CN117125839A - 一种利用微藻-真菌共生体清除污水中微塑料的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用微藻‑真菌共生体清除污水中微塑料的方法，属于污水处理技术领域。包括以下步骤：将米曲霉接种到马铃薯液体培养基中进行摇床培养，得到菌丝球；将菌丝球与小球藻按照干重比1∶2的比例放入污水中进行培养。本发明利用微藻和真菌对微塑料的降解作用以及二者形成的共生体对微塑料的吸附，快速实现对污水中微塑料的清除。与微藻或真菌单独处理微塑料相比，微藻‑真菌共生体具备更高的微塑料去除效率和更好的污水处理效果，并有利于微藻的收获，是一种较为综合且应用潜力较大的污水处理方法。
Description
技术领域
本发明属于污水处理技术领域，尤其涉及一种利用微藻-真菌共生体清除污水中微塑料的方法。
背景技术
微塑料(MPs)广义上指粒径小于5mm的塑料颗粒或碎片，近年来随着塑料制品的大量使用，微塑料污染情况愈发严峻，目前已被列为新兴污染物之一。人们已经在全球范围的各种地域、环境介质、生物体组织甚至人体的粪便和血液中检测到了一定浓度的微塑料，这种广泛存在性加之难以降解性、很强的迁移性及其与生物和非生物环境可能存在的相互作用，引起了人们的广泛关注。大量的生物短期暴露实验也不断证明，微塑料体内累积会对生物体产生多方面的影响，细小的微塑料可能穿过生物组织，进入循环系统，进而难以从生物体中排出，具有潜在的健康风险。
市政污水水质复杂，其中包括大量的塑料制品和塑料纤维等，污水中微塑料的主要成分是聚乙烯、聚丙烯和聚苯乙烯，为实现污水再生利用，解决水资源与能源危机等问题，需探究一种污水处理技术，实现对污水中微塑料的高效转化和清除。近年来我国污水处理厂的工艺技术对微塑料进行了较为有效的去除，在某些研究中，污水经过三级处理后对微塑料的去除率可达90％以上，然而仍未被去除的微塑料中小粒径的微塑料(25-190μm)存在的比例最大，这表明阻止小粒径微塑料逃逸到水生环境中仍然很困难，而它们可能通过吸附小分子或微生物生物膜对人类和动物健康构成更大的威胁，因此需要开发一种高效的方法清除污水中的微塑料。
微塑料的真菌降解具有突出的潜力，丝状真菌等还可以在短时间内通过絮凝或吸附作用实现对水体中微塑料的去除。上世纪50年代，便有学者将微藻应用于废水处理的过程中，由于微藻本身的生存环境，决定了其适用于处理含有混合营养的污水，近年来利用微藻去除微塑料的研究不断出现，已成为一种在污水中去除微塑料的有效策略。然而真菌和微藻对微塑料的去除存在效率低、对小粒径微塑料难以去除，同时存在藻类回收困难等问题。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明提出了一种利用微藻-真菌共生体清除污水中微塑料的方法。该方法能够实现污水中微塑料的高效清除，同时促进微藻生物质的快速回收利用。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种利用微藻-真菌共生体清除污水中微塑料的方法，包括以下步骤：将米曲霉接种到马铃薯液体培养基中进行摇床培养，得到菌丝球；将菌丝球与小球藻按照干重比1∶2的比例放入污水中进行培养。
进一步地，所述米曲霉接种前在28℃、好氧条件下活化处理3-4天。具体为：使用酒精灯和镊子将冻干管打开，并吸取0.5mL无菌水打入冻干管，充分溶解后混匀，得到菌悬液；吸取0.2mL菌悬液打入平板中，涂布均匀，重复两次获得两个平板；将平板全部置于28℃、好氧条件下培养3-4天，菌种长出即可使用。
进一步地，所述米曲霉接种后摇床培养条件为：温度28±1℃，转速140rpm，时间2-3天。
进一步地，使用前将小球藻接种到BG11培养基中培养，具体为：配置BG11培养基，于灭菌锅进行高温灭菌，将培养至对数期的小球藻细胞沉淀至锥形瓶底部，倒掉上清液，用无菌水洗涤小球藻细胞2到3次，再将小球藻静置沉淀后，接种到锥形瓶中。培养条件为：光照培养箱，25℃、光照强度为3300lx、光暗比12∶12，每天手动振荡2-3次，培养时间为2个月左右。
进一步地，在污水中的培养条件为：28±1℃，转速150rpm，光照强度4000lx。
进一步地，所述污水中的微塑料为聚乙烯(PE)或聚丙烯(PP)，平均粒径为50μm，投加浓度为50mg/L。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：
本发明提供了一种利用微藻-真菌共生体清除污水中微塑料的方法，利用微藻和真菌对微塑料的降解作用以及二者形成的共生体对微塑料的吸附，快速实现对污水中微塑料的清除。与微藻或真菌单独处理微塑料相比，微藻-真菌共生体具备更高的微塑料去除效率和更好的污水处理效果，并有利于微藻的收获，是一种较为综合且应用潜力较大的污水处理方法。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明中所述的“室温”如无特别说明，均按25±2℃计。
本发明以下实施例所用原料均为市售所得。所用米曲霉购自广州铭安生物科技有限公司，微塑料购自东莞市樟木头特塑朗化工原料经营部，小球藻购自青岛科创天地生物科技有限公司。
本发明试图构建一种微藻和真菌的共生体，二者的协同作用能够高效地清除污水中的微塑料，同时实现对污水的深度脱氮除磷以及微藻的生物质回收。利用微藻-真菌共生体清除污水中的微塑料，同时解决废水资源化处理等问题符合我国节能减排的战略需求，同时这也与我国大力推动碳中和、碳排放的目标高度耦合，具有可观的发展与良好的经济前景。具体技术方案为：
一种利用微藻-真菌共生体清除污水中微塑料的方法，包括以下步骤：
(1)微藻的预培养：将实验室保存的小球藻(Chlorellavulgaris)接种于多个灭菌后的BG11培养基中，(具体为：配制BG11培养基，于灭菌锅进行高温灭菌，将培养至对数期的小球藻细胞沉淀至锥形瓶底部，倒掉上清液，用无菌水洗涤小球藻细胞2到3次，再将小球藻静置沉淀后，接种到锥形瓶中)，将接种后的小球藻置于光照培养箱中培养，之后转入含有微塑料的模拟市政污水中；
(2)真菌的预培养：米曲霉(Aspergillus oryzae)于28℃、好氧条件下进行活化后使用；
(3)藻类-真菌共生系统的建立：将步骤(2)中得到的米曲霉接种到马铃薯液体培养基中，一定条件下摇床培养，待成为一定粒径的菌丝球后转入含有小球藻及微塑料的模拟市政污水中。
在本发明以下实施例步骤(1)中，模拟市政污水的配比为：葡萄糖188.5mg、NH4Cl191mg、KH2PO434mg、MgSO4·7H2O 55mg、K2SO445mg、NaCl 45mg、NaHCO345mg、Na2CO345mg、MnSO40.1mg、Fe2(SO4)30.1mg、CuSO4·5H2O0.1mg。所述模拟市政污水中的微塑料为聚乙烯(PE)或聚丙烯(PP)，平均粒径为50μm，投加浓度为50mg/L。
在本发明以下实施例步骤(1)中，小球藻在BG11培养液中的培养条件为：光照培养箱，25℃、光照强度为3300lx，光暗比12∶12，培养时间为2个月。
在本发明以下实施例步骤(1)中，小球藻在市政污水中培养条件为：恒温振荡培养箱，28±1℃，150rpm，光照强度4000lx。
在本发明以下实施例步骤(2)中，米曲霉的活化步骤具体如下：①准备2个平板；②安全柜中打开，用酒精灯灼烧冻干管顶部后迅速滴上无菌水使之破裂，随后用镊子将其敲碎；③吸取0.5mL无菌水打入冻干管，充分溶解后，混匀得到菌悬液；④吸取0.2mL菌悬液打入平板中，涂布均匀，重复两次获得两个平板；⑤将平板全部置于28℃、好氧条件下培养3-4天，菌种长出即可使用。活化后的米曲霉的培养条件为：PDA培养基，28℃恒温培养箱，培养时间为3-4天。
在本发明以下实施例步骤(3)中，用于菌丝培养时的孢子悬液在620nm下的吸光值为36，接种量为0.9mL。
在本发明以下实施例步骤(3)中，米曲霉接种到马铃薯液体培养基后的培养条件：恒温振荡培养箱，28±1℃，140rpm，培养时间为2-3天。菌丝球的粒径范围为：3-4mm。
在本发明以下实施例步骤(3)中，最终模拟市政污水中菌丝球与小球藻的干重比为1∶2，培养条件为：恒温振荡培养箱，28±1℃，150rpm，光照强度4000lx。
以下实施例作为本发明技术方案的进一步说明。
实施例1
一种利用微藻-真菌共生体清除污水中聚乙烯(PE)的方法，污水中聚乙烯的平均粒径为50μm，浓度为50mg/L，步骤如下：
(1)微藻的预培养：将小球藻(Chlorellavulgaris)接种于BG11培养基(具体为：配制BG11培养基，于灭菌锅进行高温灭菌，将培养至对数期的小球藻细胞沉淀至锥形瓶底部，倒掉上清液，用无菌水洗涤小球藻细胞2到3次，再将小球藻静置沉淀后，接种到锥形瓶中)将接种后的小球藻置于光照培养箱中培养，培养条件为：25℃、光照强度为3300lx、光暗比12∶12，培养时间为2个月，得到呈对数期增长的小球藻；
(2)真菌的预培养：米曲霉(Aspergillus oryzae)于28℃、好氧条件下活化3天；
用于菌丝培养时的孢子悬液在620nm下的吸光值为36，接种量依据以下公式计算为0.9mL；
将PDA培养基在115℃的高温条件下灭菌30min，冷却至室温，向250mL的锥形瓶中加入100mL的培养基，接种活化后的米曲霉悬液0.9mL，封口后置于140rpm恒温振荡箱中培养2天，制得新鲜的菌丝球；
(3)藻类-真菌共生系统的建立：当米曲霉成长为粒径在3-4mm的菌丝球时，按照菌丝球与小球藻干重比为1∶2的比例，取若干菌丝球转入含有小球藻和聚乙烯的模拟市政污水中(小球藻与聚乙烯的用量关系为：取100mL呈对数期增长的小球藻液转入300mL含有15mg聚乙烯的模拟市政污水中)，在恒温振荡培养箱中以28±1℃、150rpm、光照强度4000lx的条件培养3天，在该过程中，米曲霉菌丝球吸附污水中小球藻细胞及聚乙烯从而实现微藻-真菌共生体对微塑料聚乙烯的去除，并有利于小球藻的收获及其生物质的利用。
实施例2
一种利用微藻-真菌共生体清除污水中聚丙烯(PP)的方法，污水中微塑料的平均粒径为50μm，投加浓度为50mg/L，步骤如下：
(1)微藻的预培养：将小球藻(Chlorellavulgaris)接种于BG11培养基(具体为：配制备BG11培养基，于灭菌锅进行高温灭菌，将培养至对数期的小球藻细胞沉淀至锥形瓶底部，倒掉上清液，用无菌水洗涤小球藻细胞2到3次，再将小球藻静置沉淀后，接种到锥形瓶中)将接种后的小球藻置于光照培养箱中培养，培养条件为：25℃、光照强度为3300lx、光暗比12∶12，培养时间为2个月，得到呈对数期增长的小球藻后；
(2)真菌的预培养：米曲霉(Aspergillus oryzae)于28℃、好氧条件下活化3天；
用于菌丝培养时的孢子悬液在620nm下的吸光值为36，接种量依据以下公式计算为0.9mL；
将PDA培养基在115℃的高温条件下灭菌30min，冷却至室温，向250mL的锥形瓶中加入100mL的培养基，接种活化后的米曲霉悬液0.9mL，封口后置于140rpm恒温振荡箱中培养2天，制得新鲜的菌丝球；
(3)藻类-真菌共生系统的建立：当米曲霉成长为粒径在3-4mm的菌丝球时，按照菌丝球与小球藻的干重比为1∶2的比例，将菌丝球转入含有小球藻和聚丙烯的模拟市政污水中(小球藻与聚丙烯的用量关系为：取100mL呈对数期增长的小球藻液转入300mL含有15mg聚丙烯的模拟市政污水中)，在恒温振荡培养箱中以28±1℃、150rpm、光照强度4000lx的条件培养3天，在该过程中，米曲霉菌丝球吸附污水中小球藻细胞及聚丙烯从而实现微藻-真菌共生体对微塑料聚丙烯的吸附去除，并有利于小球藻的收获及其生物质的利用。
对照组1
同实施例1，区别在于，不添加菌丝球，即不进行步骤(2)：将100mL呈对数期增长的小球藻液转入300mL含有15mg聚乙烯的模拟市政污水中，在恒温振荡培养箱中以28±1℃、150rpm、光照强度4000lx的条件培养3天后进行指标的检测。
对照组2
同实施例1，区别在于，不添加微藻，即不进行步骤(1)：但按照实施例1中添加菌丝球的数量将其加入300mL含有15mg聚乙烯的模拟市政污水中，在恒温振荡培养箱中以28±1℃、150rpm、光照强度4000lx的条件培养3天后进行指标的检测。
微藻-真菌共生体清除污水中微塑料的结果测试：
将实施例1、实施例2和对照组处理的模拟市政污水进行微塑料、COD、TN和TP的去除率以及微藻生物量和油脂含量进行比较，检测结果如下：
表1
从表1中可以看出，本发明通过构建小球藻和米曲霉的藻菌共生体，既保障了污水处理效果，且较高效率的实现了对污水中微塑料的清除，同时经过处理后的微藻能够进一步提取油脂等生物质，使该微藻-真菌共生体得以充分利用，符合我国节能减排的需求，对于污水中微塑料的清除具有重要的促进意义。
对比例1
同实施例1，区别在于，将米曲霉替换成烟曲霉，分别设定微塑料为聚乙烯和聚丙烯。
利用本对比例的方法去除微塑料，聚乙烯的去除率为88.3％，聚丙烯的去除率为85.1％。
对比例2
同实施例1，区别在于，菌丝球与小球藻的干重比为1∶1，分别设定微塑料为聚乙烯和聚丙烯。
利用本对比例的方法去除微塑料，聚乙烯的去除率为83.9％，聚丙烯的去除率为86.6％。
对比例3
同实施例1，区别在于，污水中微塑料的投加浓度为10mg/L，分别设定微塑料为聚乙烯和聚丙烯。
利用本对比例的方法去除微塑料，聚乙烯的去除率为89.0％，聚丙烯的去除率为84.3％。
以上，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
Claims (6)
1.一种利用微藻-真菌共生体清除污水中微塑料的方法，其特征在于，包括以下步骤：将米曲霉接种到马铃薯液体培养基中进行摇床培养，得到菌丝球；将菌丝球与小球藻按照干重比1∶2的比例放入污水中进行培养。
2.根据权利要求1所述的利用微藻-真菌共生体清除污水中微塑料的方法，其特征在于，所述米曲霉接种前在28℃、好氧条件下活化处理3-4天。
3.根据权利要求1所述的利用微藻-真菌共生体清除污水中微塑料的方法，其特征在于，所述米曲霉接种后摇床培养条件为：温度28±1℃，转速140rpm，时间2-3天。
4.根据权利要求1所述的利用微藻-真菌共生体清除污水中微塑料的方法，其特征在于，使用前将小球藻接种到BG11培养基中培养，具体为：配制BG11培养基，于灭菌锅进行高温灭菌，将培养至对数期的小球藻细胞沉淀至锥形瓶底部，倒掉上清液，用无菌水洗涤小球藻细胞2到3次，再将小球藻静置沉淀后，接种到锥形瓶中。
5.根据权利要求1所述的利用微藻-真菌共生体清除污水中微塑料的方法，其特征在于，菌丝球与小球藻在污水中的培养条件为：28±1℃，转速150rpm，光照强度4000lx。
6.根据权利要求1-5任一项所述的利用微藻-真菌共生体清除污水中微塑料的方法，其特征在于，所述污水中的微塑料为聚乙烯或聚丙烯，平均粒径为50μm，投加浓度为50mg/L。
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