范围内(包括端值)；优选地约30.0ng/mL。
在某些优选实施例中，IGF-I的检测限(LOD)在约4.9ng/mL至200ng/mL的范围内(包括端值)；优选地在约4.9ng/mL至100ng/mL的范围内(包括端值)；优选地在约4.9ng/mL至50ng/mL的范围内(包括端值)；优选地在约4.9ng/mL至25ng/mL的范围内(包括端值)；优选地在约4.9ng/mL至20ng/mL的范围内(包括端值)；优选地约4.9ng/mL。
在某些优选实施例中，IGF-II的检测限(LOD)在约8.2ng/mL至200ng/mL的范围内(包括端值)；优选地在约8.2ng/mL至100ng/mL的范围内(包括端值)；优选地在约8.2ng/mL至50ng/mL的范围内(包括端值)；优选地在约8.2ng/mL至25ng/mL的范围内(包括端值)；优选地在约8.2ng/mL至20ng/mL的范围内(包括端值)；优选地约8.2ng/mL。
以下实例用于示出本发明。这些实例绝不旨在限制这些方法的范围。特别地，以下实例表明了使用特定内标物通过质谱法对IGF-I和IGF-II蛋白质或片段进行定量。所指示内标物的使用并不意味着以任何方式进行限制。本领域技术人员容易确定的任何适当的化学物质均可以被用作内标物。
实例
实例1：通过质谱法识别IGF-1变体
试样来源。
试样最初被提交给Quest Diagnostics以用于通过LC-MS对完整的IGF-1进行定量，并且在进一步分析之间进行去识别。IRB发起人协议号为BR13-002，并且IRB协议号为20121940。
变体数据库。
为了在患者试样中发现IGF-1变体，我们使用了外显子组聚合联合数据库ExAC(14)(在2019年2月6日访问，补充表2)，其中含有所有当前已知的变体，包括13个临床意义不确定的变体：T4M、V17M、T29I、S34N、A38V、R55K、M59R、P66A、P66T、A67S、A67T、A70P、A70T；以及先前报告的3个致病变体：V44M、R50W和R36Q。
样品制备和LC-MS
使用Bystrom等人(3)先前描述的方法的修改来制备患者样品。简而言之，将100μL等份的患者血清、质量对照物(Bio-Rad)和校准物(Ajinomoto)解冻、涡旋并转移到深孔板(Thermo Scientific)中。随后加入10μL内标物(15N标记的IGF-1，ProSpec)和400μL酸化乙醇溶液(87.5％EtOH，12.5％1N HCl)的混合物，并且剧烈混合样品并在室温下孵育30分钟。然后，将样品离心(在10℃下，5,500RCF，持续10分钟)，并将350μL上清液与60μL 1.5M Tris基混合。在-20℃下将样品冷却持续60分钟以生成额外的蛋白质沉淀，然后用先前设置进行离心。
离心之后，使用具有0.1％甲酸的水(流动相A)和具有0.1％甲酸的乙腈(流动相B)的梯度(补充图1)，使用配备有在线提取(Thermo Scientific，San Jose，CA)的多重高效液相色谱(HPLC)系统(Aria TLX-4)提取IGF-1和其变体。提取柱是Phenomenex MonolithicOnyx C18保护柱筒；分析柱为Phenomenex Kinetex C1850×4.6mm，孔径质谱法用配备有加热电喷雾电离(HESI)源的Q精确聚焦混合四极轨道阱仪器(Thermo Scientific)执行，并且在正全离子片段(AIF)模式下操作，该模式的灵敏度约为SIM扫描模式的两倍(补充图2和补充表1)。使用以下MS参数：分辨率70,000；扫描范围1，060-1，110Da；归一化碰撞能量：10；自动增益控制(AGC)：2e4；最大注射时间(IT)：自动。为了确定A67T/A70T对，质谱仪在并行反应监测模式下运行，其分辨率为35,000，隔离窗口为2.0m/z，NCE为30，固定第一质量为150Da，AGC：2e4；MaxIT：250ms和1次微扫描。
MS数据分析和可视化。
LC-MS数据通过Thermo TraceFinder 5.0Clinical进行分析，并且通过ThermoXcalibur v.4.2中的Qual Browser进行可视化。
DNA测/序确认。
用Apostle MiniMaxTM高效分离试剂盒(Beckman Coulter life science，Indianapolis，IN)从去识别的血清试样废弃物提取DNA。所提取DNA用于对IGF-1基因的外显子4区域(Build GRCh38上的Chr12：102419509-102419690)和外显子3区域(BuildGRCh38上的Chr12：102475582-102475855)进行测序。引物设计排除了常见的SNP位置(>1％的群体MAF)。根据制造商的说明(Applied Biosystems)，使用ABIPrism BigDyeTerminator v3.1循环测序试剂盒和ABI 3500遗传分析仪进行测序。
结果和讨论
我们使用同位素峰指数(IPi)和相对保留时间(rRT)的概念开发并自动化了IGF-1变体检测过程。串联质谱法用于区分最常见的一对变体A67T和A70T。
同位素峰指数(IPi)
基于WT IGF-1的呈其天然非还原形式的元素(C331H513N94O101S7)和其已知变体，可以根据其准确的m/z和峰强度的分布来精确地预测多肽观察到的电荷态中的每一者的同位素包络中的峰。
在先前工作中，我们简要描述了同位素包络内的峰的命名法(12)。在本文中，我们进一步发展了“同位素峰指数(IPi)”和“同位素峰相对强度(IPrI)”的概念(图1)。IGF-1和变体的同位素包络，无论其单同位素m/z和电荷态如何，都遵循这种指数强度分布。
IPi是同位素包络中的峰的数字索引，其展示在下标中并从零开始。单同位素峰被指定为IP0(读作“同位素峰零”或“IP零”)，并且后续重同位素峰被识别为IP1至IP13。该命名法适用于WT和所有变体的同位素包络。例如，V44M变体的IP0被指定为V44M0，并且表示V44M变体的同位素包络中的单同位素峰。在WT IGF-1的常规检测和定量期间，IP4在标签WT4下使用。
IPrI是同位素包络中的峰的强度的分布。具体模式仅取决于分子的元素组成，这在IGF-1变体中非常相似，并且因此WT和所有变体的IPrI应该相似。图1中的峰相对强度的分布是从真实患者试样求平均值，并且相对于IP4峰的强度进行计算，因为它用于WT IGF-1的定量。使用与“量词”同位素相邻的相对强度“限定词”同位素来确认IGF-1身份是在临床领域中使用IPrI的实际实例(7)。
监测所有IGF-1变体具有挑战性且具有局限性。Q准确聚焦仪器中的轨道阱质量分析仪的质量分辨率(在m/z 200下为70,000)足以识别同位素包络内的同位素峰(MH7 +7的0.14m/z差异)。任何MS方法的局限性是无法区分同量异位变体A67T和A70T，以及V17M和V44M。另外，在目前的仪器分辨率下，无法分辨具有非常接近单同位素m/z(±10ppm)的变体：R55K和R36Q；R50W、T4M和A67/70T。最后，P66T变体的同位素包络与WTIGF-1重叠，并且在常规分析中无法被检测到，因为所有P66T同位素峰都受到WT IGF-1同位素包络的干扰。
基于所有变体的理论同位素包络，我们基于变体的元素组分的差异，识别了无法通过计算相对于WT IGF的准确m/z偏移来分辨的峰，如下所示。首先计算所有具有非还原二硫键的变体中的MH7 +7的单同位素峰的准确质量(补充表3)。然后，该表被填充有接下来13个变体同位素的准确m/z，并且通过将所有m/z值从最低到最高排序来重新分组(同位素峰主表，补充表4)。<10ppm的相邻m/z差异被识别并被分组为无法从另一峰分辨出但可以从其他群中的峰分辨出的峰。总的来说，选择了5个m/z值(橙色单元格，补充表4)来监测WT和4个变体群(VG，表1)。
某些变体的同位素峰属于2个变体群(VG3和VG4)，其IPrI为其识别提供了额外的置信度(表1)。例如，根据其在IGF-1同位素包络中的相对强度，S34N2(VG3)的所提取离子色谱图(EIC)预计为S34N4的57％(参考图1)。然而，在VG4中，S34N9预计只有WT的25％，大约为S34N2的面积的一半。EIC的这种差异可以用于区分S34N与其他变体。通过从VG4切换到VG3，对S34N的检测的灵敏度可以提高两倍。这同样适用于VG3的其他变体，但A38V除外，VG4的灵敏度更高。
在我们的方法中，所有变体仅用4m/z比进行监测(表1)。在任何这些m/z比处存在峰都指示存在属于给定VG的变体。例如，图2展示来自两名不同患者的试样的LC-MS数据，其包含VG4峰。由于在患者1的试样中IP6被检测为VG4m/z，因此IPi概念预测(表1)患者1必定具有R50W、T4M、A67T或A70T变体。相似地，由于在患者2的试样中IP4被检测为VG4m/z，因此它应该具有V17M或V44M变体。DNA测序确认了患者1具有A70T，并且患者2具有V44M，从而验证了IPi作为区分变体的方法。大多数变体可以单独使用IPi方法来区分，即仅基于其质谱中的峰的同位素分布。
尽管该方法是有针对性的，但它也可能引起新变体的发现。对检测到VG2成员的患者试样的LC-MS数据进行仔细检查揭露了，IPi与VG2中的2个变体：A67S(IP4)和T29I(IP8)均不匹配。相反，峰对应于IP10或IP11(补充图3)。DNA测序揭露了变体S33P，与S33P10的所计算m/z 1095.8130一致(与VG2m/z相差6ppm，补充表4)，但与ExAC数据库不符，从而验证了IPi作为发现新变体的方法。
相对保留时间(rRT)
我们的初步研究表明，一些IGF-1变体不与WT共洗脱。WT的RT与变体的RT之间的该差异被指定为相对保留时间(rRT)，并且它可以用于区分变体。通过使用IPi概念来预测变体并将其指派给不同的VG，比较其所观察rRT，并且通过DNA测序确认其身份，我们验证了rRT作为变体区分和发现的工具(表2)。
例如，WT4和VG4的EIC表明，来自2个试样的已知IGF-1变体的rRT略有差异，从而将与WT(图2A)共洗脱的变体A70T(图2B)与洗脱晚于WT(图2D)的V44M(图2E)区分开。
值得注意的是，在一些VG中，IPi被预测为单个变体，但rRT揭露了新IGF-1变体的存在(表2)。例如，只有一种已知变体可以在VG3m/z(A38V)处具有IP1，它应与WT共洗脱。然而，我们发现试样中IP1变体的洗脱时间稍晚于WT。DNA测序确认了共洗脱变体是A38V，而稍后洗脱的变体是A67V，这是ExAC数据库中没有的变体，即具有相同氨基酸取代但位置不同的变体(表2)。相似地，对于VG1中的IP4，我们在患者试样中发现了未报告的Y31H变体，与P66A相比，所计算m/z仅存在1.5ppm差异(补充表2)，并且洗脱时间略早于WT(表2)。而且，在VG1中，rRT指示存在新变体R50Q或R56K，这些新变体已通过DNA测序进行识别。这两种新变体与已知变体具有相同的氨基酸取代，但位置不同(表2)。这些实例验证了rRT作为变体识别和发现新变体的工具。
串联质谱法
在ExAC数据库中，A67T和A70T的出现频率最高(合计93％，补充表1，由ExAC浏览器构造)。在通过MS/MS重新分析后，就可以通过y3片段离子的m/z差异将它们彼此区分开，并且通过y5片段离子的m/z差异(补充表5)将它们与WT区分开。在我们的工作流程中，我们采用了具有包括列表的并行反应监测(PRM)：m/z 1093.5215(WT4)和1098.0969(VG4)。
我们使用检测到VG4的IP6的试样验证了这种方法，指示存在A67T、A70T、T4M或R50W变体。例如，在对两个患者试样进行重新分析后，MS/MS谱揭露了y个离子，确认该患者分别为WT和A67T(患者A)以及A70T(患者B)变体的杂合子(补充图4)。总的来说，我们确认了MS/MS与28个测试试样的DNA测序结果匹配：9个测试试样具有A67T变体，并且19个测试试样具有A70T变体。
虽然通过采用交替MS和MS/MS扫描在单次运行中检测A67T和A70T的可能存在(补充图5)，但必须证明此工作流程不会影响IGF-1定量，因为整个色谱峰中的MS扫描较少。此外，鉴于最丰富的多态性A67/70T仅存在于0.2％的患者试样中，该工作流程可能很难证明合理(补充表2)。
自动变体检测
IGF-1变体检测是自动化的，并且并入到常规IGF-1定量工作流程。所有光谱均使用Thermo TraceFinder 5.0Clinical进行分析，其中质量提取公差被设置为20ppm。TraceFinder Master方法用于搜索以下化合物的试样光谱：WT4(加上WT3和WT5作为限定词)、内标物(ISTD5)以及对应于四个变体群的m/z，这些变体群被指定为内标物。该软件产生了两个报告。
对于变体报告，TraceFinder报告类型被设置为批量，具有以下过滤字符串：
AND(quanresults.sampleType＝″Specimen″，quanresults.totalArea<>″N/F″，quanresults.peakArea>300000，compound.compoundname<>″IGF-1″，Compound.CompoundName<>″ISTD″)
这生成疑似含有IGF-1变体的试样列表(图3，图A)。在所展示的示例中，样品疑似含有VG4变体。然后，关于变体的存在的信息将经由实验室信息系统(LIS)中的标准评价报告给医生
基于质谱数据，在该试样中检测到了罕见的杂合IGF-1变体。该变体的水平未被包括在上述报告的IGF-1结果中，这解释了可能低于预期值的原因。预计该变体的水平与针对野生型IGF-1蛋白质报告的值相同。该IGF-1变体的临床意义保持未知。建议进行额外的DNA测序以确认变体的存在。
在A67T/A70T对的情况下，使用IPi和rRT概念，变体的身份可以被预测，然后用DNA测序或串联质谱法进行确认。
IGF-1定量报告被设计成展示与WT检测和定量相关的信息(图3，图B)。TraceFinder报告类型被设置为复合自定义公式<compound.compoundType＝”eTargetCompound”>。除此之外，报告还使用以下单元格公式
IF(AND(sample.sampletype＝″Specimen″，quanresults.peaksfound＝FALSE)，″POSSIBLE HOMO VAR″，IF(AND(sample.sampletype＝″Specimen″，quanresults.peaksfound＝TRUE)，IF(quanresults.calcamount-compound.loq<0，″POSSIBLE HOMO VAR″，″″)，″″))
以标记疑似含有纯合IGF-1变体的试样。在这种情况下，结果被人工检查的，变体的水平基于WT IGF-1校准曲线进行估计，并且经由LIS系统中的标准评价报告给医生(以定量值为例)
基于质谱数据，在该试样中检测到了罕见的纯合IGF-1变体。上述报告的IGF-1结果中不包括该变体的水平。这解释了报告的IGF-1浓度，因为所有IGF-1都是以变体蛋白质的形式产生的。该变体的所估计浓度为75ng/mL。该变体的临床意义保持未知。建议进行额外的DNA测序以确认变体的存在。
临床应用
我们在临床实验室中使用高分辨率LC-MS方法开发了一种强大的高通量检测和发现IGF-1变体的方法。用于区分和发现变体的个别方法(IPi、rRT和MS/MS)均通过DNA测序进行了验证。与临床实验室中的其他方法相比，我们同时监测和识别IGF-1变体的方法是一个显著的改进。通过商用仪器软件自动解译LC-MS数据会降低人为错误的风险。
在我们的方法的开发和验证过程中，我们从ExAC数据库识别出了6个变体：P66A、A67S、S34N、A38V、A67T、A70T，以及2个先前报告的V44M和A67V变体。另外，该方法还发现了6个先前未报告的变体Y31H、S33P、R50Q、R56K、T41I和A62T。考虑到大量的新发现，很明显，目前对IGF-1变体的了解是有限的，而IGF-1变体的世界更加广阔。
我们预计我们的方法可能更一般地应用于高分辨率LC-MS方法，以用于在临床实验室中进行多肽和蛋白质的自动定量以及其多态性变体的高效检测。对于IGF-1，这些方法为临床医生提供了更多了解患者的IGF-1状态的机会，以及进一步探索基因型-表型关系的机会。
未来，受监测的IGF-1变体的列表将包括任何新报告的变体。还可以开发MS/MS策略，以用于P66T、A67S和A67V变体的免DNA测序确认。考虑到目前质谱仪和其扫描速度的改进，WTIGF-1的并行MS定量和其某些变体的MS/MS验证可能在临床实验室中成为可能。
通过将这种方法应用于大量试样的数据，在未来的工作中，我们的目标是比较普通人群与临床人群之间不同的IGF-1变体的出现频率。出现频率的差异可以暗示变体具有致病性或可能致病性，从而为诊断和患者护理提供信息。
表1。WT和变体群在5m/z比处被监测。在表中，展示了IGF-1变体与其相应的同位素峰指数。
表2.IPi预测之后变体的相对保留时间比较。
在每个变体群中，IPi概念适用于检测到的每个变体。在IPi预测之后，rRT被识别并在未分辨的变体内进行比较。rRT引起R50Q与R56K变体分离，以及A38V与A67V分离。它还引起Y31H、S33P和A62T变体的发现。
表3.SIM扫描与各种能量的源CID(SID)和HCD的比较汇总，如校准物和QC中所示。结果指示，在应用10NCE的HCD的情况下，第一校准物和内标物(黄色突出显示
单元格)的响应显著增加。
表4.来自ExAC数据库的IGF-1变体的列表
表5.变体同位素峰的m/z
所有IGF-1变体的理论准确的m/z和这些变体在电荷态+7和非还原二硫键处的同位素峰。
表6.同位素峰主表。
所有变体的理论m/z值均按从最低到最高的顺序排序。然后，<10ppm的相邻m/z差异(粉色单元格)被识别并被分组为无法从另一峰分辨出但可以从其他群中的峰分辨出的峰。总的来说，选择了5个m/z值(橙色单元格)来监测WT和4个变体群。
表7.IGF-1WT、A67T和A70T变体的前六个y离子。
实例2：通过质谱法对IGF-1和IGF-2进行灵敏定量
方法。通过添加含有同位素标记的内标物的酸化乙醇溶液并置于冰箱中持续60分钟来制备样品。在离心之后，收集上清液，并且通过配备有在线提取的多重高效液相色谱(HPLC)系统提取和分离分析物。检测由配备有ESI源并在正全离子片段(AIF)模式中运行的离子阱轨道阱质谱仪进行。分析物响应相对于内标物的响应的比用于建立校准曲线并定量患者样品中的IGF-1或IGF-2。
表8.IGF-1和IGF-2离子的质荷比
精的度研究。定义：测定内的样品的重现性。
常规技术：可接受性标准：SD<TEa/3；基于SD和CV％的每个过程西格玛必须>3.0。
先进技术：可接受性标准将由监督测定的医疗和科学主任确定。接收标准应该是基于数据的、合理的且可辩护的。
运行内精的度。可接受性标准：SD应该小于允许的SD(wr)或≤TEa/4。
测定内精确度被定义为测定内的质量控制池的重现性。分析所有QC水平以确定平均值、SD和变化系数(％CV)。每个水平每次运行测量5次，共5次运行，总共25次重复。分析物的汇总数据如下所示。原始数据列于下表中。
表9.
表10.
结果指示，人类血清中的IGF-1和IGF-2的检测符合可接受性标准。
总精的度。可接受性标准：如果总SD≥1/2TEa或总SD必须小于定义的最大SD或CV，则不可接受。
测定间准确度被定义为测定之间的样品的重现性。分析所有QC水平以确定平均值、SD和变化系数(％CV)。每级每次运行测量2次，共20天，总共40次重复。来自分析物的汇总数据如下所示。原始数据列于下表中。
表11.
汇总IGF-1 水平1 水平2 水平3 水平4
计数 40 40 40 40
总平均值，ng/mL 40.45 176.65 357.68 64.60
总体SD，ng/mL 3.56 11.36 21.37 4.81
总体CV 8.79％ 6.43％ 5.97％ 7.45％
西格玛总体 3.41 4.67 5.02 4.03
精确度>＝3.0西格玛？ 是 是 是 是
表12.
结果指示，人类血清中的IGF-1和IGF-2的检测符合可接受性标准。
空白限度(LOB)。LOB被确定为零校准器的平均值+2SD。IGF-1和IGF-2的LOB分别为1.621ng/mL和10.162ng/mL。
检测限(LOD)。LOD被确定为零校准器的平均值+4SD。IGF-1和IGF-2的LOD分别为2.446ng/mL和12.276ng/mL。
定量限(LOQ)。可接受标准：SD<TEa/3时的最低浓度。
对三个池进行了测试以确定LOQ，这三个池是使用甲醇中的标准校准材料制备的，该甲醇掺入剥离的尿液中。每个池每次运行测量5次，共5次运行。LOQ由SD<TEa/3时的最低浓度确定。检测限的汇总数据如下所示。IGF-1和IGF-2的LOQ分别为7.794ng/mL和31.983ng/mL。
表13.
表14.
校准验证。可接受性标准：所观察值的平均值与预期范围的偏差应该不超过TEa/4。
通过分析2个不同的校准物批次的结果来确定测定的线性。校准物批次是新制备的，并且根据当前工作校准物(先前制备)作为未知物进行测试。分析目标浓度与所观察浓度之间的差异。对数据执行的统计指示可接受性能。
IGF-1和IGF-2的分析测量范围(AMR)分别为7.8-2,000ng/mL和31.3-2,000ng/mL。
可报告范围(RR)。IGF-1和IGF-2的临床可报告范围(CRR)分别为7.8-2,000ng/mL和31.3-2,000ng/mL。
将具有已知IGF-l浓度的六(6)个患者样品用剥离血清稀释2倍、4倍、8倍和16倍。在2、4和8稀释水平下的回收率在100±20％的回收误差内。
将具有已知IGF-2浓度的六(6)个患者样品用剥离血清稀释2倍、4倍、8倍和16倍。在每个稀释水平下的所有回收率均在1 00±20％的回收误差内。
回收率研究。可接受性标准：由于缺乏完美回收率而导致的误差(回收量减去添加量)对于每个个别测量应该≤TEa。
执行加标回收率研究以评估测定内的任何基质效应。对于IGF-1碱基回收样品(总共六个)，通过将200uL剥离血清与400uL每种样品混合来制备。通过将200uL 2,000ng/mLIGF-1储备溶液添加到400uL每种样品来制备加标样品。结果在可接受的准确度范围内。
对于IGF-2碱基回收样品(总共六个)，通过将100uL剥离血清与100uL每种样品混合来制备。通过将100uL 2000ng/mL IGF-2储备溶液添加到100uL每种样品来制备加标样品。结果在可接受的准确度范围内。
分样比较研究。可接受性标准：平均值差异的绝对值应该小于TEa/4。
RLA与当前的安捷伦TOFLC-MS。进行分样比较研究，比较放射免疫测定(RIA)和当前用于IGF-1定量的安捷伦TOF LC-MS技术。在Aria TX-4系统上使用LC-MS方法对100名患者的样品进行拆分和分析。在Esoterix实验室(Calabasas，CA)使用RIA方法同时对样品进行分析。(测试代码#500282；酸后阻断RIA：酒精提取)。通过德明回归分析数据；n＝100，m＝1.039±0.01572，b＝-11.55±5.673。发现LC-MS方法与RIA具有极好的一致性。
HPLC-MS方法比较。通过LC-MS在当前的安捷伦TOF与提议的Q准确聚焦HPLC-MS方法之间进行了IGF-1的分样比较。对一百九十七(n＝197)名患者样品进行了测试，并且线性回归为1.0266x+0.57；r2＝0.9861。结果指示，人类血清中的IGF-1的定量符合可接受性标准。
通过LC-MS在当前的与提议的HPLC-MS方法之间进行了IGF-2的分样比较。对两百一十四(n＝144)名患者样品进行了测试，并且线性回归为0.9327x+38.17；r2＝0.9132。
测量不的定性。定义：人们对特定测量结果的确定程度。表示为给定数字周围的第95个百分位置信区间，由多次确定的平均值+/-1.96*SD确定。
对于修改或未修改的FDA批准或认可的测试，测量不确定性是通过每天测量每个QC水平5次持续5天来确定的。如果需要在短于5天的时间帧内完成MU研究，则每组5个QC值必须单独运行，并且在最终精确度研究中记录缩短的时间帧。
MU置信区间是使用测定验证计算器模板的精确度表计算的。通过计算平均值和标准差来分析数据，然后通过将SD乘以1.96并将其与平均值相加或相减来计算MU。
下表提供了人类血清中的IGF-1和IGF-2的每个QC水平的置信区间。
表15.
汇总IGF-1 水平1 水平2 水平3 水平4
计数 25 25 25 25
总平均值，ng/mL 41.46 146.22 294.35 104.28
总体SD，ng/mL 2.76 7.86 12.04 4.49
总体CV 6.65％ 5.38％ 4.09％ 4.30％
测量不确定性低于95&ile CI 36.06 130.82 270.76 95.48
测量不确定性高于95&ile CI 46.87 161.63 317.94 113.07
表16.
汇总IGF-2 水平1 水平2 水平3
计数 25 25 25
总平均值，ng/mL 150.90 557.99 1055.81
总体SD，ng/mL 4.98 23.76 57.00
总体CV 3.30％ 4.26％ 5.40％
测量不确定性低于95&ile CI 141.13 511.41 944.09
测量不确定性高于95&ile CI 160.67 604.56 1167.53
样品稳定性。可接受性标准：只要该分析物的基线值与时间/温度样品值之间的％差异≤TEa，则样品被认为是稳定的。血清池从临床相关部门获得，并且预先等分并准备好进行设置。
为了研究不同温度下IGF-1和IGF-2的回收率，针对每个温度评估了十个样品。将来自每个池的等分试样在各种温度下孵育持续表7-11中所指示的时间。当稳定性研究池达到适当的孵育时间时，将其放入-90℃至-60℃冰箱中，直到测定当天，此时所有研究池都会一起进行测定。
冷冻/解冻稳定性。针对人类血清中IGF-1材料的冷冻/解冻回收率，对六个样品进行了评估。然后，将所有池分成等份并储存在-90℃至-60℃下。每个池中的六个等分试样经历了不同数量的冷冻/解冻循环(0-5)。表7a中的数据指示，对于所有测试池，从初始冷冻/解冻(循环“0”)开始，进行5个额外的冷冻/解冻循环，人类血清中IGF-1的活性保持在可接受的水平。初始冷冻/解冻循环(循环“0”)表示所有试样在收集过程期间都会经历的冷冻/解冻。以相似的方式对患者样品中的IGF-2进行至多5个冷冻/解冻循环的回收。
IGF-1患者样品在至少6个冷冻/解冻循环内保持稳定。IGF-2患者样品在至少5个冷冻/解冻循环内保持稳定。
冷藏稳定性(2.0℃至8.0℃)。数据表明，人类血清在冷藏温度下保持可接受水平的IGF-1和IGF-2活性达至少7天。
环境稳定性(18.0℃至25.0℃)。数据表明，人类血清在室温下分别保持可接受水平的IGF-1和IGF-2活性达至少2天和至少7天。
冷冻稳定性(-30.0℃至-10.0℃)。数据表明，人类血清在冷冻温度下分别保持可接受水平的IGF-1和IGF-2活性达至少2个月和至少21天。
冷冻稳定性：超低(-90.0℃至-60.0℃)。数据表明，人类血清在室温下分别保持可接受水平的IGF-1和IGF-2活性达至少3个月和至少34天。
干扰研究。可接受性标准：潜在干扰物质造成的平均差异应该≤TEa/4，才被视为可接受的。
溶血干扰。通过在三个患者样品(100uL)中掺入低、中和高浓度的溶血红细胞(RBC)以表示轻度、中度和重度溶血来评估测定中溶血的影响。
对于IGF-1，轻度、中度和重度溶血的平均回收率分别为82.4％、72.4％和63.9％。轻度溶血不会干扰血清测定中的IGF-1，而中度和重度溶血样品是不可接受的。
对于IGF-2，轻度、中度和重度溶血的平均回收率分别为111.9％、119.6％和130.1％。虽然轻度和中度溶血的平均回收率在可接受的范围内，但个别值却不在可接受的范围内。溶血会干扰血清测定中处于所有水平的IGF-2。具有任何程度的溶血的样品都是不可接受的。
血脂干扰。通过在三个患者样品(100uL)中掺入低、中和高浓度的脂肪乳(20％，乳液)以表示轻度、中度和重度脂血症来评估测定中脂血症的影响。
对于IGF-1，轻度、中度和重度脂血症的平均回收率分别为102.8％、97.0％和96.8％。脂血症不会干扰血清测定中的IGF-1。具有任何程度的脂血症的样品都是可接受的。
对于IGF-2，轻度、中度和重度脂血症的平均回收率分别为105.1％、108.6％和122.5％。脂血症不会干扰血清测定中处于轻度和中度水平的IGF-2。具有重度脂血症的样品是不可接受的。
胆红素干扰。通过在三个患者样品(100uL)中掺入低、中和高浓度的胆红素粉末以表示轻度、中度和重度黄疸来评估测定中黄疸的影响。
对于IGF-1，轻度、中度和重度黄疸的平均回收率分别为102.8％、99.0％和98.9％。黄疸不会干扰血清测定中的IGF-1。具有任何程度的黄疸的样品都是可接受的。
对于IGF-2，轻度、中度和重度黄疸的平均回收率分别为99.7％、102.0％和106.0％。黄疸不会干扰血清测定中的IGF-2。具有任何程度的黄疸的样品都是可接受的。
分析特异性。还使用含有以下化合物的混合物测试了IGF-1结合蛋白的干扰：IGF结合蛋白1(IGFBP1)、IGF结合蛋白2(IGFBP2)和IGF结合蛋白3(IGFBP3)。
收集并运行六名患者样品以建立基线。然后，将等体积(200uL)的每个样品和结合蛋白(800ng/mL IGFBP1、2,000ng/mL IGFBP2和10,000ng/mL IGFBP3)组合并测试，以计算IGF-1回收率。这些操作之后，运行六种结合蛋白混合物的溶液(与之前的浓度相同)。结果指示，回收率在100±20％内，并且人类血清中的IGF-1的定量符合可接受性标准。样品回收率指示不存在干扰。
收集并运行一名患者样品以建立基线。然后，将等体积(200uL)的样品和结合蛋白(800ng/mL IGFBP1、2,000ng/mL IGFBP2和10,000ng/mL IGFBP3)组合并测试，以计算IGF-2回收率。这些操作之后，运行一种结合蛋白混合物的溶液(与之前的浓度相同)。结果指示，回收率在100±20％内，并且人类血清中的IGF-2的定量符合可接受性标准。样品回收率指示不存在干扰。注：结合蛋白溶液中IGF-2的低信号可以通过用作基质的剥离血清中存在的低IGF-2量来解释。
离子抑制研究。本研究的目的是确定在梯度过程中或在基质组分注射时是否观察到任何离子抑制或离子增强效应。为了评定这一点，在获取患者样品(6名男性和6名女性)期间，执行了同位素标记的内标物(N15标记的IGF-1)的柱后“T”输注。在此实验中，总离子计数(TIC)在感兴趣的分析物的洗脱时间期间改变小于20％。测试指示，该测定已通过测试，并且未观察到IGF-1和IGF-2的离子抑制。
遗留物。在高浓度标准物(2,000ng/mL)的八次重复之后，立即测试空白血清的十二个重复品，并且在每个LC柱(对应于每个4通道Aria LC系统)中评估遗留物。低校准物重复品在人血清中没有展现出IGF-1和IGF-2的遗留物。
参考区间(RI)。
表17.IGF-1的儿童参考范围：
表18.女性坦纳分期
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*基于乳房分期的坦纳分期
表19.男性坦纳分期
*基于睾丸体积的坦纳分期
表20.IGF-1的成人参考范围，男性和女性：
IGF-2的参考范围
成人，男性和女性267-616ng/mL
儿童，男性和女性(2-18岁)260-630ng/mL
试样类型/替代试样类型。IGF-1测定针对收集在红顶(无凝胶)管中的人类血清进行了验证。完成了来自SST管与红顶管的IGF-1的成对比较。SST管符合可接受性标准。
IGF-2测定针对收集在红顶管中的人类血清进行了验证。针对收集了四十名受试者的配对红顶和SST样品并进行了IGF-2分析。比较了SST血清与红顶血清。未观察到样品管类型之间存在显著差异。SST管符合可接受性标准。
表21.
比较 (n) 斜率 Y轴截距 R2
线性回归 40 0.947 22.3 1
德明回归 40 0.99 5.27
先前指出，血浆样品展现出与自动移液系统不相容的粘度。因此，血浆样品不能用于IGF-1和IGF-2检测。
临床实用性。IGF-1和IGF-2测量可用于诊断生长障碍。侏儒症与血清IGF-1和IGF-2水平降低有关，而肢端肥大症则导致血清IGF-1和IGF-2水平升高。
偏差。在IGF-2测定分样比较中，有一点SE(20.21)>TEa/4(20.03)但<TEa/3(26.70)。对于这些比较，小于TEa/4的SE是优选的，并且小于TEa/3的SE是可接受的。
结论。该验证研究已经过审查，该方法的性能被认为可接受患者测试。
表22.验证结果汇总
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文章、专利和专利申请的内容，以及本文提及或引用的所有其他文件和电子可用信息，均通过引用以其全文并入本文，其程度如同每个个别出版物被具体和个别地指明通过引用并入一般。申请人保留将来自任何此类文章、专利、专利申请或其他物理和电子文档的任何和所有材料和信息实际并入本申请的权利。
本文中绘示性描述的方法可在不存在本文中未具体公开的任何一个或多个要素、一个或多个限制的情况下适当地实践。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应被扩展地理解并且没有限制。此外，本文中所采用的术语和表达已被用作描述而非限制的术语，并且在使用此类术语和表达时无意排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同物。应当认识到，在所要求保护的本发明的范围内，各种修改都是可能的。因此，应当理解，尽管已经通过优选实施例和任选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以采用在本文中公开的其中实施的本发明的修改和变化，并且此类修改和变化被认为在本发明的范围内。
在本文中已广泛并且一般性地描述了本发明。落入一般公开内的较窄种类和次种类组中的每一个也形成方法的一部分。这包括对方法的一般描述，具有从该属中去除任何主题的附带条件或负面限制，而不管所切除的材料是否在本文中具体叙述。
其他实施例在所附权利要求内。另外，在按照马库什(Markush)组描述方法的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本发明也由此按照马库什组中的任何单独成员或成员子组进行描述。

Claims (8)

1.一种用于检测样品中的胰岛素样生长因子-I(IGF-I)变体的方法，所述方法包括：
a.电离所述样品中的IGF-I以产生可通过质谱法检测的一个或多个离子；
b.通过质谱法检测所述离子中的一者或多者，所述离子包括具有选自由以下组成的组的质荷比的离子：1093.5±0.5、1089.8±0.5、1095±0.5、1097.09±0.5、1098.09±0.5；以及
c.使用所检测的一个或多个离子来确定所述样品中IGF1变体的存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其中m/z 1093.5±0.5的检测确定WT4或P66T1的存在。
3.根据权利要求1所述的方法，其中m/z 1089.8±0.5的检测确定P66A4、R55K6或R36Q6的存在。
4.根据权利要求1所述的方法，其中m/z 1095.8±0.5的检测确定A67S4或T29I8的存在。
5.根据权利要求1所述的方法，其中m/z 1097.09±0.5的检测确定S34N2、A70P3、A38V1、M59R4或A67S13的存在。
6.根据权利要求1所述的方法，其中m/z 1098.09±0.5的检测确定S34N9、A70P10、A38V8、M59R11、V17/44M4、R50W6、T4M6或A67/70T6的存在。
7.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在电离之前通过高效液相色谱法(HPLC)纯化蛋白质。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品包括血浆或血清。
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