CN117165649A - 一种基于容器密封完整性检测物理与微生物法关联性分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于容器密封完整性检测物理与微生物关联性分析方法，分为物理容器密封完整性测试法、微生物容器密封完整性测试法、pCCIT与mCCIT关联性分析、得出最终结论四步；本发明系统的对注射液类刚性包装与柔性包装系统进行了物理法、微生物法容器密封完整性检测，为CCIT相关研究提供技术指导；同时提供了注射液类刚性包装与柔性包装系统的物理容器密封完整性测试方法与微生物容器密封完整性测试法的关联性研究思路，为采用pCCIT方法预测药物包装的微生物屏障特性提供可能。
Description
技术领域
本发明涉及注射液包装密封完整性研究技术领域，尤其涉及一种基于容器密封完整性检测物理与微生物法关联性分析方法。
背景技术
容器密封完整性(Container closure integrity，CCI)是注射剂质量安全研究过程中至关重要的一部分，对于注射剂无菌属性和理化特性具有重要保障作用，随着注射剂一致性评价的开展，药监部门及药品生产企业越来越关注容器密封完整性对药品质量的影响。容器密封完整性检测(Container closure integrity test，CCIT)方法依据测试技术主要可分为用以发现药品泄漏的物理容器密封完整性测试(Physical container closureintegrity test，pCCIT)方法以及用以确认对微生物的屏障性能的微生物容器密封完整性测试(Microbiological container closure integrity test，mCCIT)方法，两种类型的检测方法对于保障注射剂安全性均发挥着举足轻重的作用。
目前，国内制药行业对于CCIT的研究还处于起步阶段，相关研究机构及企业在面临密封性检测方面还面临诸多疑问而无所适从，针对不同容器密封系统(Containerclosure system，CCS)如何开展合适的pCCIT测试，不同包装系统的微生物侵入风险如何控制，尤其是pCCIT与mCCIT的相关性如何等一直鲜有人进行过系统性的考察研究。pCCIT方法通过测量与泄漏大小相关的某些系统属性，获得测试包装的泄漏情况；mCCIT能够最直接的了解在不同的泄漏孔径微生物侵入的风险大小。但是微生物测试由于自身具有一定概率属性，结果受各种外因影响且耗费时力，因此可以通过构建物理测试方法与微生物测试之间的关联性，进而通过物理方法来表征产品的微生物质量问题。为指导企业生产和药品监管，通过评估不同测定方法适应性以及分析pCCIT与mCCIT两种方法的关联性是十分重要的。
因此，本领域的技术人员针对不同CCS分别选择代表性包装开展物理与微生物容器密封完整性测试，致力于开发一种基于容器密封完整性检测物理与微生物法关联性分析方法，以解决上述现有技术的不足。
发明内容
鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是目前容器密封完整性研究时pCCIT与mCCIT的关联性研究问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种基于容器密封完整性检测物理与微生物法关联性分析方法，所述方法包括以下步骤：
步骤1、使用物理法、微生物挑战法对刚性、柔性包装系统进行测试；
步骤2、根据数据特性对刚性包装进行真空衰减法与微生物挑战法关联性分析；
步骤3、根据数据特性对柔性包装进行质量提取法与微生物挑战法关联性分析；
步骤4、得出分析结论；
所述关联性分析涉及的实验流程、数据取自步骤1；
所述数据特性包括离散型指标数据、连续性指标数据；
所述离散性指标数据选用定性比较的方式进行关联性分析；
所述连续性指标数据选用建立定量关系的方式进行关联性分析；
所述物理法包括质量提取法、真空衰减法、压力衰减法、高压放电法、氦质谱法、激光气体顶空分析法中的一种或多种；
所述微生物挑战法包括气溶胶式微生物挑战法、浸没式微生物挑战法中的一种或多种；
对于步骤2，所述真空衰减法与微生物挑战法关联性分析包括三步：
①确定真空衰减法检测指标压差值随孔径变化呈现的数据特性为连续性指标数据；
②以真空衰减法检测压差值为自变量，相应孔径下菌株侵入概率为因变量，
建立菌株侵入概率与真空衰减法检测压差值之间的定量关系；
③比较不同泄漏孔径下真空衰减法和微生物挑战法的阳性检出率及各自灵敏度差异；
对于步骤3，所述质量提取法与微生物挑战法关联性分析包括三步：
①确定质量提取法测定的质量流量值数据特性为离散型指标数据；
②定性比较微生物挑战法及质量提取法在不同泄漏孔径下的检测灵敏度；
③定性比较微生物挑战法及质量提取法在不同泄漏孔径下的阳性检出率；
采用以上方案，本发明公开的一种基于容器密封性检测物理与微生物法关联性分析方法，具有以下优点：
(1)本发明的一种基于容器密封完整性检测物理与微生物法关联性分析方法，系统的分析建立了两种不同类型pCCIT方法(质量提取法、真空衰减法)对于注射液类柔性包装(直立式聚丙烯输液袋)和刚性包装(玻璃注射剂瓶、)系统CCI评价手段，为注射液类包装系统CCIT提供方法。
(2)本发明的一种基于容器密封完整性检测物理与微生物法关联性分析方法，系统的对注射液类刚性、柔性包装系统的微生物侵入风险进行分析，得出不同菌株微生物侵入能力的差异，为mCCIT相关研究提供手段，为测试菌种选择提供依据。
(3)本发明的一种基于容器密封完整性检测物理与微生物法关联性分析方法，提供了注射液类刚性包装与柔性包装系统的物理性密封完整性测试方法与微生物挑战法的关联性研究思路，为采用pCCIT方法预测药物包装的微生物屏障特性提供可能。
综上所述，本发明公开的一种基于容器密封完整性检测物理与微生物法关联性分析方法，系统的对注射液类刚性包装与柔性包装系统进行了物理法、微生物法容器密封完整性检测，为CCIT相关研究提供技术指导；同时提供了注射液类刚性包装与柔性包装系统的物理性密封完整性测试方法与微生物挑战法的关联性研究思路，为采用pCCIT方法预测药物包装的微生物屏障特性提供可能。
以下将结合具体实施方式对本发明的构思、具体技术方案及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1为实施例1中阴性对照品实物图；
图2为实施例1中测试腔体实物图；
图3为实施例2中阴性对照品实物图；
图4为实施例2中测试腔体实物图；
图5为实施例3的三种试验菌的mCCIT微生物侵入能力比较情况；
图6为实施例4的铜绿假单胞菌侵入结果与真空衰减法的关联性曲线；
图7为实施例4的缺陷短波单胞菌侵入结果与真空衰减法的关联性曲线；
图8为实施例4的玻璃注射剂瓶(规格：10mL)的mCCIT和真空衰减法结果比较分析图；
图9为实施例4的直立式聚丙烯输液袋(规格：100mL)的mCCIT和质量提取法的关联比较图；
图10为实施例4的更低孔径下微生物侵入结果统计图。
具体实施方式
以下介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，这些实施例为示例性描述，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
如若有未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如相关说明书或者手册进行实施。
如图1～10所示，本发明的基于容器密封完整性检测物理与微生物法关联性分析方法，具体实施方式如下：
实施例1、质量提取法研究直立式聚丙烯输液袋(规格：100mL)密封完整性
步骤1.1、准备实验仪器及实验所需材料、试剂；
实验仪器：ATC ME2密封性测试仪(美国Pfeiffer-Vacuum，Inc公司)
实验材料与试剂：如表1所示；
表1直立式聚丙烯输液袋(规格：100mL)包装材料和样品信息
| 包装材料及样品 | 厂家 | 批号 |
| 直立式聚丙烯输液袋(规格：100mL) | 西安利君康乐制药有限责任公司 | Z19122001 |
| 塑料输液容器用聚丙烯双折式组合盖 | 海安县健民橡塑有限公司 | 200701 |
| 氯化钠注射液(0.9％) | 西安利君康乐制药有限责任公司 | 20122001 |
步骤1.2、样品制备；
①阴性对照品：制备与直立式聚丙烯输液袋(规格：100mL)的外形尺寸相同的实心样品作为阴性对照品，用于模拟完全不漏的样品，如图1所示；
②测试腔体：选择在直立式聚丙烯输液袋测试腔体内嵌套，如图2所示；
③阴性样品：取20个产品放入腔体中进行测定，记录最终流量值以及最大流量值，选取和阴性对照品最为接近的10个样品数据值作为阈值参数开发中的阴性样品；
④阳性样品：取空的直立式聚丙烯输液袋(规格：100mL)，在胶塞上插玻璃微管，密封胶密封后固化24h，制备漏孔尺寸分别为3μm±1μm、5μm±1μm的阳性样品各6瓶；
⑤大漏阳性样品：取合格的空的直立式聚丙烯输液袋(规格：100mL)，在其胶塞上插7号注射针头密封胶密封后作为具有大漏的型式缺陷样品，共3瓶；
⑥供试样品：直立式聚丙烯输液袋包装的氯化钠注射液；
步骤1.3、时间参数、临界阈值参数开发；
步骤1.4、方法学验证，检测限与监测范围确定，样品检测；
样品检测：在上述建立的方法和仪器参数下，对直立式聚丙烯输液袋包装的氯化钠注射液样品进行测试，参照《中国药典》2020年版四部无菌检查法抽样原则，取样20袋，测试结果应全部判定为Pass；
步骤1.5、结果分析；
参照对直立式聚丙烯输液袋(规格：250mL)的方法学开发及验证方法，建立了对不同规格、相同药包材系统——直立式聚丙烯输液袋(规格：100mL)的质量提取法CCIT方法；主要参数开发结果如下：时间参数：步骤2、4、9、11测试时间分别为6s、10s、20s、15s；临界阈值参数：微漏界限值界定为7.261μg/min；大漏界限值界定为16.250μg/min；经方法学验证，系统适用性、准确性、精密度、耐用性均良好，方法检测限为3μm；
实施例2、真空衰减法研究刚性包装玻璃注射剂瓶(规格：10mL)密封完整性步骤1.1、准备实验仪器及实验所需材料、试剂；
实验仪器：ATCME2密封性测试仪(美国Pfeiffer-Vacuum，Inc公司)
实验材料与试剂与质量提取法相同；
步骤1.2、样品制备包括：阴性对照品、测试腔体、阴性样品、阳性样品、中漏阳性样品、供试样品：
步骤1.3、参数开发；
真空衰减测试阶段可分为循环1测试系统和循环2测试系统。循环1测试系统主要用于检测测试包装大漏，循环2测试系统主要用于检测测试包装中漏及微漏；
步骤1.4、方法学验证，检测限与监测范围确定，样品检测；
步骤1.5、结果分析：
建立对玻璃注射剂瓶(规格：10mL)的测试手段，进行方法学开发及验证；关键参数开发结果如下：循环1系统平衡时间为2s，测试时间为1s，真空测试上限值为482mbar；循环2系统抽真空时间为15s，平衡时间为15s，测试时间为40s，真空测试上限值为30mbar，产品检测阈值为35Pa；经方法学验证，线性及精密度结果均良好，产品检测限为2μm；
实施例3、微生物挑战法检测刚性包装玻璃注射剂瓶(规格：10mL)的密封完整性(直立式聚丙烯输液袋(规格：100mL)相关微生物挑战法实验流程同此)
步骤1.1、实验仪器：蒸汽灭菌锅SQ810C、电子天平BJ-2202S、生化培养箱KD240、生物安全柜NU-543-400S；
材料与试剂：①玻璃注射剂瓶(规格：10mL)，与物理法相同；
②培养基(TSB)；
③铜绿假单胞菌：CMCC(B)10104
黏质沙雷氏菌：CMCC41002
缺陷短波单胞菌：CICC24090
阳性样品：本实验玻璃注射剂瓶(规格：10mL)阳性样品制备方法为在瓶身中部进行激光打孔；(直立式聚丙烯输液袋(规格：100mL)用阳性样品为在胶塞上插玻璃微管；)
步骤1.2、细菌菌悬液制备、样品制备，培养基促菌生长实验；
①细菌菌悬液制备：将铜绿假单胞菌接种至TSB，在30-35℃条件下培养24h，以0.9％无菌氯化钠溶液逐级稀释制成系列浓度的菌悬液，选择适当的稀释级(菌液浓度不大于100CFU/mL)，用约45℃大豆胰蛋白胨琼脂培养基20mL注皿，置30-35℃培养24-48h，计数；黏质沙雷氏菌、缺陷短波单胞菌同上操作；将新鲜菌悬液约500mL倒入合适的容器中，搅拌均匀备用；三种菌液同法操作；
②样品制备：阳性样品制备方式选择激光打孔，在无菌条件下，向灭菌后(121℃下灭菌15min)的激光打孔中性硼硅玻璃注射剂瓶中加入高于瓶身中部孔径的TSB，与配套铝塑组合盖、卤化丁基橡胶塞组合压盖；
阴性样品制备方式在无菌条件下，向灭菌后的已知完好的中性硼硅玻璃注射剂瓶中加入高于瓶身中部孔径的TSB，与配套铝塑组合盖、卤化丁基橡胶塞组合压盖；
③培养基促菌生长能力验证：取装有培养基的样品6瓶，不经菌液浸泡，选择2瓶接入0.1mL铜绿假单胞菌(10-100CFU/mL)、2瓶接入0.1mL黏质沙雷氏菌(10-100CFU/mL)、2瓶接入0.1mL缺陷短波单胞菌(10-100CFU/mL)，培养3天，应观察到样品均呈阳性结果；
步骤1.3、微生物浸泡实验前，将菌液梯度稀释至10-7，平板计数菌悬液浓度；
步骤1.4、①微生物侵入实验：将阴性样品和阳性样品分别倒置放入三种试验菌液中，底部以支架固定，使试样容器内的培养基充分接触封口内表面，样品的颈部、封口的外表面和阳性样品的漏孔部位应完全浸泡中在菌悬液中，浸泡4h后取出样品；
②表面处理：将样品先用酸性苯酚消毒剂清洗，再用无菌纯化水仔细冲洗小瓶2次，最后用无菌纸擦拭样品外表面；
③侵入结果统计：将上述样品置于30～35℃下培养14天；肉眼观察样品内是否有微生物生长，记录生长情况；侵入实验结果如表2及表3所示；三种试验菌的mCCIT微生物侵入能力比较情况如图5所示；
采用微生物挑战法研究了注射液类刚性包装玻璃注射剂瓶(规格：10mL)的微生物侵入风险，并比较三种菌株(粘质沙雷氏菌、铜绿假单胞菌及缺陷短波单胞菌)侵入能力的差异；从实验结果可见，在所检测系列最小孔径2μm条件下，三种菌株均有侵入现象，其中粘质沙雷氏菌的侵入几率最高为78.9％，铜绿假单胞菌为55％，缺陷短波单胞菌为35％；三种试验菌的侵入能力为：粘质沙雷氏菌(体积最小)＞铜绿假单胞菌(运动活泼)＞缺陷短波单胞菌(常见菌，除菌过滤生物指示剂)；对于铜绿假单胞菌，阳性检出率(P)与缺陷孔径尺寸(X)之间的关系为：P＝e(0.345x-0.450)/(1+e(0.345x-0.450))；采用微生物挑战法研究了注射液类柔性包装直立式聚丙烯输液袋(规格：100mL)的微生物侵入风险，从实验结果可见，在所检测系列最小孔径2μm条件下，粘质沙雷氏菌仍有侵入现象；
表2玻璃注射剂瓶(规格：10mL)微生物侵入试验结果
注：粘质沙雷氏菌2μm激光打孔阳性样品由于在操作过程中损坏一个.故其总数为19个
表3直立式聚丙烯输液袋(规格：100mL)微生物侵入试验结果
注：3、5μm阳性样品由于操作过程中受损，故而总量为19个。
实施例4、物理性密封完整性检测方法与微生物挑战法关联性实验
步骤1.1、①使用真空衰减法和微生物挑战法测试玻璃注射剂瓶(规格：10mL)密封完整性；具体操作与实施例2、实施例3相同；
②使用质量提取法和微生物挑战法测试直立式聚丙烯输液袋(规格：100mL)密封完整性；具体操作与实施例1、实施例3相同；
步骤1.2、①对于玻璃注射剂瓶(规格：10mL)，不同泄漏孔径下，发现真空衰减法检测指标压差值随孔径变化呈现连续性关系，关联性分析以建立与微生物挑战法之间的定量关系为目的；以真空衰减法检测压差值为自变量，对其取Ln值，作为X轴，相应孔径下菌株侵入概率为因变量，作为Y轴，建立菌株侵入概率与真空衰减法检测压差值二者间定量关系；铜绿假单胞菌侵入概率与真空衰减法检测压差值的关联性模型为：y＝13.847Lnx+3.6951，r＝0.973，如图6所示；缺陷短波单胞菌侵入结果与真空衰减法的关联性模型为y＝13.29Lnx-16.771，r＝0.958，如图7所示；
此外，比较在2、5、8μm泄漏孔径下，微生物挑战法和真空衰减法的阳性检出率，如图8所示；结果显示：真空衰减法对于2、5、8μm阳性样品检出率均为100％，检测灵敏度为2μm；微生物挑战法结果显示铜绿假单胞菌、粘质沙雷氏菌、缺陷短波单胞菌三种菌株在2、5、8μm的检出率均未达100％，检测灵敏度均大于8μm；可得出结论在相同泄漏孔径下，mCCIT灵敏度低于真空衰减法；
②对于直立式聚丙烯输液袋(规格：100mL)，pCCIT质量提取测试过程中发现，在不同泄漏孔径下，质量提取法测定的质量流量值并未出现连续性数据，故数据类型判定为离散型，关联性分析以定性比较为主；
首先比较在3、5μm泄漏孔径下，微生物挑战法和质量提取法的阳性检出率与方法检测灵敏度，如图9所示；结果显示：质量提取法对于3、5μm阳性样品检出率均为100％，检测灵敏度为3μm；微生物挑战法在3、5μm泄漏孔径下，检出率均未达100％，检测灵敏度大于5μm；
为探索微生物对直立式聚丙烯输液袋的临界侵入孔径，继续选择0.2μm、1μm泄漏孔径阳性样品进行微生物挑战试验，结果如图10所示，在0.2μm孔径下检测率为15％，1μm孔径下检出率为27.8％；可得出结论：在相同泄漏孔径下，质量提取法灵敏度高于mCCIT；但是pCCIT质量提取法受限于设备精度，目前检测限度值在2μm以上，而本试验mCCIT能够达到较低检测限度值(0.2μm)；
将实施例1～4综合分析，可知，本发明的一种基于容器密封完整性检测物理与微生物法关联性分析方法系统的对注射液类刚性包装与柔性包装系统进行了物理法、微生物法容器密封完整性检测，为CCIT相关研究提供技术指导；同时提供了注射液类刚性包装与柔性包装系统的物理性密封完整性测试方法与微生物挑战法的关联性研究思路，为采用pCCIT方法预测药物包装的微生物屏障特性提供可能。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的试验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (4)
1.一种基于容器密封完整性检测物理与微生物法关联性分析方法，其特征在于，
所述方法包括以下步骤：
步骤1、使用物理容器密封完整性测试法、微生物容器密封完整性测试法对刚性、柔性包装系统进行测试；
步骤2、根据数据特性对刚性包装进行真空衰减法与微生物挑战法关联性分析；
步骤3、根据数据特性对柔性包装进行质量提取法与微生物挑战法关联性分析；
步骤4、得出分析结论；
所述关联性分析涉及的实验流程、数据取自步骤1；
所述数据特性包括离散型指标数据、连续性指标数据；
所述离散性指标数据选用定性比较的方式进行关联性分析；
所述连续性指标数据选用建立定量关系的方式进行关联性分析。
2.如权利要求1所述一种基于容器密封完整性检测物理与微生物法关联性分析方法，其特征在于，
所述物理法包括质量提取法、真空衰减法、压力衰减法、高压放电法、氦质谱法、激光气体顶空分析法中的一种或多种；
所述微生物挑战法包括气溶胶式微生物挑战法、浸没式微生物挑战法中的一种或多种。
3.如权利要求1所述一种基于容器密封完整性检测物理与微生物法关联性分析方法，其特征在于，
对于步骤2，所述真空衰减法与微生物挑战法关联性分析包括三步，
①确定真空衰减法检测指标压差值随孔径变化呈现的数据特性为连续性指标数据；
②以真空衰减法检测压差值为自变量，相应孔径下菌株侵入概率为因变量，建立菌株侵入概率与真空衰减法检测压差值之间的定量关系；
③比较不同泄漏孔径下真空衰减法和微生物挑战法的阳性检出率及各自灵敏度差异。
4.如权利要求1所述一种基于容器密封完整性检测物理与微生物法关联性分析方法，其特征在于，
对于步骤3，所述质量提取法与微生物挑战法关联性分析包括三步，
①确定质量提取法测定的质量流量值数据特性为离散型指标数据；
②定性比较微生物挑战法及质量提取法在不同泄漏孔径下的检测灵敏度；
③定性比较微生物挑战法及质量提取法在不同泄漏孔径下的阳性检出率。
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