CN117126180A - 作为免疫调节剂的联苯类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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CN117126180A CN202310610573.5A CN202310610573A CN117126180A CN 117126180 A CN117126180 A CN 117126180A CN 202310610573 A CN202310610573 A CN 202310610573A CN 117126180 A CN117126180 A CN 117126180A
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李志斌
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Abstract

本发明涉及一种式(I)所示联苯类化合物、其制备方法及其应用。本发明还涉及包含所述化合物作为活性成分的药物组合物。所述化合物是具有优异的可口服吸收特征的新型小分子免疫调节剂，可用于治疗和/或预防与免疫相关的多种疾病。

Description

作为免疫调节剂的联苯类化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于药物化学领域，具体涉及作为免疫调节剂的联苯类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤免疫治疗是一种通过激发人体的免疫系统，增强自身的抗肿瘤免疫力，从而抑制或杀死肿瘤细胞的新治疗方法。该方法经过百余年的努力取得了突破性进展。2013年，《Science》杂志将肿瘤免疫治疗列为年度十大科学突破之首(Couzin-Frankel J.,2013,Science,342:1432-1433)，已成为最具前景的抗肿瘤治疗领域之一。
肿瘤细胞相比正常细胞，具有多种遗传学和表观遗传学的改变，免疫系统可利用肿瘤细胞产生的表面抗原将二者区分，进而引发抗肿瘤免疫反应。在T细胞抗肿瘤免疫过程中，其被T细胞受体(T cell receptor，TCR)介导的抗原识别信号激活后，通过共刺激和共抑制信号综合调节T细胞效应，包括细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(Cytotoxic T-lymphocyte associated antigen 4,CTLA4)、程序性死亡受体1(Programmed deathprotein 1,PD-1)、T细胞活化的免疫球蛋白抑制V型结构域(V-domain immunoglobulinsuppressor of T-cell activation,VISTA)、T细胞免疫球蛋白及黏蛋白结构域的分子3(Tcell immunoglobulin and mucin domain–containing-3,TIM3)、淋巴细胞活化基因3(Lymphocyte activation gene 3,LAG3)等抑制信号的抑制性受体，及CD28、CD134(OX40)、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(Glucocorticoid-induced TNFR-related protein,GITR)、CD137、CD27、HVEM等刺激信号的活化性受体(Mellman I.,Coukos G.,Dranoff G.,2011,Nature,480:480-489)。在正常生理条件下，免疫检查点一方面参与维持自身抗原的免疫耐受，避免自身免疫性疾病；另一方面避免免疫反应过度激活导致组织损伤。然而，在肿瘤细胞中，其可通过免疫检查点抑制T细胞激活而逃避免疫杀伤。因此，需要通过激活共刺激信号(踩“油门”)并抑制共抑制信号(松“刹车”)而重新激活T细胞攻击肿瘤细胞，进而实现肿瘤免疫治疗。
PD-1表达于激活的T细胞、B细胞及骨髓细胞中，属于CD28家族，是T细胞上的一种type1跨膜糖蛋白，由288个氨基酸组成。PD-1的分子结构由具有免疫球蛋白IgV样(氨基酸35-145)的胞外区、跨膜区、具有连接信号肽功能的胞质尾区构成，其上的胞外区与配体结合发挥重要功能(Cheng X.,Veverka V.,Radhakrishnan A.,et al.2013,J.Biol.Chem.,288:11771-11785)。程序性死亡配体1(Programmed death protein ligand 1,PD-L1)是PD-1的配体之一，属于B7家族，可持续性表达于多种肿瘤细胞、T细胞、抗原呈递细胞(APC)及多种非造血细胞中，也为type1跨膜糖蛋白，它由290个氨基酸组成。PD-1与PD-L1相互作用会抑制T细胞激活，这对于维持正常机体的免疫耐受至关重要，而在肿瘤细胞中和病毒感染时，T细胞上的PD-1被诱导性高表达，PD-L1的表达上调，导致PD-1信号通路持续激活而抑制T细胞增殖，造成肿瘤细胞和病原体的免疫逃逸(Fuller M.J.,Callendret B.,Zhu B.,et al.2013,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,110:15001-15006；Dolan D.E.,Gupta S.,2014,Cancer Control,21:231-237；Chen L.,Han X.,2015,J.Clin.Invest.,125:3384-3391；Postow M.A.,Callahan M.K.,Wolchok J.D.,2015,J.Clin.Oncol.,33:1974-1982)。近年上市的PD-1和PD-L1的多个抗体药物充分证明了阻断PD-1/PD-L1相互作用在肿瘤的免疫治疗和免疫相关的其他多种疾病中是一种非常有效的治疗手段。
研究发现，PD-L1能够与CD80发生相互作用并抑制PD-L1和PD-1结合，以及抑制T细胞激活的能力。因此，阻断CD80/PD-L1相互作用引起的免疫激活，也可能促进T细胞活性增强，进而为免疫相关的疾病提供了新的治疗机会(Sugiura D.,Maruhashi T.,Okazaki ll-mi,et al.2019,Science,364:558-566)。
发明内容
本发明的一个方面，涉及能够靶向PD-L1的一种小分子联苯类化合物，或其异构体、药学上可接受的盐、前体、代谢产物及同位素衍生物。
本发明涉及式(I)所示的化合物，或其异构体、药学上可接受的盐、前体、代谢产物及同位素衍生物，
其中，
R1和R2相同或不同地选自C1-C6烷基、氰基、卤素；
R3选自氢、卤素、C1-C6烷基、胺基C1-C6烷基、羟基C1-C6烷基、羟基C1-C6烷基酰胺基C1-C6烷基；
R4选自羟基、氨基、羟基C1-C4直链烷基胺基、羟基C5-C6烷基胺基；
其中，当R4选自羟基时，R3不能为C1-C6烷基；
X选自O或S；
m选自1、2、3；
n选自1、2、3。
在一个实施方案中，上述式(I)所示的化合物，或其异构体、药学上可接受的盐、前体、代谢产物及同位素衍生物中，
R1和R2相同或不同地选自C1-C6烷基、氰基、卤素；
R3选自氢、卤素、C1-C6烷基、胺基C1-C6烷基、羟基C1-C6烷基；
R4选自羟基、氨基、羟基C1-C4直链烷基胺基、羟基C5-C6烷基胺基；
其中，当R4选自羟基时，R3不能为C1-C6烷基；
X选自O或S；
m选自1、2、3；
n选自1、2、3。
在一个实施方案中，上述式(I)所示的化合物，或其异构体、药学上可接受的盐、前体、代谢产物及同位素衍生物中，
R1和R2相同或不同地选自C1-C6烷基、氰基、卤素；
R3选自氢、卤素、C1-C6烷基、胺基C1-C6烷基；
R4选自羟基、氨基、羟基C1-C6烷基胺基；
X选自O或S；
m选自1、2、3；
n选自1、2、3。
在一个实施方案中，R1和R2相同或不同地选自C1-C6烷基、C1-C5烷基、C1-C4烷基、C1-C3烷基、C2-C4烷基、氰基、卤素。
在一个实施方案中，R1和R2相同或不同地选自甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、氰基、F、Cl、Br和I。
在一个实施方案中，R3选自氢、卤素、C1-C6烷基、C1-C5烷基、C1-C4烷基、C1-C3烷基、C2-C4烷基、羟基C1-C6烷基、羟基C1-C5烷基、羟基C1-C4烷基、羟基C1-C3烷基、羟基C2-C4烷基、胺基C1-C6烷基、胺基C1-C5烷基、胺基C1-C4烷基、胺基C1-C3烷基和胺基C2-C4烷基、羟基C1-C5烷基酰胺基C1-C5烷基、羟基C1-C4烷基酰胺基C1-C4烷基、羟基C1-C3烷基酰胺基C1-C3烷基、羟基C2-C4烷基酰胺基C2-C4烷基。
在一个优选的实施方案中，R3选自氢、F、Cl、Br、I、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、羟基甲基、羟基乙基、羟基丙基、羟基丁基、羟基戊基、羟基己基、胺基甲基、胺基乙基、胺基丙基、胺基丁基、胺基戊基和胺基己基、羟基甲基酰胺基甲基、羟基乙基酰胺基乙基、羟基丙基酰胺基丙基、羟基丁基酰胺基丁基、羟基戊基酰胺基戊基、羟基己基酰胺基己基、羟基甲基酰胺基乙基、羟基乙基酰胺基甲基、羟基甲基酰胺基丙基、羟基乙基酰胺基丙基、羟基丙基酰胺基甲基、羟基丙基酰胺基乙基。
在一个更优选的实施方案中，R3选自氢、F、Cl、Br、I、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基；所述甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基任选地被1个羟基或氨基取代；或R3选自羟基甲基酰胺基甲基、羟基乙基酰胺基乙基、羟基丙基酰胺基丙基、羟基甲基酰胺基乙基、羟基乙基酰胺基甲基、羟基甲基酰胺基丙基、羟基乙基酰胺基丙基、羟基丙基酰胺基甲基、羟基丙基酰胺基乙基。
在一个还要优选的实施方案中，R3选自氢、甲基、乙基、氨基甲基、胺基乙基、羟基甲基、羟基乙基、羟基甲基酰胺基甲基、羟基乙基酰胺基乙基、羟基甲基酰胺基乙基、羟基乙基酰胺基甲基。
在一个最优选的实施方案中，R3选自氢、甲基、
在一个实施方案中，R3选自氢、卤素、C1-C6烷基、C1-C5烷基、C1-C4烷基、C1-C3烷基、C2-C4烷基、羟基C1-C6烷基、羟基C1-C5烷基、羟基C1-C4烷基、羟基C1-C3烷基、羟基C2-C4烷基、胺基C1-C6烷基、胺基C1-C5烷基、胺基C1-C4烷基、胺基C1-C3烷基和胺基C2-C4烷基。
在一个优选的实施方案中，R3选自氢、F、Cl、Br、I、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、羟基甲基、羟基乙基、羟基丙基、羟基丁基、羟基戊基、羟基己基、胺基甲基、胺基乙基、胺基丙基、胺基丁基、胺基戊基和胺基己基。
在一个更优选的实施方案中，R3选自氢、F、Cl、Br、I、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基；所述甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基任选地被1个羟基或氨基取代。
在一个还要优选的实施方案中，R3选自氢、甲基、胺基乙基、羟基乙基。
在一个实施方案中，R3选自氢、卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷基、C1-C5烷基、C1-C4烷基、C1-C3烷基、C2-C4烷基、胺基C1-C6烷基、胺基C1-C5烷基、胺基C1-C4烷基、胺基C1-C3烷基和胺基C2-C4烷基。
在一个优选的实施方案中，R3选自氢、F、Cl、Br、I、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、胺基甲基、胺基乙基、胺基丙基、胺基丁基、胺基戊基和胺基己基。
在一个实施方案中，R4选自羟基、氨基、羟基C1-C4直链烷基胺基、羟基C1-C3直链烷基胺基、羟基C2-C4直链烷基胺基、羟基C5-C6烷基胺基。
在一个优选的实施方案中，R4选自羟基、氨基、羟基甲基胺基、羟基乙基胺基、羟基丙基胺基、羟基戊基胺基、羟基丁基胺基、羟基己基胺基。
在一个更优选的实施方案中，R4选自羟基、氨基、羟基乙基胺基。
在一个实施方案中，R4选自羟基、氨基、羟基C1-C6烷基胺基、羟基C1-C6烷基胺基、羟基C1-C5烷基胺基、羟基C1-C4烷基胺基、羟基C1-C3烷基胺基、羟基C2-C4烷基胺基。
在一个实施方案中，R4选自羟基、氨基、羟基甲基胺基、羟基乙基胺基、羟基丙基胺基、羟基戊基胺基、羟基丁基胺基、羟基己基胺基。
在一个实施方案中，式(Ⅰ)具有式(ⅠA)所示结构：
其中，R3、R4、X、m、n如式(Ⅰ)定义。
在一个优选的实施方案中，式(Ⅰ)具有式(ⅠB)所示结构：
其中，R3、R4如式(Ⅰ)所述定义。
在一个实施方案中，其中所述化合物选自：
本发明还提供了一种药物组合物，其包含前述的化合物或其立体异构体、药学上可接受的盐、前体、代谢产物及同位素衍生物。
本发明还提供了前述的化合物或其立体异构体、药学上可接受的盐、前体及代谢产物或者前述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防与靶点PD-L1相关的疾病的药物中的用途，或者在制备用于抑制PD-L1活性的药物中的用途，或者在制备作为PD-L1抑制剂的药物中的用途，或者在制备作为靶向PD-L1信号通路的免疫调节剂的药物中的用途。
在一个优选的实施方案中，所述与靶向PD-L1相关的疾病包括肿瘤、癌症或者免疫相关的其他疾病。
各术语定义
在本说明书的各部分，本发明公开化合物的取代基按照基团种类或范围公开。特别指出，本发明包括这些基团种类和范围的各个成员的每一个独立的次级组合。例如，术语“C1-C6烷基”特别指独立公开的甲基、乙基、C3烷基、C4烷基、C5烷基和C6烷基，或者独立公开的“C1-C4烷基”，或者独立公开的“C1-C3烷基”。
本发明所述的“卤素”为氟、氯、溴或碘，优先为氟或氯或溴。
本发明所述的“烷基”，如无特别说明，包括直链或支链的烷基。例如，本发明中所述的C1-C6烷基，是指碳原子数为1-6的烷基，优选为甲基、乙基、正丙基或异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基。本发明化合物中的烷基可以是任选取代或未取代的，取代的取代基可以包括烷基、卤素、烷氧基、卤代烷基、氰基、羟基等。本发明烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基等。
在整个说明书中，基团和其取代基可由本领域技术人员选择以提供稳定部分和化合物和可用作医药上可接受的化合物的化合物和/或可用于制备医药上可接受的化合物的中间体化合物。
本文所述的化合物中的立体异构体，当以化学名称特别指定为(R)-或(S)-异构体时，应分别理解为主要构型为(R)-异构体或(S)-异构体。任何不对称碳原子可以存在于(R)-、(S)-或(R、S)-构型中，优选以(R)-或(S)-构型存在。
本发明所述的“药学可接受的盐”是指本发明化合物与药学上可接受的酸进行反应制得的酸加成盐，或者其中具有酸性基团的化合物和碱性化合物反应生成的盐。其中，所述的酸较佳的选自无机酸(如盐酸、硫酸、磷酸或氢溴酸等)，和有机酸(如草酸、马来酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、赖氨酸、组氨酸、柠檬酸或苯甲酸等)；所述的碱性化合物较佳的选自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钠或碳酸氢钾等。上述药学上可接受的盐容易分离，可采用常规分离方法提纯，如溶剂萃取、稀释、重结晶、柱色谱和制备薄层色谱等。
本发明提供一种通式(I)所示化合物在制备过程中使用到的未公开报道的化合物，包括但不限于，
本发明提供了上述化合物(I-19d)的制备方法，其包括如下步骤：
式(I-19d1)经wittig反应得式(I-19d2)，随后将羧酸甲酯还原得式(I-19d3)，进一步与2-溴乙酸乙酯经亲核取代反应得式(I-19d4)，而后将羧酸乙酯还原得式(I-19d5)，进一步与乙磺酰氯反应得式(I-19d6)，然后与NaN3反应得式(I-19d7)，随后经Staudinger还原反应得式(I-19d8)，再进一步将氨基用Boc保护得得式(I-19d9)，最后在低温的酸性条件下脱去甲基得式(I-19d)。
其他上述几个化合物可以参照化合物(I-19d)的制备合成方法获得。
其中，化合物(I-34d)的制备方法，其包括如下步骤：
式(I-19d5)在酸性条件下水解即可得到式(I-34d)。
在本发明中，“受试者”指脊椎动物。在某些实施方案中，脊椎动物指哺乳动物。所述哺乳动物包括牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物，例如是人，猫，狗或猪。哺乳动物包括，但不限于，牲畜(诸如牛)、宠物(诸如猫、犬、和马)、灵长类动物、小鼠和大鼠。在某些实施方案中，哺乳动物指人。
本发明中，术语“治疗有效量”或“预防有效量”是指在合理的医学判断范围内，足以治疗或预防患者疾病但足够低地避免严重副作用(在合理的利益/风险比)的量。化合物的治疗有效量将根据所选择的具体化合物(例如考虑化合物的效力、有效性和半衰期)、所选择的给药途径、所治疗的疾病、所治疗的疾病的严重性、所治疗的患者的年龄、大小、体重和身体疾病、所治疗的患者的医疗史、治疗持续时间、并行疗法的性质、所需的治疗效果等因素发生变化，但仍可以由本领域技术人员常规确定。
另外需要指出，所述化合物或其立体异构体、药学上可接受的盐、前体及代谢产物针对不同患者的特定使用剂量和使用方法决定于诸多因素，包括患者的年龄，体重，性别，自然健康状况，营养状况，药物的活性强度，服用时间，代谢速率，病症的严重程度以及诊治医师的主观判断。
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
本发明提供了一种新颖的具有优异可口服吸收特征的联苯类的小分子免疫抑制剂，用于治疗或预防与免疫相关的疾病。同时，这些化合物或者包含其作为活性成分的药物组合物等可在安全治疗窗口内能将对这些疾病的临床疗效达到最大化。
具体实施方式
本发明中所提供的实施例和制备例进一步阐明并举例说明了本发明所述化合物及其制备方法。应当理解，下述制备例和实施例不以任何方式限制本发明的范围。
本发明中所提及的编号与化合物为一一对应关系，例如本发明代表性的8种具体化合物及其编号如下表：
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本发明中，所涉及的分析方法如下：LC-MS分析方法(A)：
质谱条件：仪器Thermo MSQ Plus；离子源ESI(EA+EA-)；锥孔电压30V；毛细管电压3.00KV；源温度350℃。
色谱条件：仪器Thermo U3000；检测器DAD-3000(RS)(二极管阵列检测器)；色谱柱岛津Inertsil ODS-HL HP 3μm 3.0×100mm；流速0.4mL/min；柱温30℃；流动相CH3OH/H2O/HCOOH(75/25/0.2)。
LC-MS分析方法(B)：
质谱条件：仪器Thermo ISQ EC；离子源ESI(EA+EA-)；源温度300℃；鞘气压50.0psi；辅助气压5.0psi；吹扫气压0.5psi；气化室温度300℃。
色谱条件：仪器Thermo U3000；检测器DAD-3000(RS)(二极管阵列检测器)；色谱柱菲罗门Titank C18 3μm 4.6×50mm；流速2.0mL/min，分流；柱温35℃；流动相：A相含0.05％甲酸加5％乙腈水，B相含0.05％甲酸的乙腈，0～1.0min内，100％ A相到5％ A相线性洗脱，5％ A相保持0.5min。
HPLC分析方法(一)：
仪器Thermo U3000；检测器VWD-3×00(RS)(紫外检测器)；色谱柱岛津Shim-packVP-ODS 5μm 4.6×150mm；流速1.0mL/min；柱温30℃；流动相CH3OH/H2O/CH3COOH/TEA(80/20/0.1/0.2)。
HPLC分析方法(二)：
仪器Thermo U3000；检测器VWD-3×00(RS)(紫外检测器)；色谱柱岛津Shim-packVP-ODS 5μm 4.6×150mm；流速1.0mL/min；柱温30℃；流动相CH3OH/H2O/CH3COOH/TEA(75/25/0.1/0.2)。
HPLC分析方法(三)：
仪器Thermo U3000；检测器VWD-3×00(RS)(紫外检测器)；波长254nm/214nm；色谱柱岛津inertsil 3μm 4.6×150mm；流速0.8mL/min；柱温35℃；流动相：A相含0.05％甲酸加5％乙腈水，B相含0.05％甲酸的乙腈，100％A保持1.0min，1.0～8.0min内，100％ A相到5％A相线性洗脱，5％ A相保持4.0min。
HPLC分析方法(四)：
仪器Thermo U3000；检测器VWD-3×00(RS)(紫外检测器)；波长254nm；色谱柱岛津inertsil 3μm 4.6×150mm；流速0.8mL/min；柱温35℃；流动相A含0.05％甲酸和5％乙腈的水；流动相B含0.05％甲酸的乙腈；洗脱方法先用100％的A相保持1.0min，在1.0～8.0min内，A相从100％到5％线性洗脱，最后用5％的A相保持4.0min。
按照上述分析方法分析了本发明制备了如下代表性化合物，结果见下表1。
表1：代表性化合物的纯度分析结果
下面结合具体实例进一步阐述本发明内容，但本发明的保护范围并不仅仅局限于这些实例。本发明所述的百分比除特别注明外，均为重量百分比。说明书中所描述的数值范围，如计量单位、反应条件、化合物物理状态或百分比，均是为了提供明白无误的书面参考。本领域技术人员在实施本发明时，使用在此范围之外或有别于单个数值的温度、浓度、数量、碳原子数等，仍然有可能得到预期结果。另外，以下实施例中的原料如无特别说明，均可商购获得，例如可以购自上海毕得医药科技有限公司、江苏艾康生物医药研发有限公司、南京药石科技股份有限公司、上海韶远试剂有限公司、赫淳生物科技(上海)有限公司。
实施例1：中间体I-11h的制备
合成路线如下：
第一步：将I-11a(530.00mg,1.13mmol,1.0eq,合成参考文献CN202111092852.4)溶于1,4-二氧六环(10mL)中，加入三氟乙酸(5mL)，在环境温度下搅拌1h。浓缩反应液，将残余物溶解在1,4-二氧六环(10mL)中，加入I-1b(583.08mg,1.13mmol,1.0eq,合成参考文献CN202111092852.4)，1,1'-双(二环己基膦基)二茂铁二氯化钯(83.05mg,0.11mmol,0.1eq)，无水碳酸钠(359.34mg,3.39mmol,3.0eq)和水(5mL)，所得混合液用微波加热到110℃并反应1h，冷却至环境温度。浓缩反应液，粗品经硅胶柱柱层析(二氯甲烷/甲醇(v/v)＝40/1～20/1)分离后，得到固体I-11c。(363.00mg,收率47.3％)。LC-MS MS-ESI(m/z)679.6[M+H]+。
第二步：将中间体I-11c(363.00mg,0.53mmol,1.0eq)溶于二氯甲烷(10mL)中，加入三乙胺(1mL)和I-1d(143.78mg,0.79mmol,1.5eq，合成参考文献CN202111092852.4)，所得混合液在环境温度下搅拌1h后，加入醋酸硼氢化钠(674.16mg,3.18mmol,6.0eq)并继续搅拌16h。反应液用饱和碳酸氢钠溶液淬灭，用二氯甲烷/甲醇(10/1,100mL)萃取3次。合并有机相，用无水硫酸钠干燥，浓缩。粗品经制备TLC(二氯甲烷/甲醇(v/v)＝8/1)分离后，得到固体I-11e。(363.00mg,收率47.3％)。LC-MS MS-ESI(m/z)845.9[M+H]+。
第三步：将中间体I-11e(338.00mg,0.40mmol,1.0eq)溶于二氯甲烷(10mL)中，加入三氟乙酸(10mL)，所得溶液在环境温度下搅拌1h。浓缩反应液，将残余物溶解在二氯甲烷(10mL)中，再次浓缩，得到的三氟乙酸盐固体直接用于下一阶段。将上述的三氟乙酸盐溶于二氯甲烷(10mL)中，加入三乙胺(1mL)和市售的I-1f(117.6mg,0.60mmol,1.5eq)。所得混合液在环境温度下搅拌1h后，加入醋酸硼氢化钠(508.80mg,2.40mmol,6.0eq)，继续搅拌16h。反应液用饱和碳酸氢钠溶液淬灭，用二氯甲烷/甲醇(10/1,100mL)萃取3次。合并有机相，用无水硫酸钠干燥，浓缩。粗品经制备TLC(二氯甲烷/甲醇(v/v)＝6/1)分离后，得到I-11g。(307.00mg,收率82.9％)。LC-MS MS-ESI(m/z)926.0[M+H]+。
第四步：将中间体I-11g(307.00mg,0.33mmol,1.0eq)溶于四氢呋喃(10mL)中，加入水(10mL)和氢氧化锂一水合物(277.20mg,6.60mmol,20.0eq)，所得溶液在环境温度下搅拌16h。浓缩除去四氢呋喃，用1M盐酸调pH至5-6。过滤收集固体，干燥得到类白色固体I-11h。(84.00mg,收率27.9％)。LC-MS MS-ESI(m/z)912.0[M+H]+。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 9.89(s,2H),8.38(d,J＝8.4Hz,2H),7.49(t,J＝8.0Hz,2H),7.14(d,J＝7.4Hz,2H),3.90(s,6H),3.48-3.41(m,4H),3.33(s,2H),3.24(s,3H),2.78-2.70(m,4H),2.69-2.62(m,4H),2.56-2.51(m,4H),1.89-1.83(m,2H),1.75-1.69(m,4H),1.58-1.22(m,16H),1.12(s,2H).
实施例2：化合物I-11的制备
合成路线如下：
如实施例1所述方法制得I-11h。将I-11h(228.00mg,0.25mmol,1.0eq)加入到二氯甲烷(15mL)中，加入N,N′-二甲基甲酰胺(1滴),用冰/盐浴冷却至0℃，滴加草酰氯(63.50mg,0.50mmol,2.0eq),在室温下搅拌2h。在0℃下，将反应液滴加到市售的氨水(20mL)中，室温下搅拌10min后，用二氯甲烷/甲醇(10/1,50mL)萃取2次，合并有机相，浓缩。粗品经制备TLC(二氯甲烷/甲醇＝8/1展开)分离后，得到类白色固体化合物I-11。(130.00mg,收率56.3％)。LC-MS MS-ESI(m/z)910.5[M+H]+。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm9.88(s,2H),8.36(d,J＝8.2Hz,2H),7.47(t,J＝8.0Hz,2H),7.12(dd,J＝7.6,1.3Hz,2H),6.94(s,1H),6.70(s,1H),3.89-3.86(m,6H),3.43-3.37(m,4H),3.32(s,2H),3.21(s,3H),2.75-2.68(m,4H),2.67-2.60(m,4H),2.57-2.50(m,4H),1.77-1.64(m,6H),1.55-1.34(m,10H),1.36-1.20(m,6H),1.10(s,2H).
实施例3：化合物I-15的制备
合成路线如下：
如实施例1所述方法制得I-11h。取I-11h(137.00mg,0.15mmol,1.0eq)溶于二氯甲烷(20mL)中，依次加入乙醇胺(45.87mg,0.75mmol,5.0eq)，N,N′-二异丙基乙基胺(96.90mg,0.75mmol,5.0eq)和HATU(114.0mg,0.30mmol,2.0eq)，所得混合液在室温下搅拌16h。反应液用水(60mL)淬灭，用二氯甲烷(50mL)萃取2次。合并有机相，无水Na2SO4干燥，浓缩。粗品经制备TLC(二氯甲烷/甲醇＝7/1展开)分离后，得到类白色固体I-15。(92.00mg,收率62.3％)。LC-MS MS-ESI(m/z)954.4[M+H]+。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 9.90(s,2H),8.39(d,J＝8.3Hz,2H),7.49(t,J＝7.9Hz,2H),7.33(t,J＝5.6Hz,1H),7.14(dd,J＝7.6,1.3Hz,2H),4.62(t,J＝5.3Hz,1H),3.91-3.87(m,6H),3.43-3.35(m,6H),3.33(s,2H),3.23(s,3H),3.11(dd,J＝12.2,6.2Hz,2H),2.77-2.70(m,4H),2.70-2.61(m,4H),2.57-2.51(m,4H),1.81-1.65(m,6H),1.56-1.21(m,16H),1.12(s,2H).
实施例4：中间体I-19d的制备
合成路线如下：
第一步：在N2保护下，将(甲氧基甲基)三苯基溴化鏻(1783.00g,5.20mol,1.3eq)加入至四氢呋喃(6L)中。冰水浴条件下0℃加入叔丁醇钾(583.61g,5.20mol,1.3eq)，反应液变为红棕色。之后0-10℃滴加市售的I-19d1(729.00g,4.00mol,1.0eq)的四氢呋喃(1L)溶液。滴毕，自然升温至20℃搅拌反应16h，TLC监测有机相反应完全。将反应液倒入5L水中，分液。水相用甲基叔丁基醚(3L x 2)萃取，合并有机相。有机相用饱和食盐水(4L)洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，旋干得固液混合物。再加入甲基叔丁基醚(1L)打浆，过滤，弃去固体，滤液旋干。所得油状物湿法上样柱层析(正己烷/乙酸乙酯＝1/0-25/1)得棕色油状物I-19d2。(841.20g,收率按100.0％计算)。
第二步：在N2保护下，将四氢铝锂(151.84g,4.00mol,1.0eq)加入至四氢呋喃(5L)中。控温0-10℃滴加I-19d2(841.20g,4.00mol,10eq)的四氢呋喃(2L)溶液，控温0-10℃，滴毕，自然升温至室温20℃搅拌反应4h，TLC监测反应完全。降温至0-10℃，依次滴加152mL水，152mL 15％氢氧化钠水溶液，456mL水，剧烈放气放热。滴毕，搅拌反应30min后加入约200.00g无水硫酸镁，搅拌30min。过滤，滤液旋干，制砂柱层析(正己烷/乙酸乙酯＝1/0-15/1)得到黄色油状物I-19d3(587.30g,80.5％)。
第三步：称取氢化钠(24.14g,603.550mmol,60％purity,1.1eq)，加入正庚烷(200mL x 3)搅拌，静置，上层清液舍弃。加入四氢呋喃(1L)中置换正庚烷并置于2L口瓶中。在N2保护下，降温至0℃，开始滴加I-19d3(100.00g,548.67mmol,1.0eq)的四氢呋喃(100mL)溶液，加完，将反应液于0℃下搅拌反应1h，维持在0℃，滴加2-溴乙酸乙酯(100.79g,603.54mmol,1.1eq)。滴毕，反应液自然升温至12℃反应16h。TLC监测反应结束。将反应液降温至0℃，滴加水(30mL)淬灭反应。减压浓缩除去四氢呋喃，加入乙酸乙酯(400mL)溶解残留物，再用饱和食盐水(150mL)洗涤，分液。有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压浓缩得棕色油状物I-19d4。(105.00g,71.3％)。
第四步：向2L四口瓶中分别加入四氢呋喃(1L)和I-19d4(100.00g,1.0eq)。在N2保护下，降温至0℃，分批加入四氢铝锂(9.90g,0.7eq)，加毕，反应液在0℃下反应0.5h。TLC监测反应结束。在0℃下，缓慢滴加水(20mL)淬灭反应，加毕，再滴加15％氢氧化钠溶液(20mL)。自然升温至15℃下搅拌2h,过滤。滤饼用四氢呋喃(200mL)洗涤，滤液减压浓缩得淡黄色液体粗品I-19d5(70.00g,83.0％)。
第五步：向1L四颈瓶中分别加入二氯甲烷(350mL)和I-19d5(70.00g,309.31mmol,1.0eq)。在10℃下，加入三乙胺(46.95g,463.963mmol,1.5eq)，降温至0℃，控温滴加乙磺酰氯(47.73g,371.17mmol,1.2eq)。加完后，将反应液在10℃下反应24h。TLC监测反应结束。将反应液减压浓缩除去二氯甲烷，向浓缩物中加入乙酸乙酯(300mL)，超声，过滤。滤液用饱和食盐水(150mL)洗涤，干燥，减压浓缩得淡黄色油状物I-19d6(90.00g,282.639mmol,91.38％)，未进一步提纯，直接投入下一步。
第六步：将I-19d6(30.00g,94.21mmol,1.0eq)和N,N′-二甲基甲酰胺(150mL)依次加入500mL四颈瓶中。在10℃下，加入叠氮化钠(9.19g,141.319mmol,1.5eq)。加完反应液在85℃下反应24h。TLC监测反应结束。将反应液降温至室温，倒入水(500mL)中，用乙酸乙酯(500mL×2)萃取2次。合并有机相，饱和食盐水(250mL×3)洗涤，干燥，过滤。滤液减压浓缩得到棕色油状物I-19d7(23.67g,超过理论收率)，未进一步提纯，直接投入下一步。
第七步：在500mL四颈瓶中，将I-19d7(23.67g,94.18mmol,1.0eq)溶于水(80mL)和四氢呋喃(230mL)中。在10℃下，加入三苯基膦(37.05g,141.27mmol,1.5eq)，加毕，反应液在10℃下反应16h。TLC监测反应结束得I-19d8。反应液未做进一步处理，按100％收率直接投入下一步。
第八步：在10℃下，向I-19d8(21.22g,94.18mmol,1.0eq)的四氢呋喃(230ml)和水(80ml)溶液中分别加入碳酸叔丁酯(30.80g,141.26mmol,1.5eq)，碳酸氢钠(23.73g,282.52mmol,3.0eq)。加毕，反应液在10℃下反应16h。TLC监测反应结束。将反应液用乙酸乙酯(100mL×2)萃取，合并有机相，饱和食盐水(100ml)洗涤，干燥，减压浓缩得淡黄色油状物。粗品制砂，柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝1/0-15/1)得到无色油状物I-19d9(8.00g,26.10％)。
第九步：在500mL四颈瓶中，将I-19d9(8.00g,24.58mmol,1.0eq)溶于四氢呋喃(80mL)中。在15℃下，加入1M盐酸(74mL,75.00mmol,3.0eq)，加完反应液，在15℃下反应8h。TLC监测反应结束。将反应液用乙酸乙酯(100mL×2)萃取，合并有机相，饱和食盐水(50ml)洗涤，干燥，过滤，滤液减压浓缩得7.00g淡黄色液体粗品。粗品制砂，柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝1/0-15/1)得到无色液体I-19d(4.50g,58.78％)。1H-NMR(CDCl3,400MHz)δppm 9.83(s,1H),4.84-4.58(m,1H),3.52-3.32(m,6H),2.59-2.58(d，2H),1.65-1.53(m,6H),1.47(s,9H),1.40-1.30(m,4H).
实施例5：化合物I-19的制备
合成路线如下：
第一步：黄色固体中间体I-19e是由中间体I-11c(1.12g,1.65mmol,1.0eq)，I-1f(405.00mg,2.10mmol,1.3eq)，N,N′-二异丙基乙基胺(638.55mg,4.95mmol,3.0eq)和三乙酰氧基硼氢化钠(2.10g,9.90mmol,6.0eq)按照CN202210598489.1中化合物I-1第三步的类似步骤制备而成。(1.21g,收率85.4％)。LC-MS MS-ESI(m/z)859.4[M+H]+。
第二步：浅黄色固体中间体I-19g是由自制的中间体I-19e(1.21g,1.40mmol,1.0eq)，三氟乙酸(5mL)，N,N′-二异丙基乙基胺(541.80mg,4.20mmol,3.0eq)，I-19d(621.00mg,1.99mmol,1.42eq)和三乙酰氧基硼氢化钠(1.78g,8.40mmol,6.0eq)按照CN202210598489.1中化合物I-2第四步的类似步骤制备而成。(1.25g,收率84.2％)。LC-MSMS-ESI(m/z)1054.6[M+H]+。
第三步：白色固体中间体I-19h是由自制的中间体I-19g(1.25g,1.18mmol,1.0eq)和氢氧化锂一水合物(1.01g,24.0mmol,20.3eq)按照CN202210598489.1中化合物I-1第四步的类似步骤制备而得。(950.00mg,收率77.0％)。LC-MS MS-ESI(m/z)1040.5[M+H]+。
第四步：将中间体I-19h(104.00mg,0.10mmol,1.0eq)溶于二氯甲烷(DCM,10mL)中，加入三氟乙酸(TFA,8mL)，所得混合液在室温下搅拌1h，浓缩。残留物溶解于二氯甲烷(DCM,60mL)，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，分出有机相，浓缩。粗品经制备TLC(二氯甲烷(DCM)/甲醇(MeOH)/三乙胺(TEA)＝5/1/0.2展开)分离后，得到类白色固体I-19。(54.00mg,收率57.3％)。LC-MS MS-ESI(m/z)940.4[M+H]+。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 8.45-8.33(m,2H),7.48(t,J＝7.9Hz,2H),7.13(d,J＝7.5Hz,2H),3.91-3.86(m,6H),3.50-3.34(m,8H),2.86-2.78(m,2H),2.78-2.70(m,4H),2.69-2.62(m,4H),2.56-2.51(m,4H),1.91-1.80(m,2H),1.75-1.65(m,4H),1.59-1.20(m,16H),1.12(s,2H).
实施例6：化合物I-30的制备
首先，制备中间体3，合成路线如下：
第一步：将市售的SM1(785.00mg,4.0mmol,1.0eq)溶解于干燥的MeOH(10mL)，加入三氟甲烷磺酸铈(116.00mg,0.4mmol,0.1eq)，再加入原甲酸三甲酯(2.12g,20.0mmol,5.0eq)，室温搅拌过夜。加水(40mL)淬灭，用乙酸乙酯(50mL)萃取，有机相浓缩得到透明油状物即中间体1。(1.01g，收率100％计)。LC-MS MS-ESI(m/z)243.0[M+H]+。
第二步：将中间体1(1.01g,4.0mmol,1.0eq)溶解于干燥的THF(20mL)，冰盐浴冷却至零度，分批加入四氢铝锂(607.25mg,16.0mmol,4.0eq)，然后反应液回至室温继续搅拌0.5小时。将反应液缓慢加入到冰/饱和NH4Cl(50mL)中淬灭，用乙酸乙酯(60mL)萃取，有机相浓缩得到无水透明粘稠油状物即中间体2。(720.0mg,收率84.0％)。LC-MS MS-ESI(m/z)215.1[M+H]+。
第三步：将中间体2(720.0mg,3.36mmol,1.0eq)溶解于1,4-二氧六环(10mL)，加入2M HCl(10mL)，室温搅拌3小时，然后用饱和碳酸氢钠溶液中和反应液，用二氯甲烷/甲醇(10/1,55mL)萃取，有机相浓缩，得到透明油状物即中间体3。(530.0mg,收率93.7％)。LC-MSMS-ESI(m/z)169.1[M+H]+。
其次，制备化合物I-30，合成路线如下：
第一步：将如实施例5第一步制得的中间体I-19e(680.0mg,0.79mmol,1.0eq)溶解于二氯甲烷(10mL)，加入TFA(6mL)，室温下搅拌0.5h，浓缩反应液得到褐色油状物。油状物溶解于二氯甲烷(50mL)，加入过量三乙胺(1.5mL)，然后加入中间体3(530.0mg,3.15mmol,4.0eq)，反应液室温搅拌20分钟后，加入三乙酰氧基硼氢化钠(837.2mg,3.95mmol,5.0eq)，室温搅拌过夜。用饱和NaHCO3(80mL)溶液淬灭反应，用DCM/MeOH(10/1，80mL)萃取，有机相浓缩，粗品经硅胶柱(200-300目硅胶，DCM/MeOH 20/1洗脱)分离后，得到浅黄色固体中间体4。(650.0mg,收率90.2％)。LC-MS MS-ESI(m/z)911.5[M+H]+。
第二步：将中间体4(650.0mg,0.71mmol,1.0eq)溶解于THF(20mL)中，加入LiOH的水溶液(2.0M,15mL)，室温搅拌过夜。浓缩除去THF，残液用水(10mL)稀释，用2M HCl溶液调节pH至中性，析出固体，抽滤，滤饼烘干，制备纯化，得到化合物I-30。(239.13mg,收率26.6％)。LC-MS MS-ESI(m/z)897.4[M+H]+。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 9.93(s,2H),8.41(d,J＝8.0Hz,2H),7.52(t,J＝7.9Hz,2H),7.18(d,J＝6.7Hz,2H),3.93(s,6H),3.46-3.40(m,6H),2.82-2.74(m,4H),2.73-2.66(m,4H),2.58-2.52(m,4H),1.95-1.83(m,2H),1.80-1.67(m,4H),1.60-1.33(m,14H),1.28-1.17(m,2H),1.12(s,2H).
实施例7：化合物I-31的制备
合成路线如下：
将化合物I-30(100.0mg,0.11mmol,1.0eq)溶于超干DMF(10mL)中，加入市售的1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐(PyBOP，171.73mg,0.33mmol,3.0eq)，N,N'-二异丙基乙胺(DIEA,142.16mg,1.10mmol,10.0eq)和I-31a(58.84mg,1.10mmol,10.0eq)，在室温下搅拌18h。反应液用DCM/MeOH(5/1,60mL)稀释，用水(60mL)洗3次。有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩。粗品经制备TLC(DCM/MeOH＝4/1展开)分离后，得到类白色固体化合物I-31。(36.00mg，收率36.5％)。LC-MS MS-ESI(m/z)896.4[M+H]+。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm9.87(s,2H),8.35(d,J＝8.1Hz,2H),7.46(t,J＝7.9Hz,2H),7.11(d,J＝7.5Hz,2H),6.94(s,1H),6.70(s,1H),4.34(s,1H),3.87(s,6H),3.42-3.36(m,4H),3.35-3.31(m,2H),2.76-2.68(m,4H),2.67-2.58(m,4H),2.54-2.49(m,4H),1.81-1.60(m,6H),1.54-1.11(m,16H),1.05(s,2H).
实施例8：化合物I-32的制备
首先，制备中间体I-32i，合成路线如下：
将I-19g(267.41mg,0.28mmol,1.0eq)溶于超干DMF(20mL)中，加入市售的I-32h(63.87mg,0.84mmol,3.0eq)，2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU,319.40mg,0.84mmol,3.0eq)和N,N'-二异丙基乙胺(DIEA,180.94mg,1.40mmol,5.0eq)，在室温下搅拌18h。反应液用DCM/MeOH(5/1,60mL)稀释，用水(60mL)洗3次。有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩。粗品经制备TLC(DCM/MeOH＝4/1展开)分离后，得到类白色固体I-32i。(150.00mg，收率52.9％)。LC-MS MS-ESI(m/z)1012.4[M+H]+。
其次，制备中间体I-32j，合成路线如下：
将中间体I-32i(150.00mg,0.15mmol,1.0eq)溶于THF(10mL)中，加入LiOH·H2O(126.00mg,3.00mmol,20.0eq)的水(10mL)溶液，室温下搅拌18h。浓缩除去THF，水相用1NHCl调节pH至6-7，过滤收集析出的固体，用水(2mL)淋洗3次，50℃鼓风干燥箱中烘干6h得到白色固体中间体I-32j。(120.00mg，收率80.1％)。LC-MS MS-ESI(m/z)998.4[M+H]+。
最后，制备化合物I-32，合成路线如下：
化合物I-32是由中间体I-32j(100.0mg,0.10mmol,1.0eq)，1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐(PyBOP,156.11mg,0.30mmol,3.0eq)，N,N'-二异丙基乙胺(129.24mg,1.0mmol,10.0eq)和I-31a(53.49mg,1.0mmol,10.0eq)按照实施例I-31中的类似步骤制备而成。(67.00mg，收率67.1％)。LC-MS MS-ESI(m/z)997.4[M+H]+。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 9.86(s,2H),8.35(d,J＝8.2Hz,2H),7.57(s,1H),7.45(t,J＝7.9Hz,2H),7.15-7.06(m,2H),6.94(s,1H),6.71(s,1H),5.53(s,1H),3.86(s,6H),3.75(s,2H),3.41-3.34(m,8H),3.26-3.18(m,2H),2.75-2.68(m,4H),2.67-2.58(m,4H),2.52-2.47(m,4H),1.84-1.61(m,6H),1.57-1.17(m,16H),1.09(s,2H).
实施例9：化合物I-33的制备
将化合物I-30(370.00mg,0.41mmol,1.0eq)溶于超干DMF(10mL)中，加入市售的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(PyBOP,235.00mg,0.62mmol,1.5eq)，N,N'-二异丙基乙胺(158.92mg,1.23mmol,3.0eq)和I-33a(50.10mg,0.82mmol,2.0eq)，在室温下搅拌18h。反应用水(60mL)淬灭，过滤收集析出的固体，用水(5mL)淋洗3次，在50℃的鼓风干燥箱中烘干6小时。粗品经制备TLC(DCM/MeOH＝4/1展开)分离后，得到类白色固体I-33。(188.00mg，收率46.5％)。LC-MS MS-ESI(m/z)940.4[M+H]+。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 9.89(s,2H),8.38(d,J＝8.3Hz,2H),7.48(t,J＝7.9Hz,2H),7.33(t,J＝5.6Hz,1H),7.14(dd,J＝7.5,1.1Hz,2H),4.61(t,J＝5.5Hz,1H),4.35(t,J＝5.2Hz,1H),3.89(s,6H),3.43-3.39(m,6H),3.37-3.35(m,2H),3.10(dd,J＝12.1,6.1Hz,2H),2.79-2.71(m,4H),2.69-2.63(m,4H),2.59-2.51(m,4H),1.81-1.65(m,6H),1.54-1.43(m,8H),1.41(s,2H),1.37-1.29(m,4H),1.22-1.15(m,2H),1.08(s,2H).
实施例10:化合物I-34的制备
首先，制备中间体I-34d，合成路线如下：
取干燥四颈瓶，加入THF(30mL)至四颈瓶中，加入中间体I-19d5(5.0g,22.00mmol,1.0eq)至四颈瓶中。在25℃条件下，加入HCl(33.1mL,2M)至反应液，加毕，继续反应4h。TLC检测原料反应完全。将反应液用EA(30mL×2)萃取2次，合并有机相，干燥，过滤，滤液减压浓缩得浅棕色油状物I-34d。(3.40g，收率72.5％)。1H-NMR(CDCl3,400MHz):δppm 9.80-9.79(t,1H),3.73-3.71(t,2H),3.57-3.49(m,4H),2.56-2.54(q,2H),2.35(s,1H),1.66-1.53(m,6H),1.37-1.32(m,4H).
其次，制备中间体I-34e，合成路线如下：
将中间体I-19e(0.65g,0.76mmol,1.0eq)溶解于DCM(10mL)中，加入TFA(3mL)，在室温下搅拌0.5h后，浓缩反应液，得到的黄色油状中间体不经纯化直接用于下一阶段。
将黄色油状物溶解于DCM/MeOH(8/1,90mL)中，加入三乙胺(1mL)和I-34d(211.01mg,0.99mmol,1.3eq)，在室温下搅拌0.5h后；加入三乙酰氧基硼氢化钠(780.00mg,3.68mmol,4.84eq)，继续搅拌16h。用饱和NaHCO3(60mL)溶液淬灭反应，用DCM(60mL)萃取2次，合并有机相，浓缩。粗品经硅胶柱(200-300目硅胶，DCM/MeOH 15/1洗脱)分离后，得到黄色固体中间体I-34e。(0.60g，收率82.6％)。LC-MS MS-ESI(m/z)955.4[M+H]+。
再者，制备中间体I-34f，合成路线如下：
中间体I-34f是由中间I-34e(0.60g,0.63mmol,1.0eq)和LiOH·H2O(0.53g,12.60mmol,20.0eq)按照实施例I-32j中的类似步骤制备而成。(400.00mg，收率67.4％)。LC-MS MS-ESI(m/z)941.4[M+H]+。
最后，制备化合物I-34，合成路线如下：
将中间体I-34f(400.00mg,0.42mmol,1.0eq)溶于DCM(10mL)中，加入2滴DMF，用冰/盐浴冷却至0℃后，滴加I-34g(58.63mg,0.46mmol,1.1eq)，在室温下搅拌1h。将反应液缓慢滴加到NH3·H2O(60mL)中，用DCM(60mL)萃取2次，合并有机相，浓缩。粗品经制备TLC(DCM/MeOH/TEA＝25/5/1展开)分离后，得到类白色固体化合物I-34(25.00mg，收率6.3％)。LC-MS MS-ESI(m/z)940.4[M+H]+。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 9.87(s,2H),8.35(d,J＝8.1Hz,2H),7.46(t,J＝7.9Hz,2H),7.11(d,J＝7.5Hz,2H),6.94(s,1H),6.70(s,1H),4.34(s,1H),3.87(s,6H),3.72-3.55(m,2H),3.55-3.30(m,8H),2.78-2.67(m,4H),2.67-2.57(m,4H),2.56-2.48(m,4H),1.81-1.60(m,6H),1.54-1.11(m,16H),1.05(s,2H).
以上实施例1-10仅是本发明的优选制备例，应当指出，对于本领域技术人员来说，本发明所述的其它化合物可通过上述类似步骤制备而得。
实施例11：体外生物学评价
本检测方法用于本发明所述化合物的体外生物学活性评价，包括体外蛋白水平结合抑制活性评价方法和细胞水平生物学功能活性评价方法。
本检测的目的在于综合评价不同化合物对体外液相PD-1和PD-L1及CD80和PD-L1结合的抑制活性和对细胞模型上PD-1和PD-L1结合后抑制T细胞活化信号的阻断影响。
一、体外PD-1和PD-L1结合的抑制活性评价
1.实验主要原理
均相时间分辨荧光法(HTRF)：本方法应用了融合表达hFc标签的重组人PD-L1蛋白及融合表达His标签的重组人PD-1蛋白，二者为可相互作用的配体和受体。当分别使用含Eu元素鳌合标记物的anti-hFc抗体和含XL665荧光素标记的anti-His抗体与上述两个对应标签结合，且通过320nm波长激光激发后，由于配体-受体结合使得能量能够从Eu元素转移到XL665荧光素上，激发后者发出665nm波长的发射光。而当加入PD-L1与PD-1相互作用的抑制剂时，配体与受体的结合被破坏，使得Eu和XL665距离较远，能量不能转移，XL665不会被激发。
2.实验材料与设备
带His标签的重组人PD-1蛋白(His-PD-1蛋白，Cat#：10377-H08H-50)、重组人PD-L1-Fc融合蛋白(PD-L1-Fc融合蛋白，Cat#：10084-H02H-100)购自义翘神州公司(SinoBiological Inc.)，anti-hFc-Eu3+抗体、anti-His-XL665抗体购自Cisbio公司，其它相关试剂如稀释缓冲液(Diluent buffer 5,Cat#：62DL5DDC)、检测缓冲液(PPI-Europiumdetection buffer,Cat#：61DB9RDF)等均从Cisbio公司购买。荧光检测仪器Tecan(Spark10M)从瑞士Tecan公司购买。
3.实验主要过程
实验过程按照检测试剂使用说明书要求的流程进行。流程如下：
(1)实验准备：用稀释缓冲液将测试化合物稀释成不同浓度梯度(在20μL最终反应体系中最高终浓度为10μM)，将His-PD-1蛋白稀释成800nM(在20μL最终反应体系中终浓度100nM)，PD-L1-Fc融合蛋白稀释成16nM(终浓度为2nM)；用检测缓冲液分别按试剂要求将anti-His-XL665抗体和anti-hFc-Eu3+抗体稀释20倍和100倍。
(2)先将5μL测试化合物、2.5μLPD-L1-Fc融合蛋白和2.5μL His-PD-1蛋白溶液混匀后，室温孵育15min；随后向该体系加入5μL anti-His-XL665抗体和5μL anti-hFc-Eu3+抗体，继续孵育3h后检测。
(3)检测反应同时设置有对照组，包括未添加测试化合物的0％抑制阳性对照、未添加PD-1蛋白的100％抑制阴性对照。所有检测采用复孔。
(4)使用荧光检测仪Tecan(Spark 10M)检测每孔的荧光信号，激发波长为320nm，检测的发射波长分别为620nm和665nm。PD-1和PD-L1相互结合的强度参照荧光信号比值Em665/Em620。
(5)测试化合物的结合抑制率计算公式：抑制率(％)＝[1–(检测孔荧光信号比值–100％抑制阴性对照荧光信号比值)]/(0％抑制阳性对照荧光信号比值–100％抑制阴性对照荧光信号比值)×100％。不同浓度梯度的测试化合物分别计算PD-1/PD-L1结合抑制率后，计算50％抑制浓度(IC50)。本发明代表性化合物体外抑制PD-1和PD-L1结合的IC50数据见下表2：
表2：本发明代表性化合物抑制体外PD-1/PD-L1结合的IC50数据
由上述结果可见，本发明所述的代表性化合物具有很好的抑制体外PD-1/PD-L1结合的活性，提示本发明所述的通式(I)的化合物同样具有抑制PD-1/PD-L1结合的活性。
二、体外CD80和PD-L1结合的抑制活性评价
1.实验主要原理
除PD-1外，PD-L1也可通过与CD80结合，发挥免疫抑制活性。同样地，体外CD80与PD-L1结合或结合抑制实验也可通过均相时间分辨荧光法(HTRF)进行检测。当使用anti-hFc-Eu3+抗体和anti-His-XL665抗体分别与融合表达于PD-L1的hFC标签及融合表达于CD80的His标签结合，且320nm波长激光激发后，由于PD-L1与CD80的结合使得能量可以从Eu元素转移到XL665荧光素上，激发后者发光。当加入PD-L1与CD80相互作用的抑制剂时，二者的结合被破坏，使得Eu和XL665距离较远，能量不能转移，XL665不会被激发。
2.实验材料与设备
带His标签的重组人CD80蛋白(His-CD80蛋白，Cat#：10698-H08H-100)、重组人PD-L1-Fc融合蛋白(PD-L1-Fc融合蛋白，Cat#：10084-H02H-100)购自义翘神州公司(SinoBiological Inc.)，anti-hFc-Eu3+抗体、anti-His-XL665抗体购自Cisbio公司，其它相关试剂如稀释缓冲液(Diluent buffer 5,Cat#：62DL5DDC)、检测缓冲液(PPI-Europiumdetection buffer,Cat#：61DB9RDF)等均从Cisbio公司购买。荧光检测仪器Tecan(Spark10M)从瑞士Tecan公司购买。
3.实验主要过程
实验过程按照检测试剂使用说明书要求的流程进行(Invitrogen)。流程如下：
(1)实验准备：用稀释缓冲液将测试化合物稀释成不同浓度梯度(在20μL最终反应体系中最高终浓度为10μM)，将His-CD80蛋白稀释成800nM(在20μL最终反应体系中终浓度100nM)，PD-L1-Fc融合蛋白稀释成16nM(终浓度为2nM)；用检测缓冲液分别按试剂要求将anti-His-XL665抗体和anti-hFc-Eu3+抗体稀释20倍和100倍。
(2)先将5μL测试化合物、2.5μL His-CD80蛋白和2.5μL PD-L1-Fc融合蛋白溶液混匀后，室温孵育15min；随后向该体系加入5μL anti-His-XL665抗体和5μL anti-hFc-Eu3+抗体，继续孵育3h后检测。
(3)检测反应同时设置有对照组，包括未添加测试化合物的0％抑制阳性对照、未添加CD80蛋白的100％抑制阴性对照。所有检测采用复孔。
(4)使用荧光检测仪Tecan(Spark 10M)检测每孔的荧光信号，激发波长为320nm，检测的发射波长分别为620nm和665nm。CD80/PD-L1相互结合的强度参照荧光信号比值Em665/Em620。
(5)测试化合物的结合抑制率计算公式：抑制率(％)＝[1–(检测孔荧光信号比值–100％抑制阴性对照荧光信号比值)]/(0％抑制阳性对照荧光信号比值–100％抑制阴性对照荧光信号比值)×100％。不同浓度梯度的测试化合物分别计算CD80/PD-L1结合抑制率后，计算50％抑制浓度(IC50)。本发明代表性化合物体外抑制CD80和PD-L1结合的IC50数据见表3。
表3本发明代表性化合物抑制体外CD80/PD-L1结合的IC50数据
由上述结果可见，本发明所述的化合物具有很好的抑制体外CD80/PD-L1结合的活性，提示本发明所述的通式(I)的化合物同样具有抑制CD80/PD-L1结合的活性。
产业上的可应用性
本发明的化合物具有优异的PD-L1抑制活性，可成为治疗或预防与该作用相关的疾病的药物。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (13)

1.一种式(Ⅰ)的化合物，或其立体异构体、药学上可接受的盐、前体、代谢产物及同位素衍生物：
其中，
R1和R2相同或不同地选自C1-C6烷基、氰基、卤素；
R3选自氢、卤素、C1-C6烷基、胺基C1-C6烷基、羟基C1-C6烷基、羟基C1-C6烷基酰胺基C1-C6烷基；
R4选自羟基、氨基、羟基C1-C4直链烷基胺基、羟基C5-C6烷基胺基；
其中，当R4选自羟基时，R3不能为C1-C6烷基；
X选自O或S；
m选自1、2、3；
n选自1、2、3。
2.根据权利要求1所述的化合物或其立体异构体、药学上可接受的盐、前体、代谢产物及同位素衍生物，其中：
R1和R2相同或不同地选自C1-C6烷基、氰基、卤素；
R3选自氢、卤素、C1-C6烷基、胺基C1-C6烷基、羟基C1-C6烷基；
R4选自羟基、氨基、羟基C1-C4直链烷基胺基、羟基C5-C6烷基胺基；
其中，当R4选自羟基时，R3不能为C1-C6烷基；
X选自O或S；
m选自1、2、3；
n选自1、2、3。
3.根据权利要求1所述的化合物或其立体异构体、药学上可接受的盐、前体、代谢产物及同位素衍生物，其中：
R1和R2相同或不同地选自C1-C6烷基、氰基、卤素；
R3选自氢、卤素、C1-C6烷基、胺基C1-C6烷基；
R4选自羟基、氨基、羟基C1-C6烷基胺基；
X选自O或S；
m选自1、2、3；
n选自1、2、3。
4.根据权利要求1-3任一项所述的化合物或其立体异构体、药学上可接受的盐、前体、代谢产物及同位素衍生物，其中，
R1和R2相同或不同地选自C1-C6烷基、C1-C5烷基、C1-C4烷基、C1-C3烷基、C2-C4烷基、氰基、卤素；
优选的，R1和R2相同或不同地选自甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、氰基、F、Cl、Br和I。
5.根据权利要求1所述的化合物或其立体异构体、药学上可接受的盐、前体、代谢产物及同位素衍生物，其中：
R3选自氢、卤素、C1-C6烷基、C1-C5烷基、C1-C4烷基、C1-C3烷基、C2-C4烷基、羟基C1-C6烷基、羟基C1-C5烷基、羟基C1-C4烷基、羟基C1-C3烷基、羟基C2-C4烷基、胺基C1-C6烷基、胺基C1-C5烷基、胺基C1-C4烷基、胺基C1-C3烷基和胺基C2-C4烷基、羟基C1-C5烷基酰胺基C1-C5烷基、羟基C1-C4烷基酰胺基C1-C4烷基、羟基C1-C3烷基酰胺基C1-C3烷基、羟基C2-C4烷基酰胺基C2-C4烷基；
优选地，R3选自氢、F、Cl、Br、I、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、羟基甲基、羟基乙基、羟基丙基、羟基丁基、羟基戊基、羟基己基、胺基甲基、胺基乙基、胺基丙基、胺基丁基、胺基戊基和胺基己基、羟基甲基酰胺基甲基、羟基乙基酰胺基乙基、羟基丙基酰胺基丙基、羟基丁基酰胺基丁基、羟基戊基酰胺基戊基、羟基己基酰胺基己基、羟基甲基酰胺基乙基、羟基乙基酰胺基甲基、羟基甲基酰胺基丙基、羟基乙基酰胺基丙基、羟基丙基酰胺基甲基、羟基丙基酰胺基乙基；
优选地，R3选自氢、F、Cl、Br、I、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基；所述甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基任选地被1个羟基或氨基取代；或R3选自羟基甲基酰胺基甲基、羟基乙基酰胺基乙基、羟基丙基酰胺基丙基、羟基甲基酰胺基乙基、羟基乙基酰胺基甲基、羟基甲基酰胺基丙基、羟基乙基酰胺基丙基、羟基丙基酰胺基甲基、羟基丙基酰胺基乙基；
更优选地，R3选自氢、甲基、乙基、氨基甲基、胺基乙基、羟基甲基、羟基乙基、羟基甲基酰胺基甲基、羟基乙基酰胺基乙基、羟基甲基酰胺基乙基、羟基乙基酰胺基甲基；
还要优选地，R3选自氢、甲基、
6.根据权利要求2所述的化合物或其立体异构体、药学上可接受的盐、前体、代谢产物及同位素衍生物，其中：
R3选自氢、卤素、C1-C6烷基、C1-C5烷基、C1-C4烷基、C1-C3烷基、C2-C4烷基、羟基C1-C6烷基、羟基C1-C5烷基、羟基C1-C4烷基、羟基C1-C3烷基、羟基C2-C4烷基、胺基C1-C6烷基、胺基C1-C5烷基、胺基C1-C4烷基、胺基C1-C3烷基和胺基C2-C4烷基；
优选地，R3选自氢、F、Cl、Br、I、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、羟基甲基、羟基乙基、羟基丙基、羟基丁基、羟基戊基、羟基己基、胺基甲基、胺基乙基、胺基丙基、胺基丁基、胺基戊基和胺基己基；
更优选地，R3选自氢、F、Cl、Br、I、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基；所述甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基任选地被1个羟基或氨基取代；
还要优选地，R3选自氢、甲基、胺基乙基、羟基乙基。
7.根据权利要求3所述的化合物或其立体异构体、药学上可接受的盐、前体、代谢产物及同位素衍生物，其中：
R3选自氢、卤素、C1-C6烷基、C1-C5烷基、C1-C4烷基、C1-C3烷基、C2-C4烷基、胺基C1-C6烷基、胺基C1-C5烷基、胺基C1-C4烷基、胺基C1-C3烷基和胺基C2-C4烷基；
优选的，R3选自氢、F、Cl、Br、I、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、胺基甲基、胺基乙基、胺基丙基、胺基丁基、胺基戊基和胺基己基。
8.根据权利要求1或2所述的化合物或其立体异构体、药学上可接受的盐、前体、代谢产物及同位素衍生物，其中：
R4选自羟基、氨基、羟基C1-C4直链烷基胺基、羟基C1-C3直链烷基胺基、羟基C2-C4直链烷基胺基、羟基C5-C6烷基胺基；
优选地，R4选自羟基、氨基、羟基甲基胺基、羟基乙基胺基、羟基丙基胺基、羟基戊基胺基、羟基丁基胺基、羟基己基胺基；
更优选地，R4选自羟基、氨基、羟基乙基胺基。
9.根据权利要求3所述的化合物或其立体异构体、药学上可接受的盐、前体、代谢产物及同位素衍生物，其中：
R4选自羟基、氨基、羟基C1-C6烷基胺基、羟基C1-C6烷基胺基、羟基C1-C5烷基胺基、羟基C1-C4烷基胺基、羟基C1-C3烷基胺基、羟基C2-C4烷基胺基；
优选的，R4选自羟基、氨基、羟基甲基胺基、羟基乙基胺基、羟基丙基胺基、羟基戊基胺基、羟基丁基胺基、羟基己基胺基。
10.根据权利要求2所述的化合物或其立体异构体、药学上可接受的盐、前体、代谢产物及同位素衍生物，其中：式(Ⅰ)具有式(ⅠA)所示结构：
其中，R3、R4、X、m、n如权利要求2、6、8中任一项所述定义；
优选地，式(Ⅰ)具有式(ⅠB)所示结构：
其中，R3、R4如权利要求2、6、8中任一项所述定义。
11.根据权利要求1-10任一项所述的化合物或其立体异构体、药学上可接受的盐、前体、代谢产物及同位素衍生物，其中所述化合物选自：
12.一种药物组合物，其包含权利要求1至11任一项所述的化合物或其立体异构体、药学上可接受的盐、前体、代谢产物及同位素衍生物。
13.权利要求1至11任一项所述的化合物或其立体异构体、药学上可接受的盐、前体及代谢产物或者权利要求12所述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防与靶点PD-L1相关的疾病的药物中的用途，或者在制备用于抑制PD-L1活性的药物中的用途，或者在制备作为PD-L1抑制剂的药物中的用途，或者在制备作为靶向PD-L1信号通路的免疫调节剂的药物中的用途；
优选地，所述与靶向PD-L1相关的疾病包括肿瘤、癌症或者免疫相关的其他疾病。
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