CN117143967A - 结合原位靶标扩增和使用rt-pcr的空间唯一分子标识符(sumi)鉴定的方法 - Google Patents
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Abstract
允许在亚细胞水平上对多种mRNA、蛋白和代谢物在空间上进行解析的显微成像提供有价值的分子信息，这是用于理解例如肿瘤微环境内组织异质性的关键因素。本发明描述一种方法(高密度‑SUMI‑seq)，其在亚细胞水平上将源于环状寡核苷酸的滚环扩增的滚环核酸集落的空间唯一分子标识符的原位定位和鉴定(通过原位测序或连续荧光杂交)的使用和与SUMI鉴定组合的靶标扩增的RNA或DNA的体外测序结合，每细胞可分析的扩增的靶标信息量没有光学衍射限制。除扩增的RNA或DNA外，高密度‑SUMI‑Seq方法还可使用线性寡核苷酸应用于在空间上解析蛋白和代谢物以提供多组学结果。
Description
技术领域
本发明涉及用于测序和原位定位滚环核酸集落(rolony)的方法，其包括与通过杂交和/或从组织切片的扩增的RNA或DNA的靶标捕获相结合的空间唯一分子标识符(SUMI)，用于通过体外测序进行高密度空间分析。测序方法的修改允许定位蛋白和代谢物分子。
背景技术
已经证明了挂锁(padlock)寡核苷酸在聚合已与其杂交的核酸的短的部分方面是非常成功的。大部分挂锁方法均为通过将靶标逆转录成cDNA开始的。
挂锁方法例如公开于Lee等人的“Highly multiplexed subcellular RNAsequencing in situ”,Science.2014年3月21日；343(6177):1360-1363.doi:10.1126/science.1250212或Nils Schneider和Matthias Meier的“Efficient In Situ Detectionof mRNAs using the Chlorella virus DNA ligase for Padlock Probe Ligation”；2020年2月5日-Cold Spring Harbor Laboratory Press。
Sujatha Krishnakumar等人发表了用于人类DNA序列的靶向多重扩增的综合测定，PNAS，于2008年2月19日送审。
进一步地，WO2017143155A2公开了使用合并核酸文库进行的细胞多重改变及其分析，并且WO2018045181A1公开了生成核酸序列的文库以经由荧光原位测序进行检测的方法。
所发表的挂锁方法允许对DNA或RNA进行测序，但不会给出所测序的DNA或RNA来源的细胞和组织位置内的任何空间信息。
允许在单细胞水平上对多种mRNA进行解析的显微成像提供关于转录本的量和定位的有价值的信息，这是用于理解组织异质性、分子发育和疾病治疗的关键因素。
基于荧光原位杂交(FISH)的方法允许转录本在组织切片中被直接标记以及空间信息被捕获。然而，可使用的探针数量有限，并且荧光信号的重叠经常是一个问题。此外，经常达到共聚焦显微术的光学分辨率极限，并因此可同时检测的探针数量减少。SeqFISH+为不使用已用荧光团标记的探针而是使用含有条形码序列的转录本特异性探针的连续荧光原位杂交方法，所述条形码序列充当荧光标记的二级探针的靶位点。使用在连续数轮探测期间与这些条形码位点结合的二级探针来识别各种靶标特异性探针。通过限制由二级探针检测到的探针数量，发出荧光的数量有限，并因此信号可为可辨别的。采集多个单独的图像并将其通过计算汇总以创建复合高分辨图像而不需要高分辨仪器显微镜。
然而，尽管这些方法允许同时评估几个基因，但是转录本的序列信息未被捕获。基于单细胞RNA测序(scRNA-seq)的其他方法可描绘整个转录组并捕获序列信息。然而，组织或单细胞水平的初始位置也经常是缺失的。其中以接近单细胞的分辨率捕获序列和空间信息两者的方法仍然是困难的挑战。一些方法已经使用了FISSEQ和BaristaSeq(以约15个碱基的有限读取长度完成任务的另一种基于间隙填充挂锁的方法)。
最近，原位基因组测序(IGS)已描述为同时对样品中的基因组进行测序和成像的方法。该方法描述通过进行短读取原位测序，然后是通过双端测序对与具有UMI的基因组序列缔合的扩增子进行扩增子解离、PCR和非原位测序，来定位唯一分子标识符(UMI)的工作流程，这由A.C.Payne等人发表，Science 10.1126/science.aay3446(2020)，首次在线公开2020年12月31日。
最近，描述了“结合使用包含空间唯一分子标识符(SUMI)的挂锁寡核苷酸的靶向RNA或c-DNA体外测序和原位测序的方法(Method combining targeted RNA or c-DNA invitro sequencing using padlock oligonucleotides comprising a Spatial UniqueMolecular Identifier(SUMI)and in situ sequencing)”(EP22154712.8)。该方法描述了通过原位测序(SUMI)和体外测序(SUMI和靶序列)的组合对掺入到挂锁中的靶序列的空间识别。由于靶序列和SUMI序列为同一挂锁和所得滚环核酸集落的一部分，靶标信息的密度受到细胞区域内可原位测序的滚环核酸集落数量的限制。以下发明正在克服这个限制。
发明内容
本发明的目的为用于获得至少一种RNA或单链DNA中的靶序列的空间位置和序列信息的方法，其包括以下步骤：
a.使第一寡核苷酸与至少一种RNA或单链DNA的互补部分杂交，其中第一寡核苷酸提供有作为第一PCR手柄的序列；
b.使用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)利用至少一种RNA或单链DNA作为模板扩增第一寡核苷酸；
c.从扩增的第一寡核苷酸中去除至少一种RNA或单链DNA
d.使第二寡核苷酸与扩增的第一寡核苷酸的互补部分杂交，其中第二寡核苷酸提供有作为第二PCR手柄的序列；
e.使用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)利用扩增的第一寡核苷酸作为模板扩增第二寡核苷酸，从而获得包含作为第一和第二PCR手柄的序列以及靶序列的第三寡核苷酸；
f.从扩增的第二寡核苷酸中去除第三寡核苷酸；
g.在样品上的专用空间位置处提供第四寡核苷酸，其中第四寡核苷酸包含多个多联体(concatemer)，每个多联体包含与第二PCR手柄互补的序列和至少一个包含至少2个核酸的作为空间唯一分子标识符(SUMI)的序列；
h.通过第一测序步骤确定第四寡核苷酸的SUMI的序列，以确定第四寡聚核苷酸的空间位置，从而将空间位置与SUMI序列相联系；
i.使具有第二PCR手柄的第三寡核苷酸与第四寡核苷酸的互补序列杂交；
j.使用与第四寡核苷酸互补的核苷酸作为模板，用聚合酶延伸第三寡核苷酸，从而将SUMI掺入到延伸的第三寡核苷酸中；
k.使延伸的第三寡核苷酸去杂交，并通过第二测序步骤确定延伸的第三寡核苷酸的序列；
l.将延伸的第三寡核苷酸的序列信息与在第一测序步骤中获得的空间位置信息相联系。
本发明的方法可进一步被用于获得样品中蛋白或代谢物的空间位置。对于蛋白定位，第三寡核苷酸包括紧邻第一和第二PCR手柄的条形码标签。条形码标签对蛋白编码。第三寡核苷酸与同蛋白结合的抗体连接。
具体实施方式
获取包含至少一种RNA或单链DNA链的样品中靶序列的空间位置和序列信息的方法的所有实施方案和变体也可在用于空间单细胞蛋白表达的方法中应用。
优选地，空间唯一分子标识符(SUMI)包含2-500bp。
靶序列至少包括如本发明目的的步骤a和b中定义的单链DNA和RNA靶标的第一寡核苷酸的杂交的3’端和第二寡核苷酸的杂交的5’端的核酸，但也可包括在与RNA或单链DNA杂交之后填充间隙的寡核苷酸区域的序列。
在方法的进一步实施方案中，第四寡核苷酸可通过环状寡核苷酸的滚环扩增生成。第四寡核苷酸还可包含允许延伸的第三寡核苷酸通过限制性酶或化学地被分割的序列。
在本发明中，在于步骤f)中收集延伸的靶标SUMI序列或延伸的条形码标签SUMI序列之前以及在通过SUMI的原位测序或连续荧光原位杂交确定滚环核酸集落的空间位置之前或之后，可通过通用PCR反应扩增延伸的靶标SUMI序列。
作为通用PCR扩增的备选实施方案，延伸的靶标SUMI序列或延伸的条形码标签SUMI序列可为挂锁探针本身的一部分。在此，延伸的靶标SUMI序列或延伸的条形码标签SUMI序列的5’端和3’端将与SUMI滚环核酸集落的SUMI序列的互补区域5’和3’结合，从而形成挂锁。在SUMI序列的挂锁间隙填充和连接之后，靶序列将与SUMI序列连接形成环形。已填充间隙并连接以形成环状模板的挂锁探针(挂锁也可填充但仅进一步在该过程中连接)被用于对挂锁的间隙填充部分中的SUMI编码。最后，环化的挂锁探针可被用作滚环扩增(RCA)的模板，以生成用于测序的DNA链，如文中定义。
在本发明中，可修改工作流程，以允许通过SUMI测序对其他类别的生物分子进行空间定位。在此，寡核苷酸将连接于生物分子结合子(binder)上。寡核苷酸将含有对生物分子结合子(例如特异性抗体作为特定蛋白的结合子)编码的序列(条形码标签)。将SUMI序列与SUMI滚环核酸集落的条形码标签序列连接，然后是原位和体外测序，将获得与结合子连接的生物分子的空间多组学(multiomics)结果。
在本发明中，在作为第四寡核苷酸的滚环核酸集落形成之前，可通过与潜在的数字病理学成像过程相关的外力(例如光或热)来启动。
在本发明中，可收获细胞并使其接受单细胞测序分析。
本发明描述通过使用SUMI滚环核酸集落作为的模板用于通过体外测序鉴定的靶核酸(SUMI和靶标)的空间定位，来克服来自原位测序或连续原位杂交的空间分辨率限制的方法。
参照附图进一步解释本发明的方法及其实施方案。
图1显示用于核酸分析的高密度(HD)空间唯一分子标识符(SUMI)测序工作流程的寡核苷酸设计。(A)环形第一序列(SUMI序列的通用序列5’)。(B)空间唯一分子标识符(SUMI)序列(每个环形分子的唯一序列)。(C)环形第二序列(SUMI序列的通用序列3’)。(D)用于通用滚环扩增的引发区。(E)滚环扩增启动之后通过聚合酶延伸的核酸。(F)几轮滚环扩增之后生成滚环核酸集落。
图2显示用于核酸分析的高密度(HD)空间唯一分子标识符(SUMI)测序工作流程。(A)将SUMI环形核酸模板添加至固定和透化的组织切片。SUMI序列的通用序列5’(第1)和SUMI序列的通用序列3’(第2)和空间唯一分子标识符(SUMI)均为SUMI环形核酸模板的部分。(B)从SUMI环形核酸模板生成滚环核酸集落。来自SUMI环形核酸模板分子的序列在滚环扩增之后转化为模板序列的多个多联体。对滚环核酸集落(在细胞显示内圈出)进行原位测序以得到空间上登记的SUMI序列信息(以1、2和3为例)。注意：仅显示单细胞和3个SUMI滚环核酸集落用于说明。(C)通过靶向RT-PCR反应进行原位靶标捕获，在所述反应中靶标特异性寡核苷酸被直接用于已固定和透化的组织切片，以首先逆转录并然后扩增信使RNA的特定部分。寡核苷酸含有直接与靶核酸或其互补序列结合的一级序列以及一组序列通用PCR手柄(第1和第2)。(D)所得双链产物含有通用PCR手柄(第1和第2)和感兴趣的靶标。靶序列的进一步原位扩增(如果需要)通过通用PCR手柄标记的第一(第1)PCR手柄和第二PCR手柄(第2)来完成。(E)滚环核酸集落充当通用靶标扩增产物的模板。由此，将靶序列产物延伸为包括SUMI序列并将其连接于靶标扩增产物。更详细地，将双链扩增的靶序列在单链寡核苷酸中变性，并且将扩增的靶产物的一条链的第二(第2)PCR手柄与SUMI序列的互补滚环核酸集落通用序列5’(第1手柄)杂交。与滚环核酸集落杂交之后，靶标扩增产物的3’端原位延伸超过SUMI序列。一个滚环核酸集落充当许多靶序列的模板，这为高密度(HD)空间唯一分子标识符(SUMI)测序工作流程提供基础。(F)延伸的靶标SUMI序列任选地通过与(第1)和(第2)手柄互补的PCR引物进行扩增，并最终从组织切片中取出以进行进一步体外处理(任选的PCR也可体外进行)。将延伸的靶标SUMI序列分子环化和扩增以体外形成滚环核酸集落。将滚环核酸集落装载到流动池中充当体外测序的模板。将流动池装载到仪器中并进行滚环核酸集落体外测序。(G)获得SUMI和靶序列的序列信息(几个靶序列可与同一SUMI序列连接)。将SUMI序列的体内位置和相关的(SUMI序列-靶标扩增产物)体外测序配对以获得空间位置。
图3显示用于蛋白和代谢物分析的高密度(HD)空间唯一分子标识符(SUMI)测序工作流程。(A)抗体与包括用于识别抗体的条形码标签区域的寡核苷酸偶联。(B)结合子与包括用于识别代谢物的条形码标签区域的寡核苷酸偶联。(C)使用相应的通用引物(第1和第2)通过通用PCR手柄来完成条形码标签序列的进一步原位扩增。(D)条形码标签序列与SUMI序列连接，如图2所示。
图4显示用于核酸、蛋白或代谢物分析的高密度(HD)空间唯一分子标识符(SUMI)杂交和测序工作流程的寡核苷酸设计。(A)SUMI序列的通用序列5’(第1)。(B)空间唯一分子标识符(SUMI)序列(由4个检测条形码区域组成的唯一序列，如本文作为实例所示)。4个条形码区域，每个包含2-20个核苷酸。条形码区域可为>4个以增加编码能力，并且所有条形码均具有唯一序列(未显示)。(C)SUMI序列的通用序列3’(第2)，其也可含有用于单体化的限制性位点。(D)用于通用滚环扩增的引发区。
图5显示含有扩增探针的SUMI的等温扩增。(A)固定和透化的组织切片被置于SUMI滚环核酸集落上。对滚环核酸集落(玻璃流动池上的黑点)进行原位测序。(B)信使RNA的靶部分通过邻近连接探针在切片上直接扩增。(C)滚环核酸集落充当通用靶标捕获产物的模板并含有SUMI、SUMI序列的通用序列3’(第2)，且在该实例中还含有限制性位点(任选的)。由此，靶序列由SUMI序列延伸并可切割为独特的单体。与SUMI序列的滚环核酸集落通用序列5’(第1)互补的靶产物的第二PCR手柄(第2)含有3’OH阻断核苷酸(叠氮基或二硫基)，并且只有在已经使用还原剂比如磷化氢去保护之后才原位延伸超过SUMI序列。一个滚环核酸集落充当许多靶序列的模板，这为高密度(HD)空间唯一分子标识符(SUMI)测序工作流程提供基础。延伸的靶标SUMI序列如所描绘的通过PCR引物(第1和第2)使用高度进行性酶比如Phi29酶(指数RCA)进行扩增，并且可任选地在从流动池中提取之前或之后使用限制性酶随后切割，通过PCR进一步加工和扩增(参见图2工作流程)。
图6显示由可充当通过SUMI序列延伸的靶标扩增产物的模板的环状寡核苷酸生成的原位测序的滚环核酸集落的实例。将滚环核酸集落置于流动池上并将其提交给边合成边测序(SBS)。描绘显示所询问的每个碱基的全部四个荧光通道以及独特的T掺入的一个循环(循环6)。在靶标扩增产物通过SUMI序列原位延伸之后，从组织切片中取出SUMI延伸的靶标扩增产物，并使其直接接受体外测序。
如图1和图4所示，寡核苷酸具有一个SUMI，其最少包含至少两个核苷酸。环状寡核苷酸SUMI的5’和3’包含具有5-50个核苷酸的通用序列(第1和第2)。在本发明方法中，通过能够滚环扩增的聚合酶将单链环状模板复制成多个DNA多联体，其形成DNA纳米球或滚环核酸集落。为了这个目的，本发明中使用的寡核苷酸可包含至少一个具有5-50个核苷酸的引物区用于滚环扩增。
在本发明的一个实施方案中，通用序列可不直接跟随SUMI序列，并且可位于距SUMI序列可变距离处。
在本发明的另一个实施方案中，启动滚环扩增的引物区域可为相同的。
在进一步的实施方案中，含有SUMI的寡核苷酸在被提供到组织切片上时可能不是环状的，但可直接在组织上发生环化。
在本发明的一个实施方案中，靶标捕获可以DNA作为靶标开始。需要考虑线性寡核苷酸的相应设计调整。
如图3所示，线性寡聚物可被用于编码蛋白或代谢物。此外，线性寡核苷酸的3’-端与由环状寡核苷酸生成的滚环核酸集落序列互补，以便将条形码标签和SUMI序列结合成一个核酸分子。
在本发明的第一个实施方案中，如图1所示含有空间唯一分子标识符(SUMI)的环状寡核苷酸被用于在组织切片上生成滚环核酸集落。滚环核酸集落充当测序模板用于原位测序，以识别空间唯一分子标识符(SUMI)。所有滚环核酸集落的亚细胞空间信息均被登记，并与SUMI序列相联系。原位测序可在原位靶标捕获之前或之后发生。
本发明的一般步骤显示于图2。在此，信使RNA的靶向部分在已经固定和透化的组织切片上直接扩增。使用两种直接靶向信使RNA的特异性寡核苷酸，利用RT-PCR反应扩增mRNA上感兴趣的序列，其中寡核苷酸含有侧接待扩增的靶区域的一级序列和作为PCR手柄的一组通用序列。滚环核酸集落由环状寡核苷酸生成并充当原位测序的测序模板，并且还充当通过SUMI序列延伸的靶标扩增产物的模板。在靶标扩增产物通过SUMI序列原位延伸并且SUMI序列通过原位测序被确定之后，将SUMI延伸的靶标扩增产物从组织切片中取出并直接接受体外测序。在环化、滚环核酸集落化和体外测序之前扩增SUMI延伸的靶标扩增产物可能是优选的。
通过将体外获得的靶序列/SUMI与来自原位测序的SUMI序列相联系来揭示包括所鉴定突变的靶序列的亚细胞位置。由于数百个独特的SUMI滚环核酸集落可在一个细胞中在空间上被分辨，并且每个滚环核酸集落提供数千个多联体化的SUMI序列作为模板，理论上可在一个细胞内以亚细胞分辨率在空间上识别数十万个靶标扩增的mRNA序列，并从而提供一种高密度(HD)方法。
在本发明的第二个实施方案中，蛋白和代谢物的亚细胞位置将通过测序工作流程来揭示。如图3所示的线性寡核苷酸设计将使用“抗原识别部分”作为蛋白结合原理来确定亚细胞蛋白的位置。
术语“抗原识别部分”是指针对在细胞样品的细胞上表达的标志物的任何种类的抗体或片段化抗体或片段化抗体衍生物。该术语涉及完全完整的抗体、片段化抗体或片段化抗体衍生物，例如Fab、Fab￠、F(ab￠)2、sdAb、scFv、di-scFv、纳米抗体。此类片段化抗体衍生物可通过重组程序合成，包括含有这些种类分子的共价和非共价缀合物。抗原识别部分的进一步实例为靶向TCR分子的肽/MHC复合物、细胞粘附受体分子、共刺激分子的受体、人工工程化结合分子，例如肽或适体，其靶向例如细胞表面分子。此类定向的抗原识别部分抗体可针对由生物样本(靶细胞)细胞内表达的抗原，如IL2、FoxP3、CD154，或细胞外表达的抗原，如CD3、CD14、CD4、CD8、CD25、CD34、CD56和CD133。
作为第一个实施方案的变体，用于滚环核酸集落空间定位的基于杂交的SUMI解码原理的环状寡核苷酸如图4所示。在不能获得SUMI的原位测序的情况下，基于杂交的方法可为有利的。在这种情况下，可使用多色解码方案来解码滚环核酸集落。本发明方法中使用的检测探针可由能够结合条形码区域的至少一部分的具有2-20个核苷酸的寡核苷酸组成。生成的滚环核酸集落继续充当靶标捕获延伸的模板，如前所述(参见图2)。对于用于核酸分析的高密度(HD)空间唯一分子标识符(SUMI)杂交和测序工作流程，体外测序需要更长的测序读取长度来解码SUMI序列。
在第二实施方案中，该方法应限于感兴趣的组织区域。感兴趣的组织区域通过经典成像技术如显微术进行识别。为将原位测序方法集中于感兴趣的区域，滚环核酸集落的形成应通过外力(如光或热)来控制。由于滚环核酸集落充当测序模板，因此没有滚环核酸集落就不会进行测序。可通过阻断聚合酶或通过阻断引物来抑制滚环核酸集落形成的聚合和启动。阻断原理可通过可在概念上由成像技术引导的外力如光或热来消除。
作为第三实施方案，在SUMI解码(例如通过原位测序)之后，可消化组织切片并分离单个细胞。分选含有细胞的滚环核酸集落并使其最终接受单细胞测序。对含有细胞的滚环核酸集落的分选可通过由滚环扩增导致的增加的核酸含量或通过源于针对滚环核酸集落序列的杂交探针的荧光强度来完成。由于来自原位测序的SUMI序列也可通过单细胞测序来识别，因此来自单细胞测序的信息内容可经由源于原位测序的SUMI与空间位置相联系。
在该第三变体中，通过使用与例如由被用于RCA的Phi29酶识别的靶向基因(图2)或者靶向抗体或靶向分子结合子的条形码标签(图3)对应的特异性引物，可由环状寡核苷酸生成特定的滚环核酸集落，允许选择性扩增扩增子的子集。最后，将测序的数据关联回到组织上的区域，其中mRNA或cDNA转录本或抗体或感兴趣的分子结合子与最初环状寡核苷酸相互作用。
在第四实施方案中，如图5可见，确立靶标SUMI序列并将其通过指数RCA使用高度进行性聚合酶比如Phi29扩增。在此，滚环核酸集落还充当通用靶标捕获产物的模板并且含有SUMI。一个滚环核酸集落可充当许多靶序列的模板，这为高密度(HD)空间唯一分子标识符(SUMI)测序工作流程提供基础。
将用所公开方法分析的样品可源于任何样本，如整个动物、器官、组织切片、细胞聚集体，或者无脊椎动物(例如秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster))、脊椎动物(例如斑马鱼(Danio rerio)、非洲爪蟾(Xenopuslaevis))和哺乳动物(例如小家鼠(Musmusculus)、智人(Homo sapiens))的单细胞。生物样品可呈组织切片、细胞聚集体、悬浮细胞或贴壁细胞的形式。细胞可为活的或死的。
滚环核酸集落的空间信息，即滚环核酸集落在样品上的位置，例如通过成像步骤来确定。在根据本发明方法的仍然另一个变体中，将样品转化成分离的细胞，其然后通过捕获在微腔中或通过粘附而被固定。
成像可例如用被称为“多表位配体制图”、“基于芯片的细胞计数法”或“多组学”的技术进行，这些技术例如描述于EP0810428、EP1181525、EP1136822或EP1224472中。在该项技术中，使细胞固定并与同荧光部分偶联的抗体接触。抗体被生物样本上(例如细胞表面上)相应的抗原识别，并在去除未结合的标志物和激发荧光部分之后，抗原的位置通过荧光部分的荧光发射进行检测。在某些变体中，可使用与对MALDI成像或CyTOF可检测的部分偶联的抗体替代与荧光部分偶联的抗体。本领域的技术人员知道如何更改基于荧光部分的技术以用这些检测部分工作。靶标部分的定为通过对荧光辐射的波长具有足够分辨率和灵敏度的数字成像设备实现。数字成像设备可在有或没有光学放大的情况下使用，例如与荧光显微镜一起使用。将所得图像存储在适当的存储设备上，如硬盘驱动器，例如以RAW、TIF、JPEG或HDF5格式。
Claims (9)
1.用于获得至少一种RNA或单链DNA中的靶序列的空间位置和序列信息的方法，其包括以下步骤：
a.使第一寡核苷酸与所述至少一种RNA或单链DNA的互补部分杂交，其中所述第一寡核苷酸提供有作为第一PCR手柄的序列；
b.使用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)利用所述至少一种RNA或单链DNA作为模板扩增所述第一寡核苷酸；
c.从所述扩增的第一寡核苷酸中去除所述至少一种RNA或单链DNA；
d.使第二寡核苷酸与所述扩增的第一寡核苷酸的互补部分杂交，其中所述第二寡核苷酸提供有作为第二PCR手柄的序列；
e.使用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)利用所述扩增的第一寡核苷酸作为模板扩增所述第二寡核苷酸，从而获得包含作为第一和第二PCR手柄的序列以及靶序列的第三寡核苷酸；
f.从所述扩增的第二寡核苷酸中去除所述第三寡核苷酸；
g.在所述样品上的专用空间位置处提供第四寡核苷酸，其中所述第四寡核苷酸包含多个多联体，每个多联体包含与所述第二PCR手柄互补的序列和至少一个包含至少2个核酸的作为空间唯一分子标识符(SUMI)的序列；
h.通过第一测序步骤确定所述第四寡核苷酸的SUMI的序列，以确定所述第四寡聚核苷酸的空间位置，从而将所述空间位置与SUMI序列相联系；
i.使具有所述第二PCR手柄的所述第三寡核苷酸与所述第四寡核苷酸的互补序列杂交；
j.使用与所述第四寡核苷酸互补的核苷酸作为模板，用聚合酶延伸所述第三寡核苷酸，从而将所述SUMI掺入到所述延伸的第三寡核苷酸中；
k.使所述延伸的第三寡核苷酸去杂交，并通过第二测序步骤确定所述延伸的第三寡核苷酸的序列；
l.将所述延伸的第三寡核苷酸的序列信息与在所述第一测序步骤中获得的空间位置信息相联系。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于第所述四寡核苷酸进一步包含允许所述延伸的第三寡核苷酸通过限制性酶或化学地被分割的序列。
3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于所述第四寡核苷酸为通过包含与第二PCR手柄互补的序列和至少一个作为空间唯一分子标识符(SUMI)的序列的环状寡核苷酸的滚环扩增提供的。
4.根据权利要求3的方法，其特征在于所述滚环扩增(RCA)通过光和/或热激活。
5.根据权利要求1-4中任何一项的方法，其特征在于所述第一测序步骤在将所述SUMI序列掺入到所述延伸的第三寡核苷酸中之后进行。
6.根据权利要求1-5中任何一项的方法，其特征在于所述第三寡核苷酸包含能够结合蛋白的抗原识别部分。
7.根据权利要求6的方法，其特征在于所述第三寡核苷酸包含抗原识别部分与之连接的条形码标签序列。
8.根据权利要求1-7中任何一项的方法，其特征在于使所述样品的细胞进一步接受单细胞测序。
9.根据权利要求1-8中任何一项的方法，其特征在于原位测序之后使细胞接受单细胞测序。
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2023
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