CN117165462A - 一种生产红没药烯的区室化工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种通过解脂耶氏酵母过氧化物酶体区室化工程合成α‑红没药烯的工程菌及方法，属于分子生物学技术领域。本发明首次在严格好氧微生物解脂耶氏酵母中将法尼烯基合成途径过表达并定位至过氧化物酶体合成α‑红没药烯。本发明的工程菌株Polg P9能够利用含厨房废油的培养基高效合成α‑红没药烯，摇瓶最高产量为2550.7mg/L，在发酵罐中通过分批补料的方式获得15.5g/Lα‑红没药烯，是迄今为止报道的微生物细胞工厂菌株中的最高产量。为今后开展解脂耶氏酵母等微生物细胞工厂合成红没药烯或其他萜烯类化合物提供了有价值的参考。
Description
技术领域：
本发明涉及一种过氧化物酶体区室化工程合成α-红没药烯的方法，属于分子生物学技术领域。
背景技术：
红没药烯(Bisabolene)，化学式为(C15H24)，是一种疏水的单环倍半萜，具有三种结构异构体，分别为：α-红没药烯、β-红没药烯、γ-红没药烯。红没药烯是植物的次生代谢产物，由异戊二烯骨架结构单位(异戊烯基焦磷酸IPP和二甲基烯丙基焦磷酸DMAPP)组成。由于其令人愉悦的果香和香熏香气，习惯上被用作食品添加剂中的调味剂和化妆品中的香精。由于其医疗特性，它还在制药行业中作为抗炎和抗癌剂在药品中得到应用。由于其能量高和类似于石油燃料的理化性质，最近被能源部门确定为潜在的替代生物柴油的前体物质。因此，红没药烯的市场前景巨大。
厨房废油(waste cooking oil，WCO)主要指高温使用的煎炸油、厨房垃圾中混入的食用油脂和直接排入下水道的含油废水。厨房废油含有甘油三酯、极性化合物和非挥发性化合物。目前，全球植物油的年消费量约为2亿吨，其中32％的食用油成为了废油。大部分废油被排入污水管道，造成水体污染。因此，回收利用厨房废油作为生产增值化学品的原料是防止环境污染的可取之处，也将增加废油的经济价值。厨房废油已被用于生产生物柴油、生物塑料、柠檬酸和赤藓糖醇，为回收废油提供了潜在的经济和环保方式。
解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)是一种非常规的产油酵母，具有完整的脂质生物合成和降解途径。过氧化物酶体是脂肪酸发生β-氧化的位置，其形成的大量乙酰辅酶A是合成红没药烯时所必需的重要前体物质，与发生在细胞质中的糖酵解途径相比，β-氧化途径降解脂肪酸生成乙酰辅酶A的过程中没有CO2释放，所以碳原子不会丢失，从理论上讲，碳转化率更高。与细胞质中的通路表达相比，细胞器中的通路区室化通常在以下方面具有优势：第一，区室化工程可以使整条通路的反应更加集中在细胞器内，这不仅防止了代谢物、酶或辅助因子的损失，还产生了更高的局部浓度，因此加速了代谢反应。第二，区室化有助于将通路与竞争反应或不利条件隔离开来，一种化合物在几种途径中都是中间体是很常见的，当这些路径出现在同一空间时，任何路径都不可能在不妨碍其他路径的情况下达到最大效率。消除竞争途径可能并不总是有效，因为竞争途径可能是细胞生长所必需的，在这种情况下，通过区室化工程隔绝通路是改善目标产物前体利用率较好的策略。第三，当代谢途径的中间产物对宿主细胞有毒时，途径的区室化是十分有必要的，中间产物在细胞器内大量生成，而不会对宿主细胞有毒害影响。因此，利用过氧化物酶体区室化工程，可能为解脂耶氏酵母高效生产α-红没药烯提供更好的策略。
目前大多数萜类化合物生产通常主要集中在细胞质中，利用过氧化物酶体中的乙酰辅酶A合成α-红没药烯，即将法尼烯基合成途径和植物来源的α-红没药烯合酶定位至解脂耶氏酵母过氧化物酶体合成α-红没药烯的方法目前还未见报道。本发明又通过区室化工程结合系统代谢工程对工程菌株进一步改造：通过增强甲羟戊酸途径、强化β-氧化途径、为过氧化物酶体通过ATP、动态调控过氧化物酶体、生物反应器放大生产等技术提高α-红没药烯的产量。
发明内容：
针对解脂耶氏酵母传统细胞质代谢工程合成萜类化合物的途径干扰和防止代谢物、酶或辅助因子的损失等问题，本发明提供了一种通过解脂耶氏酵母过氧化物酶体区室化合成α-红没药烯的方法。
本发明提供的技术方案之一，是一株通过解脂耶氏酵母过氧化物酶体途径定位合成α-红没药烯的工程菌Po1g P1，所述Po1g P1是在解脂耶氏酵母宿主菌的过氧化物酶体中表达乙酰辅酶A硫解酶(Acetoacetyl-CoA thiolase，Erg10)、羟甲基戊二酰乙酰辅酶A合酶(Hyd roxymethylglutaryl-CoA synthase，Erg13)、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(Hydroxymethylglut aryl-CoA reductase，HMGR)、甲羟戊酸激酶(Mevalonate kinase，Erg12)、磷酸甲羟戊酸激酶(Phosphomevalonate kinase，Erg8)、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(Diphosphomevalonate decarboxylase，Erg19)、异戊烯基二磷酸异构酶(Isopentenyl-diphosphate delta-isomerase，ID I)、法尼基焦磷酸合酶(Farnesyl diphosphatesynthase，Erg20)和外源α-红没药烯合酶(α-Bisabolene synthase，α-BiS)所得(图1)；
进一步地，通过过氧化物酶体增强型定位信号(Enhanced peroxisome-targetingsignal,ePTS1)将上述酶定位至过氧化物酶体进行表达，所述ePTS1是在目的蛋白上添加的具有将酶定位至过氧化物酶体内功能的过氧化物酶体定位信号。
进一步地，所述解脂耶氏酵母宿主菌为解脂耶氏酵母Po1gΔKU70菌株。
上述获得的解脂耶氏酵母工程菌株Po1g P1能够利用YPO培养基在好氧条件下合成α-红没药烯；为进一步开发解脂耶氏酵母作为过氧化物酶体亚细胞工厂的潜力，在工程菌株Po1g P1的基础上，继续地对其进行改造。
本发明提供的技术方案之二，是在解脂耶氏酵母工程菌株Po1g P1的基础上，分别表达或同时表达添加了过氧化物酶体定位信号的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(Hydroxymethylglut aryl-CoA reductase，HMGR)和外源α-红没药烯合酶(α-Bisabolenesynthase，α-BiS)，增强过氧化物酶体内α-红没药烯合成路径代谢流，分别构建获得HMGR双拷贝过氧化物酶体工程菌株Po1g P2、α-BiS双拷贝过氧化物酶体工程菌株Po1g P3、以及HMGR和α-BiS双拷贝过氧化物酶体工程菌株Po1g P4(图2)。
本发明提供的技术方案之三，是在解脂耶氏酵母工程菌株Po1g P4的基础上，单基因过表达或组合过表达过氧化物酶体多功能酶(Multifunctional enzyme,MFE1)、过氧化物酶体硫解酶(Peroxisomalthiolase,POT1)，增强过氧化物酶体内β-氧化降解脂肪酸的能力，以生成更多的α-红没药烯合成的前体物质乙酰辅酶A，构建获得MFE1过表达过氧化物酶体菌株Po1g P5，POT1过表达过氧化物酶体菌株Po1g P6和MFE1、POT1同时过表达过氧化物酶体菌株Po1g P7(图3)。
本发明提供的技术方案之四，是在解脂耶氏酵母工程菌株Po1g 7的基础上，表达过氧化物酶体ATP转运蛋白(Adenine nucleotide transporter,ANT1)，将细胞质内的ATP转运到过氧化物酶体，为过氧化物酶体提供额外的ATP，构建过氧化物酶体工程菌株Po1gP8(图4)。
本发明提供的技术方案之五，是在解脂耶氏酵母工程菌株Po1g 8的基础上，敲除过氧化物酶体膜蛋白(Peroxisomal membrane protein,YlPex23p)，实现对过氧化物酶体的动态调控，构建过氧化物酶体工程菌株Po1g P9。
进一步地，所述乙酰辅酶A硫解酶(Acetoacetyl-CoA thiolase，Erg10)为来源于解脂耶氏酵母的乙酰辅酶A硫解酶，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
进一步地，所述羟甲基戊二酰乙酰辅酶A合酶(Hydroxymethylglutaryl-CoAsynthase，Erg13)为来源于解脂耶氏酵母的HMG-CoA合成酶，编码基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示；
进一步地，所述羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(Hydroxymethylglutaryl-CoAreductase，HMGR)来源于解脂耶氏酵母的HMG-CoA还原酶，编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；
进一步地，所述甲羟戊酸激酶(Mevalonate kinase，Erg12)为来源于解脂耶氏酵母的甲羟戊酸激酶，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
进一步地，所述磷酸甲羟戊酸激酶(Phosphomevalonate kinase，Erg8)为来源于解脂耶氏酵母的磷酸甲羟戊酸激酶，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
进一步地，二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(Diphosphomevalonate decarboxylase，Erg19)为来源于解脂耶氏酵母的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶，编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示；
进一步地，异戊烯基二磷酸异构酶(Isopentenyl-diphosphate delta-isomerase，IDI)为来源于解脂耶氏酵母的异戊烯基二磷酸异构酶，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
进一步地，法尼基焦磷酸合酶(Farnesyl diphosphate synthase，Erg20)为来源于解脂耶氏酵母的法尼基焦磷酸合酶，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
进一步地，所述α-红没药烯合酶(α-Bisabolene synthase，α-BiS)为来源于北美冷杉的α-红没药烯合成酶，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
进一步地，所述过氧化物酶体多功能酶(Multifunctional enzyme,MFE1)为来源于解脂耶氏酵母的过氧化物酶体β-氧化多功能酶，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
进一步地，所述过氧化物酶体硫解酶(Peroxisomal thiolase,POT1)为来源于解脂耶氏酵母的过氧化物酶体β-氧化硫解酶，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；
进一步地，所述过氧化物酶体ATP转运蛋白(Adenine nucleotide transporter,ANT1)为来源于解脂耶氏酵母的过氧化物酶体ATP转运蛋白，编码基因的核苷酸序列如SEQID NO.12所示；
进一步地，所述过氧化物酶体膜蛋白(Peroxisomal membrane protein,PEX23)为来源于解脂耶氏酵母过氧化物酶体膜蛋白YlPex23p，编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.13所示；
进一步地，所述ePTS1，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
本发明提供的技术方案之六，是上述解脂耶氏酵母工程菌株Po1g P1-Po1g P9中任意菌株的应用；
进一步地，是在发酵生产α-红没药烯中的应用；
进一步地，采用上述菌株利用YPO培养基在摇瓶级别好氧条件下合成α-红没药烯的方法如下：
将解脂耶氏酵母工程菌株Po1g P1-Po1g P9中的任意菌株的种子液按1％接种量接种至YPD培养基中，30℃，200-220rpm条件培养15-18h，再按2％(v/v)接种量转接至YPO培养基中30℃，200-220rpm培养条件下发酵120±5h。
所述YPD培养基组成为：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，余量为水，pH5.7-5.8，115℃，灭菌20min。
所述YPO培养基组成为：蛋白胨18-22g/L，酵母浸粉8-12g/L，厨房废油11-12g/L，吐温80 1.8-2.2g/L，MgSO4·7H2O 2g/L,余量为水，115-121℃，灭菌20min。
进一步地，发酵120h后取样，检测红没药烯的含量，摇瓶发酵下Po1g P1-Po1g P9菌株发酵液中α-红没药烯含量分别达到460.8mg/L、877.9mg/L、796.3mg/L、1256.2mg/L、1365.3mg/L、1587.6mg/L、1884.3mg/L、2235.1mg/L、2550.7mg/L。
进一步地，是上述解脂耶氏酵母工程菌株Po1g P9在发酵罐发酵生产α-红没药烯的中的应用；
更进一步地，利用含有厨房废油的培养基在分批补料条件下合成α-红没药烯的方法是：
将解脂耶氏酵母工程菌株Po1g P9种子液按1％接种量接种至YPD培养基中，30℃，200-220rpm条件培养15-18h，再按1％(v/v)的接种量转接至YPD培养基中30℃，200-220rpm条件培养至OD600达到1左右，种子液按2％接种量接种到发酵罐中。
发酵罐发酵条件如下：
发酵罐培养基：60g/L厨房废油、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉、2g/L的吐温80、10g/L的MgSO4·7H2O、3g/L(NH4)2SO4、其余为水；
发酵过程中培养基pH稳定控制在6.0、温度为30℃、叶轮搅拌速率为600rpm、通气量为1.5vvm，发酵时间为130-180h，每隔12h通过分批补料的方式在发酵罐中按照发酵液体积添加30-60mL/L经过灭菌处理的厨房废油培养基。
α-红没药烯的合成量随着发酵时间的增加而不断积累，在发酵144h时产量达到最高15.5g/L，是目前在微生物底盘细胞中报道的最高产量。生物量OD600在48h内迅速增加，在发酵的后期逐渐稳定到182左右。
有益效果：
本发明公开了一种通过解脂耶氏酵母过氧化物酶体区室化工程合成α-红没药烯的方法，首次在解脂耶氏酵母中将法尼烯基合成途径定位至过氧化物酶体合成α-红没药烯。本发明的工程菌株Po1g P1-P9能够利用YPO培养基高效合成α-红没药烯。通过法尼烯基合成途径的过氧化物酶体定位并利用含厨房废油的培养基合成甲羟戊酸及下游萜类化合物，使得解脂耶氏酵母合成甲羟戊酸及下游萜类化合物的产率大幅提高。
实验证实：工程菌株Po1g P1-Po1g P9利用YPO培养基摇瓶发酵120h合成红没药烯的产量分别可达460.8mg/L、877.9mg/L、796.3mg/L、1256.2mg/L、1365.3mg/L、1587.6mg/L、1884.3mg/L、2235.1mg/L、2550.7mg/L，而在胞质中合成α-红没药烯的对照工程菌株Po1g KαBS利用葡萄糖生产α-红没药烯的产量仅为0.4mg/L。
为进一步提高α-红没药烯的产量，挖掘解脂耶氏酵母过氧化物酶体作为亚细胞工厂合成α-红没药烯的潜能，本申请探究了不同代谢策略对过氧化物酶体合成α-红没药烯的影响。如，将法尼烯基合成途径定位到过氧化物酶体避免其他途径干扰；为充分利用过氧化物酶体亚细胞区域中存在的代谢物资源，过表达双拷贝过氧化物酶体MVA路径限速酶HMGR和外源基因α-BiS；为了增强β-氧化降解脂肪酸的能力，生成更多的前体物质乙酰辅酶A，过表达β-氧化途径多功能酶MFE1和硫解酶POT1；为给过氧化物酶体提供ATP，过表达过氧化物酶体ATP转运蛋白ANT1；为实现过氧化物酶体的动态调控，敲除了过氧化物酶体膜蛋白YlPex23p。过氧化物酶体工程菌株Po1g P1-Po1g P9合成α-红没药烯的产量分别为460.8mg/L、877.9mg/L、796.3mg/L、1256.2mg/L、1365.3mg/L、1587.6mg/L、1884.3mg/L、2235.1mg/L、2550.7mg/L。上述结果表明，在表达了MVA路径限速酶基因HMGR和外源基因α-BiS、β-氧化途径多功能酶MFE1和硫解酶POT1、过氧化物酶体ATP转运蛋白ANT1、敲除过氧化物酶体膜蛋白YlPex23p的解脂耶氏酵母工程菌株中均能够不同程度的提高α-红没药烯的产量。
最终，为对工程菌株Po1g P9进行发酵罐放大生产工艺研究，将工程菌株Po1g P9在含有厨房废油培养基的发酵罐中进行分批补料发酵，发酵144h时产量达到最高15.5g/L，是目前在微生物底盘细胞中发酵生产α-红没药烯的最高产量。
本发明通过法尼烯基合成途径的过氧化物酶体定位提高了α-红没药烯合成的产量，利用微生物合成法来生产甲羟戊酸下游萜类化合物，极大地提高了所述菌株的应用附加值，有利用解决植物提取法和化学合成法所带来的分离提纯工艺复杂、提取效率低、能耗高、污染环境等问题，具有可观的应用前景和经济价值。
附图说明：
图1区室化工程代谢线路图；
图2双拷贝HMGR和α-BiS代谢线路图；
图3过表达β-氧化途径多功能酶MFE1和硫解酶POT1代谢线路图；
图4ANT1作用示意图；
图5Po1g KαBS和Po1g P1菌株基因PCR验证图
其中，泳道1-10分别为Po1g KαBS、Po1g P1(Erg10-ePTS1、Erg13-ePTS1、HMGR-ePTS 1、Erg12-ePTS1、Erg8-ePTS1、Erg19-ePTS1、IDI-ePTS1、Erg20-ePTS1、α-Bisabolene-ePTS1)；
图6PCR验证图；
其中，泳道1-7分别为Po1g P2、Po1g P3、Po1g P4、Po1g P5、Po1g P6、Po1g P7、Po1g P8；图7敲除过氧化物酶体膜蛋白YlPex23p验证胶图；
其中，泳道1-5是验证诺尔丝菌素表达盒和下同源臂是否整合到基因组上的5个不同转化子，泳道6-10是验证诺尔丝菌素表达盒是否整合到基因组上的5个不同转化子；
图8Po1gΔKU70和Po1g P9的过氧化物酶体超微结构图
(A)透射电子显微镜分析过氧化物酶体形态变化
其中，P：过氧化物酶体；数据信息：对于所有显微照片，显示一个单一的焦平面，比例尺为1μm。
(B)过氧化物酶体激光全扫描共聚焦显微镜分布分析
数据信息：对于所有显微照片，显示一个单一的焦平面，比例尺为5μm。
图9实施例4产量图。
图10实施例5产量图。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例仅为本发明中的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他实施例，都属于本发明保护范围之内。
本发明所使用的解脂耶氏酵母Po1gΔKU70(基因型MATA,xpr2-332,leu2-270,ku70-,ura3-302::URA3,Axp-2)为现有技术，是在解脂耶氏酵母Po1g菌株中敲除KU70基因获得的，其构建方法参考文献Genetic engineering of an unconventional yeast forrenewable biofuel a nd biochemical production.Journal of VisualizedExperiments,2016,115,e54371。所述解脂耶氏酵母Po1g菌株购买自中国台湾的YeasternBiotech Co.公司。
本发明涉及携带筛选标记的过表达载体pYLEX1、pYLEX1(hyg)和pYLEX1(nat)。表达载体pYLEX1(hyg)和pYLEX1(nat)是基于表达载体pYLEX1的基础上分别整合潮霉素(hygromycin)和诺尔丝菌素(Nourseothricin)表达盒构建出来的。
所述pYLEX1质粒，购自Yeastern Biotech Co.,Ltd.。所述质粒带有营养缺陷筛选基因亮氨酸表达盒、标记基因Amp、强启动子hp4d以及终止子XPR2 term。
本发明涉及的培养基如下：
YPD固体培养基配方：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L，余量为水。
YPO培养基组成成分为：蛋白胨18-22g/L，酵母浸粉8-12g/L，厨房废油11-12g/L，吐温80 1.8-2.2g/L，MgSO4·7H2O 2g/L,余量为水，115-121℃，灭菌20min。
YNB固体筛选培养基配方：YNB(Yeast Nitrogen Base)6.7g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L，余量为水。
YPD-hyg固体培养基配方：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，潮霉素0.6g/L，琼脂粉20g/L，余量为水。
YPD-nat固体培养基配方：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，诺尔丝菌素0.08g/L，琼脂粉20g/L，余量为水。
本发明实施例在构建解脂耶氏酵母工程菌株Po1g P1-P9过程中使用到的部分基因的编码序列如SEQ ID NO.1-14所示。
以下通过具体实施例对本发明作进一步地解释说明。
实施例1构建在过氧化物酶体中定位表达法尼烯基合成途径和植物来源的α-红没药烯合酶的解脂耶氏酵母工程菌株Po1g P1
1.1构建表达载体
(1)来自北美冷杉的α-红没药烯合酶基因(GenBank登录号：AF006195.1)根据解脂耶氏酵母密码子使用偏好性进行密码子优化并在基因3′端加入His标签，之后进行基因合成并整合在质粒pYLEX1上，以交由金唯智公司合成的基因质粒pYLEX1-α-Bisabolene为模板，通过引物PCR的方式在α-红没药烯合成酶的终止密码子前添加过氧化物酶体定位信号ePTS1(ctgggccgaggacgacgatccaagctg)序列，获得α-Bisabolene-ePTS1片段；PCR获得α-Bisabolene-ePTS1片段的引物如下：
α-Bisabolene-ePTS1-F:acaaccacacacatccacgtgAATGGCCGGTGTCTCTGCC；
α-Bisabolene-ePTS1-R:TTAGTTTCGGGTTCCCACTTAcagcttggatcgtcgtcctcggcccagGTGGTGATGGTGGTGGTGGAG；
同样地，根据Genbank中解脂耶氏酵母的基因组序列(Yarrowia lipolyticaCLIB122，SEQ ID NO.1-9所示)，根据上述同样的方法(仅替换引物和模板即可)分别在来自解脂耶氏酵母的乙酰辅酶A硫解酶(Erg10,YALI0B08536g)、羟甲基戊二酰乙酰辅酶A合酶(Erg13,YALI0F30481g)、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR,YALI0E04807g)、甲羟戊酸激酶(Erg12,YALI0B16038g)，磷酸甲羟戊酸激酶(Erg8,YALI0E06193g)、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(Erg19,YALI0F05632g)、异戊烯基二磷酸异构酶(IDI,YALI0F04015g)、法尼基焦磷酸合酶(Erg20,YALI0E05753g)的终止密码子前添加过氧化物酶体定位信号ePTS1(ctgggccgaggacgacgatccaagctg)序列。以及同时根据表达载体pYLEX1序列分别设计上述将ePTS1添加至目的基因的引物：
Erg10-ePTS1-F:
ggaacccgaaactaaggatccAATGGAGCCCGTCTACATTGTT
Erg10-ePTS1-R:
ACAAGTTCCGTAGTTGGATCctacagcttggatcgtcgtcctcggcccagacacttctcaacaatgatag
Erg13-ePTS1-F:
acaaccacacacatccacgtgAATGTCGCAACCCCAGAACG
Erg13-ePTS1-R:
TTAGTTTCGGGTTCCgtgctacagcttggatcgtcgtcctcggcccagctgcttgatctcgtactttc
HMGR-ePTS1-F:
acaaccacacacatccacAATGCTACAAGCAGCTATTGGAAA
HMGR-ePTS1-R:
TTAGTTTCGGGTTCCCACctacagcttggatcgtcgtcctcggcccagtgaccgtatgcaaatattcg
Erg12-ePTS1-F:
ggaacccgaaactaaggatcAATGGACTACATCATTTCGGCG
Erg12-ePTS1-R:
ACAAGTTCCGTAGTTGctacagcttggatcgtcgtcctcggcccagatgggtccagggaccgat
Erg8-ePTS1-F:
acaaccacacacatccacgtgAATGCTACTTGAACCCCTTCTCG
Erg8-ePTS1-R:
TTAGTTTCGGGTTCCgtgCTAcagcttggatcgtcgtcctcggcccagatgaccacctattcggctcc
Erg19-ePTS1-F:
acaaccacacacatccacgtgAATGATCCACCAGGCCTCCA
Erg19-ePTS1-R:
TTAGTTTCGGGTTCCgtgctacagcttggatcgtcgtcctcggcccagcttgctgttcttcagagaac
IDI-ePTS1-F:
actttggtctactccgAATGCTACTTGATCCACCGCC
IDI-ePTS1-R:
GGGACAGGCCATGGAGGTACCTAcagcttggatcgtcgtcctcggcccagatgacgacgtcttacagc
Erg20-ePTS1-F:
acaaccacacacatccacgtgAATGTCCAAGGCGAAATTCG
Erg20-ePTS1-R:
TTAGTTTCGGGTTCCgtgctacagcttggatcgtcgtcctcggcccagcttctgtcgcttgtaaatct
具体方法如下：以来源于解脂耶氏酵母Po1gΔKU70的基因组为模板，分别使用Erg10-ePTS1-F/R、Erg13-ePTS1-F/R、HMGR-ePTS1-F/R、Erg12-ePTS1-F/R、Erg8-ePTS1-F/R、Erg19-ePTS1-F/R、IDI-ePTS1-F/R、Erg20-ePTS1-F/R引物PCR扩增得到携带相应末端同源序列的Erg10-ePTS1、Erg13-ePTS1、HMGR-ePTS1、Erg12-ePTS1、Erg8-ePTS1、Erg19-ePTS1、IDI-ePTS1、Erg20-ePTS1组装片段。PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性15S，55℃退火15S，72℃延伸2min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。
质粒pYLEX1和pYLEX1(hyg)通过PmlⅠ或KpnⅠ内切酶消化后，回收纯化。
利用Vazyme组装试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit对pYLEX1线性化片段分别和α-Bisabolene-ePTS1、Erg10-ePTS1、Erg13-ePTS1、HMGR-ePTS1、Erg12-ePTS1、Erg8-ePTS1、Erg19-ePTS1、IDI-ePTS1、Erg20-ePTS1组装片段进行组装，构建获得pYLEX1-α-Bi sabolene-ePTS1、pYLEX1-Erg10-ePTS1、pYLEX1-Erg13-ePTS1、pYLEX1-HMGR-ePTS1、pYLEX1-Erg12-ePTS1、pYLEX1-Erg8-ePTS1、pYLEX1-Erg19-ePTS1、pYLEX1-IDI-ePTS1、pYLEX1-Erg20-ePTS1质粒；
利用Vazyme组装试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit对pYLEX1(hyg)线性化片段分别和HMGR-ePTS1组装片段和α-Bisabolene-ePTS1组装片段进行组装，构建完成pYLEX1(hyg)-HMGR-ePTS1和pYLEX1(hyg)-α-Bisabolene-ePTS1质粒。
(2)根据Genbank中解脂耶氏酵母基因组的MFE1、POT1、ANT1基因序列(SEQ IDNO.10-12所示)和表达载体pYLEX1序列分别设计引物，扩增上述目的基因的引物如下：
MFE1-F:
ActttggtctactccggtacAATGTCTGGAGAACTAAGATACGACGG
MFE1-R:
GggacaggccatggaggtaccTTAGAGCTTAGCATCCTTGGGG
POT1-F:
ActttggtctactccggtacATGGAGCCCGTCTACATTGTTT
POT1-R:
GggacaggccatggaggtaccCTAACACTTCTCAACAATGATAGAGGAA
ANT1-F:
actttggtctactccgAATGGCAGCTATTTCCAAAGACTATG
ANT1-R
gggacaggccatggaggtacTTATCCCTTGATCAAGGTGGGG
以来源于解脂耶氏酵母Po1gΔKU70的基因组为模板，分别使用MFE1-F/R、POT1-F/R、ANT1-F/R引物PCR扩增得到MFE1片段、POT1片段、ANT1片段。PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性15S，55℃退火15S，72℃延伸2min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。
质粒pYLEX1通过PmlⅠ内切酶消化后，回收纯化。利用Vazyme组装试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit对pYLEX1线性化片段分别和MFE1片段、POT1片段、ANT1片段进行重组，构建完成pYLEX1-MFE1、pYLEX1-POT1、pYLEX1-ANT1质粒。
(3)质粒pYLEX1-Erg10-ePTS1通过BsaWI内切酶消化后，回收纯化。根据表达载体pYLEX1-Erg10-ePTS1整合位点BsaWI的序列设计引物：
BsaW I-F：
AtcctgcgatgcagatccggaGAGGCCGTTGAGCACCGC
BsaW I-R：
CctgcaccattatgttccggGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTCG
以表达载体pYLEX1-Erg13-ePTS1为模板，使用BsaWI-F/BsaWI-R引物PCR扩增得到携带相应末端同源序列的Erg13-ePTS1表达盒组装片段。PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性15S，55℃退火15S，72℃延伸2min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。利用Vazyme组装试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit对pYLEX1-Erg10-ePTS1酶切片段和ePTS1-Erg13表达盒组装片段进行组装，构建完成pYLEX1-Erg10-Erg13-ePTS1质粒，通过引物设计的形式在整合片段Erg13-ePTS1表达盒上预留了BsaWI位点作为下一轮质粒构建的基因整合位点。
(4)质粒pYLEX1-Erg10-Erg13-ePTS1通过BsaWI内切酶消化后，回收纯化。根据表达载体pYLEX1-Erg10-Erg13-ePTS1整合位点BsaWI的序列设计引物：
BsaW I-F：
AtcctgcgatgcagatccggaGAGGCCGTTGAGCACCGC
BsaW I-HMGR-R：
GggtcctggccacgggtgcgATAAGCTGTCAAACATGAGAATTCG
以表达载体pYLEX1-HMGR-ePTS1为模板，使用BsaWI-F/BsaWI-HMGR-R引物PCR扩增得到携带相应末端同源序列的HMGR-ePTS1表达盒组装片段。PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性15S，55℃退火15S，72℃延伸2min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。
利用Vazyme组装试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit对pYLEX1-Erg10-Erg13-ePTS1酶切片段和ePTS1-HMGR表达盒组装片段进行组装，构建完成pYLEX1-Erg10-Erg13-HMGR-ePTS1质粒。
(5)质粒pYLEX1-Erg10-Erg13-HMGR-ePTS1通过PshAⅠ内切酶消化后，回收纯化。
根据表达载体pYLEX1-Erg10-Erg13-HMGR-ePTS1整合位点PshAⅠ的序列设计引物：
PshAⅠ-F：
AgtcataagtgcggcgacgaGAGGCCGTTGAGCACCGC
PshAⅠ-R：
AcgtcttgctggcgttcgGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTCG
以表达载体pYLEX1-Erg12-ePTS1为模板，使用PshAⅠ-F/PshAⅠ-R引物PCR扩增得到携带相应末端同源序列的Erg12-ePTS1表达盒组装片段。PCR反应条件：95℃预变性5mi n，95℃变性15S，55℃退火15S，72℃延伸2min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。
利用Vazyme组装试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit对pYLEX1-Erg10-Erg13-HMGR-ePTS1酶切片段和Erg12-ePTS1表达盒组装片段进行组装，构建完成pYLEX1-Erg10-Erg13-HMGR-Erg12-ePTS1质粒，通过引物设计的形式在整合片段Erg12-ePTS1表达盒上预留了PshAⅠ位点作为下一轮质粒构建的基因整合位点。
(6)质粒pYLEX1-Erg10-Erg13-HMGR-Erg12-ePTS1通过PshAⅠ内切酶消化后，回收纯化。根据表达载体pYLEX1-Erg10-Erg13-HMGR-Erg12-ePTS1整合位点PshAⅠ的序列设计引物：
PshAⅠ-F：
AgtcataagtgcggcgacgaGAGGCCGTTGAGCACCGC
PshAⅠ-Erg8-R：
CgcataagggagagcgtcgaGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTCG
以表达载体pYLEX1-Erg8-ePTS1为模板，使用PshAⅠ-F/PshAⅠ-Erg8-R引物PCR扩增得到携带相应末端同源序列的Erg8-ePTS1表达盒组装片段。PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性15S，55℃退火15S，72℃延伸2min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。
利用Vazyme组装试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit对pYLEX1-Erg10-Erg13-HMGR-Erg12-ePTS1酶切片段和Erg8-ePTS1表达盒组装片段进行组装，构建完成pYLEX1-Erg10-Erg13-HMGR-Erg12-Erg8-ePTS1质粒。
(7)质粒pYLEX1-Erg10-Erg13-HMGR-Erg12-Erg8-ePTS1通过FspAⅠ内切酶消化后，回收纯化。根据表达载体pYLEX1-Erg10-Erg13-HMGR-Erg12-Erg8-ePTS1整合位点FspAⅠ的序列设计引物：
FspAⅠ-F：
gacaggagcacgatcatgcgAGGCCGTTGAGCACCGC
FspAⅠ-R：
gggtcctggccacgggtgcgATAAGCTGTCAAACATGAGAATTCG
以表达载体pYLEX1-Erg19-ePTS1为模板，使用FspAⅠ-F/FspAⅠ-R引物PCR扩增得到携带相应末端同源序列的ePTS1-Erg19表达盒组装片段。PCR反应条件：95℃预变性5mi n，95℃变性15S，55℃退火15S，72℃延伸2min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。
利用Vazyme组装试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit对pYLEX1-Erg10-Erg13-HMGR-Erg12-Erg8-ePTS1酶切片段和Erg19-ePTS1表达盒组装片段进行组装，构建完成pYL EX1-Erg10-Erg13-HMGR-Erg12-Erg8-Erg19-ePTS1质粒，通过引物设计的形式在整合片段Er g19-ePTS1表达盒上预留了FspAⅠ位点作为下一轮质粒构建的基因整合位点。
(8)质粒pYLEX1-Erg10-Erg13-HMGR-Erg12-Erg8-Erg19-ePTS1通过FspAⅠ内切酶消化后，回收纯化。根据表达载体pYLEX1-Erg10-Erg13-HMGR-Erg12-Erg8-Erg19-ePTS1整合位点FspAⅠ的序列设计引物：
FspAⅠ-F：
gacaggagcacgatcatgcgAGGCCGTTGAGCACCGC
FspAⅠ-IDI-R：
AcgtcttgctggcgttcgGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTCG
以表达载体pYLEX1-IDI-ePTS1为模板，使用FspAⅠ-F/FspAⅠ-IDI-R引物PCR扩增得到携带相应末端同源序列的IDI-ePTS1表达盒组装片段。PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性15S，55℃退火15S，72℃延伸2min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。
利用Vazyme组装试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit对pYLEX1-Erg10-Erg13-HMGR-Erg12-Erg8-Erg19-ePTS1酶切片段和IDI-ePTS1表达盒组装片段进行组装，构建完成pYLEX1-Erg10-Erg13-HMGR-Erg12-Erg8-Erg19-IDI-ePTS1质粒。
(9)质粒pYLEX1-Erg10-Erg13-HMGR-Erg12-Erg8-Erg19-IDI-ePTS1通过BstZ17 I内切酶消化后，回收纯化。根据表达载体pYLEX1-Erg10-Erg13-HMGR-Erg12-Erg8-Erg19-IDI-ePT S1整合位点BstZ17 I的序列设计引物：
BstZ17 I-F：
cgcatagttaagccagtaGAGGCCGTTGAGCACCGC
BstZ17 I-R：
tagcgatagcggagtgtaGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTCG
以表达载体pYLEX1-Erg20-ePTS1为模板，使用BstZ17 I-F/BstZ17 I-R引物PCR扩增得到携带相应末端同源序列的Erg20-ePTS1表达盒组装片段。PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性15S，55℃退火15S，72℃延伸2min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。
利用Vazyme组装试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit对pYLEX1-Erg10-Erg13-HMGR-Erg12-Erg8-Erg19-IDI-ePTS1酶切片段和Erg20-ePTS1表达盒组装片段进行组装，构建完成pYLEX1-Erg10-Erg13-HMGR-Erg12-Erg8-Erg19-IDI-Erg20-ePTS1质粒，通过引物设计的形式在整合片段Erg20-ePTS1表达盒上预留了BstZ17 I位点作为下一轮质粒构建的基因整合位点。
(10)质粒pYLEX1-Erg10-Erg13-HMGR-Erg12-Erg8-Erg19-IDI-Erg20-ePTS1通过BstZ17I内切酶消化后，回收纯化。根据表达载体pYLEX1-Erg10-Erg13-HMGR-Erg12-Erg8-Erg19-IDI-Erg20-ePTS1整合位点BstZ17 I的序列设计引物：
BstZ17 I-F：
cgcatagttaagccagtaGAGGCCGTTGAGCACCGC
BstZ17 I-α-bisabolene-R：
tagcgatagcggagtgtaCATCGATGATAAGCTGTCAAACATG
以表达载体pYLEX1-α-bisabolene-ePTS1为模板，使用BstZ17 I-F/BstZ17 I-α-bisabolen e-R引物PCR扩增得到携带相应末端同源序列的α-Bisabolene-ePTS1表达盒组装片段。PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性15S，55℃退火15S，72℃延伸2min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。
利用Vazyme组装试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit对pYLEX1-Erg10-Erg13-HMGR-Erg12-Erg8-Erg19-IDI-Erg20-ePTS1酶切片段和α-Bisabolene-ePTS1表达盒组装片段进行组装，构建完成pYLEX1-Erg10-Erg13-HMGR-Erg12-Erg8-Erg19-IDI-Erg20-α-bisabolene-eP TS1质粒。通过Spe I内切酶消化后，回收纯化浓缩整合片断。
1.2使用醋酸锂转化法构建得到工程菌株Po1g P1，步骤为：
(1)解脂耶氏酵母Po1gΔKU70感受态细胞的制备
I.将划线保存于YPD培养基固体平板中的解脂耶氏酵母，用接种环挑取单菌落接种于50mL液体YPD培养基中，28℃、225rpm摇床培养至OD600＝15。
II.室温12000rpm离心4min，收集菌体，用10mL无菌水冲洗菌体2次，用5mL0.1mol/L醋酸锂(pH 6.0)悬浮细胞，室温培养10min。
III.向感受态细胞中添加灭菌冷却的甘油至终浓度25％(v/v)，等分100μL到无菌的2mL离心管中，进行酵母转化或并-80℃冰箱保存。
(2)线性化酶切质粒pYLEX1-α-bisabolene、pYLEX1-Erg10-Erg13-HMGR-Erg12-Erg8-Erg19-IDI-Erg20-α-bisabolene-ePTS1获得重组基因片段分别进行转化，筛选重组子。
I.将100μL的感受态细胞、500ng-1μg线性化重组质粒和10μL鲑鱼精DNA(10mg/mL)轻轻混匀，30℃培养15min。
II.加700μL 40％的PEG 4000，吹吸混匀后于30℃、225rpm培养1h。
III.将离心管放入39℃水浴锅中温浴1h。
IV.添加1mL的YPD培养基，30℃、225rpm恢复培养2h，室温12000rpm离心1min，弃上清并用1mL无菌水重悬菌体。
V.室温12000rpm离心1min，收集菌体，用100μL无菌水重悬菌体并涂到筛选培养基YNB固体平板上，30℃培养2-3d。
VI.随机挑选重组子，利用下列引物进行PCR验证(α-Bisabolene-F1：AGTACGCTTTAA AGAC，α-Bisabolene-R1：ATCACCTCCATCGGTC；Erg10-F：TTGGGGCGAGGCTGCC，Er g13-R：TCCGCGATACCGTGTGG；Erg13-F：AGATGCTCTTCGAGGAGAC，HMGR-R：AAGAAGATGCTCTTCG；HMGR-F：ATTATCGAGACCGTTGTTC，Erg12-R：ATATACAAGA GCGTTTG；Erg12-F：TCTCTCAAGACTGTTGAAGC，Erg8-R：AAGAAGATTGATGTTGA C；Erg8-F：TCAGCGAGCTCAGAAAAG，Erg19-R：AGGGCAAAGGAATAGATG；Erg19-F：TGTGTTTGGTAAGCCTGC，IDI-R：GCCCAGCACGGAGTCGTC；IDI-F：ATTATCCGAT CGACTCCTC，Erg20-R：ATTGGAGGTGTTGTGCC；Erg20-F：ACCGATTTGACTACTCT GC，α-Bisabolene-R2：ATGTCCCTACTCTGGACG；α-Bisabolene-F2：ACTCGCTTTCCCCG GCG，HYG-R：AGCCGTCAACCAAGCTCTG)。得到片段大小为1750bp，如图5，条带大小与理论预期相符，说明目的基因成功整合到解脂耶氏酵母基因组中。
测序进一步验证pYLEX1-α-bisabolene、pYLEX1-Erg10-Erg13-HMGR-Erg12-Erg8-Erg19-IDI-Erg20-α-bisabolene-ePTS1质粒酶切片段是否整合到基因组上。将获得：
①含α-Bisabolene基因(细胞质中)的解脂耶氏酵母工程菌命名为Po1g KαBS，其基因型为Po1gΔKU70α-Bisabolene；
②含Erg10-ePTS1、Erg13-ePTS1、HMGR-ePTS1、Erg12-ePTS1、Erg8-ePTS1、Erg19-eP TS1、IDI-ePTS1、Erg20-ePTS1、α-Bisabolene-ePTS1基因(过氧化物酶体中)的解脂耶氏酵母工程菌命名为Po1g P1，其基因型为Po1gΔKU70 Erg10-Erg13-HMGR-Erg12-Erg8-Erg19-IDI-Erg20-α-bisabolene-ePTS1。
实施例2构建在过氧化物酶体中过量生产α-红没药烯的解脂耶氏酵母工程菌株Po1g P2-Po1gP8
2.1构建表达载体
(1)质粒pYLEX1(hyg)-HMGR-ePTS1通过SpeⅠ内切酶消化后，回收纯化。根据表达载体pYLEX1(hyg)-HMGR-ePTS1整合位点SpeⅠ的序列设计引物：
SpeⅠ-F：
CgaggcagcagatccactagCGACGCTCTCCCTTATGCG
SpeⅠ-R：
gcggccgcataggccaGACACGGGCATCTCACTTGC
以表达载体pYLEX1-α-bisabolene-ePTS1为模板，使用SpeⅠ-F/SpeⅠ-R引物PCR扩增得到携带相应末端同源序列的α-Bisabolene-ePTS1表达盒组装片段。PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性15S，55℃退火15S，72℃延伸2min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。
利用Vazyme组装试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit对pYLEX1(hyg)-HMG R-ePTS1酶切片段和α-Bisabolene-ePTS1表达盒组装片段进行组装，构建完成pYLEX1(hyg)-HMGR-α-bisabolene-ePTS1质粒。
(2)质粒pYLEX1(hyg)-HMGR-α-bisabolene-ePTS1通过SalⅠ内切酶消化后，回收纯化。根据表达载体pYLEX1(hyg)HMGR-α-bisabolene-ePTS1整合位点SalⅠ的序列设计引物：
SalⅠ-F：
ctctcaagggcatcggtcgacGAGGCCGTTGAGCACCGC
SalⅠ-R：
cgcataagggagagcgtcgaGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTCG
以表达载体pYLEX1-MFE1为模板，使用SalⅠ-F/SalⅠ-R引物PCR扩增得到携带相应末端同源序列的MFE1表达盒组装片段。PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性15S，55℃退火15S，72℃延伸2min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。
利用Vazyme组装试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit对pYLEX1(hyg)-HMG R-α-bisabolene酶切片段和MFE1表达盒组装片段进行组装，构建完成pYLEX1(hyg)-HMG R-α-bisabolene-ePTS1-MFE1质粒。
(3)质粒pYLEX1(hyg)-HMGR-α-bisabolene-ePTS1通过SalⅠ内切酶消化后，回收纯化。根据表达载体pYLEX1(hyg)-HMGR-α-bisabolene-ePTS1整合位点SalⅠ的序列设计引物：
SalⅠ-F：
ctctcaagggcatcggtcgacGAGGCCGTTGAGCACCGC
SalⅠ-R：
cgcataagggagagcgtcgaGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTCG
以表达载体pYLEX1-POT1为模板，使用SalⅠ-F/SalⅠ-R引物PCR扩增得到携带相应末端同源序列的POT1表达盒组装片段。PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性15S，55℃退火15S，72℃延伸2min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。
利用Vazyme组装试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit对pYLEX1(hyg)-HMG R-α-bisabolene酶切片段和POT1表达盒组装片段进行组装，构建完成pYLEX1(hyg)-HMG R-α-bisabolene-ePTS1-POT1质粒。
(4)质粒pYLEX1(hyg)-HMGR-α-bisabolene-ePTS1-MFE1通过FspAⅠ内切酶消化后，回收纯化。根据表达载体pYLEX1(hyg)-HMGR-α-bisabolene-ePTS1-MFE1整合位点FspAⅠ的序列设计引物：
FspAⅠ-F：
GACAGGAGCACGATCATGcgcacgaggccgttgagcaccgc
FspAⅠ-R：
gggtcctggccacgggtgcgATAAGCTGTCAAACATGAGAATTCG
以表达载体pYLEX1-POT1为模板，使用FspAⅠ-F/FspAⅠ-R引物PCR扩增得到携带相应末端同源序列的POT1表达盒组装片段。PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性15S，55℃退火15S，72℃延伸2min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。
利用Vazyme组装试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit对pYLEX1(hyg)-HMG R-α-bisabolene-ePTS1-MFE1酶切片段和POT1表达盒组装片段进行组装，构建完成pYLEX1(hyg)-HMGR-α-bisabolene-ePTS1-MFE1-POT1质粒。
(5)质粒pYLEX1(hyg)-HMGR-α-bisabolene-ePTS1-MFE1-POT1通过BstZ17Ⅰ内切酶消化后，回收纯化。根据表达载体pYLEX1(hyg)-HMGR-α-bisabolene-ePTS1-MFE1-POT 1整合位点BstZ17Ⅰ的序列设计引物：
BstZ17Ⅰ-F：
CgcatagttaagccagtaGAGGCCGTTGAGCACCGC
BstZ17Ⅰ-R：
TagcgatagcggagtgtaGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTCG
以表达载体pYLEX1-ANT1为模板，使用BstZ17Ⅰ-F/BstZ17Ⅰ-R引物PCR扩增得到携带相应末端同源序列的ANT1表达盒组装片段。PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性15S，55℃退火15S，72℃延伸2min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。
利用Vazyme组装试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit对pYLEX1(hyg)-HMG R-α-bisabolene-ePTS1-MFE1-POT1酶切片段和ANT1表达盒组装片段进行组装，构建完成pYLEX1(hyg)-HMGR-α-bisabolene-ePTS1-MFE1-POT1-ANT1质粒。通过Bsu36Ⅰ内切酶消化后，回收纯化浓缩整合片断。
2.2使用醋酸锂转化法构建得到工程菌株Po1g P2-Po1g P8，步骤为：
(1)用1.2中(1)解脂耶氏酵母Po1gΔKU70感受态细胞的制备的方法，将工程菌株Po1g P1制备成感受态。
(2)对上步2.1得到的pYLEX1(hyg)-HMGR-ePTS1、pYLEX1(hyg)-α-bisabolene-ePTS1、pYLEX1(hyg)-HMGR-α-bisabolene-ePTS1、pYLEX1(hyg)-HMGR-α-bisabolene-ePTS1-MFE1、pYLEX1(hyg)-HMGR-α-bisabolene-ePTS1-POT1、pYLEX1(hyg)-HMGR-α-bisabolene-ePTS1-MFE1-POT1、pYLEX1(hyg)-HMGR-α-bisabolene-ePTS1-MFE1-POT1-ANT1质粒线性化后进行纯化回收，使用醋酸锂转化法分别转入工程菌株Po1g P1感受态中，涂布于YPD-hyg平板中，倒置于30℃培养箱中。
(3)待长出单菌落后，随机挑选重组子，利用下列引物进行PCR验证(hph-CX-1：ccatccagcctcgcgtcgcgaGACATGGAGGCCCAGAATACC；hph-CX-2：acgtcttgctggcgttcgcAGTATAGCGACCAGCATTCACA)。得到片段大小为1124bp，如图6，条带大小与理论预期相符，说明目的基因成功整合到解脂耶氏酵母基因组中。
测序进一步验证pYLEX1(hyg)-HMGR-ePTS1、pYLEX1(hyg)-α-bisabolene-ePTS1、pYLEX1(hyg)-HMGR-α-bisabolene-ePTS1、pYLEX1(hyg)-HMGR-α-bisabolene-ePTS1-MFE1、pYLEX1(hyg)-HMGR-α-bisabolene-ePTS1-POT1、pYLEX1(hyg)-HMGR-α-bisabolene-ePTS1-MFE1-POT1、pYLEX1(hyg)-HMGR-α-bisabolene-ePTS1-MFE1-POT1-ANT1质粒酶切片段是否整合到基因组上，将成功整合至工程菌株Po1g P1中获得的菌株分别命名为Po1g P2、Po1gP3、Po1g P4、Po1g Po1g P5、Po1g P6、Po1g P7、Po1g P8。
实施例3构建缺失过氧化物酶体膜蛋白YlPex23p且过量生产α-红没药烯的解脂耶氏酵母工程菌株Po1g P9。
3.1 YlPex23p敲除盒的构建
(1)敲除盒片段的获取：根据Genbank中解脂耶氏酵母的基因组序列(SEQ IDNO.13)分别使用引物PEX23-up-F(AGGACGAGAAAGAGGTCTATG)，PEX23-up-R(TTGTTCACGTAATTCAAGGGT)和PEX23-down-F(AGTACTGTAGGATGGGATGAC)，PEX23-down-R(TTGATTACTTCCTGGTGCTCT)对酵母基因组进行PCR扩增，分别得到YlPex23p基因的上下游各1000bp左右的片段PEX23-S和PEX23-X；同时，使用引物PEX23-NOR-F(cacccttgaattacgtgaacaaATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATGAGGCCGTTGAGCACCGCC)，PEX23-NOR-R(gtggtcatcccatcctacagtactATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGATAAGCTGTCAAACATGAGAATT)在质粒pYLEX1(nat)上进行PCR扩增，得到诺尔丝菌素抗性基因的表达盒BDH-NOR。
(2)敲除盒片段的连接：对上述得到的3个片段，即片段一：PEX23-S、片段二：BDH-NOR、片段三：PEX23-X进行融合，上述序列彼此均有同源序列，因此经过两步融合PCR之后能够得到一条3777bp大小的条带，切胶回收，也即YlPex23p的敲除盒。
(3)融合PCR扩增
①PCR反应体系1如表1-1。
表1-1 PCR反应体系
②PCR反应条件见表1-2。
表1-2 PCR反应条件
注：设置变性、退火、延伸部分14个循环，1％琼脂糖凝胶电泳验证。
③PCR反应体系2如表1-3。
表1-3 PCR反应体系
④PCR反应体系见表1-4。
表1-4 PCR反应条件
注：设置变性、退火、延伸部分34个循环，1％琼脂糖凝胶电泳验证。
(4)融合完成得到敲除组装片段PEX23-up-NOR-PEX23-down。
3.2使用醋酸锂转化法构建得到工程菌株Po1g P9，步骤为：
(1)用1.2中(1)解脂耶氏酵母Po1g ΔKU70感受态细胞的制备的方法，将工程菌株Po1g P8制备成感受态。
(2)对上步得到的敲除组装片段PEX23-up-NOR-PEX23-down进行纯化回收，使用醋酸锂转化法分别转入工程菌株Po1g P8感受态中，涂布于YPD-nat平板中，倒置于30℃培养箱中。
(3)随机挑选重组子，利用下列引物进行PCR验证(PEX23-YZ-F：ACTGGCTCTGTTGCCAGG，NOR-YZ-R：ACCAAGGTGTTCCCCG；NOR-YZ-F：ACCGCCTCGGACGGCG，PEX23-YZ-R：ACTGTTTGTGGCGTCTG)。得到片段大小分别为1750bp和723bp，如图7，条带大小与理论预期相符，说明目的基因成功整合到解脂耶氏酵母基因组中。
测序进一步验证敲除组装片段PEX23-up-NOR-PEX23-down是否整合到基因组上，将成功整合至工程菌株Po1g P8中获得的菌株命名为Po1g P9。
3.3通过透射电子显微镜和激光全扫描共聚焦显微镜观察工程菌株Po1g P9
为了研究缺失过氧化物酶体膜蛋白YlPex23p工程菌株Polg P9中过氧化物酶体的变化，将工程菌株Polg P9在YPO中培养1-5d，经前处理对细胞进行透射电子显微镜观察。与亲本解脂耶氏酵母菌株Po1gΔKU70相比，工程菌株Po1g P9的图像显示，细胞中颗粒状过氧化物酶体数量增加，并出现大“囊泡”(如图8A)。随后，进一步通过激光全扫描共聚焦显微镜研究过氧化物酶体的变化，将带有过氧化物酶体定位信号的绿色荧光蛋白整合到工程菌株Polg P9发酵1-5d。与整合了带有过氧化物酶体定位信号的绿色荧光蛋白的亲本解脂耶氏酵母菌株Po1gΔKU70结果相比，Po1g 9在亮场图像中可见明显的大“囊泡”(如图8B-Bright)，这与透射电子显微镜观察结果相一致。考虑到绿色荧光蛋白在过氧化物酶体中的精确位置，我们确定大“囊泡”为膨胀的过氧化物酶体。为了进一步确认α-红没药烯在过氧化物酶体中的特异性分布，用尼罗红染色(尼罗红用于显示细胞内脂质储存的位置，包括过氧化物酶体中的脂质)发酵1-5d的工程菌株Polg P9。hrGFPO-ePTS1荧光图像(如图8B-hrGFPO)与尼罗红染色结果对比显示(如图8B-Nile red)，在亮场图像中，绿色荧光点与红色荧光点重叠，产生明亮的黄色光(如图8B-Merge)，在Po1g P9中可以清晰地观察到更多形态较大的过氧化物酶体。这些结果表明，YlPex23p基因的缺失可导致过氧化物酶体数量的增加和更大的形态，从而为红没药烯提供了更大的储存空间。
实施例4在细胞质中产α-红没药烯的工程菌株Po1g KαBS和在过氧化物酶体中生产α-红没药烯的Po1g P1-Po1g P9生产α-红没药烯效率的比较。
工程菌株：解脂耶氏酵母工程菌Po1g KαBS、Po1g P1、Po1g P2、Po1g P3、Po1g P4、Po1g P5、Po1g P6、Po1g P7、Po1g P8、Po1g P9。
冷冻甘油管保存的解脂耶氏酵母Po1g PαBS、Po1g P1、Po1g P2、Po1g P3、Po1gP4、Po1g P5、Po1g P6、Po1g P7、Po1g P8、Po1g P9分别划线接种于YPD固体平板，30℃培养30h。
将YPD固体平板上长出的Po1g PαBS、Po1g P1、Po1g P2、Po1g P3、Po1g P4、Po1gP5、Po1g P6、Po1g P7、Po1g P8、Po1g P9菌落分别接入装有5mL的YPD(蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L)液体培养基的试管中，30℃，220rpm转速振荡培养活化15h。
将活化后的解脂耶氏酵母工程菌株Po1g P1-Po1g P9中的任意菌株的种子液按1％接种量接种至50mL YPD培养基中，30℃，220rpm条件培养15h，再取1mL菌液转接至50mLYPO培养基中30℃，220rpm培养条件下发酵120h。发酵前添加10％萃取剂十二烷以捕获发酵过程中产生的α-红没药烯，便于测定。
所述YPO培养基组成为：蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，厨房废油12g/L，吐温802.2g/L，MgSO4·7H2O 2g/L,余量为水，115-121℃，灭菌20min。
发酵120h取样，然后在600nm波长下检测菌液的光吸收值。即取1mL菌液12,000rpm转速离心2min。弃去上清，用等体积的H2O重悬，稀释至合适倍数后使用分光光度计检测其光吸收值。
测定α-红没药烯含量的方法：在刚进行摇瓶发酵的时候添加十二烷，发酵结束后，将发酵液全部倒入50mL离心管中，7500rpm，4℃，离心5min，取有机相过膜，气相色谱-质谱联用检测α-红没药烯的含量，使用(-)-Trans-caryophyllene(购自Sigma-aldrich公司)标准品制作标准曲线。
其中，上述气相色谱-质谱联用检测条件为：
色谱柱HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm，美国瓦里安)，载气：高纯氦气，流速为1mL/min，进样口温度280℃，升温程序：60℃，20℃/min升到170℃，2℃/min升到210℃，280℃保持3min，溶剂延迟3min，离子扫描模式为选扫(67、93、136m/z)，进样量为1μL。
结果如图9所示，经过120h的发酵，Po1g P1、Po1g P2、Po1g P3、Po1g P4、Po1gP5、Po1g P6、Po1g P7、Po1g P8、Po1g P9菌株发酵液中α-红没药烯含量分别达到460.8mg/L、877.9mg/L、796.3mg/L、1256.2mg/L、1365.3mg/L、1587.6mg/L、1884.3mg/L、2235.1mg/L、2550.7mg/L。而在胞质中合成α-红没药烯的对照工程菌株Po1g PαBS利用葡萄糖生产α-红没药烯的产量仅为0.4mg/L。
实施例5工程菌株Po1g P9通过发酵罐分批补料放大生产
工程菌株：解脂耶氏酵母工程菌Po1g P9。
冷冻甘油管保存的解脂耶氏酵母Po1g P9划线接种于YPD固体平板，30℃培养30h。
将YPD固体平板上长出的Po1g P9菌落接入装有5mL的YPD液体培养基(蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L)的试管中，30℃，220rpm转速振荡培养活化18h。
将活化后的解脂耶氏酵母工程菌株Po1g P9种子液按1％接种量接种至50mL YPD培养基中，30℃，200-220rpm条件培养15-18h，再取1mL菌液转接至100mL YPD培养基中30℃，220rpm条件培养至OD600达到1左右，种子液按2％接种量接种到发酵罐中。
发酵罐培养基：60g/L厨房废油、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉、2g/L的吐温80、10g/L的MgSO4·7H2O、3g/L(NH4)2SO4、其余为水；培养基pH稳定控制在6.0、温度为30℃、叶轮搅拌速率为600rpm、通气量为1.5vvm，发酵时间为168h；发酵前添加10％萃取剂十二烷以捕获发酵过程中产生的α-红没药烯(便于测定)；每隔12h通过分批补料的方式在发酵罐中添加47mL/L(发酵培养基)经过灭菌处理的厨房废油。
发酵每24h取一次样，然后在600nm波长下检测菌液的光吸收值。即取1mL菌液12,000rpm转速离心2min。弃去上清，用等体积的H2O重悬，稀释至合适倍数后使用分光光度计检测其光吸收值。
测定α-红没药烯含量的方法：将发酵液全部倒入50mL离心管中，7500rpm，4℃，离心5min，取有机相过膜，气相色谱-质谱联用检测α-红没药烯的含量，使用(-)-Trans-caryophylle ne(购自Sigma-aldrich公司)标准品制作标准曲线。
其中，上述气相色谱-质谱联用检测条件为：
色谱柱HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm，美国瓦里安)，载气：高纯氦气，流速为1mL/min，进样口温度280℃，升温程序：60℃，20℃/min升到170℃，2℃/min升到210℃，280℃保持3min，溶剂延迟3min，离子扫描模式为选扫(67、93、136m/z)，进样量为1μL。
结果如图10所示，α-红没药烯的合成量随着发酵时间的增加而不断积累，在发酵144h时产量达到最高15.5g/L，生物量OD600在48h内迅速增加，在发酵的后期逐渐稳定到182左右。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。
Claims (10)
1.一株生产α-红没药烯的工程菌，其特征在于，所述工程菌株是在解脂耶氏酵母宿主菌的过氧化物酶体中表达乙酰辅酶A硫解酶Erg10、羟甲基戊二酰乙酰辅酶A合酶Erg13、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶HMGR、甲羟戊酸激酶Erg12，磷酸甲羟戊酸激酶Erg8、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶Erg19、异戊烯基二磷酸异构酶IDI、法尼基焦磷酸合酶Erg20和外源α-红没药烯合酶α-BiS所得。
2.如权利要求1所述的一株生产α-红没药烯的工程菌，其特征在于，通过过氧化物酶体增强型定位信号ePTS1将所述酶定位至过氧化物酶体进行表达。
3.如权利要求1所述的一株生产α-红没药烯的工程菌，其特征在于，所述解脂耶氏酵母宿主菌为解脂耶氏酵母Po1gΔKU70菌株。
4.如权利要求1所述的一株生产α-红没药烯的工程菌，其特征在于，所述羟甲基戊二酰辅酶A还原酶HMGR在过氧化物酶体中双拷贝过表达，和/或所述α-红没药烯合酶α-BiS在过氧化物酶体中为双拷贝过表达。
5.如权利要求4所述的一株生产α-红没药烯的工程菌，其特征在于，羟甲基戊二酰辅酶A还原酶HMGR和α-红没药烯合酶α-BiS过氧化物酶体双拷贝过表达的基础上，过表达过氧化物酶体多功能酶MFE1，和/或过氧化物酶体硫解酶POT1。
6.如权利要求5所述的一株生产α-红没药烯的工程菌，其特征在于，羟甲基戊二酰辅酶A还原酶HMGR和α-红没药烯合酶α-BiS过氧化物酶体双拷贝过表达的基础上，过表达过氧化物酶体多功能酶MFE1，和过氧化物酶体硫解酶POT1，以及过氧化物酶体ATP转运蛋白ANT1。
7.如权利要求6所述的一株生产α-红没药烯的工程菌，其特征在于，还敲除了过氧化物酶体膜蛋白YlPex23p。
8.如权利要求1-7任意一项所述的生产α-红没药烯的工程菌，其特征在于，
所述乙酰辅酶A硫解酶Erg10来源于解脂耶氏酵母，编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；
所述羟甲基戊二酰乙酰辅酶A合酶Erg13来源于解脂耶氏酵母，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述羟甲基戊二酰辅酶A还原酶HMGR来源于解脂耶氏酵母，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述甲羟戊酸激酶Erg12来源于解脂耶氏酵母，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述磷酸甲羟戊酸激酶Erg8来源于解脂耶氏酵母，编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示；
所述二磷酸甲羟戊酸脱羧酶Erg19来源于解脂耶氏酵母，编码基因的核苷酸序列如SEQID NO.6所示；
所述异戊烯基二磷酸异构酶IDI来源于解脂耶氏酵母，编码基因的核苷酸序列如SEQID NO.7所示；
所述法尼基焦磷酸合酶Erg20来源于解脂耶氏酵母，编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示；
所述α-红没药烯合酶α-BiS来源于北美冷杉，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
所述过氧化物酶体多功能酶MFE1来源于解脂耶氏酵母，编码基因的核苷酸序列如SEQID NO.10所示；
所述过氧化物酶体硫解酶POT1来源于解脂耶氏酵母，编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示；
所述过氧化物酶体ATP转运蛋白ANT1来源于解脂耶氏酵母，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
所述过氧化物酶体膜蛋白PEX23来源于解脂耶氏酵母，编码基因的核苷酸序列如SEQID NO.13所示；
所述ePTS1，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
9.权利要求1-8任意一项所述的工程菌在生产α-红没药烯中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，利用含有厨房废油的培养基合成α-红没药烯的方法是：菌种种子液按2％的接种量接入发酵罐培养基后，pH稳定控制在6.0、温度为30℃、叶轮搅拌速率为600rpm、通气量为1.5vvm，发酵时间为130-180h，每隔12h通过分批补料的方式在发酵罐中按照发酵液体积添加30-60mL/L经过灭菌处理的厨房废油；
发酵罐培养基组成：60g/L厨房废油、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉、2g/L的吐温80、10g/L的MgSO4·7H2O、3g/L(NH4)2SO4、其余为水。
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