CN117169093A - 基于荧光抗体标记的细胞定量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞检测领域，具体为基于荧光抗体标记的细胞定量检测方法。本发明中，首先通过细胞固定和渗透化处理将待检测的细胞样品制备成单细胞悬浮液，并选择荧光抗体与单细胞悬浮液共同孵育，使荧光抗体能够特异结合目标细胞表面的分子，使用缓冲液洗涤去除未结合的抗体，收集完成结合的荧光显微镜图像，并利用深度学习算法模型进行是否完成结合的预测。

Description

基于荧光抗体标记的细胞定量检测方法

技术领域

本发明涉及细胞检测领域，具体为基于荧光抗体标记的细胞定量检测方法。

背景技术

细胞定量检测方法有很多，可以通过观察细胞的形态和特征，在显微镜下进行手动计数；可以采用染色剂对细胞进行染色，利用染色剂与细胞内特定成分反应生成有色沉淀物，再通过光学显微镜或比色计依据染色物质的光学性质进行测量和分析，然而，传统的细胞定量检测方法往往会有一些弊端。

一方面，传统的细胞定量检测方法常用的染色剂或显色剂往往具有较低的灵敏度，可能无法检测到低浓度的目标细胞，尤其是它们在样品中分布较稀疏时；

另一方面，传统的细胞定量检测方法在观察标记后的样品时，依赖于研究人员对细胞形态的准确判断，可能导致主观误差和操作的不一致性，影响结果的准确性和可重复性。

发明内容

本发明的目的在于提供基于荧光抗体标记的细胞定量检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：基于荧光抗体标记的细胞定量检测方法，其方法步骤包括：

S1、通过细胞固定和渗透化处理将待检测的细胞样品制备成单细胞悬浮液；

S2、选择荧光抗体与单细胞悬浮液共同孵育，使荧光抗体能够特异结合目标细胞表面的分子；

S3、使用缓冲液洗涤去除未结合的抗体；

S4、收集完成结合的荧光显微镜图像，并利用深度学习算法模型进行是否完成结合的预测。

作为本技术方案的进一步改进，所述通过细胞固定和渗透化处理将待检测的细胞样品制备成单细胞悬浮液，使用细胞解离缓冲液添加到培养容器中覆盖细胞，并将细胞转移至离心管，在使用化学物质通过交联和修复细胞内的蛋白质和核酸，固定细胞的结构和形态，使用溶解剂破坏细胞膜的脂质双层结构，使荧光抗体穿过细胞膜进入细胞内部。

作为本技术方案的进一步改进，所述选择荧光抗体与单细胞悬浮液共同孵育，使荧光抗体能够特异结合目标细胞表面的分子，通过文献研究确定目标分子，并根据目标分子的特性选择抗体，根据荧光显微镜的激发波长和发射波长特性选择荧光染料，将荧光染料和抗体分子结合成荧光抗体，根据孵育时间和温度使荧光抗体与目标细胞结合。

作为本技术方案的进一步改进，所述收集完成结合的实时荧光显微镜图像，并利用深度学习算法模型进行是否完成结合的预测，具体包括：

使用深度学习算法中的卷积神经网络模型根据数据库中的历史荧光显微镜图像进行模型建立，利用建立好的模型对收集的实时荧光显微镜图像进行是否完成结合的预测。

作为本技术方案的进一步改进，所述使用溶解剂破坏细胞膜的脂质双层结构，使荧光抗体穿过细胞膜进入细胞内部，渗透化的时间根据不同类型的细胞设置不同的时间。

作为本技术方案的进一步改进，所述根据孵育时间和温度使荧光抗体与目标细胞结合，孵育时间和温度的设置根据荧光抗体和细胞类型的特性进行调整。

作为本技术方案的进一步改进，所述使用深度学习算法中的卷积神经网络模型根据数据库中的历史荧光显微镜图像进行模型建立，其中模型建立的过程如下：

训练集通过卷积神经网络模型进行前向传播，图像在网络中从输入层开始，通过卷积层、激活函数和池化层进行处理，逐渐提取特征并进行维度的变化，最终到达全连接层。

作为本技术方案的进一步改进，所述利用建立好的模型对收集的实时荧光显微镜图像进行是否完成结合的预测，具体包括：

将输入的数据特征从输入层传递到输出层，每一层的节点根据权重和偏置进行计算，并将结果传递给下一层，根据输出结果利用激活函数产生预测结果。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、基于荧光抗体标记的细胞定量检测方法首先收集目标细胞，通过细胞固定和渗透化的处理以此制备出单细胞悬浮液，根据目标细胞的类型选择合适的荧光抗体与单细胞悬浮液共同孵育，从而让抗体能够特异结合目标细胞表面的分子，以此提高目标细胞的被检测能力。

2、基于荧光抗体标记的细胞定量检测方法根据研究室数据库的历史荧光显微镜图像，利用卷积升级网络算法进行模型建立，利用建立好的模型对制备的实时荧光细胞进行是否结合成功的预测，并将预测的结果发送给研究人员以供参考，以此降低由于人为主观因素导致的错误率，体现了方法的可重复性。

附图说明

图1为本发明的方法步骤示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1，本发明提供一种技术方案：基于荧光抗体标记的细胞定量检测方法，包括如下方法步骤：

S1、通过细胞固定和渗透化处理将待检测的细胞样品制备成单细胞悬浮液；

S2、选择荧光抗体与单细胞悬浮液共同孵育，使荧光抗体能够特异结合目标细胞表面的分子；

S3、使用缓冲液洗涤去除未结合的抗体；

S4、收集完成结合的荧光显微镜图像，并利用深度学习算法模型进行是否完成结合的预测。

具体如下：

S1、方便后续的荧光抗体标记和细胞定量分析，需要将待检测的细胞样品制备成单细胞悬浮液，通过细胞固定和渗透化处理将待检测的细胞样品制备成单细胞悬浮液，具体包括：

细胞收集：通过向培养容器中加入适当的缓冲液（如PBS）来洗涤细胞，以去除在培养过程中产生的代谢产物、细胞碎片和其他污染物，并轻轻摇动和旋转培养容器，使缓冲液充分接触细胞表面，然后将洗涤液倒掉；使用细胞解离缓冲液（如胰酶、Trypsin）来解离细胞，将细胞解离缓冲液添加到培养容器中，使其覆盖细胞，从而破坏细胞间的黏附分子，并将细胞转移至离心管；

细胞固定：使用乙醛、甲醛、乙腈等化学物质通过交联和修复细胞内的蛋白质和核酸，固定细胞的结构和形态，防止细胞在后续处理过程中退化或改变；

渗透化处理：使用溶解剂（如甲醇、乙醇和TritonX-100）破坏细胞膜的脂质双层结构，使细胞膜透性增加，从而使荧光抗体能够穿过细胞膜进入细胞内部，渗透化的时间一般在几分钟到数十分钟之间，其中，不同类型的细胞对渗透化处理的敏感性不同，有些细胞膜较脆弱，容易被溶解剂破坏，渗透化时间应该相对较短，以避免过度破坏细胞膜和细胞结构，而对于一些更耐受的细胞类型，需将渗透化时间延长，以此制备单细胞悬浮液，例如，甲醇作为溶解剂来破坏细胞膜的脂质双层结构需要渗透化时间定为20分钟，这段时间足够长，使溶解剂能够透过细胞膜，使细胞膜透性增加，以便荧光抗体可以进入细胞核。

S2、选择荧光抗体与单细胞悬浮液共同孵育，使荧光抗体能够特异结合目标细胞表面的分子，具体包括：

选择荧光抗体：首先通过文献研究确定目标细胞的表面或细胞内位置的目标分子，并根据目标分子的特性选择一个具有高特异性和高亲和力的抗体，其中，高特异性和高亲和力参考供应商提供的抗体产品信息、文献引用以及其他研究人员的实验结果来评估，然后使用免疫组织化学分析的验证方法去对抗体进行验证，确保其能够特异性地结合目标分子，最后根据荧光显微镜的激发和发射波长特性选择荧光染料，荧光抗体由荧光染料和抗体分子结合而成；

共同孵育：将荧光抗体添加到单细胞悬浮液中，让荧光抗体与目标细胞充分接触，孵育时间和温度根据荧光抗体和细胞类型的特性进行调整，例如，针对抗核抗体（ANA）的荧光抗体在室温下孵育30分钟，能够得到明确的标记信号；针对EGFR的荧光抗体在室温下孵育2小时，能够得到强烈的荧光信号；针对细胞凋亡标记的荧光抗体，如Caspase-3，在4°C下孵育3小时，以增加特异性结合；神经元细胞的荧光染色，在37°C的体温下进行孵育，以模拟体内环境；

S3、为了去除未结合的荧光抗体和背景信号，从而减少非特异性结合引起的干扰，使用缓冲液洗涤去除未结合的抗体，过程如下：

准备洗涤缓冲液，将样品转移到一个新的容器中，并加入洗涤缓冲液，轻轻摇动或搅拌样品，使洗涤缓冲液与样品充分接触，洗涤次数取决于需要去除的未结合荧光抗体的量、背景信号的强度和对荧光信号的要求，例如，对于细菌内源性蛋白的定量，由于细菌在细胞结构上简单，非特异性结合的可能性低，因此进行1至2次洗涤就足够去除未结合的荧光抗体和背景信号；对于免疫荧光检测肿瘤标本，肿瘤样本中存在着更多的非特异性结合和背景信号，因此进行3次及以上的洗涤以增强洗涤效果。

S4、收集完成结合的荧光显微镜图像，并利用深度学习进行是否完成结合的预测，在进行深度学习之前，需要进行深度学习算法模型的训练，因此需要训练模型，训练过程如下：

历史数据收集：利用实验室数据库收集大量的历史荧光显微镜图像，并为每个图像提供正确的细胞标签。这些标签是二进制的，表示图像是否包含细胞，也可以是多类别的，表示不同类型的细胞，例如，收集500张荧光显微镜图像作为训练集，制作标签，用0表示没有荧光细胞，用1表示有荧光细胞，将数据集划分为400张训练图像和100张验证图像；

数据处理：为了提高图像质量和模型的训练效果，需要对图像大小、对比度或者颜色等进行调整，例如，归一化图像，将像素值从0-255缩放到0-1之间；

训练模型：训练集通过卷积神经网络模型进行前向传播，图像在网络中从输入层开始，通过卷积层、激活函数、池化层等进行处理，逐渐提取特征并进行维度的变化，最终到达全连接层。在卷积层的每一层拥有多个卷积核进行特征学习，每个卷积核会在图像上进行滑动，提取局部特征并生成特征图；在卷积层之后，使用非线性的激活函数引入非线性性质，并增加网络的非线性拟合能力；在池化层中，通过对特征图的划分区域进行采样和压缩，降低特征图的维度；在全连接层中，将经过多次卷积和池化操作后所得的特征图展平，并连接到全连接层，全连接层负责将特征进行高维转换和分类，在最后一层的全连接层，激活函数是softmax函数，用于输出类别的概率分布；将网络输出的结果与样本的标签进行比较，通过损失函数（如交叉熵损失函数）计算预测结果和实际标签之间的差异；通过反向传播算法，根据损失函数的值计算模型的梯度，并从最后一层开始逐层反向传播梯度，更新模型参数以最小化损失函数。

在训练完模型之后，需要收集最近的荧光显微镜图像，根据S1到S3完成的实时荧光细胞，利用显微镜相机进行拍摄，并将图像发送给已完成的模型进行预测，将输入的数据特征从输入层传递到输出层，每一层的节点根据权重和偏置进行计算，并将结果传递给下一层，根据输出结果利用激活函数产生预测结果，当结果为0时，表示结合失败；当结果为1时，表示结合成功，并将预测结果转换为文本数值类型发送到研究人员的显示器上。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (8)

1.基于荧光抗体标记的细胞定量检测方法，其特征在于，其方法步骤如下：

S1、通过细胞固定和渗透化处理将待检测的细胞样品制备成单细胞悬浮液；

S2、选择荧光抗体与单细胞悬浮液共同孵育，使荧光抗体能够特异结合目标细胞表面的分子；

S3、使用缓冲液洗涤去除未结合的抗体；

S4、收集完成结合的荧光显微镜图像，并利用深度学习算法模型进行是否完成结合的预测。

2.根据权利要求1所述的基于荧光抗体标记的细胞定量检测方法，其特征在于：所述通过细胞固定和渗透化处理将待检测的细胞样品制备成单细胞悬浮液，使用细胞解离缓冲液添加到培养容器中覆盖细胞，并将细胞转移至离心管，在使用化学物质通过交联和修复细胞内的蛋白质和核酸，固定细胞的结构和形态，使用溶解剂破坏细胞膜的脂质双层结构，使荧光抗体穿过细胞膜进入细胞内部。

3.根据权利要求1所述的基于荧光抗体标记的细胞定量检测方法，其特征在于：所述选择荧光抗体与单细胞悬浮液共同孵育，使荧光抗体能够特异结合目标细胞表面的分子，通过文献研究确定目标分子，并根据目标分子的特性选择抗体，根据荧光显微镜的激发波长和发射波长特性选择荧光染料，将荧光染料和抗体分子结合成荧光抗体，根据孵育时间和温度使荧光抗体与目标细胞结合。

4.根据权利要求1所述的基于荧光抗体标记的细胞定量检测方法，其特征在于：所述收集完成结合的实时荧光显微镜图像，并利用深度学习算法模型进行是否完成结合的预测，具体包括：

使用深度学习算法中的卷积神经网络模型根据数据库中的历史荧光显微镜图像进行模型建立，利用建立好的模型对收集的实时荧光显微镜图像进行是否完成结合的预测。

5.根据权利要求2所述的基于荧光抗体标记的细胞定量检测方法，其特征在于：所述使用溶解剂破坏细胞膜的脂质双层结构，使荧光抗体穿过细胞膜进入细胞内部，渗透化的时间根据不同类型的细胞设置不同的时间。

6.根据权利要求3所述的基于荧光抗体标记的细胞定量检测方法，其特征在于，所述根据孵育时间和温度使荧光抗体与目标细胞结合，孵育时间和温度的设置根据荧光抗体和细胞类型的特性进行调整。

7.根据权利要求4所述的基于荧光抗体标记的细胞定量检测方法，其特征在于：所述使用深度学习算法中的卷积神经网络模型根据数据库中的历史荧光显微镜图像进行模型建立，其中模型建立的过程如下：

训练集通过卷积神经网络模型进行前向传播，图像在网络中从输入层开始，通过卷积层、激活函数和池化层进行处理，逐渐提取特征并进行维度的变化，最终到达全连接层。

8.根据权利要求4所述的基于荧光抗体标记的细胞定量检测方法，其特征在于：所述利用建立好的模型对收集的实时荧光显微镜图像进行是否完成结合的预测，具体包括：

将输入的数据特征从输入层传递到输出层，每一层的节点根据权重和偏置进行计算，并将结果传递给下一层，根据输出结果利用激活函数产生预测结果。