CN117126138A - 用于泛素-蛋白酶体系统中对靶蛋白进行降解的化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

用于泛素-蛋白酶体系统中对靶蛋白进行降解的化合物及其制备方法和应用 Download PDF

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CN117126138A CN202311058442.7A CN202311058442A CN117126138A CN 117126138 A CN117126138 A CN 117126138A CN 202311058442 A CN202311058442 A CN 202311058442A CN 117126138 A CN117126138 A CN 117126138A
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Abstract

本发明公开了用于泛素‑蛋白酶体系统中对靶蛋白进行降解的化合物及其制备方法和应用，所述化合物的结构通式如式I所示：Ra‑linker‑SP‑linker‑Rb式I；其中，Ra为E3泛素连接酶配体；Rb为靶蛋白配体；SP为磺酰基吡啶，化学结构式如式Ⅱ所示：以及linker选自琥珀酸酐基、戊二酸酐基、‑CO‑R1‑CO‑或‑NH‑R2‑CO‑，其中，R1和R2各自独立地选自任意取代的C1‑C6亚烷基。本发明用于泛素‑蛋白酶体系统中对靶蛋白进行降解的化合物SD02显著诱导了STING蛋白的多泛素化，SD02通过泛素‑蛋白酶体系统有效降解了STING蛋白，另外，SD02表现出剂量依赖性地降低TBK1和IRF3的磷酸化水平，可降低SATE‑3',3'‑c‑di‑dAMP诱导的干扰素相关基因的mRNA水平，SD02对THP1、U937和U2OS细胞的细胞生长抑制作用，即使在高浓度下，SD02也不会妨碍细胞增殖。

Description

用于泛素-蛋白酶体系统中对靶蛋白进行降解的化合物及其 制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种用于泛素-蛋白酶体系统中对靶蛋白进行降解的化合物及其制备方法和应用。
背景技术
蛋白酶降解靶向嵌合体(PROTACs)已经成为一类有前途的治疗药物，相比传统的小分子抑制剂，它们具有显著优势。通过利用细胞内的蛋白质降解机制，PROTACs相比传统抑制剂具有改进的给药方式、减少的副作用、增强的选择性和降低的药物耐药性等优势。
近年来，广泛的研究集中于开发针对KRAS、BTK、AR等关键靶点的PROTAC分子。虽然大多数PROTACs在靶蛋白(POI)和E3连接酶方面使用非共价基团，如ERK1/2降解剂、Bruton酪氨酸激酶(BTK)降解剂和KRAS G12C降解剂等。这些共价PROTACs将靶蛋白的可逆和不可逆共价配体纳入E3连接酶基团中，使其能够起到共价降解作用。然而，用于POI的可逆非共价配体通常不适用作共价PROTAC的探头。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种用于泛素-蛋白酶体系统中对靶蛋白进行降解的化合物及其制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明提供一种用于泛素-蛋白酶体系统中对靶蛋白进行降解的化合物，所述化合物的结构通式如式I所示：
Ra-linker-SP-linker-Rb式I；
其中，Ra为E3泛素连接酶配体；Rb为靶蛋白配体；SP为磺酰基吡啶，化学结构式如式Ⅱ所示：
以及linker选自琥珀酸酐基、戊二酸酐基、-CO-R1-CO-或-NH-R2-CO-，其中，R1和R2各自独立地选自任意取代的C1-C6亚烷基。
本发明还提供上述化合物在制备用于泛素-蛋白酶体系统的靶蛋白降解剂中的应用。
本发明还提供上述化合物在制备治疗STING过度激活导致的自身免疫性疾病药物中的应用。
本发明还提供一种药物组合物，包含上述化合物。还可以包含药物可接受的辅料。该药物组合物可用于治疗个体STING过度激活导致的自身免疫性疾病。
进一步地，能够用于本公开的疾病的示例性实例包括但不限于婴儿发病的STING相关血管病(SAVI)、全身性红斑狼疮(SLE)和Aicardi Goutières综合征(AGS)。
进一步地，能够用于本公开的个体的示例性实例包括但不限于哺乳动物。
进一步地，能够用于本公开的哺乳动物的示例性实例包括但不限于人类。
本发明的有益效果体现在：
本发明用于泛素-蛋白酶体系统中对靶蛋白进行降解的化合物SD02显著诱导了STING蛋白的多泛素化，SD02通过泛素-蛋白酶体系统有效降解了STING蛋白，另外，SD02表现出剂量依赖性地降低TBK1和IRF3的磷酸化水平，可降低SATE-3',3'-c-di-dAMP诱导的干扰素相关基因的mRNA水平，SD02对THP1、U937和U2OS细胞的细胞生长抑制作用，即使在高浓度下，SD02也不会妨碍细胞增殖。
附图说明
图1为STING降解剂分子SD02及其工作机理图；
图2为STING降解剂分子SD02可与STING蛋白共价结合，其中(A)SD02的化学结构。(B)通过CB-Dock网络服务器(http://clab.labshare.cn/cb-dock/php/index.php)预测了SN011与STING的结合构象。酪氨酸197被标记为蓝色棒状物。SN011显示为青色棒状物。(C)SD02与STING的197位酪氨酸残基共价结合的二级质谱(MS/MS)。半胱氨酸(蓝色字体)残基表示半胱氨酸羧甲基化。
图3为STING降解剂分子SD02的降解活性及其机制，其中(A)THP1细胞暴露于不同浓度的SD02(78nM，312nM，1.25μM，5μM，20μM)中，孵育24小时后，通过免疫印迹分析裂解液中的STING水平，使用β-Tubulin作为加载对照。(B)THP1细胞用SD02(2μM)处理16小时，然后继续用MG132(10μM)或MLN7243(1μM)处理额外的8小时，通过免疫印迹分析裂解液中的STING水平，使用β-Tubulin作为加载对照。(C)THP1细胞用SD02(2μM)处理16小时，然后继续用VHL Ligand 2(15μM或20μM)处理额外的8小时，通过免疫印迹分析裂解液中的STING水平，使用β-Tubulin作为加载对照。(D)HEK-293T细胞转染Flag-STING和HA-Ubiquitin 24小时，然后用SD02(5μM)处理20小时。随后，细胞用MG132(10μM)处理4小时，进行共免疫沉淀和免疫印迹分析STING泛素化。
图4为STING降解剂分子SD02对下游信号通路的影响，其中(A)cGAS-STING途径的示意图。CDNs代表环状二核苷酸。(B-E)THP1细胞暴露于不同剂量的SD02(0.25μM，0.5μM，1μM，2μM)中，孵育24小时后，再用25nM的SATE-3',3'-c-di-dAMP处理4小时。(B)制备全细胞裂解液，并进行西方印迹分析，评估总TBK1、磷酸化TBK1(pTBK1-Ser172)、总IRF3、磷酸化IRF3(pIRF3-Ser386)和GAPDH的水平。(C-E)利用实时PCR测量IFN-β、CXCL10和TNF-α的mRNA表达水平，并将其归一化到肌动蛋白表达水平。
图5为STING降解剂分子SD02与STING小分子抑制剂的活性对比，其中(A-C)通过实时PCR分析THP1细胞中IFNβ、CXCL10和TNF-α的mRNA表达水平。细胞在处理2μM SN011或2μMSD02 24小时后，再刺激使用25nM SATE-3',3'-c-di-dAMP处理4小时。mRNA水平经量化，并归一化到肌动蛋白表达水平。(D)THP1细胞中总TBK1、磷酸化TBK1(pTBK1-Ser172)、总IRF3、磷酸化IRF3(pIRF3-Ser386)和GAPDH的水平通过西方印迹分析。细胞在处理2μM SN011或2μM SD02 24小时后，在刺激使用25nM SATE-3',3'-c-di-dAMP处理4小时前，制备全细胞裂解液，并通过西方印迹分析评估蛋白水平。(E)THP1细胞中通过生物荧光测定STING途径激活的光度活性。细胞在处理不同剂量的SD02或SN011 24小时后，再刺激使用25nM SATE-3',3'-c-di-dAMP处理12小时。(F)利用CCK8测定法评估THP1细胞中不同剂量的SD02或SN011处理24小时对细胞生长的抑制效应。
图6为SD02的核磁共振氢谱图。
具体实施方式
在以下的说明中，包括某些具体的细节以对各个公开的实施方案提供全面的理解。然而，相关领域的技术人员会认识到，不采用一个或多个这些具体的细节，而采用其它方法、部件、材料等的情况下仍实现实施方案。
除非本申请中另有要求，在整个说明书和所附的权利要求书中，词语“包括”、“包含”、“含有”和“具有”应解释为开放式的、含括式的意义，即“包括但不限于”。
在本公开和所附权利要求书中使用时，除非上下文另有明确规定，否则不带数量指示的单数指称物包括复数指称物。
在整个说明书中提到的“一实施方案”、“实施方案”、“在另一实施方案中”或“在某些实施方案中”意指在至少一实施方案中包括与该实施方案所述的相关的具体参考要素、结构或特征。因此，在整个说明书中不同位置出现的短语“在一实施方案中”或“在实施方案中”或“在另一实施方案中”或“在某些实施方案中”不必全部指同一实施方案。此外，具体要素、结构或特征可以任何适当的方式在一个或多个实施方案中结合。
应当理解，在本公开的说明书和所附的权利要求书中用到的单数形式的冠词“一”(对应于英文“a”、“an”和“the”)包括复数的对象，除非文中另外明确地规定。
定义
因此，除非另有相反的说明，否则说明书及所附权利要求中所用的下列术语具有以下的意思：
本公开中命名的某些化学基团前面所置的简写符号表示在所指示的化学基团存在的碳原子总数。例如，C1-C4烷基描述如下文所定义的具有总共1至4个碳原子的烷基，而C3-C10环烷基描述如下文所定义的具有总共3至10个碳原子的环烷基。简写符号中的碳总数不包含可能存在于所述基团的取代基中的碳。
在本公开中，术语“泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-Proteasome System,UPS)”系指由泛素(ubiquitin,Ub)、泛素活化酶(ubiquitin activating enzyme,E1)、泛素结合酶(ubiquitin conjugating enzyme,E2)、泛素连接酶(ubiquitin protein ligase,E3)、蛋白酶体及其底物(蛋白质)构成系统，是细胞内蛋白质降解的主要途径，参与细胞内80％以上蛋白质的降解。
在本公开中，术语“泛素连接酶E3”系指能够将泛素分子连接到靶蛋白质的某个赖氨酸上的酶。
在本公开中，术语“靶蛋白(Protein of Interest,POI)”系指指体内具有药效功能并能被药物作用的蛋白质
在本公开中，术语“泛素(ubiquitin)”系指一种存在于大多数真核细胞中的小蛋白。其主要功能是标记需要分解掉的蛋白质，使其被水解。
在本公开中，术语“蛋白酶体(proteasome)”系指一种广泛分布于细胞质和细胞核中的多亚基复合物。其约有50种蛋白质亚基组成。其具有多种蛋白水解酶活性，可以降解被泛素标记的靶蛋白。
在本公开中，术语“SP(磺酰基吡啶)”系指磺酰基-二氢吡啶酮，其结构式如下所示：
在本公开中，术语“蛋白降解靶向嵌合体(PROTAC)”系指将降解剂分子可以招募靶蛋白(POI)和泛素连接酶E3，使得靶蛋白(POI)被标记上泛素分子，从而被蛋白酶体识别和降解。
在本公开中，术语“烷基”系指直链或支链的烃链基团，仅由碳与氢原子组成，不含有不饱和键，具有1至12个碳原子，且其通过单键连接至分子的其余部份。在某些实施方案中，烷基具有1至8个碳原子。在某些实施方案中，烷基具有1至6个碳原子。在某些实施方案中，烷基具有1至4个碳原子。烷基的示例性实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基(异丙基)、正丁基、正戊基、1,1-二甲基乙基(叔丁基)、3-甲基己基、2-甲基己基等。
烷基基团可以是任意取代的，亦即取代或未取代的。当被取代时，取代基团是单独地并且独立地选自下列的一个或多个基团：环烃基、芳基、杂芳基、杂脂环基、羟基、烃氧基、芳氧基、巯基、烃硫基、芳硫基、氰基、卤代、羰基、硫代羰基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、S-亚磺酰氨基、N-亚磺酰氨基、C-羧基、O-羧基、异氰酸根合(isocyanato)、氰硫基、异硫氰酸根合(isothiocyanato)、硝基、甲硅烷基、三卤代甲烷磺酰基、-NR’R”(R’和R”为本公开中定义的烷基)或包括单-和二-取代的氨基基团在内的氨基，及其被保护的衍生物。每当取代基被描述为被“任意取代的”时，取代基可被上述取代基之一取代。
在本公开中，术语“亚烷基”本身或作为另一基团的一部分系指烷基的二价形式。
在某些实施方案中，“C1-C6亚烷基”系指含有一至六个碳原子的上述定义的亚烷基基团。C1-C6亚烷基基团可以如对亚烷基基团定义的那样被任意地取代。
在某些实施方案中，“C1-C4亚烷基”系指含有一至四个碳原子的上述定义的亚烷基基团。C1-C4亚烷基基团可以如对亚烷基基团定义的那样被任意地取代。
在本公开中，术语“配体”系指对受体具有识别能力并能与之结合的物质。
在本公开中，术语“药物可接受的”系指必须与制剂的其它成分相容并且不会对其接受者有害的载体、载剂、稀释剂、赋形剂和/或盐。
在本公开中，术语“药物可接受的辅料”包括但不限于已经被美国食品与药品管理局认可的而可用于人类或动物的任何佐剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、香味增强剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、稳定剂、等渗压剂、溶剂或乳化剂等对组成药物组合物无副作用的各种形式的载体。
在本公开中，术语“任意的”或“任意地”意为随后描述的事件或状况可以发生也可以不发生，且说明书包括该事件或状况发生的情况及未发生的情况。
在本公开中，术语“哺乳动物”系指包括例如狗、猫、牛、羊、马和人类等的动物。在某些实施方案中，哺乳动物包括人类。
在本公开中，术语“患者”系指动物(例如，人)、伴侣动物(例如，狗、猫或马)和家畜(例如，牛、猪和羊)。在某些实施方案中，患者是包括雄性和雌性的哺乳动物。在某些实施方案中，患者为人类。
在本公开中，术语“药物组合物”系指本公开中所述的化合物与通常被本领域所接受的将生物活化化合物输送至诸如人类等哺乳动物的介质所形成的制剂。这样的介质包括所有药物可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在本公开中，术语“治疗有效量”指改善、减弱或消除特定疾病或病况和特定疾病或病况的症状、或者避免或延迟特定疾病或病况或者特定疾病或病况的症状的发病的化合物或化合物组合的量。根据化合物、疾病状态及其严重性、以及待治疗哺乳动物的年龄、体重等，构成“治疗有效量”的本公开中所述的化合物的量将会不同，但是本领域的技术人员根据其自身的知识以及本公开可以依惯例确定本公开中所述的化合物的量。
本公开所用的“进行治疗”或“治疗”涵盖患有相关疾病或病症的哺乳动物例如人类中治疗相关的疾病或疾病状态，并且包括：
(i)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中发生，尤其是当该哺乳动物易感于所述疾病状态，但尚未被诊断出患有这种疾病状态时；
(ii)抑制疾病或疾病状态，即阻止其发生；或者
(iii)缓解疾病或疾病状态，即使疾病或疾病状态消退或不进展。
正如本公开所用的那样，术语“疾病”和“疾病状态”可以相互交换使用，或者可以是不同的，因为特殊的疾病或疾病状态可能并没有已知的致病因子(因此不能用病因学解释)，因此其不被公认为是疾病，而是被认为是不期望的疾病状态或病症，其中临床医生已经鉴定出或多或少的特定系列的症状。
本发明用于泛素-蛋白酶体系统中对靶蛋白进行降解的化合物，其结构通式如式I所示：
Ra-linker-SP-linker-Rb式I；
其中，Ra为E3泛素连接酶配体；Rb为靶蛋白配体；SP为磺酰基吡啶，化学结构式如式Ⅱ所示：
以及linker选自琥珀酸酐基、戊二酸酐基、-CO-R1-CO-或-NH-R2-CO-，其中，R1和R2各自独立地选自任意取代的C1-C6亚烷基。
在某些实施方案中，能够用于本公开的E3泛素连接酶配体的示例性实例包括但不限于VHL配体、mdm2配体、clAP1配体或CRBN配体。
在某些实施方案中，能够用于本公开的VHL配体的示例性实例包括但不限于如式Ⅲ1、式Ⅲ2或Ⅲ3所示化合物：
在某些实施方案中，能够用于本公开的mdm2配体的示例性实例包括但不限于如式Ⅲ4或式Ⅲ5所示化合物：
在某些实施方案中，能够用于本公开的clAP1配体的示例性实例包括但不限于如式Ⅲ6、式Ⅲ7或式Ⅲ8所示化合物：
在某些实施方案中，能够用于本公开的CRBN配体的示例性实例包括但不限于如式Ⅲ9、Ⅲ10或式Ⅲ11所示化合物：
在某些实施方案中，能够用于本公开的靶蛋白配体的示例性实例包括但不限于干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes,STING)配体。
在某些实施方案中，能够用于本公开的靶蛋白配体的示例性实例包括但不限于式Ⅳ所示化合物：
在某些实施方案中，用于泛素-蛋白酶体系统中对靶蛋白进行降解的化合物的结构式如式I1或式I2所示：
下面结合具体实施例进行说明。
STING降解剂(SD02)的制备
合成路线为：
将4-氟苯磺酰氯(3.04克，15.68毫摩尔)在二氯甲烷(20毫升)中加入2-氨基-4-硝基苯酚(2.00克，13.0毫摩尔)和吡啶(1.54克，19.5毫摩尔，1.57毫升)溶液中，滴加到0摄氏度时的二氯甲烷(40毫升)中。反应混合物在室温下搅拌12小时。溶剂挥发后，残渣经过硅胶快速柱层析(正己烷：乙酸乙酯＝4：1)纯化，得到化合物2(2.7克，收率67％)的黄色固体。
将化合物2(1.5克，4.8毫摩尔)的甲醇(15毫升)溶液加入10％Pd/C(0.1克)中。反应混合物在室温下经H2搅拌12小时。溶剂用Celite填充。溶剂挥发后，残渣得到化合物3(1.4克)的黄色固体。
将化合物3(1.98克)和咪唑(458毫克)的二氯甲烷(20毫升)溶液滴加到0摄氏度的二氯甲烷(2毫升)中的TBSCl(1.0克)的溶液中。反应混合物在室温下搅拌12小时。溶剂挥发后，残渣经过硅胶快速柱层析(二氯甲烷：甲醇＝10：1)纯化，得到化合物4(2.3克，收率83％)的红色固体。
将化合物4(740毫克)加入0摄氏度的4-联苯甲酸(370毫克)溶液中。反应混合物在室温下搅拌12小时。溶剂挥发后，粗品化合物5出现为红色固体。
将化合物5(630毫克)的二氯甲烷(15毫升)溶液滴加入0摄氏度的TBAF(1摩尔/升)在THF(1.2毫升)中的溶液。反应混合物在室温下搅拌4小时。溶剂挥发后，残渣经过硅胶快速柱层析(正己烷：乙酸乙酯＝5：1)纯化，得到化合物6(250毫克，收率50％)的白色固体。
将6-[(6-氧代-1H-吡啶-3-羧酰)氨基]己酸(500毫克)，EDCI(460毫克)和DAMP(40毫克)的DMF(10毫升)溶液滴加到0摄氏度的化合物6(925毫克)中。反应混合物在室温下搅拌12小时。溶剂挥发后，残渣经过硅胶快速柱层析(二氯甲烷：甲醇＝50：1)纯化，得到化合物7(1.2克，收率86％)的白色固体。
将3-(氯磺酰)苯甲酰氯(574毫克)和三乙胺(560微升)混合在二氯甲烷(10毫升)中，滴加到0摄氏度的二氯甲烷(10毫升)中的叔丁基(3-氨基丙基)氨甲酸酯(418毫克)的溶液中。反应混合物在0摄氏度下搅拌1小时。溶剂挥发后，残渣经过硅胶快速柱层析(二氯甲烷：乙酸乙酯＝8：1)纯化，得到化合物8(868毫克，收率96％)的无色油状物。
将化合物7(50毫克)和三乙胺(200微升，1.44毫摩尔)的二氯甲烷(2毫升)和DMF(0.5毫升)溶液中，滴加化合物8(108毫克，0.29毫摩尔)的二氯甲烷(2毫升)溶液。反应混合物在室温下搅拌2小时。溶剂挥发后，残渣经过HPLC纯化，得到化合物9(26毫克，收率35％)的褐色固体。
将化合物9(26毫克)的甲醇(1毫升)溶液滴加到0摄氏度的甲醇(5毫升)中的HCl(4摩尔/升)溶液中。反应混合物在室温下搅拌6小时。溶剂挥发后，残渣经过HPLC纯化，得到化合物10(25毫克)的褐色固体。
将化合物10(15毫克)，EDCI(3.7毫克)和DAMP(0.4毫克)的DMF(1毫升)溶液滴加到0摄氏度的接有丁二酸基的VHL Ligand 2(15毫克)中。反应混合物在室温下搅拌12小时。溶剂挥发后，残渣经过HPLC纯化，得到SD02(5.4毫克，收率23％)的褐色固体。HRMS(ESI-TOF)计算质量为[M+H]C74H79FN10O15S3，1463.49453，实际测得为1463.49243。参见图6，取5mgSD02分子，溶解于DMSO-d6。将样品置于400MHz核磁中扫描氢谱，得到如下数据：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.67(d,J＝7.3Hz,1H),8.98(s,1H),8.87-8.73(m,1H),8.43(d,J＝2.0Hz,1H),8.39-8.23(m,2H),8.18(t,J＝5.6Hz,1H),8.12-7.93(m,9H),7.90-7.72(m,10H),7.51(td,J＝7.8,2.7Hz,3H),7.47-7.31(m,8H),6.33(d,J＝9.6Hz,1H),4.90(dd,J＝7.4,2.5Hz,1H),4.50-4.31(m,2H),4.24(d,J＝4.5Hz,1H),3.34-3.31(m,3H),3.23-3.05(m,5H),2.45(s,3H),2.06-1.93(m,3H),1.70(ddt,J＝18.9,12.2,5.9Hz,3H),1.56-1.43(m,5H),1.35(dd,J＝6.9,3.8Hz,3H),1.31-1.18(m,3H),0.87(s,9H)..
证实了SD02的结构式如式I1所示：
蛋白表达和纯化
蛋白序列：>SH-SUMO-STING(141-379)
MNWSHPQFEKSSGSSGGGTHHHHHHGGSGGSGLQMSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGENLYFQGAPAEISAVCEKGNFNVAHGLAWSYYIGYLRLILPELQARIRTYNQHYNNLLRGAVSQRLYILLPLDCGVPDNLSMADPNIRFLDKLPQQTGDHAGIKDRVYSNSIYELLENGQRAGTCVLEYATPLQTLFAMSQYSQAGFSREDRLEQAKLFCRTLEDILADAPESQNNCRLIAYQEPADDSSFSLSQEVLRHLRQEEKEEVTVGSLKTSAVPSTSTMSQEPELLISGMEKPLPLRTDFS.
使用大肠杆菌BL21(DE3)pLyS菌株表达SUMO-STING蛋白。质粒转染的大肠杆菌菌株被涂布在含有K+和C+的LB琼脂平板上，并在37℃下孵育过夜。选择单克隆并转移到含有K+和C+的LB液体培养基中，在摇床上生长。当培养基的OD600达到0.4～0.6时，将摇床冷却到18℃。然后加入0.3mM的IPTG，并在18℃和160rpm的条件下继续摇床培养24小时。利用离心将细胞团沉淀，以6,500rcf的速度在4℃下离心10分钟，并将其在-20℃下保存以备后续使用。
为了提取蛋白质，收获的细胞在含有溶解缓冲液(25mM HEPES，250mM NaCl，5％甘油，pH 8.0)的条件下重悬，缓冲液中添加1mg/mL的DNA酶、5mM的MgCl2和1mM的PMSF。然后使用超声波处理溶液30分钟，接着以40,000rcf的速度在4℃下离心30分钟。经过0.45μm的滤膜过滤后收集上清液。蛋白质经过镍亲和层析柱纯化，然后进行脱盐。脱盐后的蛋白质再经过STREP-TACTIN XT填充柱的二次纯化。洗脱液中含有纯化后的SUMO-STING蛋白质，存储在-80℃下以备后续实验使用。所有的纯化步骤在4℃下进行，并使用SDS-PAGE对洗脱的蛋白质进行分析。
免疫印迹和免疫沉淀
对于免疫印迹，细胞裂解液在10％SDS-PAGE凝胶中分离，随后转移到硝酸纤维素膜上。膜在TBST缓冲液(含有0.1％Tween-20的三氯化钠缓冲盐水)中用5％BSA进行阻断处理，然后在指定的一抗抗体下于4℃下孵育过夜。膜经过三次用TBST缓冲液洗涤后，在室温下与适当的HRP偶联的二抗抗体孵育1小时。孵育和洗涤后，通过显影剂暴露蛋白条带，并使用e-BLOT进行检测。
对于免疫沉淀，HEK293T细胞以每孔4×10^5个细胞的密度在6孔板上过夜培养。第二天，使用lipofectamine 3000(Thermo Fisher)向每孔加入2μg的质粒。48小时后，细胞用DMSO或5μM的SD02处理24小时，并添加5μM的MG132以阻断SD02诱导的STING降解。然后将细胞在含有免疫沉淀(IP)裂解缓冲液(25mM Tris-HCl pH 7.4，150mM NaCl，1mM EDTA，1％Triton X-100，和5％甘油)中裂解，并加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液，在4℃下旋转30分钟。通过以12000rpm的速度在4℃下离心10分钟来清除裂解液，得到上清液。使用BCA蛋白定量试剂盒(Elabscience)测量总蛋白浓度。从上清液中取出50μg作为输入样品。将1μg的anti-DDDDK标签抗体(ProteinTech)加入上清液(100μg)中，在4℃下旋转孵育过夜。加入Protein A琼脂糖珠(ThermoFisher)与蛋白复合物旋转孵育2小时，随后用冰冷PBS洗涤三次。将蛋白质在含有40μL SDS装载缓冲液中煮沸10分钟，样品在SDS-PAGE凝胶上进行分析。凝胶按照上述免疫印迹方法进行处理。
荧光素酶检测
将THP1 Lucia细胞(5-10×10^4个细胞/孔)播种到96孔细胞培养板中。以新鲜培养基准备不同浓度的SN011或SD02(10mM)。药物孵育24小时后，将细胞用25nM的SATE-3',3'-c-di-dAMP处理12小时。然后，将96孔板每个孔中的10μL转移到一个96孔白板中。在向每个孔中加入QUANTI-LucTM试剂后，使用带自动进样器的微孔阅读器测量细胞的荧光素酶活性。
MS/MS(质谱/质谱)
用去盐柱(PD SpinTrap G-25)将SUMO-STING的缓冲液替换为PBS。然后使用纳米分光光度计测量蛋白质，以计算物质的摩尔浓度。实验中SD02与蛋白质的比例为2:1。反应在室温下摇动24小时。反应结束后，使用去盐柱将反应液的缓冲液替换为H2O。然后，将样品分离在10％SDS-PAGE凝胶中，凝胶用考马斯亮蓝R-250染色溶液染色，然后用脱色溶液(10％醋酸，5％乙醇)脱色。之后，将凝胶上的目标条带切成小块，并用脱色溶液(25mMNH4HCO3，30％ACN)脱色，直到胶块透明。然后，将胶块与56℃的10mM DTT/25mM NH4HCO3孵育1小时，与室温下60mM IAA/25mM NH4HCO3暗处理30分钟。反应结束后，在37℃下加入25mMNH4HCO3溶液和2μg胰蛋白酶孵育过夜。第二天，用0.1％FA水和0.1％FA乙腈收集上清液。然后，在室温下使用离心浓缩仪将上清液旋干，用于MS/MS分析。
实时荧光定量PCR
THP1 Lucia细胞在药物处理后孵育24小时，然后与SATE-3',3'-c-di-dA MP共同孵育4小时。对于对照实验，细胞接受SN011(2μM)和SD02(2μM)的处理。对于剂量依赖性实验，细胞接受不同浓度的SD02处理(0.25nM、0.5nM、1μM、2μM)。收获细胞后，使用RNAex Pro试剂按照生产厂家的指示从每个样本中提取RNA。然后使用Evo M-MLV逆转录试剂预混物将RNA逆转录为DNA。使用Green Pro Taq HS预混合qPCR试剂盒和基因特异性引物扩增DNA。使用Q5荧光定量PCR仪器进行荧光实时PCR分析，进行三次重复。相对表达量被归一化到Actin水平。用于该实验所需的qPCR引物序列如下：IFN-β：5′-AGCACTGGCTGGAATGAGAC-3′和5′-TTTCGGAGGTAACCTGTAAG-3′；IP10：5′-TGGCATTCAAGGAGTACCTC-3′和5′-TTGTAGCAATGATCTCAACACG-3′；TNF-α：5′-CCTCTCTCTAATCAGCCCTCTG-3′和5′-GAGGACCTGGGAGTAGATGAG-3′；IL-6：5′-ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG-3′和5′-CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG-3′。
细胞存活率测定
THP1 Lucia细胞(每孔5-10×10^4个细胞)被种植在96孔细胞培养板中。SN011或SD02的库存溶液(10mM)在新鲜培养基中稀释得到不同浓度，并加入细胞中进行24小时的孵育。孵育后，加入CCK-8试剂(每孔10μL)并再次孵育1小时。使用微孔阅读器在450nm处测量每个孔的吸光度。类似地，293T细胞(每孔5-10×10^3个细胞)被种植在96孔细胞培养板中，并进行相同的操作程序。
微尺度热传导(MST)
使用Monolith NT 115仪器评估小分子(SN011和SD02)与纯化的SUMO-STING蛋白的结合亲和力。实验进行了三次重复。SUMO-STING蛋白样品在PBS中使用NT-647-NHS染料标记，混合溶液在室温下暗处孵育30分钟。随后，使用B柱纯化标记的蛋白，并通过调整浓度来优化激发，以获得超过200个计数的荧光强度。标记的样品以最终浓度40nM在含有0.05％Tween 20的PBS缓冲液中使用。MST设置如下：药物浓度(20μM)，最大MST功率(100％)，激光开启时间(20秒)，激光关闭时间(1秒)，温度控制(25℃)。最后，使用MO.Affinity Analysis软件包对数据进行分析。
结论
STING作为一个关键的信号中心，在检测到细胞内的细菌、病原体或自体DNA后诱导I型干扰素(IFN)反应。研究证据表明，失调的STING介导的干扰素产生直接导致了多种疾病，包括STING相关婴儿期起病的血管病(SAVI)、全身性红斑狼疮(SLE)和Aicardi Goutières综合征(AGS)等。因此，开发抑制STING信号通路的方式对于治疗与STING过度活化相关的疾病具有巨大潜力。为了实现这一目标，本发明高效且选择性的STING抑制剂(SN011)作为靶向2'3'-cGAMP结合口袋的STING配体，作为PROTAC的一部分。至于E3连接酶基团，本发明选择了VHL Ligand 2，这种连接酶基团被广泛应用于招募von Hippel-Lindau(VHL)蛋白。为了促进对靶蛋白质进行配体导向的磺酰化修饰，本发明采用了N-磺酰基吡啶作为反应基团，该基团具有选择性地与酪氨酸或赖氨酸残基发生反应。
通过在大肠杆菌中表达了人STING的C端结构域(140-379)，并使用串联亲和标签进行纯化。亲和力结果表明，SD02的VHL Ligand 2组分并不降低SN011的亲和力。为了确认SD02对STING的标记活性，将STING与SD02一起孵育，并通过胰蛋白酶消化和液相色谱质谱分析(LC/MS/MS)分析产生的胰蛋白酶消化肽段。参见图3，从SD02与STING的197位酪氨酸残基共价结合的二级质谱(MS/MS)，可以看出，VHL Ligand 2分子成功修饰在酪氨酸197位点。
参见图3，为了评估SD02在诱导降解方面的功效，本发明进行了免疫印迹实验，分析THP1细胞中STING蛋白的水平。本发明的结果显示，SD02处理导致STING水平呈剂量依赖性下降。为了进一步了解SD02诱导降解的机制，本发明研究了在THP1细胞中与NEDD8活化酶E1抑制剂MLN4924和蛋白酶抑制剂MG132共同处理对STING降解的影响。本发明观察到这种共同处理显著阻断了STING的降解。类似地，与VHL配体VHL Ligand 2的共同处理也抑制了SD02诱导的STING降解。为了确认SD02能够诱导STING的泛素化，本发明在HEK293T细胞中进行了泛素化实验。细胞共转染了带有FLAG标签的STING表达载体和HA标签的泛素表达载体，并在有无MG132的情况下用SD02处理。用抗FLAG抗体免疫沉淀细胞裂解液中的STING蛋白，然后用抗HA抗体进行印迹，结果显示，在MG132存在的情况下，SD02显著诱导了STING蛋白的多泛素化。综合这些结果表明，SD02通过泛素-蛋白酶体系统有效降解了STING蛋白。
参见图4，细胞内的环状二核苷酸(CDNs)，如c-di-AMP和c-di-GAMP，会被STING蛋白所识别。在识别后，STING启动下游的TBK1-IRF3信号通路，导致TBK1和IRF3的磷酸化。磷酸化的IRF3随后形成二聚体并转位到细胞核，触发相关基因的表达。为了激活STING-TBK1-IRF3信号通路，本发明使用了SATE-3',3'-c-di-dAMP，这是一种强效的STING激动剂。
为了研究STING降解的下游效应，本发明对用SD02处理的THP1细胞进行了一系列实验。首先，本发明进行了免疫印迹分析，评估SD02对SATE-3',3'-c-di-dAMP诱导的TBK1和IRF3磷酸化的影响。如预期，SD02表现出剂量依赖性地降低TBK1和IRF3的磷酸化水平。
此外，本发明采用实时定量PCR(qPCR)评估了THP1细胞中干扰素相关基因(IFN-β，CXCL10和TNF-α)的表达水平。在进行SATE-3',3'-c-di-dAMP处理之前，细胞被不同浓度的SD02处理24小时，随后暴露于SATE-3',3'-c-di-dAMP 4小时。如预期，SATE-3',3'-c-di-dAMP显著增加了干扰素相关基因的mRNA水平。值得注意的是，SD02表现出剂量依赖性地降低了SATE-3',3'-c-di-dAMP诱导的这些上调基因的表达水平。
参见图5，为了比较STING抑制剂(SN-011)和降解剂(SD02)的效果，本发明进行了一系列实验，包括qPCR和免疫印迹分析。在将THP1细胞分别用2μM的SN-011和SD02处理24小时后，本发明进一步用SATE-3',3'-c-di-dAMP处理细胞6小时。本发明的结果显示，SN-011和SD02都降低了SATE-3',3'-c-di-dAMP诱导的干扰素相关基因的mRNA水平，其中SD02的抑制效果较SN-011弱。
本发明还发现，类似于SN-011，SD02通过免疫印迹分析抑制了SATE-3',3'-c-di-dAMP诱导的TBK1和IRF3的磷酸化。为了进一步确认这些结果，本发明使用THP-1Lucia ISG细胞进行了荧光素酶报告基因实验。在将细胞分别用不同浓度的SN-011和SD02处理24小时后，本发明进一步用25nM的SATE-3',3'-c-di-dAMP处理细胞12小时。在THP-1Lucia ISG细胞中，SD02和SN-011在纳摩尔浓度下都能有效阻断SATE-3',3'-c-di-dAMP诱导的荧光素酶分泌，其IC50值分别为604nM和383nM。值得注意的是，2μM浓度下的SD02抑制率低于SN011，这与先前的发现一致。此外，本发明还采用CCK8实验评估了SD02和SN011对THP1、U937和U2OS细胞的细胞生长抑制作用。即使在高浓度下，SD02也不会妨碍细胞增殖，而SN011表现出强烈的抑制效应。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.用于泛素-蛋白酶体系统中对靶蛋白进行降解的化合物，其特征在于，所述化合物的结构通式如式I所示：
Ra-linker-SP-linker-Rb式I；
其中，Ra为E3泛素连接酶配体；Rb为靶蛋白配体；SP为磺酰基吡啶，化学结构式如式Ⅱ所示：
以及linker选自琥珀酸酐基、戊二酸酐基、-CO-R1-CO-或-NH-R2-CO-，其中，R1和R2各自独立地选自任意取代的C1-C6亚烷基。
2.如权利要求1所述的用于泛素-蛋白酶体系统中对靶蛋白进行降解的化合物，其特征在于，所述E3泛素连接酶配体选自VHL配体、mdm2配体、clAP1配体或CRBN配体。
3.如权利要求1所述的用于泛素-蛋白酶体系统中对靶蛋白进行降解的化合物，其特征在于，所述E3泛素连接酶配体选自如式Ⅲ1至式Ⅲ11所示化合物中的任意一种：
4.如权利要求1所述的用于泛素-蛋白酶体系统中对靶蛋白进行降解的化合物，其特征在于，所述靶蛋白配体选用干扰素基因刺激因子配体。
5.如权利要求1所述的用于泛素-蛋白酶体系统中对靶蛋白进行降解的化合物，其特征在于，所述靶蛋白配体选用式Ⅳ所示化合物：
6.如权利要求1至5中任一项所述的用于泛素-蛋白酶体系统中对靶蛋白进行降解的化合物，其特征在于，所述化合物的结构式如式I1或式I2所示：
7.如权利要求1至6中任一项所述的化合物在制备用于泛素-蛋白酶体系统的靶蛋白降解剂中的应用。
8.如权利要求1至6中任一项所述的化合物在制备治疗STING过度激活导致的自身免疫性疾病药物中的应用。
9.药物组合物，其特征在于，包含如权利要求1至6中任一项所述的化合物。
10.如权利要求6所述的化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将4-氟苯磺酰氯在二氯甲烷中加入2-氨基-4-硝基苯酚和吡啶溶液中，滴加到0摄氏度时的二氯甲烷中，反应混合物在室温下搅拌12小时，溶剂挥发后，残渣经过硅胶快速柱层析，得到化合物2；
(2)将化合物2的甲醇溶液加入10％Pd/C中，反应混合物在室温下经H2搅拌12小时，溶剂用Celite填充，溶剂挥发后，得到化合物3；
(3)将化合物3和咪唑的二氯甲烷溶液滴加到0摄氏度的二氯甲烷中的TBSCl的溶液中，反应混合物在室温下搅拌12小时，溶剂挥发后，残渣经过硅胶快速柱层析纯化，得到化合物4；
(4)将化合物4加入0摄氏度的4-联苯甲酸溶液中，反应混合物在室温下搅拌12小时，溶剂挥发后，得到化合物5；
(5)将化合物5的二氯甲烷溶液滴加入0摄氏度的TBAF在THF中的溶液，反应混合物在室温下搅拌4小时，溶剂挥发后，残渣经过硅胶快速柱层析纯化，得到化合物6；
(6)将6-[(6-氧代-1H-吡啶-3-羧酰)氨基]己酸，EDCI和DAMP的DMF溶液滴加到0摄氏度的化合物6中，反应混合物在室温下搅拌12小时，溶剂挥发后，残渣经过硅胶快速柱层析纯化，得到化合物7；
(7)将3-(氯磺酰)苯甲酰氯和三乙胺混合在二氯甲烷中，滴加到0摄氏度的二氯甲烷中的叔丁基(3-氨基丙基)氨甲酸酯的溶液中。反应混合物在0摄氏度下搅拌1小时。溶剂挥发后，残渣经过硅胶快速柱层析纯化，得到化合物8；
(8)将化合物7和三乙胺的二氯甲烷和DMF溶液中，滴加化合物8的二氯甲烷溶液，反应混合物在室温下搅拌2小时，溶剂挥发后，残渣经过HPLC纯化，得到化合物9；
(9)将化合物9的甲醇溶液滴加到0摄氏度的甲醇中的HCl溶液中，反应混合物在室温下搅拌6小时，溶剂挥发后，残渣经过HPLC纯化，得到化合物10；
(10)将化合物10，EDCI和DAMP的DMF溶液滴加到0摄氏度的接有丁二酸基的VHL Ligand2中，反应混合物在室温下搅拌12小时，溶剂挥发后，残渣经过HPLC纯化，得到式I1所示的化合物。
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