CN117165534A - 一种永生化人胃癌成纤维细胞株及其构建和增殖强化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于细胞永生化技术领域，具体涉及一种永生化人胃癌成纤维细胞株及其构建和增殖强化方法，采用酶消化法分离，纯化人胃癌组织来源成纤维细胞,利用猿猴病毒SV40转染原代人胃癌成纤维细胞，药物筛选，得到了永生化人胃癌成纤维细胞株，通过增殖增强培养基强化了其增殖能力；序列鉴定结果显示，永生化人胃癌成纤维细胞为全新的细胞株；传代15代后，永生化人胃癌成纤维细胞的增殖速率仍优于非永生化人胃癌成纤维细胞，β‑半乳糖苷酶染色结果显示：随着细胞代数增加，与非永生化成纤维细胞相比,永生化成纤维细胞未见明显衰老，这说明成功建立了永生化人胃癌成纤维细胞系，为胃癌肿瘤微环境研究提供进一步的实验基础。
Description
技术领域
本发明属于细胞永生化技术领域，具体涉及一种永生化人胃癌成纤维细胞株及其构建和增殖强化方法。
背景技术
肿瘤相关成纤维细胞系是构成肿瘤微环境的重要细胞成分，原代细胞往往只有特定的几代能够稳定增长，无法保证持续传代，进而无法保证肿瘤微环境重建，不利于后续实验进行，目前，尤其是在胃癌相关领域，仍缺少一株稳定的增殖能力强的永生化人胃癌成纤维细胞株用于体外细胞实验，在商业领域更无相关永生化人胃癌成纤维细胞株的成功产品。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种永生化人胃癌成纤维细胞株及其构建和增殖强化方法，采用酶消化法分离，纯化人胃癌组织来源成纤维细胞,利用猿猴病毒SV40转染以及再转染原代人胃癌成纤维细胞，以嘌呤霉素筛选，得到了一株永生化人胃癌成纤维细胞株，并通过增殖增强培养基培养，强化了其增殖能力；最后，序列鉴定结果显示,永生化人胃癌成纤维细胞为全新的细胞株，与已知细胞数据库信息均无重合，即使在传代15代后，永生化人胃癌成纤维细胞的增殖速率明显优于非永生化人胃癌成纤维细胞，β-半乳糖苷酶染色结果显示：随着细胞代数增加,与非永生化人胃癌成纤维细胞相比,永生化人胃癌成纤维细胞未见明显衰老，这说明成功建立了人胃癌来源的永生化成纤维细胞系，为胃癌肿瘤微环境研究提供进一步的实验基础。
具体的本发明的技术方案如下：
一种永生化人胃癌成纤维细胞株，名称为人胃癌永生化成纤维细胞GCAF1 Homosapiens，于2023年7月26日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO. C2023233。
本发明还提供上述一种永生化人胃癌成纤维细胞株的构建和增殖能力强化方法，包括如下步骤：
S1：分离培养原代人胃癌成纤维细胞；
S2：原代人胃癌成纤维细胞孔板铺板；
S3：病毒转染，将得到的细胞传代，病毒再转染；
S4：以嘌呤霉素筛选，得到永生化人胃癌成纤维细胞株；
S5：细胞增殖能力强化：培养至细胞密度80%~90%，增殖增强培养基培养，使永生化人胃癌成纤维细胞增殖能力强化；
所述增殖增强培养基包括雌酮和恩利卡生。
进一步的，S1中，所述分离培养原代人胃癌成纤维细胞的步骤包括：
（1）组织块培养：胃癌组织置于装有清洗液的离心管，冲洗2~4次，剪切胃癌组织，浸泡冲洗，均铺培养瓶，预贴壁培养；
（2）贴壁细胞提取及传代：培养基A 2~3ml浸润组织块，连续培养14日，弃去培养基A，吸去组织块，加入PBS洗涤2~4次后加入1ml胰酶，37℃消化2~3min，再加入培养基A中和消化，离心，弃上清，加入培养基A重悬细胞沉淀后，传代培养；
（3）贴壁细胞组分纯化：培养至细胞密度为75~80%，控制胰酶消化时间及细胞贴壁时间优化细胞组分，提高原代人胃癌成纤维细胞纯度。
进一步的，S2中，所述原代人胃癌成纤维细胞孔板铺板的步骤包括：对分离纯化后得到的原代人胃癌成纤维细胞进行24孔板铺板，每孔铺3x104细胞。
进一步的，S3中，病毒转染使用的病毒为猿猴病毒SV40，病毒滴度为108TU/ml，MOI=10，以5ul/孔加入孔板。
进一步的，S4中，所述嘌呤霉素筛选的步骤包括：
传代培养3日，待细胞状态稳定后，每孔1ml培养基+1ug/L嘌呤霉素进行药物筛选，每日更换1次培养基，清除细胞碎片及代谢产物，连续7~10日，将成功转染后的细胞筛出后，胰酶消化继续进行传代培养。
进一步的，S5中，所述增强培养基的组分包括：胎牛血清、DMEM、青链霉素双抗、雌酮、恩利卡生。
本发明还提供一种永生化人胃癌成纤维细胞株及其构建和增殖强化方法在构建体外胃癌免疫微环境或筛选药物中的应用。
本发明的有益效果在于：
（1）本发明提供了一种永生化人胃癌成纤维细胞株，填补了该领域的细胞系空白，为构建体外胃癌免疫微环境建立了基础，对研究胃癌的形成及转移的机理及其治疗方法具有重大意义；
（2）本发明的构建方法利用细胞特性，改进胰酶消化时间，即使原组织样本质量较差也可获取纯净的人胃癌成纤维细胞组分，显著减少了原代细胞提取至永生化所需的时间，贴壁细胞反复病毒转染，提高感染效率，即使初始样本量相对较低，经悉心培养及多次病毒感染后也可获取较多永生化人胃癌成纤维细胞系进行后续处理；
（3）本发明对永生化人胃癌成纤维细胞株增殖增强方法显著强化了永生化细胞的增殖能力，将内源性雌激素Estrone联合抗凋亡试剂恩利卡生联合用于培养永生后的人胃癌成纤维细胞，便于该细胞系后期开展肿瘤细胞与肿瘤成纤维细胞相互作用及肿瘤微环境探索等研究。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为永生化人胃癌成纤维细胞镜下视野（P0为原代，P1传代1次；放大倍数：4倍、10倍、20倍）；
图2为非永生化与永生化人胃癌成纤维细胞免疫荧光鉴定；
图3为传代后非永生化与永生化人胃癌成纤维细胞的增殖速率对比（3代、6代、10代、15代）；
图4为非永生化与永生化人胃癌成纤维细胞的衰老鉴定对比（β- 半乳糖苷酶染色）；
图5为不同程度增殖能力强化前后的永生化人胃癌成纤维细胞的增殖速率对比。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1
1.本发明标本来源：2023年03月，取自山东大学齐鲁医院一名男性胃癌患者手术后标本，病理分型为印戒细胞癌伴部分粘液腺癌。患者无明显不适主诉，术前CT显示肿瘤，术前签署山东省齐鲁医院生物样本资源中心患者知情同意书。
2.标本获取与处理：手术台上切除标本后，直接于无菌条件下置入转运培养基中带回实验室中，于生物安全柜中进行操作。
转运培养基配制：
①DMEM/F12培养基 45ml；
②10%胎牛血清 5ml；
③100ug/ml Primocin（母液50mg/ml）100ul；
④0.1% BSA 50mg；
⑤10uM Y-27632(母液100mM) 5ul；
⑥2mM谷氨酰胺（母液100X）500ul
实施例2
1.原代人胃癌成纤维细胞的培养过程，步骤如下：
（1）组织块培养：预贴壁3小时后，轻轻加入培养基A 3ml浸润组织块(组织块应全部浸没防止浮起)，培养前3日需每日换液，目的是将细胞碎屑进行洗脱以及提供充分营养，有利于细胞从组织块爬出，3日后，每隔2日进行换液，连续培养14日；
（2）贴壁细胞提取及传代：连续培养14日后，弃去培养基，吸去组织块，PBS洗涤3次后加入1ml胰酶，37℃消化3分钟，再加入3ml培养基A中和消化，1000rpm，5min离心，弃上清，加入1ml培养基A重悬细胞沉淀后，于T-25培养瓶中进行传代培养；
培养基A配制：
① 10%胎牛血清 (Biological Industries BI，lsrael，货号：04-001-1ACS)5ml；
② DMEM (Hyclone，美国，货号：SH30023.01)培养基45ml；
③ 青链霉素双抗 250ul；
④ 100ug/mL Primocin（母液50mg/ml）100ul；
（3）贴壁细胞组分纯化：培养36小时后，T-25培养瓶中细胞密度长至75%；此时贴壁细胞包括原代人胃癌成纤维细胞，同时存在胃癌细胞、普通成纤维细胞、成红细胞等杂细胞；此时通过控制胰酶消化时间及细胞贴壁时间优化细胞组分，提高原代人胃癌成纤维细胞纯度；原代人胃癌成纤维细胞相较其他细胞易贴壁，易被消化，具体操作如下：①缩短胰酶消化时间为1.5min，随后加入3ml培养基A中止消化；并将T-25瓶中剩余细胞组分反复消化2次，提高细胞利用率，最后一次消化所的细胞1000rpm，5min离心，弃上清，加入1ml培养基A重悬细胞沉淀后备用；剩余未被消化的贴壁细胞为杂细胞。②差速贴壁法获取纯原代人胃癌成纤维细胞：上①步中所得细胞悬液铺板于新的T-25培养瓶中，并置于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中贴壁培养30min后吸出上清，此时贴壁细胞为较纯净的原代人胃癌成纤维细胞，加入5ml培养基A培养。上清转移至另一T-25培养瓶中，重复②中操作2次，以提高细胞利用率；
（4）贴壁细胞镜下形态学观察：经过（3）步骤细胞组分纯化后，镜下观察培养瓶内细胞，可见细胞生长良好，并呈现区别于杂细胞的均一形态：细胞呈多角形或长梭形，单层生长，体饱满，背景清晰，无杂质。证明细胞组分纯净，生长状态良好。
2.原代人胃癌成纤维细胞永生化过程
（1）铺板：对分离纯化后得到的原代人胃癌成纤维细胞进行24孔板铺板， 每孔铺3x104细胞；
（2）转染：待细胞密度长至50%时，使用人胃癌成纤维细胞培养基A常规换液，每孔1ml。猿猴病毒SV40(病毒滴度：108TU/ml，MOI=10) 5ul/孔加入后继续培养，8小时后进行换液，此时培养基换为10％FBS(Biological Industries BI，lsrael，货号：04-001-1ACS)+DMEM培养基(Hyclone，美国，货号：SH30023.01)，继续培养；
（3）传代：病毒作用2天后，待细胞密度长至80%时，以1：2进行传代培养。每孔加入1ml 10％FBS(Biological Industries BI，lsrael，货号：04-001-1ACS)+DMEM培养基(Hyclone，美国，货号：SH30023.01)，继续培养；
（4）病毒再转染：目前暂无成纤维细胞系反复病毒转染以提高转染效率的先例，根据病毒转染原理，我们采取了病毒再转染以提高转染效率，构建稳健细胞系的操作：待上一步细胞长至密度50%时，重复（2）步进行病毒再转染，提高转染效率；
（5）嘌呤霉素筛选：传代培养3日，待细胞状态稳定后，每孔1ml培养基+1ug/l嘌呤霉素进行药物筛选，每日更换1次培养基，清除细胞碎片及代谢产物，连续7日，将成功转染的细胞筛出后，胰酶消化继续进行传代培养，得到一株永生化人胃癌成纤维细胞株，显微镜传代培养观察如图1所示。
实施例3
为获得一株功能强化的永生化人胃癌成纤维细胞系用于后续胃癌免疫微环境相关研究，我们将雌激素（Estrone）联合抗凋亡试剂恩利卡生（Emricasan）加入永生化人胃癌成纤维细胞培养基A中，以促进表型及增殖能力的强化。
G蛋白偶联雌激素受体（GPER）在癌症相关成纤维细胞（CAFS）中过表达，在CAFS中，雌激素经GPER介导触发了一系列信号转导通路：GPER通过激活人表皮生长因子受体（EGFR）/细胞外信号调节激酶（ERK）／c-fos信号转导通路，上调细胞周期素cyclinD1/A/E，从而刺激肿瘤细胞和CAFS，促进肿瘤细胞进展及转移，维持并强化CAFS功能。
一种永生化人胃癌成纤维细胞株的增殖强化方法，步骤如下：
（1）细胞培养：将上述初步构建成功的永生化人胃癌成纤维细胞于T25培养瓶中进行培养，初始细胞密度2x105/cm2,使用人胃癌相关成纤维细胞培养基A；
（2）促细胞增殖：培养至细胞贴壁后，将人胃癌相关成纤维细胞培养基A换为增强培养基，4-5ml/T25瓶；
增强培养基配制：
①10%胎牛血清（Biological Industries BI，lsrael，货号：04-001-1ACS）5ml；
②DMEM（Hyclone，美国，货号：SH30023.01）培养基45ml；
③青链霉素双抗 250μl；
④100ug/ml Primocin（母液50mg/ml）100ul；
⑤1000pM Estrone（雌酮，母液0.1mM）0.5ul；
⑥30μM Emricasan（恩利卡生，母液10mM）150μl。
（3）继续培养至细胞密度80%-90%，胰酶消化后，以1：3进行传代，继续使用增强培养基进行培养，连续培养3-5代；
（4）增殖能力强化后的人胃癌相关永生化成纤维细胞可在细胞密度较低情况下进行传代培养。正常密度传代时，到达可传代数量级细胞量的时间较未强化时缩短。
本发明发现了雌激素结合CAFS-GPER并促进癌症相关成纤维细胞表型强化，但暂无相关雌激素用于人胃癌相关成纤维细胞系的研究，故本发明创新性将内源性雌激素Estrone联合抗凋亡试剂恩利卡生联合用于培养永生化人胃癌成纤维细胞，便于该细胞系后期开展肿瘤细胞与CAFS相互作用及肿瘤微环境探索等研究。
实施例4
一种永生化人胃癌成纤维细胞的鉴定：
（1）永生化人胃癌成纤维细胞的形态学观察：
取传代培养1的永生化人胃癌成纤维细胞，在光学显微镜下观察活细胞生长情况（4X&10X&20X）。结果见图1，由图1可见：本细胞系生长旺盛，背景清晰，杂质少见，贴壁生长细胞为纤维状，2~3日可以传代。
（2）永生化人胃癌成纤维细胞STR鉴定：
① 短串联重复序列(short tandem repeat，STR)又称为微卫星DNA，是指染色体上，由数个碱基对作为核心单位(2-6个碱基对)，串联重复形成的一类DNA序列(重复次数为10 ~ 60多次，基因片段在400碱基对以下)；每个核心单位重复的次数会出现个体差异，从而形成片段长度不同的等位基因。因此，一组STR序列的重复次数在不同个体中几乎是唯一的，是个体的基因身份特征，也是细胞生物学对细胞身份和来源进行鉴定的主要方法。
② 胰酶消化收集P15代永生化人胃癌成纤维细胞，PBS充分清洗3遍，去除胰酶及培养基成分，1000rpm，5min离心收集细胞沉淀，细胞量＞106个。用Axygen的基因组抽提试剂盒提取DNA，采用21- STR扩增方案扩增，在ABI 3730XL型遗传分析仪上对STR位点和性别基因Amelogenin进行检测。
③ STR位点及Amelogenin位点包括：D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、VWA、TH01、AMEL、TPOX、CSF1PO、D12S391、FGA、D2S1338、D21S11、D18S51、D8S1179、D3S1358、D6S1043、 PENTAE、D19S433、PENTAD、D1S1656。细胞系遗传物质STR分析如表1所示。
④ 在德国微生物菌种保藏中心DSMZ数据库 (Deutsche SammlungvonMikroorganismen and Zellkulturen)、美国典型培养物保藏中心(ATCC数据库)，日本JCRB细胞保藏中心，日本理化学研究所(RIKEN)进行STR序列检索，未发现相同STR检测结果。即在数据库未找到与该细胞匹配的位点，表明此为新细胞株；未发现多等位点，表明此细胞株为单一细胞，无其他细胞污染。
表1：永生化人胃癌成纤维细胞和Amelogenin位点的基因分型结果
（3）永生化人胃癌成纤维细胞特异性蛋白免疫荧光染色鉴定
① 细胞爬片：取3片玻璃片于24孔板中，每孔加入培养基0.5ml，加入细胞2×105/孔。置37℃，体积分数为5%CO2培养箱过夜；
② 固定：细胞爬片后，吸出培养基，用PBS洗1遍，加入4%多聚甲醛于4℃固定30min。用PBS 1ml 5min/次，清洗3次；
③ 破膜封闭：玻璃片封闭液配置：0.5% Trition X-100与PBS 1:1混合，再加5%胎牛血清，取300ul破膜封闭液滴进每孔，作用1h后，PBS 1ml 5min/次，清洗3次；
④ 一抗孵育：一抗配制（α-SMA与FAP与PBS 1:500稀释），破膜封闭后，取50uL一抗于防水膜上（湿盒中），将玻片（有细胞的一面）盖上置于4℃冰箱过夜；
⑤ 二抗孵育：二抗配制（二抗:PBS=1:2500稀释），室温避光孵育1小时后，PBS 1ml5min/次，清洗3次，染DAPI（DAPI:PBS=1:1000）5min，PBS1ml 5min/次，清洗3次；
注释：一抗分别为兔抗人α-SMA单克隆抗体（ab124964，Abcam，英国），兔抗人FAP单克隆抗体（ab53066，Abcam，英国）；FAP对应的荧光二抗为Alexa Fluor 488标记驴抗兔IgG（H+L）（YEASEN，中国，货号：34206ES60）；α-SMA对应的荧光二抗为Alexa Fluor 594标记驴抗兔IgG（H+L）（YEASEN，中国，货号：34212ES60）。
⑥ 包埋：载玻片上各滴20 μl Fluoromount-G ，将玻片有细胞的一面盖上。实验共分2组，分别为原代人胃癌成纤维细胞组及永生化人胃癌成纤维细胞组。
⑦ 显像：共聚焦显微镜拍照观察。
如图2所示，永生化人胃癌成纤维细胞染色体核型仍保留正常细胞的基本特征，而未发生恶性转化。
（4）永生化人胃癌成纤维细胞生长曲线绘制及衰老检测
①生长曲线绘制：利用MTT试剂盒检测第3，6，10，15代永生化与非永生化人胃癌成纤维细胞的生长曲线，以每孔1500个细胞种于96孔板中进行培养。每孔加入20μL MTT试剂，37℃、体积分数为5% CO2培养箱中避光孵育2小时，使用酶标仪检测470nm波长处吸光度值，连续检测4日。重复实验3次，取均值，如图4所示。
②衰老检测：将非永生化和永生化的第3，6，10，15代人胃癌成纤维细胞以1.5×105个/孔细胞密度接种于6孔板，培养24小时后吸除细胞培养液，加入1ml β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定10min，吸除细胞固定液，PBS每孔3ml洗涤细胞3次，每次3min，吸除PBS，每孔加入1ml 染色工作液，37℃孵育20分钟-2小时或更长时间，直至部分细胞颜色变蓝，如果孵育时间较长，可以用封口膜或保鲜膜封住6孔板防止蒸发，普通光学显微镜下观察，如图3所示，即使传15代，永生化人胃癌成纤维细胞的增殖速率依然明显优于非永生化人胃癌成纤维细胞。
（5）永生化人胃癌成纤维细胞增殖能力强化对比试验
按照实施例3的一种永生化人胃癌成纤维细胞株的增殖强化方法，通过减少增强培养基相关组分，培养三组细胞对比其增殖速率，培养基组分如下：
表2 不同增强培养基培养的细胞增殖强化速率对比
| 组别 | 雌酮 | 恩利卡生 |
| NC组 | - | - |
| A组 | + | - |
| B组 | + | + |
| C组 | - | + |
“+”为添加对应试剂，“-”为不添加对应试剂。
实验方法：
1)细胞用胰酶消化制成单细胞悬液，用计数板计数细胞悬液浓度后，配制成实验需要的细胞浓度1.5×103个/ml。
2）在96孔板中接种细胞悬液，将培养板放在培养箱预培养(在37℃，5％CO2的条件下)。
3)每孔加入20μl MTT试剂。
4)将培养板在培养箱内孵育2小时。
5)用酶标仪测定在470nm处的吸光度，连续检测4天，重复实验3次，取均值。
实验结果如图5所示：结果表明雌酮（一种内源性雌激素）具备维持、强化永生化人胃癌成纤维细胞的功能，同时，雌酮同恩利卡生具备良好的协同作用，显著提高了本发明永生化人胃癌成纤维细胞的增殖能力。
Claims (9)
1.一种永生化人胃癌成纤维细胞株，名称为人胃癌永生化成纤维细胞GCAF1 Homosapiens，于2023年7月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.C2023233。
2.一种永生化人胃癌成纤维细胞株的构建和增殖能力强化方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：分离培养原代人胃癌成纤维细胞；
S2：原代人胃癌成纤维细胞孔板铺板；
S3：病毒转染，将得到的细胞传代，病毒再转染；
S4：以嘌呤霉素筛选，得到永生化人胃癌成纤维细胞株；
S5：细胞增殖能力强化：培养至细胞密度80%~90%，增殖增强培养基培养，使永生化人胃癌成纤维细胞增殖能力强化；
所述增殖增强培养基的组分包括雌酮和恩利卡生。
3.如权利要求2所述的一种永生化人胃癌成纤维细胞株的构建和增殖能力强化方法，其特征在于，S1中，所述分离培养原代人胃癌成纤维细胞的步骤包括：
（1）组织块培养：胃癌组织置于装有清洗液的离心管，冲洗2~4次，剪切胃癌组织，浸泡冲洗，均铺培养瓶，预贴壁培养；
（2）贴壁细胞提取及传代：培养基A 2~3ml浸润组织块，连续培养14日，弃去培养基A，吸去组织块，加入PBS洗涤2~4次后加入1ml胰酶，37℃消化2~3min，再加入培养基A中和消化，离心，弃上清，加入培养基A重悬细胞沉淀后，传代培养；
（3）贴壁细胞组分纯化：培养至细胞密度为75~80%，控制胰酶消化时间及细胞贴壁时间优化细胞组分，提高原代人胃癌相关成纤维细胞纯度。
4.如权利要求2所述的一种永生化人胃癌成纤维细胞株的构建和增殖能力强化方法，其特征在于，S2中，所述原代人胃癌成纤维细胞孔板铺板的步骤包括：对分离纯化后得到的原代人胃癌相关成纤维细胞进行24孔板铺板，每孔铺3x104细胞。
5.如权利要求2所述的一种永生化人胃癌成纤维细胞株的构建和增殖能力强化方法，其特征在于，S3中，病毒转染使用的病毒为猿猴病毒SV40，病毒滴度为108TU/ml，MOI=10，以5ul/孔加入孔板。
6.如权利要求2所述的一种永生化人胃癌成纤维细胞株的构建和增殖能力强化方法，其特征在于，S4中，所述嘌呤霉素筛选的步骤包括：
传代培养3日，待细胞状态稳定后，每孔1ml培养基+1ug/L嘌呤霉素进行药物筛选，每日更换1次培养基，清除细胞碎片及代谢产物，连续7~10日，将成功转染后的细胞筛出后，胰酶消化继续进行传代培养。
7.如权利要求2所述的一种永生化人胃癌成纤维细胞株的构建和增殖能力强化方法，其特征在于，S5中，所述增强培养基的组分包括：胎牛血清、DMEM、青链霉素双抗、雌酮、恩利卡生。
8.权利要求1所述的一种永生化人胃癌成纤维细胞株或权利要求2~7任一项所述的一种永生化人胃癌成纤维细胞株的构建和增殖能力强化方法在构建体外胃癌免疫微环境中的应用。
9.权利要求1所述的一种永生化人胃癌成纤维细胞株或权利要求2~7任一项所述的一种永生化人胃癌成纤维细胞株的构建和增殖能力强化方法在筛选胃癌相关疾病药物中的应用。
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| GR01 | Patent grant | ||
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