CN117126926A - 基于crispr系统的单碱基突变基因的检测方法、检测装置及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因检测技术，公开了一种单碱基突变基因的检测方法、检测装置及其应用。该方法包括以下步骤：根据目标单碱基突变基因及其相应的野生型基因，分别设计突变型引导RNA、野生型引导RNA、突变型基因引物对以及野生型基因引物对；将待测样品进行DNA提取获得待测基因，将待测基因或者野生型基因与相应的引物对、限制性内切酶进行RPA扩增得到待测RPA产物和野生型RPA产物；将待测RPA产物或者野生型RPA产物与相应的引导RNA进行CRISPR反应得到待测CRISPR产物和野生型CRISPR产物，检测荧光强度得到待测样品荧光值和野生型荧光值，将待测样品荧光值与野生型荧光值进行比较分析。该检测方法快速简便、效率高，且特异性好、灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术，具体地，涉及一种基于CRISPR系统的单碱基突变基因的检测方法、检测装置及其应用。
背景技术
单碱基突变与许多人类疾病有关，可作为早期临床诊断、实时监测和治疗人类癌症的生物标志物，例如肿瘤蛋白p53(TP53)，表皮生长因子受体(EGFR)和大鼠肉瘤(RAS)基因突变。因此，单碱基突变的检测对于促进癌症诊断和开发治疗方法具有极其重要的意义。作为一种“经典”单碱基突变，表皮生长因子受体(EGFR)L858R(L858R替代中的外显子21突变)在非小细胞肺癌(NSCLC)中过表达，EGFR L858R对针对肿瘤患者有效的药物的酪氨酸激酶抑制剂敏感。因此，有必要检测EGFR L858R突变以治疗和预后NSCLC。然而，在临床样本中，突变型DNA(MT)的一小部分(<0.1％)与许多野生型DNA(WT)共存，这使得单碱基突变的检测具有挑战性。对单碱基突变进行高灵敏度和特异性的检测非常必要。
当前，已经开发了多种检测低丰度单碱基突变的方法，例如DNA测序技术(二代测序，Sanger测序等)，聚合酶链反应(PCR，包括等位基因特异性PCR，微滴数字PCR等)。这些方法具有检测限低的优点，但也存在操作过程复杂、反应组分复杂、突变DNA非特异性吸附等缺点。因此，迫切需要一种特异性高、灵敏度高、成本低、耗时短的单碱基突变检测方法。
基于CRISPR的诊断提供了一种检测多个单碱基突变的替代方法，CRISPR-Cas系统已广泛应用于基因编辑。在Cas家族中，Cas12a、Cas13a和Cas14在特异性识别和不加选择地切割靶单链DNA序列后表现出非特异性切割活性。然而，对于仅由CRISPR系统的测定，很难实现高灵敏度确定单碱基突变，如何引入合适的工具与CRISPR系统相结合，以克服灵敏度的障碍，已成为亟需解决的问题之一。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的CRISPR系统测定单碱基突变灵敏度较低的问题，提供一种基于CRISPR系统的单碱基突变基因的检测方法、检测装置及其应用，该检测方法快速简便、效率高，且特异性好、灵敏度高。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种基于CRISPR系统的单碱基突变基因的检测方法，该方法包括以下步骤：
S1、根据目标单碱基突变基因及其相应的野生型基因，分别设计突变型引导RNA、野生型引导RNA、突变型基因引物对以及野生型基因引物对；
S2、将待测样品进行DNA提取获得待测基因，将所述待测基因或者所述野生型基因与相应的引物对、限制性内切酶进行RPA扩增得到待测RPA产物和野生型RPA产物；
S3、将所述待测RPA产物或者所述野生型RPA产物与相应的引导RNA进行CRISPR反应得到待测CRISPR产物和野生型CRISPR产物，检测所述待测CRISPR产物和野生型CRISPR产物的荧光强度得到待测样品荧光值和野生型荧光值，将所述待测样品荧光值与所述野生型荧光值进行比较分析。
优选地，步骤S1中，所述野生型基因为表皮生长因子受体EGFR-858WT基因，所述目标单碱基突变基因为表皮生长因子受体EGFR-858WT基因中存在一个碱基突变。
优选地，所述表皮生长因子受体EGFR-858WT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述目标单碱基突变基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
优选地，所述突变型引导RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述野生型引导RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
优选地，所述突变型基因引物对的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示、反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述野生型基因引物对的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示、反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。
优选地，步骤S1中，所述突变型引导RNA和所述野生型引导RNA分别在5’端连接有PAM序列。
优选地，所述PAM序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
优选地，步骤S2中，所述RPA扩增的RPA体系含有：所述待测基因或者所述野生型基因、相应的引物对、所述限制性内切酶、反应缓冲液、碱性缓冲液、激活剂和水。
优选地，所述待测基因或者所述野生型基因、相应的引物对、限制性内切酶、反应缓冲液、碱性缓冲液、激活剂和水的体积比为1:2-3:0.8-1.2:9-11:5-6:0.8-1.2:4-6。
优选地，所述限制性内切酶为MSCI酶。
优选地，所述RPA扩增的条件至少包括：温度为25-45℃，时间为10-60min。
优选地，步骤S3中，所述CRISPR反应的CRISPR体系含有：所述待测RPA产物或者所述野生型RPA产物、相应的引导RNA、Cas12a、CRISPR缓冲液、RNA酶抑制剂、ssDNA-FQ报告基因和水。
优选地，所述Cas12a、相应的引导RNA、CRISPR缓冲液、RNA酶抑制剂、ssDNA-FQ报告基因、待测RPA产物或者野生型RPA产物以及水的体积比为1:0.25-2:1.5-2.5:0.8-1.2:0.8-1.2:4-6:8-10。
优选地，ssDNA-FQ报告基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；所述CRISPR缓冲液含有：8-12mM Tris-HCl，8-12mM MgCl2，8-12mM NaCl和80-120μg/mL牛血清白蛋白。
优选地，步骤S3中，所述CRISPR反应的条件至少包括：温度为30-45℃，时间为15-25min。
优选地，所述荧光强度采用酶标仪检测，所述酶标仪的激发波长为480-500nm，发射波长为510-540nm。
优选地，所述比较分析包括：判断所述待测样品荧光值相对于所述野生型荧光值是否有变化，或者计算所述待测样品荧光值相对于所述野生型荧光值的变化比值。
本发明第二方面提供一种基于CRISPR系统的单碱基突变基因的检测装置，该检测装置包括微流控芯片、用于控制所述微流控芯片进行检测操作的微流控制器和荧光检测器，所述微流控芯片包括芯片主体和位于所述芯片主体上的微通道，所述微通道形成至少一个相互独立的检测单元，每个所述检测单元包括用于进行DNA提取的前处理区以及用于进行RPA扩增和CRISPR反应的反应区，所述荧光检测器用于检测所述反应区内CRISPR反应产物的荧光强度。
优选地，所述芯片主体为圆形有机玻璃成型件，所述微通道为位于所述芯片主体的一侧表面的亚敏膜通道。
优选地，所述荧光检测器为酶标仪，所述微流控制器为离心式微流控程控仪。
本发明第三方面提供上述的检测方法在制备疾病诊断试剂盒中的应用。
优选地，所述疾病为癌症，更优选为肺癌。
通过上述技术方案，本发明的有益效果为：
本发明提供的检测方法在针对目标单碱基突变基因或野生型基因进行RPA扩增时，利用限制性内切酶剪切非突变的野生型基因，再结合CRISPR技术进行荧光强度检测，不仅能够达到高灵敏检测目标单碱基突变基因的目的，而且对目标单碱基突变基因具有高度的选择性，使得检测方法具有高灵敏度、高特异性、重复性高等特点，且该方法步骤简单、操作快捷，效率高、成本低且易于推广，可应用于护理点实时监测；优选情况下，在限制性内切酶采用MSCI酶时，能够更加有效地使得目标单碱基突变基因大量扩增，从而进一步提升检测灵敏度。
本发明提供的检测装置能够将上述检测方法应用于微流控芯片中，通过微通道中的流体流动来控制整个系统，集成度高、小型化，具有样品体积小、精度高、分析时间短、制造工艺简单等优点，使得检测方法实用性更高，可有效用于临床样品的检测。
附图说明
图1是本发明提供的微流控芯片的结构示意图；
图2是实施例2中突变型基因和野生型基因在MSCI酶作用下的琼脂糖凝胶电泳图；
图3是实施例3中不同突变型sgRNA下的△F％值；
图4是实施例4中不同的RPA反应体系孵育时间下的△F％值；
图5是实施例5中不同的RPA反应体系孵育温度下的△F％值；
图6是实施例6中不同sgRNA与Cas12a的体积比下的△F％值；
图7是实施例7中不同的CRISPR反应体系孵育时间下的△F％值；
图8是实施例9中不同的EGFR-L858R突变率下的△F％值。
附图标记说明
1芯片主体 2检测单元
21前处理区 22反应区
23CRISPR反应室 24核酸裂解液存储室
25提取反应室 26废液室
27流量控制室 28Mg2+溶液储存室
29RPA反应室
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明第一方面提供一种基于CRISPR系统的单碱基突变基因的检测方法，该方法包括以下步骤：
S1、根据目标单碱基突变基因及其相应的野生型基因，分别设计突变型引导RNA、野生型引导RNA、突变型基因引物对以及野生型基因引物对；
S2、将待测样品进行DNA提取获得待测基因，将所述待测基因或者所述野生型基因与相应的引物对、限制性内切酶进行RPA扩增得到待测RPA产物和野生型RPA产物；
S3、将所述待测RPA产物或者所述野生型RPA产物与相应的引导RNA进行CRISPR反应得到待测CRISPR产物和野生型CRISPR产物，检测所述待测CRISPR产物和野生型CRISPR产物的荧光强度得到待测样品荧光值和野生型荧光值，将所述待测样品荧光值与所述野生型荧光值进行比较分析。
本发明中，所述目标单碱基突变基因可以是临床疾病诊断或治疗中任意一种生物标记蛋白的编码基因的单碱基突变基因，其中，单碱基突变基因指的是在野生型基因中某一碱基位点发生改变，由原来的碱基改变为另一种碱基而获得的基因。相应地，突变型引导RNA为识别目标单碱基突变基因的序列，野生型引导RNA为识别野生型基因的序列，突变型引导RNA与野生型引导RNA的序列只有一个碱基的区别。
本发明中，CRISPR反应在相应的引导RNA(sgRNA)的引导下，存在能够激活Cas12a蛋白的目标DNA片段(目标单碱基突变基因或者野生型基因)时，Cas12a蛋白会被激活，将CRISPR体系中的荧光探针切断，从而产生荧光信号，该过程能够有效缩短单碱基突变基因的检测时间，提高对突变型基因的检测灵敏度，实用性高，且特异性好、成本低。
本发明提供的检测方法先将待测基因和野生型基因进行RPA反应，并在针对目标单碱基突变基因或野生型基因进行RPA扩增时，添加限制性内切酶以剪切非突变的野生型基因，再将RPA产物与CRISPR技术结合，利用CRISPR-Cas12a蛋白对非特异性单链DNA的反式切割活性，切割荧光探针，从而获得荧光信号，在特定的激发波长以及发射波长下，记录其样品荧光值以及对照荧光值，根据荧光值对比判断是否存在突变基因；不仅能够达到高灵敏检测目标单碱基突变基因的目的，而且对目标单碱基突变基因具有高度的选择性，使得检测方法具有高灵敏度、高特异性、重复性高等特点，且该方法步骤简单、操作快捷，效率高、成本低且易于推广，可应用于护理点实时监测。
根据本发明，优选地，步骤S1中，所述目标单碱基突变基因为非小细胞肺癌(NSCLC)临床诊断的生物标志物表皮生长因子受体(EGFR)的单碱基突变基因，此时，所述野生型基因为表皮生长因子受体EGFR-858WT基因，所述目标单碱基突变基因为表皮生长因子受体EGFR-858WT基因中存在一个碱基突变，并在非小细胞肺癌中过表达。进一步优选地，所述表皮生长因子受体EGFR-858WT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，以下简称为EGFR-858WT；所述目标单碱基突变基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，以下简称为EGFR-L858R。EGFR-858WT的长度均为297bp，突变型基因EGFR-L858R的核苷酸序列相对EGFR-858WT单碱基错配，EGFR-858WT中5’端第100位为T，而EGFR-L858R中5’端第100位为G。
根据本发明，优选地，所述突变型引导RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述野生型引导RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
根据本发明，突变型基因引物对为针对突变型基因通过相关引物设计原则筛选出来的高效特异序列，野生型基因引物对为针对野生型基因通过相关引物设计原则筛选出来的高效特异序列。优选地，所述突变型基因引物对的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示、反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述野生型基因引物对的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示、反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。
根据本发明，优选地，步骤S1中，所述突变型引导RNA和所述野生型引导RNA分别在5’端连接有PAM序列。进一步优选地，所述PAM序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；
PAM序列：TTTN(SEQ ID NO：9)。
根据本发明，优选地，步骤S2中，所述RPA扩增的RPA体系含有：所述待测基因或者所述野生型基因、相应的引物对、所述限制性内切酶、反应缓冲液、碱性缓冲液、激活剂和水，以有效促进RPA扩增的进行；即，待测基因对应的RPA体系含有：所述待测基因、突变型基因引物对、限制性内切酶、反应缓冲液、碱性缓冲液、激活剂和水，野生型基因对应的RPA体系含有：所述野生型基因、野生型基因引物对、限制性内切酶、反应缓冲液、碱性缓冲液、激活剂和水。
根据本发明，优选地，所述限制性内切酶为MSCI酶，购自赛默飞世尔科技有限公司。发明人发现，在该优选的实施方式下，在限制性内切酶采用MSCI酶时，能够更加有效地使得目标单碱基突变基因大量扩增，从而进一步提升检测灵敏度。
根据本发明，优选地，所述待测基因或者所述野生型基因(浓度为101-1010copies/μL)、相应的引物对、限制性内切酶、反应缓冲液、碱性缓冲液、激活剂和水的体积比为1:2-3:0.8-1.2:9-11:5-6:0.8-1.2:4-6。示例性地，RPA体系可以为50μL体系，由20μL反应缓冲液、11μL碱性缓冲液、2.5μL正向引物(浓度为10-200nM)、2.5μL反向引物(浓度为10-200nM)、2μL所述待测基因或者所述野生型基因、2μL激活剂和补充ddH2O配置成；相对于50μL的RPA体系，限制性内切酶的添加量为1-3μL。
本发明中，反应缓冲液可以采用常规的适用于RPA扩增反应的缓冲液；碱性缓冲液可以采用常规的适用于RPA扩增的碱性缓冲液；激活剂可以采用常规的适用于RPA扩增的激活剂，反应缓冲液、碱性缓冲液和激活剂均可以通过商购的RPA试剂盒提供。
本发明中，RPA扩增的条件可以参考相应的试剂盒，优选地，所述RPA扩增的条件至少包括：温度为25-45℃，例如可以为25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，以及这些点值中的任意两个所构成的范围中的任意值；时间为10-60min，例如可以为10min、20min、30min、40min、50min、60min，以及这些点值中的任意两个所构成的范围中的任意值。发明人发现，在该优选的实施方式下，RPA扩增体系及过程改变了以往繁琐的PCR实验步骤，实验条件比较简单，不需要借助实验室的电动热循环仪，易于推广到非专业人士进行操作，检测成本大大降低，易于制备，重复性高，可应用于对目标单碱基突变基因的实时检测。
根据本发明，CRISPR反应可以采用本领域常规的CRISPR反应体系；优选地，步骤S3中，所述CRISPR反应的CRISPR体系含有：所述待测RPA产物或者所述野生型RPA产物、相应的引导RNA、Cas12a、CRISPR缓冲液、RNA酶抑制剂、ssDNA-FQ报告基因和水；即，待测RPA产物的CRISPR体系含有：所述待测RPA产物、突变型引导RNA、Cas12a、CRISPR缓冲液、RNA酶抑制剂、ssDNA-FQ报告基因和水，野生型RPA产物的CRISPR体系含有：所述野生型RPA产物、野生型引导RNA、Cas12a、CRISPR缓冲液、RNA酶抑制剂、ssDNA-FQ报告基因和水。
根据本发明，优选地，所述Cas12a、相应的引导RNA、CRISPR缓冲液、RNA酶抑制剂、ssDNA-FQ报告基因、待测RPA产物或者野生型RPA产物以及水的体积比为1:0.25-2:1.5-2.5:0.8-1.2:0.8-1.2:5-6:8-10。示例性地，CRISPR体系可以为20μL体系，将Cas12a(200ng/μL，1μL)，引导RNA(100nM，1μL)，CRISPR缓冲液(2μL)，RNA酶抑制剂(1μL)，ssDNA-FQ报告基因(25μM，1μL)以及5μl所述待测RPA产物或者所述野生型RPA产物和补充ddH2O配置成。
根据本发明，所述Cas12a、ssDNA-FQ报告基因、CRISPR缓冲液和RNA酶抑制剂均可以采用常规的适用于CRISPR反应的Cas12a、ssDNA-FQ报告基因、缓冲液和RNA酶抑制剂，可通过商购提供。优选地，所述ssDNA-FQ报告基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；所述CRISPR缓冲液为1×NEBuffer 2.1，具体含有：8-12mM Tris-HCl，8-12mM MgCl2，8-12mMNaCl和80-120μg/mL牛血清白蛋白；
ssDNA-FQ报告基因(SEQ ID NO：10)：FAM-TTATT-BHQ1，其中，FAM为荧光基团，BHQ1为猝灭基团。
本发明中，CRISPR反应的条件可以参考常规的CRISPR反应参数；优选地，步骤S3中，所述CRISPR反应的条件至少包括：温度为30-45℃，例如可以为30℃、35℃、40℃、45℃，以及这些点值中的任意两个所构成的范围中的任意值；时间为10-60min，例如可以为10min、20min、30min、40min、50min、60min，以及这些点值中的任意两个所构成的范围中的任意值。
根据本发明，优选地，所述荧光强度采用酶标仪检测，所述酶标仪的激发波长为480-500nm，发射波长为510-540nm。
本发明中，所述水可以采用双蒸水(ddH2O)或者超纯水。
根据本发明，优选地，所述比较分析包括：判断所述待测样品荧光值(计为F)相对于所述野生型荧光值(计为F0)是否有变化，或者计算所述待测样品荧光值F相对于所述野生型荧光值F0的变化比值△F％；
△F％通过公式(I)计算得到：△F％＝[(F0-F)/F0]×100％(I)。
本发明第二方面提供一种基于CRISPR系统的单碱基突变基因的检测装置，用于实施上述的检测方法过程，参见图1，该检测装置包括微流控芯片、用于控制微流控芯片进行检测操作的微流控制器和荧光检测器，微流控芯片包括芯片主体1和位于芯片主体1上的微通道，微通道形成至少一个相互独立的检测单元2，每个检测单元2包括用于进行DNA提取的前处理区21以及用于进行RPA扩增和CRISPR反应的反应区22，荧光检测器用于检测反应区22内CRISPR反应产物的荧光强度。
本发明中，芯片主体1是采用微注射成型技术制成的CD型PMMA密封芯片，其直径可以为94mm，厚度可以为4.0mm，微通道可以使用亚敏膜以适当的压力制作而成。每个芯片主体1可以包含多个检测单元2，以实现对多个待测样品的并行检测。
根据本发明，优选地，芯片主体1为圆形有机玻璃成型件，微通道为位于芯片主体1的一侧表面的亚敏膜通道。
根据本发明，优选地，荧光检测器为酶标仪，微流控制器为离心式微流控程控仪，属于与微流控芯片相配套的恒温离心式进样仪。离心式微流控程控仪的尺寸可以为240×202×300mm，具有恒温控制、液晶触摸屏，可实现转速、时间和正反转的切换。
根据本发明，前处理区21包括核酸裂解液存储室24、提取反应室25和废液室26，核酸裂解液存储室24用于存储待测样品的核酸裂解液，提取反应室25是待测样品加入的腔室，同时也是提取DNA的反应室，废液室26用于收集存储DNA提取产生的废液；反应区22包括流量控制室27、用于存储Mg2+反应溶液的Mg2+溶液储存室28、RPA反应室29和CRISPR反应室23。
采用上述检测装置进行上述基于CRISPR系统的单碱基突变基因检测的过程为：先将RPA体系提前加入RPA反应室29中，CRISPR体系提前加入CRISPR反应室23中，核酸裂解液提前加入核酸裂解液存储室24中，Mg2+缓冲溶液提前加入Mg2+溶液储存室28；再将待测样品(例如：血样)加入提取反应室25(预先加入红细胞裂解试剂)中，通过微流控制器进行低速离心，使得外周血或骨髓血液样品与红细胞裂解试剂混合，通过微流控制器离心分离裂解的红细胞和未裂解的白细胞，留下沉淀的白细胞，其他转到废液室26；然后将核酸裂解液存储室24中的核酸裂解液(核酸释放剂)转到提取反应室25中得到破碎细胞，破碎细胞进行离心将废液转至废液室26内，得到的待测基因经过前处理的步骤通过流量控制室27控制流量后，经过Mg2+溶液储存室28的Mg2+缓冲溶液进入RPA反应区29，进行RPA反应，随后转至CRISPR反应室23进行CRISPR反应，可视觉识别观察CRISPR反应室23内得到的CRISPR反应产物的荧光，最终将CRISPR反应产物吸取至荧光检测器中进行荧光检测，记录荧光信号。
本发明第三方面提供上述的检测方法在制备疾病诊断试剂盒中的应用。
根据本发明，疾病诊断试剂盒可以是对任意一种疾病进行诊断的试剂盒，以相应疾病的生物标记物作为目标单碱基突变基因即可。优选地，所述疾病为癌症，更优选为肺癌，例如，针对非小细胞肺癌(NSCLC)的诊断，以表皮生长因子受体(EGFR)的单碱基突变基因作为目标单碱基突变基因。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下实施例中，MSCI限制性内切酶为Thermo Fisher赛默飞世尔科技有限公司生产的FastDigest-MSCI酶；反应缓冲液、ERA碱性缓冲液、激活剂均由RPA试剂盒提供，RPA试剂盒购自苏州先达基因科技有限公司(GenDx Biotech)，产品编号为GenDx ERA试剂盒，该试剂盒中ERA basic buffer为ERA碱性缓冲液，reaction buffer为反应缓冲液，activator为激活剂；Cas12a蛋白购自金斯瑞生物科技有限公司，产品名称为GenCRISPRTM LbCas12aNuclease，产品编号为Z03753；RNA酶抑制剂购自碧云天生物技术有限公司，产品名称为RNase Inhibitor、编号为R0102-2kU；在无特殊说明的情况下，其余试剂和原料均为常规的市售品。
1×NEBuffer 2.1的配方为：10mM Tris-HCl，10mM MgCl2，10mM NaCl，100μg/mL牛血清白蛋白(BSA)。
以下实施例中，无特殊说明的情况下，室温指的是25±5℃。
实施例1
S1、以非小细胞肺癌(NSCLC)临床诊断的生物标志物表皮生长因子受体(EGFR-858WT)基因作为野生型基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，以下简称为EGFR-858WT；目标单碱基突变基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，以下简称为EGFR-L858R；两个基因的长度均为297bp，突变型EGFR-L858R的核苷酸序列相对野生型EGFR-858WT的序列单碱基错配，EGFR-858WT中5’端第100位为T，EGFR-L858R中5’端第100位为G，相应设计的突变型引导RNA(突变型sgRNA，核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示)和野生型引导RNA(野生型sgRNA，核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示)，且两个引导RNA的5’端连接有PAM序列(核苷酸序列如SEQID NO：9所示)；各个sgRNA、突变基因以及野生型基因、引物对等序列均由上海生工生物技术公司合成；
野生型基因EGFR-858WT(SEQ ID NO：1)：5’-TGAACTACTTGGAGGACCGTCGCTTGGTGCACCGCGACCTGGCAGC CAGGAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCAAAGTAAGGAGGTGGCTTTAGGTCAGCCAGCATTTTCCTGACACCAGGGACCAGGCTGCCTTCCGGGGAGGATGCTCTCCAGACATTCTGGGTGAGCTCGCAGCAGCTGCTGCTGGCAGCTGGGTCCAGCCAGGGTCTCCTGGTAGTG-3’；
目标单碱基突变基因EGFR_L858R(SEQ ID NO：2)：5’-TGAACTACTTGGAGGACCGTCGCTTGGTGCACCGCGACCTGGCAGC CAGGAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCGGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCAAAGTAAGGAGGTGGCTTTAGGTCAGCCAGCATTTTCCTGACACCAGGGACCAGGCTGCCTTCCGGGGAGGATGCTCTCCAGACATTCTGGGTGAGCTCGCAGCAGCTGCTGCTGGCAGCTGGGTCCAGCCAGGGTCTCCTGGTAGTG-3’；
上述下划线加粗的为突变位点；
突变型sgRNA序列(SEQ ID NO：3)：5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGGCGGGCUAAACUGCUGGGUGCG-3’；
野生型sgRNA(SEQ ID NO：4)：
5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGGCUGGCGAAACUGCUGGGUGCG-3’；
PAM序列：TTTN(SEQ ID NO：9)；
突变型基因引物对的正向引物(L858R-rpa-F-close)的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示、反向引物(L858R-rpa-R-close)的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述野生型基因引物对的正向引物(858WT-rpa-F-close)的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示、反向引物(858WT-rpa-R-close)的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；
L858R-rpa-F-close：5’-AAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGAT-3’；L858R-rpa-R-close：5’-GCCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCTCTTC-3’；858WT-rpa-F-close：5’-AAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGAT-3’；858WT-rpa-R-close：5’-GCCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCTCTTC-3’。
S2、先将2μL DNA模板(突变型EGFR-L858R或者野生型EGFR-858WT，浓度分别为105copies/μL)与20μL反应缓冲液、11μL ERA碱性缓冲液、2.5μL相应的正向引物(浓度为10nM)、2.5μL相应的反向引物(浓度为10nM)、2μL激活剂、补充ddH2O配置成50μL的突变型RPA反应体系和野生型RPA反应体系，再加入2μL MSCI限制性内切酶混合到上述两个RPA反应体系中，然后在37℃水浴锅中孵育30min，得到突变型RPA产物和野生型RPA产物；
S3、将5μL突变型RPA产物或者野生型RPA产物与Cas12a(浓度为200ng/μL，1μL)，相应的sgRNA(浓度为100nM，1μL)，1×NEBuffer 2.1(2μL)，RNA酶抑制剂(1μL)，ssDNA-FQ报告基因(核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，浓度为25μM，1μL)补充ddH2O配置成20μL的突变型CRISPR体系和野生型CRISPR体系；将上述两个CRISPR体系分别在涡旋振荡器上充分混合后，于37℃下孵育20min得到突变型CRISPR产物和野生型CRISPR产物；用酶标仪(激发波长为494nm，发射波长为525nm)分别检测突变型CRISPR产物和野生型CRISPR产物的荧光强度得到突变型荧光值为251，野生型荧光值为1146.5，将突变型荧光值与野生型荧光值进行比较分析，发现突变型基因EGFR-L858R的荧光值相对于野生型基因EGFR-858WT的荧光值，存在明显的降低。
实施例2
将突变型基因EGFR-L858R以实施例1中对应的突变型基因引物对进行PCR扩增(PCR扩增体系包括Taq DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液等PCR扩增必需组分，再加入DNA样本作为模板以及PCR的引物进行扩增)，得到50μL突变型PCR产物；将野生型基因EGFR-858WT以实施例1中对应的野生型基因引物对进行PCR扩增，得到50μL野生型PCR产物；将突变型PCR产物或者野生型PCR产物分别加入2μL MSCI核酸内切酶，在温度为37℃反应20min，以不加酶的产物作为对照；用1％的琼脂糖凝胶电泳进行电泳，结果如图2所示。
图2中泳道1为Marker；泳道2为不含有MSCI酶的对照组，所用的靶是野生型基因EGFR-858WT；泳道3为不含有MSCI酶的对照组，所用的靶是突变型基因EGFR_L858R；泳道4为含有MSCI酶的对照组，所用的靶是野生型基因EGFR-858WT；泳道5为含有MSCI酶的对照组，所用的靶是突变型基因EGFR_L858R；明显可以发现添加MSCI酶的野生型基因被MSCI核酸内切酶切割，形成了两条条带，而添加MSCI酶的突变型基因没有任何变化，说明MSCI酶只对野生型基因EGFR-858WT有影响。
实施例3
按照实施例1的方法进行目标单碱基突变基因EGFR_L858R的检测，不同的是，将步骤S1中的突变型sgRNA(以下将实施例1中的突变型sgRNA计为sgRNA-1)替换为突变型sgRNA-2～sgRNA-4(核苷酸序列如SEQ ID NO：11-SEQ ID NO：13所示)；sgRNA-2～sgRNA-4分别与实施例1中的突变型sgRNA存在一个错配位点，sgRNA-2～sgRNA-4均由上海生工生物技术公司合成；获得突变型荧光值F和野生型荧光值F0，计算△F％，结果见图3。
sgRNA-2(SEQ ID NO：11)：
sgRNA-3(SEQ ID NO：12)：
sgRNA-4(SEQ ID NO：13)：
下划线加粗的部分是与突变型sgRNA错配的部分，从左到右是5’端到3’端。
由图3可知，在CRISPR反应中选择实施例1中提供的sgRNA-1时，其荧光强度最强，证明该类型的sgRNA在CRISPR反应体系中，其功能效果最显著。
实施例4
按照实施例1的方法进行目标单碱基突变基因EGFR_L858R的检测，不同的是，将步骤S2中RPA反应体系的孵育时间分别设置为0、10、20、30、40、50、60min；获得突变型荧光值F和野生型荧光值F0，计算△F％，结果见图4。
由图4可知，RPA反应体系的孵育时间在0-60min范围内，样品荧光值F相对于对照荧光值F0的变化比值(△F％)出现一直升高最终趋于平衡的变化，在RPA孵育时间为30min时，已出现较强的显著性差异(p值<0.0001)，故RPA孵育时间选定为30min，用于后续实验。
实施例5
按照实施例1的方法进行目标单碱基突变基因EGFR_L858R的检测，不同的是，将步骤S2中RPA反应体系的孵育温度分别设置为25、30、37、40、45℃；获得突变型荧光值F和野生型荧光值F0，计算△F％，结果见图5。
由图5可知，RPA体系的孵育温度在25-45℃范围内，样品荧光值F相对于对照荧光值F0的变化比值(△F％)出现先升高后降低的变化，在RPA反应温度为37℃时，荧光强度最强，证明在温度为37℃时，RPA体系的反应效率最高，故在本实验中，RPA反应的温度选用37℃。
实施例6
按照实施例1的方法进行目标单碱基突变基因EGFR_L858R的检测，不同的是，将步骤S3中sgRNA与Cas12a的体积比分别设置为0.25：1、0.5：1、1：1、1.5：1、2：1；获得突变型荧光值F和野生型荧光值F0，计算△F％，结果见图6。
由图6可知，CRISPR体系中sgRNA与Cas12a的体积比为0.25：1、0.5：1、1：1、1.5：1、2：1，样品荧光值F相对于对照荧光值F0的变化比值(△F％)出现先升高再降低的变化，当crRNA与Cas12a的体积比为0.5:1时，其荧光强度最强，证明此时体系反应最充分，效果最显著，故crRNA与Cas12a的体积比为0.5:1，可用于后续实验。
实施例7
按照实施例1的方法进行目标单碱基突变基因EGFR_L858R的检测，不同的是，将步骤S3中CRISPR反应的孵育时间依次设置为0、10、20、30、40、50、60min；获得突变型荧光值F和野生型荧光值F0，计算△F％，结果见图7。
由图7可知，CRISPR体系的孵育时间在0-60min范围内，样品荧光值F相对于对照荧光值F0的变化比值(△F％)出现一直升高最终趋于平衡的变化，在CRISPR反应时间为20min时，结果已出现较强的显著性差异(p值<0.0001)，故CRISPR反应时间选定为20min，用于后续实验。
实施例8
S1、将收集到的肺癌患者的8个血液样本(样品1-样品8)作为待测样品，将各待测样品进行基因组DNA提取，具体过程为：将200-500μL待测样品的外周血或骨髓血样品与红细胞裂解试剂倒置混合四次，然后，使用1min的微量离心机分离裂解的红细胞(RBC)和未裂解的白细胞(WBC)，将沉淀的白细胞用100μL核酸释放剂在95℃下分裂3min以释放基因组DNA，将2μL处理过的样品作为待测基因；
S2、采用实施例1的步骤S1中提供的各个sgRNA、野生型基因以及引物对，先将2μLDNA模板(待测基因或者野生型EGFR-858WT)与20μL反应缓冲液、11μL ERA碱性缓冲液、2.5μL正向引物(浓度为10nM)、2.5μL反向引物(浓度为10nM)、2μL激活剂、补充ddH2O配置成50μL的待测RPA反应体系和野生型RPA反应体系，再加入2μL MSCI限制性内切酶混合到上述两个RPA反应体系中，在37℃水浴锅中孵育30min，得到待测RPA产物和野生型RPA产物；
S3、将5μL待测RPA产物或者野生型RPA产物与Cas12a(浓度为200ng/μL，1μL)，crRNA(浓度为100nM，1μL)，1×NEBuffer 2.1(2μL)，RNA酶抑制剂(1μL)，ssDNA-FQ报告基因(浓度为25μM，1μL)、补充ddH2O配置成20μL的待测CRISPR体系和野生型CRISPR体系；将上述两个CRISPR体系分别在涡旋振荡器上充分混合后，于37℃下孵育20min得到待测CRISPR产物和野生型CRISPR产物；用酶标仪(激发波长为494nm，发射波长为525nm)分别检测待测CRISPR产物和野生型CRISPR产物的荧光强度，得到待测样品荧光值F和野生型荧光值F0，将待测样品荧光值F和野生型荧光值F0相比是否有变化，结果见表1，有变化则表示阳性(+)结果，无变化则表示阴性(－)结果，以PCR检测结果作为参照。
表1
| 样品名称 | 实施例8检测结果 | PCR检测结果 |
| 样品1 | － | － |
| 样品2 | + | + |
| 样品3 | + | + |
| 样品4 | + | + |
| 样品5 | + | + |
| 样品6 | － | － |
| 样品7 | + | + |
| 样品8 | + | + |
从表1的数据看出，本发明提供的突变型EGFR-L858R检测方法与PCR检测的检测结果进行对比，具有很好的准确性。
实施例9
按照实施例1的方法进行目标单碱基突变基因EGFR_L858R的检测，不同的是，将步骤S2的RPA体系中DNA模板替换为不同比例的突变型EGFR-L858R，DNA模板中突变型EGFR-L858R的突变率依次设置为0.0001％，0.001％，0.01％，0.1％，1％，10％，25％，50％，100％，其余为野生型EGFR-858WT；获得突变型荧光值F和野生型荧光值F0，计算△F％，结果见图8。
由图8可知，突变型EGFR-L858R在0.0001％掺杂比例下，无法检测到有显著差异的荧光信号，突变型EGFR-L858R的检测限为0.001％。
对比例1
以Yang Wang等开发的单碱基突变基因检测方法作为对照方法(参考文献：Amultiplexed electrochemical quantitative polymerase chain reaction platformfor single-base mutation analysis)，其对突变型EGFR-L858R的检测灵敏度为0.05％。
对比例2
以Wenqian Yuan等开发的单碱基突变基因方法作为对照方法(参考文献Asensitive and selective mutation detection strategy based on non-canonicalDNA structure preference of endonuclease IV)，其对突变型EGFR-L858R的检测限为0.05％突变丰度。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种基于CRISPR系统的单碱基突变基因的检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
S1、根据目标单碱基突变基因及其相应的野生型基因，分别设计突变型引导RNA、野生型引导RNA、突变型基因引物对以及野生型基因引物对；
S2、将待测样品进行DNA提取获得待测基因，将所述待测基因或者所述野生型基因与相应的引物对、限制性内切酶进行RPA扩增得到待测RPA产物和野生型RPA产物；
S3、将所述待测RPA产物或者所述野生型RPA产物与相应的引导RNA进行CRISPR反应得到待测CRISPR产物和野生型CRISPR产物，检测所述待测CRISPR产物和野生型CRISPR产物的荧光强度得到待测样品荧光值和野生型荧光值，将所述待测样品荧光值与所述野生型荧光值进行比较分析。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤S1中，所述野生型基因为表皮生长因子受体EGFR-858WT基因，所述目标单碱基突变基因为表皮生长因子受体EGFR-858WT基因中存在一个碱基突变；
优选地，所述表皮生长因子受体EGFR-858WT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述目标单碱基突变基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述突变型引导RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述野生型引导RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
优选地，所述突变型基因引物对的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示、反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述野生型基因引物对的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示、反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。
4.根据权利要求1至3中任意一项所述的检测方法，其特征在于，步骤S1中，所述突变型引导RNA和所述野生型引导RNA分别在5’端连接有PAM序列；
优选地，所述PAM序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
5.根据权利要求1至3中任意一项所述的检测方法，其特征在于，步骤S2中，所述RPA扩增的RPA体系含有：所述待测基因或者所述野生型基因、相应的引物对、所述限制性内切酶、反应缓冲液、碱性缓冲液、激活剂和水；
优选地，所述待测基因或者所述野生型基因、相应的引物对、限制性内切酶、反应缓冲液、碱性缓冲液、激活剂和水的体积比为1:2-3:0.8-1.2:9-11:5-6:0.8-1.2:4-6；
优选地，所述限制性内切酶为MSCI酶；
优选地，所述RPA扩增的条件至少包括：温度为25-45℃，时间为10-60min。
6.根据权利要求1至3中任意一项所述的检测方法，其特征在于，步骤S3中，所述CRISPR反应的CRISPR体系含有：所述待测RPA产物或者所述野生型RPA产物、相应的引导RNA、Cas12a、CRISPR缓冲液、RNA酶抑制剂、ssDNA-FQ报告基因和水；
优选地，所述Cas12a、相应的引导RNA、CRISPR缓冲液、RNA酶抑制剂、ssDNA-FQ报告基因、待测RPA产物或者野生型RPA产物以及水的体积比为1:0.25-2:1.5-2.5:0.8-1.2:0.8-1.2:4-6:8-10；
优选地，所述ssDNA-FQ报告基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；所述CRISPR缓冲液含有：8-12mM Tris-HCl，8-12mM MgCl2，8-12mM NaCl和80-120μg/mL牛血清白蛋白。
7.根据权利要求1至3中任意一项所述的检测方法，其特征在于，步骤S3中，所述CRISPR反应的条件至少包括：温度为30-45℃，时间为15-25min；
优选地，所述荧光强度采用酶标仪检测，所述酶标仪的激发波长为480-500nm，发射波长为510-540nm；
优选地，所述比较分析包括：判断所述待测样品荧光值相对于所述野生型荧光值是否有变化，或者计算所述待测样品荧光值相对于所述野生型荧光值的变化比值。
8.一种基于CRISPR系统的单碱基突变基因的检测装置，其特征在于，该检测装置包括微流控芯片、用于控制所述微流控芯片进行检测操作的微流控制器和荧光检测器，所述微流控芯片包括芯片主体(1)和位于所述芯片主体(1)上的微通道，所述微通道形成至少一个相互独立的检测单元(2)，每个所述检测单元(2)包括用于进行DNA提取的前处理区(21)以及用于进行RPA扩增和CRISPR反应的反应区(22)，所述荧光检测器用于检测所述反应区(22)内CRISPR反应产物的荧光强度。
9.根据权利要求8所述的检测装置，其特征在于，所述芯片主体(1)为圆形有机玻璃成型件，所述微通道为位于所述芯片主体(1)的一侧表面的亚敏膜通道；
优选地，所述荧光检测器为酶标仪，所述微流控制器为离心式微流控程控仪。
10.权利要求1至7中任意一项所述的检测方法在制备疾病诊断试剂盒中的应用；
优选地，所述疾病为癌症，更优选为肺癌。
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| CN202311040183.5A CN117126926A (zh) | 2023-08-17 | 2023-08-17 | 基于crispr系统的单碱基突变基因的检测方法、检测装置及其应用 |
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