CN117120470A - Pd-1结合蛋白及其医药用途 - Google Patents

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Abstract

提供PD‑1结合蛋白及其医药用途。具体而言，提供PD‑1结合蛋白、PD‑1/LAG‑3结合蛋白及其治疗癌症的方法和制药用途。

Description

PD-1结合蛋白及其医药用途
本申请要求2021年3月10日提交的中国专利申请2021102597905以及2021年3月10日提交的中国专利申请2021102612286的优先权。
技术领域
本公开属于生物医药领域，涉及PD-1结合蛋白及其用于治疗疾病(例如癌症)的用途。
背景技术
PD-1(Programmed Cell death-1)属于CD28受体家族，是免疫抑制性受体(Riley等人2009，Immunol.Rev.29:114-25)。PD-1是I型跨膜蛋白，主要表达在活化的B细胞、T细胞和骨髓细胞(Chen等人2013，Nat.Rev.Immunol.13:227-42)，有两种细胞表面的糖蛋白配体，分别是PD配体1(PD-L1，又名CD274，B7-H1)和PD配体2(PD-L2，又名B7-DC)。PD-L1和PD-L2均不与其它CD28受体家族成员结合。PD-L1广泛表达于淋巴细胞(例如CD4 +T细胞和CD8 +T细胞、巨噬细胞等)以及如外周组织、各种肿瘤细胞和病毒感染细胞等。PD-L2主要表达于活化的树突状细胞和巨噬细胞(Dong等人1999，Nat.Med.5:1365-9)。PD-1与其配体PD-L1或PD-L2结合后，会下调T细胞的功能，包括降低T细胞的活化、分化增殖和细胞因子的分泌等。PD-L1高表达于多种人类肿瘤，包括黑色素瘤、胶质瘤、非小细胞肺癌、头颈癌、白血病、胰腺癌、肾癌和肝癌等(Zou和Chen，2008，Nat.Rev.Immunol.8:467-77)。肿瘤细胞高表达的PD-L1，下调T细胞功能，增加T细胞凋亡，在肿瘤的免疫逃逸过程中起到重要作用(Freeman等人2000，J.Exp.Med.192:1027-34；Latchman等人2001，Nat.Immunol.2:261-8；Cater等人2002，Eur.J.Immunol.32:634-43；Ohigashi等人2005，Clin.Cancer Res.11:2947-53)。阻断PD-1和PD-L1的相互作用能够逆转免疫抑制，而同时抑制PD-1和PD-L1、PD-L2的作用能够起到协同作用(Iwai等人2002，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，99:12293-7；Brown等人2003，J.Immunol.170:1257-66)。
LAG-3(lymphocyte activation gene-3，也称CD223)也是免疫球蛋白超家族的一员，可负性调节免疫细胞的各项功能和生存周期。LAG-3主要表达在T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、Treg细胞以及DC等细胞上(Proc Natl Acad Sci U S A,1997,94(11):5744-9.Eur J Immunol,2005,35(7):2081-8；J Immunol,2009,182(4):1885-91)。LAG-3是一类免疫抑制性分子，是TCR的共受体组成部分之一，它干预T淋巴细胞TCR激活，在T淋巴细胞激活中发挥负性调控功能。在一些疾病中，LAG-3表达均会升高，并且会出现相应的免疫抑制。Gandhi等发现霍奇金淋巴瘤患者血液和肿瘤组织中，淋巴细胞高表达LAG-3；肿瘤组织中特异性CD8+T细胞的功能明显受损，如果去除LAG-3阳性的T细胞，其抗肿瘤功能可以恢复，细胞因子分泌增加。据此推测，LAG-3的表达与特异性T细胞的免疫负调节功能相关，抑制LAG-3分子功能可以增强T细胞的抗肿瘤作用，该分子是一个潜在的肿瘤免疫治疗靶点(Blood,2006,108(7):2280-9)。
驼科动物(如骆驼和羊驼)会产生一种独特的缺失轻链的重链抗体(HcAb)，源于这种抗体的可变区片段(VHH)称为单域抗体(single domain antibody，sdAb)。单域抗体的分子量只有12-15kDa，是传统抗体(包含四条链)的十分之一，其直径约2.5nm、长约4nm，是目前已知的最小的具有完整抗原结合活性的抗体。单域抗体同样含有3个CDR，其中CDR3对亲和力起到主要作用。与人抗体VH相比，单域抗体的CDR3更长，可以形成凸环(bulge loop)结构，能够深入抗原内部，从而更好地结合抗原。因而，VHH具有高亲和力和高特异性的特点。此外，单域抗体中FR2的疏水残基被亲水残基取代，水溶性更好，不易形成聚集体。与传统抗体相比，单域抗体具有高结合力、高特异性、高溶解度、高稳定性和高表达量等诸多优点。
目前，全球范围内针对PD-1的单域抗体均处于早期开发阶段，尚没有靶向PD-1的单域抗体药物上市，也没有针对PD-1/LAG-3的双抗药物上市，均处于早期开发阶段。
本公开提供了能特异性结合PD-1的VHH抗体，以及同时结合PD-1和LAG-3的双特异性抗体，后者能选择性地靶向表达PD-1和LAG-3两者的细胞，有效阻断同时过表达PD-1和LAG-3的T细胞上的PD-1和LAG-3，从而降低LAG-3抗体产生的副作用，有效治疗肿瘤。
发明内容
本公开提供一种PD-1结合蛋白，更具体的，提供一种PD-1/LAG-3结合蛋白或PD-1结合蛋白和LAG-3结合蛋白的联用，及其医药用途。
PD-1结合蛋白
本公开提供了一种PD-1结合蛋白，其包含至少一个能够特异性结合PD-1的免疫球蛋白单一可变结构域。一些实施方案中，所述PD-1结合蛋白包含一个特异性结合PD-1的免疫球蛋白单一可变结构域。在另一些实施方案中，所述PD-1结合蛋白包含2、3、4或更多个特异性结合PD-1的免疫球蛋白单一可变结构域。一些实施方案中，所述PD-1结合蛋白包含两个或更多个相同的特异性结合PD-1的免疫球蛋白单一可变结构域。在另一些实施方案中，所述PD-1结合蛋白包含两个或更多个不同的特异性结合PD-1的免疫球蛋白单一可变结构域。一些实施方案中，所述两个或更多个特异性结合PD-1的免疫球蛋白单一可变结构域直接连接。在另一些实施方案中，所述两个或更多个特异性结合PD-1的免疫球蛋白单一可变结构域通过连接子连接。所述连接子可以包含1-20或更多个氨基酸，是一种非功能性氨基酸序列。例如，所述连接子是柔性连接子，例如G 4S、GS、GAP、(G 4S) n等，其中，n为1-8之间的整数。
一些实施方案中，本公开的PD-1结合蛋白包含至少一个免疫球蛋白单一可变结构域，所述免疫球蛋白单一可变结构域包含DSVKGRFT或ASVKGRFA所示的氨基酸序列。一些具体实施方案中，免疫球蛋白单一可变结构域包含三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，DSVKGRFT或ASVKGRFA位于CDR2中。
一些实施方案中，本公开的PD-1结合蛋白，按从氨基端至羧基端的顺序包含 三个彼此间隔的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3。所述CDR1、CDR2、CDR3如SEQ ID NO：154-157、7-33、35-58、123-128任一序列中的CDR1、CDR2、CDR3所示，CDR是根据Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact编号系统定义的。一些具体实施方案中，是根据Kabat编号系统定义的。
一些实施方案中，本公开的免疫球蛋白单一可变结构域(按从氨基端至羧基端的顺序)包含三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中：
CDR1包含SEQ ID NO：62所示氨基酸序列，CDR2包含X 1IDSVGX 2TX 3YX 4X 5SVKG(SEQ ID NO：115)所示氨基酸序列，其中，X 1选自S或T，X 2选自T或A，X 3选自D、N或G，X 4选自T或A，X 5选自N或D，CDR3包含SEQ ID NO：64所示氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：81所示氨基酸序列，CDR2包含VVDRX 24GGX 6IYAX 7SVKX 8(SEQ ID NO：116)所示氨基酸序列，其中，X 24选自Y或F，X 6选自I或T，X 7选自A或D，X 8选自K或D，CDR3包含GSYTX 9X 10X 11SCX 12PDAL(SEQ ID NO：117)所示氨基酸序列，其中，X 9选自S或D，X 10选自A或D，X 11选自N或G，X 12选自Q或H；或
CDR1包含YNX 13MX 14(SEQ ID NO：118)所示氨基酸序列，其中，X 13选自F或Y，X 14选自S或T，CDR2包含SEQ ID NO：66所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：67所示氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：84所示氨基酸序列，CDR2包含VINTGX 15NX 16TYYADSVKG(SEQ ID NO：119)所示氨基酸序列，其中，X 15选自A或T，X 16选自S或T，CDR3包含SEQ ID NO：86所示氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：78所示氨基酸序列，CDR2包含X 17YPTAGX 18TYX 19X 20DSX 21KG(SEQ ID NO：120)所示氨基酸序列，其中，X 17选自L或I，X 18选自R或K，X 19选自Y或F，X 20选自G或A，X 21选自M或V，CDR3包含SEQ ID NO：80所示氨基酸序列；或
CDR1、CDR2、CDR3分别包含SEQ ID NO：59、60、61所示氨基酸序列；或
CDR1、CDR2、CDR3分别包含SEQ ID NO：74、75、76所示氨基酸序列；或
CDR1、CDR2、CDR3分别包含SEQ ID NO：88、89、90所示氨基酸序列；
或，CDR1、CDR2、CDR3分别包含SEQ ID NO：96、97、98所示氨基酸序列。
一些实施方案中，本公开的PD-1结合蛋白包含至少一个免疫球蛋白单一可变结构域，所述免疫球蛋白单一可变结构域包含三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中：
CDR1包含如X 22KCMG(SEQ ID NO：152)所示的氨基酸序列，其中，X 22选自N、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R或S；
CDR2包含如VVDRFGGTIYAX 25SVKG(SEQ ID NO：204)所示的氨基酸序列；
CDR3包含如GSYTSAX 23SCQPDAL(SEQ ID NO：153)所示的氨基酸序列，其中，X 25选自A或D，X 23选自N、A、E、F、G、H、K、P、Q、R或S。
一些具体实施方案中，本公开的PD-1结合蛋白包含选自以下的任一项：
CDR1包含SEQ ID NO：62所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：63、68、69、70、72、77任一所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：64或73所示氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：81所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：71、82、91、93、94任一所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：83、92、95任一所示氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：65、113、114任一所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：66所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：67所示氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：84所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：85、102任一所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：86所示氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：78所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：79、87、99、100、101任一所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：80所示氨基酸序列。
CDR1包含如SEQ ID NO：129-141任一所示的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO：71或82所示的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列；或
CDR1包含如SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO：71或82所示的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO：142-151任一所示的氨基酸序列；或
CDR1包含如SEQ ID NO：129所示的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO：71或82所示的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO：145所示的氨基酸序列；或
CDR1包含如SEQ ID NO：132所示的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO：71或82所示的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO：145所示的氨基酸序列；或
CDR1包含如SEQ ID NO：129所示的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO：71或82所示的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO：146所示的氨基酸序列；或
CDR1包含如SEQ ID NO：132所示的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO：71或82所示的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO：146所示的氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：81所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：71、82任一所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：83所示氨基酸序列。
一些具体实施方案中，本公开的PD-1结合蛋白包含选自以下的任一项：
CDR1包含SEQ ID NO：62所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：63、68、69、70、72、77任一所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：64所示氨基 酸序列；或
CDR1、CDR2、CDR3分别包括SEQ ID NO：62、63、73所示氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：81所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：71、82任一所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：83所示氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：81所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：91、93任一所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：92所示氨基酸序列；或
CDR1、CDR2、CDR3分别包括SEQ ID NO：81、94、95所示氨基酸序列。
一些实施方案中，本公开的PD-1结合蛋白的免疫球蛋白单一可变结构域包含三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中，CDR3选自SEQ ID NO：61、64、67、73、76、80、83、86、90、92、95、98任一所示的氨基酸序列或与之具有3、2、1个氨基酸差异的氨基酸序列。
一些实施方案中，本公开的PD-1结合蛋白中至少一个免疫球蛋白单一可变结构域中：
(i)CDR1包含选自SEQ ID NO：59、62、65、74、78、81、84、88、113、114所示的任一氨基酸序列，或与之具有3、2、1个氨基酸差异的氨基酸序列；和/或
(ii)CDR2包含选自SEQ ID NO：60、63、66、68、69、70、71、72、75、77、79、82、85、87、89、91、93、94、97、99、100、101、102所示的任一氨基酸序列，或与之具有3、2、1个氨基酸差异的氨基酸序列；和/或
(iii)CDR3包含选自SEQ ID NO：61、64、67、73、76、80、83、86、90、92、95、98所示的任一氨基酸序列，或与之具有3、2、1个氨基酸差异的氨基酸序列。
一些实施方案中，一个或多个上述CDR嫁接(graft)于支架或FR(包括但不限于源自人的支架、或非免疫球蛋白支架)上。适于所述CDR嫁接的支架及技术在本领域中是已知的。
一些实施方案中，本公开的PD-1结合蛋白为结合PD-1的抗体，或包含所述抗体、其抗原结合片段的缀合物、融合蛋白。
一些具体实施方案中，所述抗体为骆驼抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体或其片段。一些具体实施方案中，抗原结合片段为sdAb或双特异性抗体、多特异性抗体。
一些实施方案中，本公开的PD-1结合蛋白中的至少一个免疫球蛋白单一可变结构域是VHH。
一些具体实施方案中，所述VHH包含SEQ ID NO：7-33中任一的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：7-33中任一具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的氨基酸序列。
在另一些实施方案中，所述VHH是人源化的VHH。所述人源化的VHH包含与SEQ ID NO：154-157、35-58、123-128中任一的氨基酸序列，或与SEQ ID NO： 154-157、35-58、123-128中任一具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的氨基酸序列。或者，所述VHH的氨基酸序列与SEQ ID NO：154-157、7-33、35-58、123-128中任一相比包含一或多个氨基酸取代，优选保守氨基酸取代，例如，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代。
一些实施方案中，本公开的PD-1结合蛋白是经过亲和力成熟获得的，例如，在SEQ ID NO：154-157、7-33、35-58、123-128的基础上进行亲和力成熟。经亲和力成熟的PD-1结合蛋白可以在一个或多个CDR中具有一个或多个变化，所述变化导致对PD-1的亲和力相比于亲本PD-1结合蛋白有所增加。
一些实施方案中，本公开的PD-1结合蛋白，除了包含至少一个能够特异性结合PD-1或其表位的免疫球蛋白单一可变结构域外，还包含Fc区。
在本公开的PD-1结合蛋白中包含Fc区可以使所述结合蛋白形成二聚体分子，同时延长所述结合蛋白的体内半衰期。可用于本公开的Fc区可以来自不同亚型的免疫球蛋白，例如，IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM。一般而言，Fc区包括恒定区的铰链区或部分铰链区、CH2区和CH3区。
一些实施方案中，可以在野生型的Fc序列上引入突变用于改变Fc介导的相关活性。所述突变包括但不限于：
a)改变(例如降低)Fc介导的CDC活性的突变；
b)改变(例如降低)Fc介导的ADCC活性的突变；或
c)改变(例如提高)FcRn介导的体内半衰期的突变。
此类突变描述于下列文献中：Leonard G Presta，Current Opinion in Immunology 2008，20：460-470；Esohe E.Idusogie等人J Immunol 2000，164：4178-4184；RAPHAEL A.CLYNES等人Nature Medicine，2000，Volume 6，Number 4：443-446；Paul R.Hinton等人J Immunol，2006，176：346-356。例如，可以通过突变CH2区上的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸用于增加或去除Fc介导的ADCC或CDC活性或是增强或减弱FcRn的亲和力。此外，可以通过突变铰链区的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸增加蛋白的稳定性。
一些实施方案中，Fc序列上可以引入突变，从而使得突变的Fc更容易形成同二聚体或者异二聚体。如Ridgway，Presta等人1996以及Carter 2001中提到的利用Fc接触界面氨基酸侧链基团空间作用的knob-hole模型，使得不同Fc突变之间更容易形成异二聚体；再如，通过改变Fc接触界面氨基酸所带的电荷，进而改变Fc接触界面之间的离子相互作用力，使得不同的Fc突变对之间更容易形成异二聚体(参见CN 102558355A)，或是具有相同突变的Fc之间更容易形成同二聚体(参见CN 103388013A)。
所述免疫球蛋白Fc区优选是人免疫球蛋白Fc区，例如人IgG1Fc、人IgG4、人IgG4(S228P)的Fc区。一些具体实施方案中，所述免疫球蛋白Fc区的氨基酸序如SEQ ID NO：103、108所示或与之具有至少70％、至少80％、至少85％、至 少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。
一些实施方案中，本公开的PD-1结合蛋白中，免疫球蛋白单一可变结构域与免疫球蛋白Fc区通过连接子连接。所述连接子可以是长1-20个或更多个氨基酸的非功能性氨基酸序列，连接子自身不形成二级或三级结构。例如，所述连接子是柔性连接子，例如G 4S、GS、GAP、(G 4S) 2、(G 4S) 3、(G 4S) 4、(G 4S) 5、ASGS等。
一些实施方案中，本公开的PD-1结合蛋白包含一个免疫球蛋白单一可变结构域，其直接或通过连接子与免疫球蛋白Fc区连接。一些具体实施方案中，本公开的PD-1结合蛋白包含两个免疫球蛋白单一可变结构域，其直接或通过连接子与免疫球蛋白Fc区连接，所述免疫球蛋白Fc区允许所述PD-1结合蛋白形成包含两个免疫球蛋白单一可变结构域的二聚体分子。这样的PD-1结合蛋白也称为二价PD-1结合蛋白。
一些实施方案中，本公开的PD-1结合蛋白包含直接或通过连接子相互连接的三个或四个免疫球蛋白单一可变结构域和一个免疫球蛋白Fc区，所述免疫球蛋白Fc区允许所述PD-1结合蛋白形成包含三个或四个免疫球蛋白单一可变结构域的多聚体分子。这样的PD-1结合蛋白也称为三价或四价PD-1结合蛋白。
另一些实施方案中，PD-1结合蛋白包含至少一个PD-1结合结构域和至少一个其它抗原的结合结构域，例如，形成异二聚体。
一些实施方案中，本公开的包含免疫球蛋白Fc区的PD-1结合蛋白包含SEQ ID NO：34、104-107、109-112、200-203任一所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：34、104-107、109-112、200-203任一具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。
一些实施方案中，本公开提供PD-1结合蛋白，其能够与由SEQ ID NO：154-157、7-33、35-58、123-128中任一的氨基酸序列组成的VHH结合相同的PD-1表位，或竞争结合相同PD-1表位。
本公开的PD-1结合蛋白具有下述特征中的至少一个：
(a)以≤10 -7的KD值与人PD-1或其表位结合；
(b)抑制PD-1与PD-L1的结合；
(c)抑制PD-1与PD-L2的结合；
(d)诱导CD4+T细胞分泌IFN-γ；
(e)增强PBMC的活化；
(f)增强T细胞的活化；
(g)抑制肿瘤生长。
本公开的所述PD-1结合蛋白结合PD-1的KD值可以≤1×10 -7M，例如≤1×10 -8M，或≤1×10 -9M，或≤1×10 -10M。
一些实施方案中，本公开的PD-1结合蛋白能够特异性结合人PD-1并阻断PD-1和PD-L1的相互作用，和/或PD-1和PD-L2的相互作用。
本公开的PD-1结合蛋白能够抑制肿瘤生长至少约10％，例如至少约20％、 约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％。
此外，本公开的PD-1结合蛋白对热处理具有耐受性或具有较高的稳定性。例如，在40℃下处理多达30天未见明显聚集或降解，至少在60℃稳定。
PD-1/LAG-3结合蛋白
本公开提供了一种PD-1/LAG-3结合蛋白，其包含特异性结合PD-1的第一抗原结合结构域和特异性结合LAG-3的第二抗原结合结构域，所述特异性结合PD-1的第一抗原结合结构域包含至少一个免疫球蛋白单一可变结构域，所述免疫球蛋白单一可变结构域包含三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中：
CDR1包含如X 22KCMG(SEQ ID NO：152)所示的氨基酸序列，其中，X 22选自N、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R或S，CDR2包含如VVDRFGGTIYAX 25SVKG(SEQ ID NO：204)所示的氨基酸序列，CDR3包含如GSYTSAX 23SCQPDAL(SEQ ID NO：153)所示的氨基酸序列，其中，X 25选自A或D，X 23选自N、A、E、F、G、H、K、P、Q、R或S；或
CDR1包含SEQ ID NO：62所示氨基酸序列，CDR2包含X 1IDSVGX 2TX 3YX 4X 5SVKG(SEQ ID NO：115)所示氨基酸序列，其中，X 1选自S或T，X 2选自T或A，X 3选自D、N或G，X 4选自T或A，X 5选自N或D，CDR3包含SEQ ID NO：64所示氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：81所示氨基酸序列，CDR2包含VVDRX 24GGX 6IYAX 7SVKX 8(SEQ ID NO：116)所示氨基酸序列，其中，X 24选自Y或F，X 6选自I或T，X 7选自A或D，X 8选自K或D，CDR3包含GSYTX 9X 10X 11SCX 12PDAL(SEQ ID NO：117)所示氨基酸序列，其中，X 9选自S或D，X 10选自A或D，X 11选自N或G，X 12选自Q或H；或
CDR1包含YNX 13MX 14(SEQ ID NO：118)所示氨基酸序列，其中，X 13选自F或Y，X 14选自S或T，CDR2包含SEQ ID NO：66所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：67所示氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：84所示氨基酸序列，CDR2包含VINTGX 15NX 16TYYADSVKG(SEQ ID NO：119)所示氨基酸序列，其中，X 15选自A或T，X 16选自S或T，CDR3包含SEQ ID NO：86所示氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：78所示氨基酸序列，CDR2包含X 17YPTAGX 18TYX 19X 20DSX 21KG(SEQ ID NO：120)所示氨基酸序列，其中，X 17选自L或I，X 18选自R或K，X 19选自Y或F，X 20选自G或A，X 21选自M或V，CDR3包含SEQ ID NO：80所示氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：59所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：60所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：61所示氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：74所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：75所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：76所示氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：88所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：89所 示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：90所示氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：96所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：97所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：98所示氨基酸序列。
一些实施方案中的PD-1/LAG-3结合蛋白，其中特异性结合PD-1的第一抗原结合结构域中的免疫球蛋白单一可变结构域包含如下的CDR1、CDR2和CDR3：
CDR1包含如SEQ ID NO：129-141任一所示的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO：71或82所示的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列；或
CDR1包含如SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO：71或82所示的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO：142-151任一所示的氨基酸序列；或
CDR1包含如SEQ ID NO：129所示的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO：71或82所示的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO：145所示的氨基酸序列；或
CDR1包含如SEQ ID NO：132所示的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO：71或82所示的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO：145所示的氨基酸序列；或
CDR1包含如SEQ ID NO：129所示的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO：71或82所示的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO：146所示的氨基酸序列；或
CDR1包含如SEQ ID NO：132所示的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO：71或82所示的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO：146所示的氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：62所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：63、68、69、70、72、77任一所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：64所示氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：62所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：63所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：73所示氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：81所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：71、82任一所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：83所示氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：81所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：91、93任一所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：92所示氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：81所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：94所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：95所示氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：65、113、114任一所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：66所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：67所示氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：84所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：85、102任一所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：86所示氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：78所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：79、87、99、100、101任一所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：80所示氨基酸序列。
一些实施方案中的PD-1/LAG-3结合蛋白，其中特异性结合PD-1的第一抗原结合结构域中的免疫球蛋白单一可变结构域包含如SEQ ID NO：154-157、7-33、35-58、123-128任一所示或与之具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。
一些实施方案中的PD-1/LAG-3结合蛋白，其中特异性结合LAG-3的第二抗原结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：
VH包含分别如SEQ ID NO：164-166所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，VL包含分别如SEQ ID NO：167-169所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3；或
VH包含分别如SEQ ID NO：158-160所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，VL包含分别如SEQ ID NO：161-163所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3。
一些实施方案中的PD-1/LAG-3结合蛋白，其中特异性结合LAG-3的第二抗原结合结构域的VH包含如SEQ ID NO：178-181任一所示或与之具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列，VL包含如SEQ ID NO：182-186任一所示或与之具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列；或
VH包含如SEQ ID NO：170-173任一所示或与之具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列，VL包含如SEQ ID NO：174-177任一所示或与之具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列；
一些具体实施方案中，VH包含如SEQ ID NO：178所示氨基酸序列或与之具有至少95％同一性，VL包含如SEQ ID NO：183所示氨基酸序列与之具有至少95％同一性。
一些实施方案中的PD-1/LAG-3结合蛋白，其中，所述特异性结合LAG-3的第二抗原结合结构域包含全长重链(HC)和全长轻链(LC)；例如，全长重链为IgG1或IgG4同种型，全长轻链为Kappa同种型；例如，全长重链为SEQ ID NO：187所示或与之具有至少90％序列同一性，全长轻链为SEQ ID NO：188所示或与之具有至少90％序列同一性。
一些实施方案中的PD-1/LAG-3结合蛋白，其中，所述特异性结合LAG-3的第二抗原结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：
所述特异性结合PD-1的第一抗原结合结构域的免疫球蛋白单一可变结构域位于特异性结合LAG-3的第二抗原结合结构域的重链可变区或全长重链的N端；
所述特异性结合PD-1的第一抗原结合结构域的免疫球蛋白单一可变结构域位于特异性结合LAG-3的第二抗原结合结构域的重链可变区或全长重链的C端；
所述特异性结合PD-1的第一抗原结合结构域的免疫球蛋白单一可变结构域位于特异性结合LAG-3的第二抗原结合结构域的轻链可变区或全长轻链的N端；和/或
所述特异性结合PD-1的第一抗原结合结构域的免疫球蛋白单一可变结构域位于特异性结合LAG-3的第二抗原结合结构域的轻链可变区或全长轻链的C端。
一些实施方案中的PD-1/LAG-3结合蛋白，其中，特异性结合PD-1的第一抗原结合结构域的免疫球蛋白单一可变结构域与特异性结合LAG-3的第二抗原结合结构域直接或通过连接子相连接；例如，所述连接子为具有如(G 4S) x所示的氨基酸序列，其中，x独立地选自1-20的整数；例如，所述连接子为(G 4S) 2、(G 4S) 3所示的氨基酸序列。
一些实施方案中的PD-1/LAG-3结合蛋白，其包含第一多肽链和第二多肽链，第一多肽链包含如SEQ ID NO：189-195任一所示的氨基酸序列或与之具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列，第二多肽链包含如SEQ ID NO：188所示的氨基酸序列或与之具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。
一些实施方案中的PD-1/LAG-3结合蛋白，其具有选自以下至少一项的活性：
(a)以≤10 -7的K D值与人PD-1或其表位结合；
(b)以≤10 -7的K D值与人LAG-3或其表位结合；
(c)抑制PD-1与PD-L1的结合；
(d)抑制PD-1与PD-L2的结合；
(e)抑制LAG-3与MHCII的结合；
(f)诱导淋巴细胞分泌IFN-γ和/或IL-2；
(g)增强PBMC的活化；
(h)增强T细胞的活化、刺激T细胞应答或刺激T细胞增殖；
(i)抑制肿瘤生长、延缓癌症发展。
一些实施方案中，上述PD-1/LAG-3结合蛋白为抗PD-1/LAG-3双特异性抗体。
一些实施方案中，抗PD-1/LAG-3双特异性抗体含有前述本公开提供的特异性结合PD-1的第一抗原结合结构域中的免疫球蛋白单一可变结构域，和前述本公开提供的特异性结合LAG-3的第二抗原结合结构域中的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。
一些实施方案中，抗PD-1/LAG-3双特异性抗体中：
特异性结合PD-1的第一抗原结合结构域为第一抗体，其是VHH，具有前述本公开提供的PD-1结合蛋白中的CDR1、CDR2、CDR3；和
特异性结合LAG-3的第二抗原结合结构域为第二抗体，其包括重链(HC)和轻链(LC)。
一些具体实施方案中，所述第二抗体为任意的抗LAG-3抗体。此处全文引入WO2004/078928、WO2010/019570(公开抗体25F7和26H10)、US2011/070238、WO2014/008218、WO2015/138920(例如BAP050)、WO2014/140180、WO2015/116539、WO2016/028672、WO2016/126858、WO2016/200782、WO2017/015560、WO2019210848A、WO2019149716A、WO2019210848A，以及WO2017219995A中的LAG-3抗体。
一些具体实施方案中，所述VHH作为第一抗体位于第二抗体的重链或轻链的N端和/或C端。
一些具体实施方案中，抗PD-1/LAG-3双特异性抗体包含1个第二抗体和2个第一抗体；所述第二抗体包括两条HC和两条LC，第二抗体的一条HC的VH与一条LC的VL形成抗原结合部位，另一条HC的VH与另一条LC的VL形成抗原结合部位。
一些具体实施方案中，抗PD-1/LAG-3双特异性抗体中一个第一抗体位于第二抗体的重链或轻链的N端，另一个第一抗体位于第二抗体的重链或轻链的C端。
一些具体实施方案中，抗PD-1/LAG-3双特异性抗体中每个第一抗体分别位于第二抗体的两条重链或两条轻链的N端；或者，每个第一抗体分别位于第二抗体的两条重链或两条轻链的C端。
一些具体实施方案中，抗PD-1/LAG-3双特异性抗体中每个第一抗体分别位于第二抗体的两条重链的N端；或者，每个第一抗体分别位于第二抗体的两条重链的C端；
一些具体实施方案中，抗PD-1/LAG-3双特异性抗体中第二抗体可以连接有1、2、3、4、5、6、7、8个第一抗体，所述第一抗体可以是相同的或不同的，可以均连接在第二抗体的重链N端，或均连接在第二抗体的重链C端，或均连接在第二抗体的轻链N端，或均连接在第二抗体的轻链C端，或重链N端、重链C端、轻链N端、轻链C端的任意组合。
一些具体实施方案中，抗PD-1/LAG-3双特异性抗体中第一抗体直接或通过连接子与第二抗体的每条重链的N端或C端连接。所述连接子选自：如(G mS n) x所示的氨基酸序列或多聚鸟嘌呤(poly G)，其中m、n各自独立地选自1-8的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7或8)，x独立地选自1-20的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)。例如，连接子为G 4S、(G 4S) 2、(G 4S) 3、(G 4S) 4、(G 4S) 5、(G 4S) 6所示的氨基酸序列。
一些实施方案中，抗PD-1/LAG-3双特异性抗体中第二抗体的重链包含重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)，轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。第二抗体可以为全长抗体。
一些实施方案中，抗PD-1/LAG-3双特异性抗体中，第二抗体的重链为IgG同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，例如为IgG1同种型；和/或，所述第二抗体的轻链为Kappa同种型。
一些实施方案中，抗PD-1/LAG-3双特异性抗体中，两条HC包含相同的CDR和/或两条LC包含相同的CDR。一些具体实施方案中，第二抗体的两条HC包含相同的VH和/或两条LC包含相同的VL。一些具体实施方案中，第二抗体的两条HC具有相同的氨基酸序列和/或两条LC具有相同的氨基酸序列。
一些实施方案中，抗PD-1/LAG-3双特异性抗体中，两个第一抗体具有相同或 不相同的氨基酸序列。例如，两个所述第一抗体具有相同的氨基酸序列。
一些实施方案中，抗PD-1/LAG-3双特异性抗体包含两条第一多肽链和两条第二多肽链，其中对于每条多肽链：
a)第一多肽链各自独立地包含第一抗体和第二抗体的重链(HC)；和b)第二多肽链各自独立地包含第二抗体的轻链(LC)；其中，VHH通过连接子与第二抗体的HC的N端和/或C端相连；或者，
i)第一多肽链各自独立地包含第二抗体的重链(HC)；和ii)第二多肽链各自独立地包含第一抗体和第二抗体的轻链(LC)；其中，VHH直接或通过连接子与第二抗体的LC的N端和/或C端相连。
一些具体实施方案中，抗PD-1/LAG-3双特异性抗体包含两条相同的第一多肽链和两条相同的第二多肽链。
一些实施方案中，提供与本公开的PD-1结合蛋白、PD-1/LAG-3结合蛋白、抗PD-1抗体、抗PD-1/LAG-3双特异性抗体竞争性结合相同表位的抗体。
一些实施方案中，本公开的PD-1结合蛋白、LAG-3结合蛋白、PD-1/LAG-3结合蛋白、抗PD-1/LAG-3双特异性抗体还包含人免疫球蛋白Fc区；例如，所述Fc区是人IgG1、IgG2或IgG4的Fc区。所述Fc区可以具有突变。示例性突变是：
-IgG1上的K214T、E233P、L234A、L234V、L234F、L235E、L235A、G236缺失、G237A、P238S、D265A、H268A、A327G、A330S、P331A、P331S、L358M、D365E；
-IgG2上的V234A、G237A、P238S、H268A、H268Q、V309L、A330S、P331S；
-IgG4上的S228P、F234A、L235A、G236缺失、G237A、P238S；
-IgG1、IgG2、IgG3或IgG4上的N297A。
一些具体实施方案中，所述Fc区的突变选自：IgG1上的L234A/L235A，IgG2上的V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S，IgG4上的F234A/L235A，IgG4上的S228P或S228P/F234A/L235A，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4上的N297A，IgG2上的V234A/G237A，IgG1上的K214T/E233P/L234V/L235A/G236缺失/A327G/P331A/D365E/L358MV309L/A330S/P331S，IgG1上的L234F/L235E/D265A，IgG1上的L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S，IgG4上的S228P/F234A/L235A/G237A/P238S，以及IgG4上的S228P/F234A/L235A/G236缺失/G237A/P238S。还可使用杂合IgG2/4Fc域，例如具有来自IgG2的残基117-260和来自IgG4的残基261-447的Fc。
一些具体的实施方案中，所述人IgG4的Fc区具有S228P、F234A、L235A和/或K447A突变。一些具体的实施方案中，所述人IgG1的Fc区具有L234A/L235A或L234A/L235A/P329G突变。
PD-1结合蛋白和LAG-3结合蛋白的组合物
本公开提供含有PD-1结合蛋白和LAG-3结合蛋白的组合物，其中PD-1结合 蛋白包含前述本公开提供的特异性结合PD-1的第一抗原结合结构域，LAG-3结合蛋白包含前述本公开提供的特异性结合LAG-3的第二抗原结合结构域。
一些实施方案中，组合物中的PD-1结合蛋白包含至少一个免疫球蛋白单一可变结构域，所述免疫球蛋白单一可变结构域包含三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2、CDR3如SEQ ID NO：154-157、7-33、35-58、123-128任一序列中的CDR1、CDR2、CDR3所示，CDR是根据Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact编号系统定义的，一些具体实施方案中，是根据Kabat编号系统定义的。
一些实施方案中，免疫球蛋白单一可变结构域中：
CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：152、204、153所示的氨基酸序列；或
CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：62、115、64所示氨基酸序列；或
CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：81、116、117所示氨基酸序列；或
CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：118、66、67所示氨基酸序列；或
CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：84、119、86所示氨基酸序列；或
CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：78、120、80所示氨基酸序列；或
CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：59-61所示氨基酸序列；或
CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：74-76所示氨基酸序列；或
CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：88-90所示氨基酸序列；或
CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：96-98所示氨基酸序列。
一些具体方案中，CDR1包含如SEQ ID NO：129-141任一所示的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO：71或82所示的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列；或
CDR1包含如SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO：71或82所示的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO：142-151任一所示的氨基酸序列；或
CDR1包含如SEQ ID NO：129所示的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO：71或82所示的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO：145所示的氨基酸序列；或
CDR1包含如SEQ ID NO：132所示的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO：71或82所示的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO：145所示的氨基酸序列；或
CDR1包含如SEQ ID NO：129所示的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO： 71或82所示的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO：146所示的氨基酸序列；或
CDR1包含如SEQ ID NO：132所示的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO：71或82所示的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO：146所示的氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：62所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：63、68、69、70、72、77任一所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：64所示氨基酸序列；或
CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：62、63、73所示氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：81所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：71、82任一所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：83所示氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：81所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：91、93任一所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：92所示氨基酸序列；或
CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：81、94、95所示氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：65、113、114任一所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：66所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：67所示氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：84所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：85、102任一所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：86所示氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：78所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：79、87、99、100、101任一所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：80所示氨基酸序列。
一些实施方案中，PD-1结合蛋白包含如SEQ ID NO：154-157、7-33、35-58、123-128任一所示或与之具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。
一些实施方案中，PD-1结合蛋白为SEQ ID NO：200-203所示的氨基酸序列。
一些实施方案中，PD-1结合蛋白中的免疫球蛋白单一可变结构域是VHH，例如，所述VHH为人源化的和/或经亲和力成熟的VHH。
一些实施方案中，PD-1结合蛋白为特异性结合PD-1或其片段的抗体；优选地，所述抗体为骆驼抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体。一些具体实施方案中，PD-1结合蛋白还包含人免疫球蛋白Fc区，例如人IgG1或IgG4的Fc区，所述人IgG4的Fc区例如具有S228P、F234A、L235A和/或K447A的突变。
一些实施方案中，LAG-3结合蛋白包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：VH包含如SEQ ID NO：164-166所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，VL包含如SEQ ID NO：167-169所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3；或VH包含如SEQ ID NO：158-160所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，VL包含如SEQ ID NO：161-163所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3。
一些具体实施方案中，LAG-3结合蛋白为全长抗体，包含全长重链(HC)和全长轻链(LC)，全长重链例如为IgG1或IgG4同种型，全长轻链例如为Kappa同种型。
一些具体实施方案中，LAG-3结合蛋白包含：
VH包含如SEQ ID NO：178-181任一所示或与之具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列，
VL包含如SEQ ID NO：182-186任一所示或与之具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列；或
VH包含如SEQ ID NO：170-173任一所示或与之具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列，
VL包含如SEQ ID NO：174-177任一所示或与之具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。
一些具体方案中，VH包含如SEQ ID NO：178所示氨基酸序列或与之具有至少95％同一性，VL包含如SEQ ID NO：183所示氨基酸序列与之具有至少95％同一性；一些具体方案中，VH和VL分别包含如SEQ ID NO：178、183所示的序列。
一些具体实施方案中，LAG-3结合蛋白的全长重链为SEQ ID NO：187所示或与之具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性，全长轻链为SEQ ID NO：188所示或与之具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性。
一些实施方案中，对于本公开中采用序列同一性限定的PD-1结合蛋白、LAG-3结合蛋白、PD-1/LAG-3结合蛋白、或抗PD-1/LAG-3双特异性抗体，同一性源自对氨基酸序列或其编码的核苷酸序列的保守修饰或保守取代。
多核苷酸
本公开提供编码本公开的PD-1结合蛋白、LAG-3结合蛋白、PD-1/LAG-3结合蛋白、或抗PD-1/LAG-3双特异性抗体的多核苷酸。本公开的多核苷酸可为RNA、DNA或cDNA。根据本公开的一些实施方案，本公开的核酸是基本上分离的核酸。
本公开的核酸也可呈载体形式，可存在于载体中和/或可为载体的一部分，该载体例如质粒、粘端质粒、YAC或病毒载体。载体可尤其为表达载体，即可提供PD-1结合蛋白在体外和/或体内(即在适合宿主细胞、宿主有机体和/或表达系统中)表达的载体。该表达载体通常包含至少一种本公开的核酸，其可操作地连接至一个或多个适合的表达调控元件(例如启动子、增强子、终止子等)。针对在特定宿主中的表达对所述元件及其序列进行选择为本领域技术人员的常识。对本公开的PD-1结合蛋白的表达有用或必需的调控元件及其他元件例如为启动子、增强子、终止子、整合子、选择标记物、前导序列、报告基因。
本公开的核酸可基于本公开的多肽的氨基酸序列的信息通过已知的方式(例如通过自动DNA合成和/或重组DNA技术)制备或获得，和/或可从适合的天然来源加以分离。
宿主细胞
本公开提供表达一种或多种本公开的PD-1结合蛋白、LAG-3结合蛋白、 PD-1/LAG-3结合蛋白、抗PD-1/LAG-3双特异性抗体和/或含有本公开的多核苷酸或载体的重组宿主细胞。一些实施方案中，宿主细胞为细菌细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。
细菌细胞例如包括革兰氏阴性细菌菌株(例如大肠杆菌(Escherichia coli)菌株、变形杆菌属(Proteus)菌株及假单胞菌属(Pseudomonas)菌株)及革兰氏阳性细菌菌株(例如芽孢杆菌属(Bacillus)菌株、链霉菌属(Streptomyces)菌株、葡萄球菌属(Staphylococcus)菌株及乳球菌属(Lactococcus)菌株)的细胞。
真菌细胞例如包括木霉属(Trichoderma)、脉孢菌属(Neurospora)及曲菌属(Aspergillus)的物种的细胞；或者包括酵母属(Saccharomyces)(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)(例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))、毕赤酵母属(Pichia)(例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)及嗜甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica))及汉森酵母属(Hansenula)的物种的细胞。
哺乳动物细胞例如包括例如HEK293细胞、CHO细胞、BHK细胞、HeLa细胞、COS细胞等。
然而，本公开也可使用两栖类细胞、昆虫细胞、植物细胞及本领域中用于表达异源蛋白的任何其他细胞。
本公开的细胞不能发育成完成的植株或动物个体。
生产或制备方法
本公开提供制备本公开的PD-1结合蛋白、LAG-3结合蛋白、PD-1/LAG-3结合蛋白、或抗PD-1/LAG-3双特异性抗体的方法，所述方法通常包含以下步骤：
-在允许表达本公开的PD-1结合蛋白、LAG-3结合蛋白、PD-1/LAG-3结合蛋白、或抗PD-1/LAG-3双特异性抗体的条件下，培养本公开的宿主细胞；及
-从培养物中回收由所述宿主细胞表达的目的蛋白；及
-任选的，包括进一步纯化和/或修饰本公开的目的蛋白。
本公开的PD-1结合蛋白、LAG-3结合蛋白、PD-1/LAG-3结合蛋白、抗PD-1/LAG-3双特异性抗体可在如上所述细胞中以细胞内方式(例如在细胞质中、在周质中或在包涵体中)产生，接着从宿主细胞分离且任选进一步纯化；或其可以细胞外方式(例如在培养宿主细胞的培养基中)产生，接着自培养基分离且任选进一步纯化。
用于重组产生多肽的方法及试剂，例如特定适合表达载体、转化或转染方法、选择标记物、诱导蛋白表达的方法、培养条件等在本领域中是已知的。类似地，适用于制造本公开的蛋白的方法中的蛋白分离及纯化技术为本领域技术人员所公知。作为一个示例，编码重链和轻链的cDNA序列，可以克隆并重组至表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染CHO细胞。哺乳动物类表达系统会导致抗体的糖基化，特别是在Fc区的高度保守N端。通过表达与人源抗原特异性结合的抗体得到稳定的克隆。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化、收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛， 离子交换。得到的产物需立即冷冻，如-70℃，或者冻干。
然而，本公开的PD-1结合蛋白、LAG-3结合蛋白、PD-1/LAG-3结合蛋白、抗PD-1/LAG-3双特异性抗体也可以通过本领域已知的其它产生蛋白质的方法获得，例如化学合成，包括固相或液相合成。
药物组合物
本公开提供药物组合物，其含有预防或治疗有效量的选自以下的任一项或其组合：如上所述的本公开的PD-1结合蛋白、LAG-3结合蛋白、PD-1/LAG-3结合蛋白、抗PD-1/LAG-3双特异性抗体、以上蛋白或抗体的编码多核苷酸，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂、缓冲剂或赋形剂。
一些具体实施方案中，所述药物组合物单位剂量中可含有0.01至99重量％的PD-1结合蛋白、PD-1/LAG-3结合蛋白或抗PD-1/LAG-3双特异性抗体。另一些具体实施方案中，药物组合物单位剂量中含PD-1结合蛋白、PD-1/LAG-3结合蛋白或抗PD-1/LAG-3双特异性抗体的量为0.1-2000mg；一些具体实施方案中为1-1000mg。
试剂盒(或药盒)
本公开提供试剂盒或药盒，包含一个或多个容器，其各自独立地包含选自以下的任一项或其组合：本公开的PD-1结合蛋白、LAG-3结合蛋白、PD-1/LAG-3结合蛋白、抗PD-1/LAG-3双特异性抗体、以上蛋白或抗体的编码多核苷酸。
一些实施方案中，还提供包含上述多核苷酸的诊断试剂，以及提供相关诊断用途。
预防、治疗疾病的方法和制药用途
本公开提供了本公开的PD-1/LAG-3结合蛋白、抗PD-1/LAG-3双特异性抗体、PD-1结合蛋白和LAG-3结合蛋白的组合物、多核苷酸、药物组合物在预防和/或治疗疾病中用途和方法，所述疾病可以是与PD-1信号通路相关或不相关的。
一些实施方案中，本公开提供一种预防和/或治疗与PD-1相关的疾病的方法，所述方法包括向受试者施用预防和/或治疗有效量的本公开的PD-1结合蛋白，或包含本公开PD-1结合蛋白的药物组合物。以及，还提供在制备本公开的PD-1结合蛋白在预防和/或与PD-1相关疾病的药物中的用途。
本公开的PD-1/LAG-3结合蛋白、抗PD-1/LAG-3双特异性抗体、PD-1结合蛋白和LAG-3结合蛋白的组合物、多核苷酸、药物组合物可以单独使用，或者与其它抗肿瘤治疗手段联合使用(例如与其他免疫原性剂、标准癌症疗法或其他抗体分子联合使用)，以抑制癌性肿瘤的生长。
一些实施方案中，本公开提供一种促进T细胞增殖的方法，另一些实施方案中，本公开提供一种使患者或受试者从免疫反应上调获益的方法，另一些实施方案中，提供一种促进受试者或患者体内细胞因子(如INFγ、IL-2)表达的方法，所述方法均包括向患者或受试者施用预防和/或治疗有效量的本公开的PD-1/LAG-3结合蛋白、抗PD-1/LAG-3双特异性抗体、PD-1结合蛋白和LAG-3结合蛋白的组合物、多核苷酸、药物组合物。
一些实施方案中，本公开提供一种预防和/或治疗癌症的方法，包括给患者或 受试者施用预防和/或治疗有效量的本公开的PD-1/LAG-3结合蛋白、抗PD-1/LAG-3双特异性抗体、PD-1结合蛋白和LAG-3结合蛋白的组合物、多核苷酸、药物组合物，抑制患者或受试者中的肿瘤细胞生长。一些具体实施方案中，所述癌症优选但不限于对免疫治疗有应答的癌症。
以上方法中，癌症的非限制性的例子包括肺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤(例如转移的恶性黑色素瘤)、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、恶性血液病、头颈癌、胶质瘤、胃癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫体瘤和骨肉瘤。可以用本公开的方法治疗的其他癌症的例子包括：骨癌、胰腺癌、皮肤癌、前列腺癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、肛区癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、阴道癌、阴户癌、何杰金病、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病，包括急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮状癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症，包括石棉诱发的癌症，以及所述癌症的组合。一些实施方案中，上述癌症或肿瘤是转移性的。
一些实施方案中，本公开提供一种PD-1和/或LAG-3的相关病症和疾病的方法，所述病症和疾病包括自身免疫性疾病，例如系统性红斑狼疮(SLE)，牛皮癣，系统性硬皮病，自身免疫性糖尿病等，包括施用有效量的本公开的PD-1/LAG-3结合蛋白、抗PD-1/LAG-3双特异性抗体、PD-1结合蛋白和LAG-3结合蛋白的组合物、多核苷酸、药物组合物。
此外，本公开还提供一种预防和/或治疗受试者或患者中的感染性疾病的方法，包括给该受试者或患者施用本公开的PD-1结合蛋白、PD-1/LAG-3结合蛋白、抗PD-1/LAG-3双特异性抗体、PD-1结合蛋白和LAG-3结合蛋白的组合物、多核苷酸、药物组合物，使得所述对象的感染性疾病得到预防和/或治疗。类似于对于如上所述的肿瘤的应用，PD-1结合蛋白可以单独使用，或者与疫苗组合使用来刺激对病原体、毒素和自身抗原的免疫应答。特别可以应用该治疗方法的病原体的示例包括当前没有有效疫苗的病原体，或常规疫苗不完全有效的病原体。其中包括但不限于HIV、肝炎病毒(甲、乙、丙)、流感病毒、疱疹病毒、贾第虫、疟疾、利什曼原虫、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌。
可用本公开的方法治疗的感染性疾病的病原体病毒的一些示例包括HIV、肝炎(甲、乙、丙)、疱疹病毒(例如VZV、HSV-1、HAV-6，HSV-II和CMV、EB病毒)、腺病毒、流感病毒、虫媒病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、流行性腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、痘苗病毒、HTLV病毒、登革热病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病毒、JC病毒和虫媒病毒脑炎病毒。
可用本公开的方法治疗的感染性疾病的病原体细菌的一些示例包括衣原体、立克次氏体菌、分枝杆菌、葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、脑膜炎球菌和淋球菌、 克雷伯氏杆菌、变形菌、雷氏菌、假单胞菌、军团杆菌、白喉杆菌、沙门氏菌、芽孢杆菌、霍乱菌、破伤风菌、肉毒杆菌、炭疽杆菌、鼠疫杆菌、钩端螺旋体、和莱姆病细菌。
可用本公开的方法治疗的感染性疾病的病原体真菌的一些示例包括假丝酵母(白假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、光滑假丝酵母、热带假丝酵母等)、新型隐球菌、曲霉属(烟曲霉、黑曲霉等)、毛霉属(毛霉、犁头霉、根霉)、申克孢子丝菌、皮炎芽生菌、巴西副球孢子菌、粗球孢子菌和夹膜组织胞浆菌。
可用本公开的方法治疗的感染性疾病的病原体寄生虫的一些示例包括溶组织内阿米巴、结肠小袋纤毛虫、福氏耐格里阿米巴、棘阿米巴属的种、兰伯贾第虫、隐孢子虫属的种、卡氏肺囊虫、间日疟原虫、果氏巴贝虫、布氏锥虫、克氏锥虫、杜氏利什曼原虫、鼠弓形体、巴西日圆线虫。
一些实施方案中，提供PD-1结合蛋白和LAG-3结合蛋白联合用于制备药物的用途，所述药物用于治疗肿瘤、治疗自身免疫性疾病、治疗感染、促进T细胞增殖、使受试者或患者从免疫反应上调获益和/或促进受试者或患者体内细胞因子(如INFγ、IL-2)表达。
一些实施方案中，提供前述PD-1结合蛋白，其与前述LAG-3结合蛋白联合用于治疗自身免疫性疾病、治疗感染、促进T细胞增殖、使受试者或患者从免疫反应上调获益和/或促进受试者或患者体内细胞因子(如INFγ、IL-2)表达，所述PD-1结合蛋白和所述LAG-3结合蛋白同时或顺序施用。
一些实施方案中，提供前述LAG-3结合蛋白，其与前述PD-1结合蛋白联合用于治疗自身免疫性疾病、治疗感染、促进T细胞增殖、使受试者或患者从免疫反应上调获益和/或促进受试者或患者体内细胞因子(如INFγ、IL-2)表达，所述LAG-3结合蛋白和所述PD-1结合蛋白同时或顺序施用。
附图说明
图1为PD-1抗体与稳定高表达PD-1的细胞系CHO-PD-1上PD-1的结合结果图。
图2为PD-1抗体阻断PD-L1蛋白与稳定高表达PD-1的细胞系CHO-PD-1上PD-1结合的结果图。
图3为PD-1抗体在体外解除PD-1/PD-L1阻断的免疫激活结果图。
图4为编号为7#、32#、32#_hu_3、106#、107#的PD-1抗体体外激活T细胞并分泌IFNγ的结果图。
图5为编号为32#_hu_3_hIgG4、7#_hu_4_hIgG4、106#_hu_1_hIgG4的PD-1单域抗体体外激活T细胞并分泌IFNγ的结果图。
图6A至图6B为PD-1抗体抑制小鼠M38结肠癌肿瘤生长的结果和小鼠体重。
图7为PD-1/LAG-3双抗2136#、2138#、2140#与CHO-PD1细胞表面的PD-1结合的结果图，阴性对照为PBS，阳性对照为PD-1Ab646。
图8为PD-1/LAG-3双抗2140#、2170#、2171#、2172#、2173#，PD-1抗体106#_hu-1_hIgG4、0076#_hIgG4与CHO-PD1细胞表面的PD-1结合的结果图。
图9为PD-1/LAG-3双抗2140#、2170#、2171#、2172#、2173#与CHO-LAG-3细胞结合的结果图，阴性对照为NC，阳性对照为LAG-3Ab303。
图10为PD-1/LAG-3双抗2136#、2138#、2140#阻断CHO-PD1细胞上的PD-1与PD-L1结合的结果图，使用LAG-3Ab303和PD-1Ab646作为对照。
图11为PD-1/LAG-3双抗2140#、2170#、2171#、2172#、2173#，PD-1抗体106#_hu-1_hIgG4、0076#_hIgG4阻断CHO-PD1细胞上的PD-1与PD-L1结合的结果图，使用NC作为阴性对照。
图12为PD-1/LAG-3双抗2140#、2170#、2171#、2172#、2173#阻断LAG-3与细胞系A375上内源稳定高表达的MHCII结合的结果图，使用LAG-3Ab303作为对照。
图13为PD-1/LAG-3双抗2136#、2138#、2140#均能在体外解除PD-1/PD-L1阻断的免疫激活结果图。
图14为PD-1/LAG-3双抗2140#、2170#和PD-1抗体106#_hu-1_hIgG4、0076#_hIgG4均能在体外解除PD-1/PD-L1阻断的免疫激活结果图。
图15A至图15B为PD-1/LAG-3双抗2170#、RO7247669，PD-1抗体0076#_hIgG4，LAG-3Ab303，0076#_hIgG4联合LAG-3Ab303激活PBMC分泌IL-2和IFNγ的结果图，使用NC作为阴性对照。
图16为金黄色葡萄球菌超抗原(SEB)刺激实验中，PD-1/LAG-3双抗2170#、RO7247669，PD-1抗体0076#_hIgG4，LAG-3Ab303，0076#_hIgG4联合LAG-3Ab303促PBMC分泌IFNγ的结果图，使用NC作为阴性对照。
图17为PBMC的肿瘤杀伤实验中，PD-1/LAG-3双抗2170#、RO7247669，PD-1抗体0076#_hIgG4，LAG-3Ab303，0076#_hIgG4联合LAG-3Ab303促PBMC分泌IFNγ的结果图，使用NC作为阴性对照。
图18A至图18C为PD-1/LAG-3双抗2136#、2138#、2140#在人源化小鼠模型中抑制肿瘤生长的结果图，使用PBS作为阴性对照。图18A为肿瘤体积，图18B为小鼠体重，图18C为人CD45细胞重建水平。
图19A至图19B为PD-1/LAG-3双抗2136#、2138#、2140#在人源化小鼠模型中抑制肿瘤生长的结果图，使用PBS、PD-1Ab646、LAG-3Ab303作为对照。图19A为肿瘤体积，图19B为小鼠体重。
图20A至图20C为PD-1/LAG-3双抗2170#，PD-1抗体0076#_hIgG4，LAG-3Ab303，0076#_hIgG4联合LAG-3Ab303在人源化小鼠模型中抑制肿瘤生长的结果图，使用NC作为阴性对照。图20A为肿瘤体积，图20B为小鼠体重，图20C为人CD45细胞重建水平。
具体实施方式
术语
为了更容易理解本公开，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本公开中的它处另有明确定义，否则本公开使用的所有其它技术和科学都具有本公开所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
“程序性死亡1”、“细胞程序性死亡1”、“蛋白PD-1”、“PD-1”、“PDCD1”和“hPD-1”可互换使用，且包括人PD-1的变体、同种型(isotype)、种间同源物、以及与PD-1具有至少一个共同表位的类似物。完整的PD-1序列可以从GenBank登录号U64863找到。
“程序性死亡配体-1(PD-L1)”是PD-1的两种细胞表面糖蛋白配体之一(另一种为PD-L2)，它在与PD-1结合时下调T细胞活化和细胞因子分泌。如本文中使用的“PD-L1”包括人PD-L1(hPD-L1)，hPD-L1的变体、同种型、和种间同源物，以及与hPD-L1具有至少一个共同表位的类似物。完整的hPD-L1序列可以用GenBank登录号Q9NZQ7查到。
“LAG-3”是指淋巴细胞活化基因3。术语“LAG-3”包含变体、同等型(isoform)、同源物、直系同源体(ortholog)及旁系同源体(paralog)。术语“人LAG-3”指人序列LAG-3，例如具有Uniprot号:P18627的人LAG-3的完整氨基酸序列。本领域中亦已知LAG-3，例如CD223。人LAG-3序列与Uniprot号:P18627的人LAG-3的不同之处可在于具有例如保守突变或在非保守区中的突变，且LAG-3与Uniprot号:P18627的人LAG-3具有实质上相同的生物功能。举例而言，人LAG-3的生物功能是在LAG-3的胞外域中具有表位，该表位被本公开的抗体特异性结合，或人LAG-3的生物功能是结合MHCII类分子。特定人LAG-3序列在氨基酸序列中通常与Uniprot号:P18627的人LAG-3至少90％相同，且含有在与其他物种(例如鼠类)的LAG-3氨基酸序列相比时鉴别为人氨基酸序列的氨基酸残基。在某些情形下，人LAG-3在氨基酸序列中可与Uniprot号:P18627的LAG-3至少85％或甚至至少95％、96％、97％、98％或99％相同。在某些实施方案中，人LAG-3序列较Uniprot号:P18627的LAG-3序列显示不超过10个氨基酸差异。在某些实施方案中，人LAG-3可较Uniprot号:P18627的LAG-3序列显示不超过5或甚至不超过4、3、2或1个氨基酸差异。可如本文所阐述的测定百分比同一性。
“细胞因子”是由一个细胞群体释放的、作为细胞间介质作用于其它细胞的蛋白质因子，例如淋巴因子、单核因子、趋化因子和传统的多肽激素。示例性的细胞因子包括：人IL-2、IFN-人、IL-6、TNF6、IL-17和IL-5。
本公开所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。
“PD-1结合蛋白”意指任何能够特异性结合PD-1或其表位的蛋白或包含所述蛋白的任何分子。PD-1结合蛋白可以包括针对PD-1的如本公开定义的抗体、其抗原结合片段或其缀合物。PD-1结合蛋白还涵盖免疫球蛋白超家族抗体(IgSF)或CDR移植分子。本公开的“PD-1结合蛋白”可以包含至少一个结合PD-1的免疫球蛋白单一可变结构域(如VHH)。在一些实施方案中，“PD-1结合蛋白”可以包含2、3、4或更多个结合PD-1的免疫球蛋白单一可变结构域(如VHH)。本公开的PD-1结合蛋白除结合包含PD-1的免疫球蛋白单一可变结构域外，也可包含连接子和/或具有效应功能的部分，例如半衰期延长部分(如结合血清白蛋白的免疫球蛋白单一可变结构域)、和/或融合配偶体(如血清白蛋白)和/或缀合的聚合物(如PEG)和/或Fc区。在一些实施方案中，本公开的“PD-1结合蛋白”还涵 盖双/多特异性抗体，其含有结合不同抗原的免疫球蛋白(如结合第一抗原(如PD-1)的第一抗体和结合第二抗原(如LAG-3)的第二抗体，可选的，包括结合第三抗原的第三抗体，进一步可选的，包括结合第四抗原的第四抗体)。
“LAG-3结合蛋白”意指任何能够特异性结合LAG-3或其表位的蛋白或包含所述蛋白的任何分子。LAG-3结合蛋白可以包括针对LAG-3的如本公开定义的抗体、其抗原结合片段或其缀合物。
“PD-1/LAG-3结合蛋白”意指任何能够特异性结合PD-1或其表位和LAG-3或其表位的蛋白或包含所述蛋白的任何分子。PD-1/LAG-3结合蛋白可以包括针对PD-1和LAG-3的如本公开定义的抗体、其抗原结合片段或其缀合物。
“与PD-1结合”，指能与PD-1或其片段或其表位相互作用，所述PD-1或其片段或其表位可以是人源的。
“与LAG-3结合”，指能与LAG-3或其片段或其表位相互作用，所述LAG-3或其片段或其表位可以是人源的。
“抗体”或“免疫球蛋白”广义上涵盖传统的抗体(由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构抗体)，以及具有抗原结合活性的Fab、Fv、sFv、F(ab’)2、线性抗体、单链抗体、scFv、sdAb、sdFv、纳米抗体、肽抗体peptibody、结构域抗体(重链(VH)抗体、轻链(VL)抗体)和多特异性抗体(双特异性抗体、diabody、triabody和tetrabody、串联二-scFv、串联三-scFv)。因而，本公开中使用的“抗体”包括全长抗体、其单个的链及其任意具有抗原结合活性的部分、结构域或片段、以及包含其单个的链及任意具有抗原结合活性的部分、结构域或片段的多特异性抗体(包括但不限于抗原结合结构域或片段，分别例如VHH结构域或VH/VL结构域)。传统的抗体或免疫球蛋白通常是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ(kappa)链或λ(lambda)链。
本公开的“抗体”包括但不限于：(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iii)F(ab′)2片段，一种包含两个连接着的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过肽连接子连接，所述肽连接子允许两个结构域结合形成抗原结合位点；(Bird等人，1988，《科学(Science)》242：423-426；Huston等人，1988，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》85：5879-5883)242，通过引用完全并入本文中)；(iv)“双功能抗体”或“三功能抗体”，通过基因融合构造的多价或多特异性片段(Tomlinson等人，2000，《酶学方法(Methods Enzymol.)》326：461-479；WO94/13804；Holliger等人，1993，《美国美国国家科学院院刊》90：6444-6448，全部通过引用完全并入本文中)；(v)“结构域抗体”或“dAb”(有 时称为“免疫球蛋白单一可变结构域”)，包括来自其它物种的免疫球蛋白单一可变结构域，如啮齿动物(例如，如WO00/29004中所公开)、护士鲨和骆驼科VHH dAb；(vi)SMIP(小分子免疫药物)、骆驼抗体、纳米抗体以及IgNAR；(vii)上述(i)-(vi)的人源化抗体。
本公开的抗体可以是多克隆的、单克隆的、异种的、同种异体的、同基因的或其经过修饰的形式，其中单克隆抗体尤其适用于多个实施例中。一般来说，本公开的抗体是重组抗体。如本文所用的“重组”泛指例如细胞或核酸、蛋白质或载体等产品，表示所述细胞、核酸、蛋白质或载体已经通过引入异源核酸或蛋白质或改变天然核酸或蛋白质而加以修饰，或所述细胞来源于如此修饰的细胞。例如，重组细胞表达天然(非重组)细胞形式内不存在的基因或表达原本异常表达、低表达或完全不表达的天然基因。
多肽或蛋白的“结构域”是指折叠的蛋白结构，其能够独立于蛋白的其余部分维持其三级结构。一般而言，结构域负责蛋白的单个功能性质，且在许多情况下可添加、移除或转移至其他蛋白而不损失蛋白的其余部分和/或结构域的功能。
“免疫球蛋白结构域”是指抗体链(例如常规四肽链结构抗体的链或重链抗体的链)的球形区域，或是指基本上由这类球形区域组成的多肽。免疫球蛋白结构域的特征在于其维持抗体分子的免疫球蛋白折叠特征，例如，常规四肽链结构抗体中，其由重链和轻链的链内二硫键所连接的两个β片层所组成。
“免疫球蛋白可变结构域”是指基本上由本领域及下文中分别称为“框架区”和“CDR”区组成，其含有“框架区1”或“FR1”、“框架区2”或“FR2”、“框架区3”或“FR3”、及“框架区4”或“FR4”的四个“框架区”，其中所述框架区由分别称为“互补决定区1”或“CDR1”、“互补决定区2”或“CDR2”、及“互补决定区3”或“CDR3”的三个“互补决定区”或“CDR”间隔开。因此，免疫球蛋白可变结构域的一般结构或序列可如下表示为：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可变结构域因具有抗原结合位点而赋予其对抗原的特异性。
“抗体框架(FR)”，是指可变结构域的一部分，其用作该可变结构域的抗原结合环(CDR)的支架。
对于“CDR”的确定或定义，能够通过分辨抗体的结构和/或分辨抗体-配体复合物的结构来完成CDR的确定性描绘和包含抗体的结合位点的残基的鉴定。这可通过本领域技术人员已知的各种技术中的任一种，例如X射线晶体学来实现。多种分析方法可用于鉴定CDR，包括但不限于Kabat编号系统、Chothia编号系统、AbM编号系统、IMGT编号系统、接触定义、构象定义。Kabat编号系统是用于编号抗体中残基的标准并且通常用于鉴定CDR区域(参见例如Johnson&Wu，2000，Nucleic Acids Res.，28：214-8)。Chothia编号系统与Kabat编号系统类似，但Chothia编号系统考虑了某些结构环区域的位置。(参见例如Chothia等，1986，J.Mol.Biol.，196：901-17；Chothia等人，1989，Nature，342：877-83)。AbM编号系统使用建模抗体结构的由Oxford Molecular Group生产的计算机程序集成套件(参见例如Martin等，1989，ProcNatl Acad Sci(USA)，86：9268-9272；“AbMTM，A Computer Program for ModelingVariable Regions of Antibodies，”Oxford，UK；Oxford Molecular，Ltd)。AbM编号系统使用知识数据库和从头开始方法的组合，从基本序列建模抗体的三级结构(参见Samudrala等，1999，在PROTEINS，Structure，Function and Genetics Suppl.，3：194-198中的“Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined HierarchicalApproach”描述的那些)。接触定义基于复杂晶体结构的分析(参见例如MacCallum等，1996，J.Mol.Biol.，5：732-45)。构象定义中，CDR的位置可鉴定为对抗原结合做出焓贡献的残基(参见例如Makabe等，2008，Journal ofBiological Chemistry，283：1156-1166)。其它的CDR边界定义可能不严格遵循上述方法之一，但仍然与Kabat CDR的至少一部分重叠，尽管根据特定残基或残基组不显著影响抗原结合的预测或实验结果，它们可缩短或延长。如本文使用的，CDR可指通过本领域已知的任何方法(包括方法的组合)定义的CDR。本文使用的方法可利用根据这些方法中的任一种定义的CDR。对于包含超过一个CDR的任何给定实施例，可根据Kabat、Chothia、延伸的、AbM、IMGT、接触和/或构象定义中的任一个来定义CDR。
“免疫球蛋白单一可变结构域”通常用于指可以在不与其他可变结构域相互作用的情况下(例如在没有如常规四链单克隆抗体的VH和VL结构域之间所需要的VH/VL相互作用的情况下)，形成功能性抗原结合位点的免疫球蛋白可变结构域(其可以是重链或轻链结构域，包括VH、VHH或VL结构域)。“免疫球蛋白单一可变结构域”的实例包括纳米抗体(包括VHH、人源化VHH和/或骆驼化VH，例如骆驼化人VH)、IgNAR、结构域、作为VH结构域或衍生自VH结构域的(单结构域)抗体(诸如dAbs TM)和作为VL结构域或衍生自VL结构域的(单结构域)抗体(诸如dAbs TM)。基于和/或衍生自重链可变结构域(诸如VH或VHH结构域)的免疫球蛋白单一可变结构域通常是优选的。免疫球蛋白单一可变结构域的一个具体实例为如下文定义的“VHH结构域”(或简称为“VHH”)。
“VHH结构域”，亦称为重链单域抗体、VHH、VHH抗体片段、VHH抗体、纳米抗体，是称为“重链抗体”(即“缺乏轻链的抗体”)的抗原结合免疫球蛋白的可变结构域(Hamers-Casterman C，Atarhouch T，Muyldermans S，Robinson G，Hamers C，Songa EB，Bendahman N，Hamers R.：“Naturally occurring antibodies devoid of light chains”；Nature363，446-448(1993))。使用术语“VHH结构域”以将所述可变结构域与存在于常规四肽链结构抗体中的重链可变结构域(其在本公开中称为“VH结构域”)以及轻链可变结构域(其在本公开中称为“VL结构域”)进行区分。VHH结构域特异性结合表位而无需其他抗原结合结构域(此与常规四肽链结构抗体中的VH或VL结构域相反，在该情况下表位由VL结构域与VH结构域一起识别)。VHH结构域为由单一免疫球蛋白结构域形成的小型稳定及高效的抗原识别单元。术语“重链单域抗体”、“VHH结构域”、“VHH”、“VHH结构域”、“VHH抗体片段”、“VHH抗体”以及“结构域”(“Nanobody”为Ablynx N.V.公司，Ghent，Belgium的商标)可互换使用。“VHH结构域”包括但不限于经骆驼科动物产生的天然抗体，也可以是骆驼科动物产生的抗体后再经人源化的，也可以是经噬菌体体展示技术筛选获得的。
如本领域中对于VH结构域及VHH结构域所公知的，各CDR中的氨基酸残基的总数可能不同，且可能不对应于由Kabat编号指示的氨基酸残基的总数(即根据Kabat编号的一个或多个位置可能在实际序列中未被占据，或实际序列可能含有多于Kabat编号所允许数目的氨基酸残基)。这意味着一般而言，根据Kabat的编号可能对应或可能不对应于实际序列中氨基酸残基的实际编号。其它的编号系统或编码规则包括Chothia、IMGT、AbM。在未特殊指明的情况下，本公开的抗体通常使用Kabat编号系统。Kabat中的EU编号也用于恒定结构域和/或Fc结构域。
VHH结构域中的氨基酸残基的总数将通常在110至120范围内，常常介于112与115之间。然而应注意较小及较长序列也可适于本公开所述的目的。
VHH结构域(单独或作为较大多肽的一部分)提供许多优于使用常规VH及VL结构域、scFv或常规抗体片段(例如Fab-或F(ab’)2-片段)的显著优势：
-仅需要单一结构域以高亲和力及高选择性结合抗原，从而使得既不需要存在两个单独结构域，也不需要确保该两个结构域以适当空间构象及构型存在(例如scFv一般需要使用经特别设计的连接子)；
-VHH结构域可由单一基因表达且不需要翻译后折叠或修饰；
-VHH结构域可容易地改造成多价及多特异性格式；
-VHH结构域高度可溶且无聚集趋势；
-VHH结构域对热、pH、蛋白酶及其他变性剂或条件高度稳定，且因此可在制备、储存或运输中不使用冷冻设备，从而达成节约成本、时间及环境；
-VHH结构域易于制备且相对廉价，甚至在生产所需的规模上亦如此；
-VHH结构域与常规四肽链结构抗体或其抗原结合片段相比相对较小(大约15kDa或大小为常规IgG的1/10)，因此相比于常规四肽链结构抗体或其抗原结合片段，显示较高的组织渗透性且可以较高剂量给药；
-VHH结构域可显示腔结合性质(尤其由于与常规VH结构域相比其延长的CDR3环)，从而可到达常规四肽链结构抗体或其抗原结合片段不可到达的靶及表位。
获得结合特定抗原或表位的VHH的方法，先前已公开于以下文献中：R.van der Linden et al.，Journal of Immunological Methods，240(2000)185-195；Li et al.，J Biol Chem.，287(2012)13713-13721；Deffar et al.，African Journal of Biotechnology Vol.8(12)，pp.2645-2652，17June，2009和WO94/04678。
“Fc变异体”或“变异体Fc”意指在Fc结构域中包含氨基酸修饰的蛋白质。本公开的Fc变异体根据构成其的氨基酸修饰来定义。因此，举例来说，S228P或228P是相对于亲本Fc多肽在位置228处具有脯氨酸取代的Fc变异体，其中编号是根据EU索引。WT氨基酸的身份可以不指明，在此情况下前述变异体称为228P。
“人源化”的例子包括可将源自骆驼科的VHH结构域通过以人常规四肽链结构抗体VH结构域中相应位置处存在的一个或多个氨基酸残基置换原始VHH序列的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基而“人源化”，涵盖通过提供VHH改良性质的一个或多个突变对序列进行的其他修饰，例如移除潜在的翻译后修饰位点。人源化VHH结构域可含有一个或多个完全人框架区序列，且在一些具体实施方案 中，可含IGHV3的人框架区序列。“人源化”的又一例子包括将异源的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体构架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量异源蛋白成分，从而诱导的强烈的抗体可变抗体反应。人源化方法例如蛋白表面氨基酸人源化(resurfacing)及抗体人源化通用框架移植法(CDR grafting to a universal framework)，即将CDR“移植”于其他“支架”(包括但不限于人支架或非免疫球蛋白支架)上。适于所述CDR移植的支架及技术在本领域中是已知的。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库，以及在Kabat，E.A.等人，1991Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。此外，为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少回复突变或回复突变，以保持活性。
“亲和力成熟”的PD-1结合蛋白或PD-1抗体，在一个或多个CDR中具有一个或多个变化，所述变化导致对抗原的亲和力相比于其亲本抗体有所增加。亲和力成熟的抗体可通过例如由以下所述的本领域中已知的方法来制备：Marks等人，1992，Biotechnology 10：779-783或Barbas等人，1994，Proc.Nat.Acad.Sci，USA 91：3809-3813.；Shier等人，1995，Gene 169：147-155；Yelton等人，1995，Immunol.155：1994-2004；Jackson等人，1995，J.Immunol.154(7)：3310-9；及Hawkins等人，1992，J.MoI.Biol.226(3)：889896；KS Johnson及RE Hawkins，“Affinity maturation of antibodies using phage display”，Oxford University Press 1996。
通常，本公开的PD-1结合蛋白将以如于Biacore或KinExA或Fortibio测定中测量的优选10 -7至10 -10摩尔/升(M)、更优选10 -8至10 -10摩尔/升、甚至更优选10 -9至10 -10或更低的解离常数(KD)，和/或以至少10 -7M、优选至少10 -8M、更优选至少10 -9M，更优选至少10 -10M的缔合常数(KA)结合所要结合的抗原(即PD-1)。任何大于10 -4M的K D值一般都视为指示非特异性结合。抗原结合蛋白对抗原或表位的特异性结合可以以已知的任何适合方式来测定，包括例如本公开所述的表面等离子体共振术(SPR)测定、Scatchard测定和/或竞争性结合测定(例如放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)及夹心式竞争性测定。
当“竞争”用于竞争相同表位的抗原结合蛋白(例如抗原结合蛋白或抗体)的情况中时，意指在抗原结合蛋白之间竞争，其通过以下测定法来测定：待检测的抗原结合蛋白(例如抗体或其免疫学功能片段)防止或抑制(例如降低)参考抗原结合蛋白(例如配体或参考抗体)与共同抗原(例如PD-1抗原或其片段)的特异性结合。众多类型的竞争性结合测定可用于确定一种抗原结合蛋白是否与另一种竞争，这些测定例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见例如Stahli等，1983，Methodsin Enzymology 9：242-253)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见例如Kirkland等，1986，J.Immunol.137：3614-3619)、固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见例如Harlow和Lane，1988，Antibodies，A Laboratory Manual(抗体，实验室手册)，Cold Spring Harbor Press)；用I-125标记物的固相直接标记RIA(参见例如Morel等，1988，Molec.Immunol.25：7-15)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见 例如Cheung，等，1990，Virology176：546-552)；和直接标记的RIA(Moldenhauer等，1990，Scand.J.Immunol.32：77-82)。通常所述测定法涉及使用能与带有未标记的检测抗原结合蛋白及标记的参考抗原结合蛋白结合的纯化抗原(所述抗原在固态表面或细胞表面上)。在待测抗原结合蛋白存在下，测量结合于固态表面或细胞的标记的量，来测量竞争性抑制。通常，待测抗原结合蛋白是过量存在的。由竞争性测定(竞争抗原结合蛋白)鉴定的抗原结合蛋白包括：与参考抗原结合蛋白相同的表位发生结合的抗原结合蛋白；以及，与充分接近参考抗原结合蛋白结合的表位所邻近的表位发生结合的抗原结合蛋白，所述两个表位在空间上互相妨碍结合的发生。在本公开实施例中提供关于用于测定竞争性结合的方法的其它详细资料。通常当竞争的抗原结合蛋白过量存在时，其将抑制(例如降低)至少40-45％、45-50％、50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％或75％或更多参考抗原结合蛋白与共同抗原的特异性结合。在某些情况下，结合被抑制至少80-85％、85-90％、90-95％、95-97％或97％或更多。
“交叉反应”是指本公开的PD-1结合蛋白与来自不同物种的PD-1或其表位结合的能力。例如，结合人PD-1的本公开的单域抗体或衍生蛋白也可以结合另一物种的PD-1。交叉反应性是通过在结合测定(例如SPR和ELISA)中检测与纯化抗原的特异性反应性，或与生理表达PD-1的细胞的结合或功能性相互作用来测量。确定交叉反应性的方法包括如本公开所述的标准结合测定，例如表面等离子体共振(SPR)分析，或流式细胞术。
“抑制”或“阻断”可互换使用，并涵盖部分和完全抑制/阻断这两者。
“抑制生长”(例如涉及细胞)旨在包括细胞生长任何可测量的降低。
“表位”或可互换使用的“抗原决定簇”指抗体的互补位所结合的抗原上的任何抗原决定簇。抗原决定簇通常包含分子的化学活性表面基团，例如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，表位通常以独特的空间构象包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个连续或非连续的氨基酸，其可以是“线性”表位或“构象”表位。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用的点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用的点跨越彼此分开的蛋白质氨基酸残基而存在。可使用本领域中熟知的许多表位定位技术鉴别给定抗原的表位(例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)，US4708871)。可使用本领域技术人员已知的常规技术，就与相同表位的结合竞争性筛选抗体。例如，可进行竞争和交叉竞争研究，以获得彼此竞争或交叉竞争与抗原结合的抗体(高通量筛选方法如参见WO03/48731)。因此，可使用本领域技术人员已知的常规技术，获得与本公开的抗体分子竞争结合PD-1上的相同表位的抗体及其抗原结合片段。
“特异性结合”、“选择性结合”是指抗体与预定的抗原上的表位结合。通常，当使用重组人PD-1或其表位作为分析物并使用抗体作为配体，在仪器中通过表面等离子体共振(SPR)技术测定时，抗体以大约低于10 -7M或甚至更小的平衡解离常数(K D)与预定的抗原或其表位结合，并且其与预定抗原或其表位结合的 亲和力是其与预定抗原(或其表位)或紧密相关的抗原之外的非特异性抗原(如BSA等)结合的亲和力的至少两倍。“识别抗原的抗体”在本文中可以与“特异性结合的抗体”互换使用。
“保守修饰”或“保守取代”适用于氨基酸和核苷酸序列。对于特定的核苷酸序列，保守修饰或保守取代是指编码相同或基本相同的氨基酸序列的那些核酸的相互置换，或在核苷酸不编码氨基酸序列的情况下，是指基本上相同的核苷酸序列。对于氨基酸序列，保守修饰或保守取代是指具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸置换多肽中的氨基酸，使得可频繁进行改变且对多肽的功能、活性或其他生物性质影响较小或基本上无影响。本领域技术人员知晓，一般而言，多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等(1987)MolecμLar Biology of the Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224页，(第4版))。
上述保守氨基酸替换在本领域中是公知的，例如保守氨基酸替换优选是以下组(i)-(v)内的一个氨基酸被同一组内的另一氨基酸残基所取代：
(i)较小脂族非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro及Gly；
(ii)极性带负电残基及其(不带电)酰胺：Asp、Asn、Glu及Gln；
(iii)极性带正电残基：His、Arg及Lys；(iv)较大脂族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val及Cys；及
(v)芳族残基：Phe、Tyr及Trp。
特别优选地保守氨基酸取代如下：Ala被Gly或Ser取代；Arg被Lys取代；Asn被Gln或His取代；Asp被Glu取代；Cys被Ser取代；Gln被Asn取代；Glu被Asp取代；Gly被Ala或Pro取代；His被Asn或Gln取代；Ile被Leu或Val取代；Leu被Ile或Val取代；Lys被Arg、Gln或Glu取代；Met被Leu、Tyr或Ile取代；Phe被Met、Leu或Tyr取代；Ser被Thr取代；Thr被Ser取代；Trp被Tyr取代；Tyr被Trp或Phe取代；Val被Ile或Leu取代。
“氨基酸突变”包括氨基酸取代、缺失、插入、修饰及其任意组合，以使得最终构建体拥有期望的特性，例如增强的稳定性、提高的活性。氨基酸序列缺失和插入包括氨基和/或羧基端缺失和氨基酸插入。优选的氨基酸突变是氨基酸取代。为了改变例如抗PD-1抗体的结合特性，可以将非保守性的氨基酸取代，即将一个氨基酸用具有不同结构和/或化学特性的另一种氨基酸替换。优选的氨基酸取代包括用亲水性氨基酸替换疏水性氨基酸。氨基酸取代包括由非天然存在的氨基酸或由20种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物(例如4-羟脯氨酸、3-甲基组氨酸、鸟氨酸、高丝氨酸、5-羟赖氨酸)替换。可以使用本领域中公知的遗传或化学方法生成氨基酸突变，包括定点诱变、PCR、基因合成、化学修饰等方法。氨基酸突变可以发生在抗体的CDR区、FR区或Fc区。
“回复突变”是指将人抗体来源的FR区氨基酸残基突变成原始来源抗体对应位置的氨基酸残基，通常是为了避人源化抗体引起的免疫原性下降的同时，引起的活性下降，对所述的人源化抗体可变区可进行最少回复突变，以保持抗体的活 性。
本公开的“PD-1结合蛋白”或“PD-1抗体”可以例如缀合的方式包含一个或多个效应分子。所述“效应分子”包括例如抗肿瘤剂、药物、毒素、生物活性蛋白(例如酶)、其它抗体或抗体片段、合成或天然存在的聚合物、核酸及其片段(例如DNA、RNA及其片段)、放射性核素，特别地放射性碘化物、放射性同位素、螯合金属、纳米颗粒和报道基团例如荧光化合物或可通过NMR或ESR光谱分析检测的化合物。当效应分子是聚合物时，其通常可以是合成或天然存在的聚合物，例如任选地取代的直链或支链聚亚烷基、聚亚烯基或聚氧化亚烷基聚合物或分支多糖或未分支多糖，例如同聚或异聚多糖。可存在于上述合成聚合物上的具体的任选取代基包括一个或多个羟基、甲基或甲氧基。合成聚合物的具体实例包括任选地取代的直链或支链聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(乙烯醇)或其衍生物，特别地任选地取代的聚(乙二醇)例如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。具体的天然存在的聚合物包括乳糖、直链淀粉、葡聚糖、糖原或其衍生物。聚合物与PD-1结合蛋白或PD-1抗体的缀合方式可以通过常规方法实现。在一个实施方案中，聚合物是白蛋白或其片段，例如人血清白蛋白或其片段。另一个实施方案中，对本公开的PD-1抗体进行聚乙二醇化(PEG化)修饰，以例如为了增强半衰期。PEG是在一端与羟基连接的直链或支链聚醚，并且具有下列常规结构：HO-(CH 2CH 2O) n-CH 2CH 2-OH。为了使PEG与分子(多肽、多糖、多核苷酸和小的有机分子)偶联，可以通过制备一些或两个末端具有官能团的PEG的衍生物来活化PEG。蛋白的PEG缀合的常见途径是用官能团活化PEG，该官能团适合与赖氨酸和N-末端氨基酸基团的反应。尤其是，参与缀合的常见反应基团是赖氨酸的α或ε氨基。聚乙二醇化连接基与蛋白的反应可导致PEG部分主要在下列位点处的连接：蛋白的N-末端的α氨基、赖氨酸残基侧链上的ε氨基、或组氨酸残基侧链上的咪唑基。由于大部分重组蛋白质具有单个α和许多ε氨基和咪唑基，可以根据连接基团的化学性质，产生许多位置异构体。
“序列”(例如在“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“单一可变结构域序列”、“VHH序列”或“蛋白序列”等的术语中)一般应理解为既包括相关氨基酸序列，又包括编码所述序列的核酸序列或核苷酸序列，除非本公开需要进一步限定的解释。
“多核苷酸”或“核酸”指任何长度的核苷酸链，包括DNA和RNA。核苷酸可为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基和/或其类似物、或者可通过DNA或RNA聚合酶掺入链内的任何底物。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸及其类似物。如果存在的话，可在链组装之前或链组装之后赋予对核苷酸结构的修饰。多核苷酸还可含有本领域一般已知的核糖或脱氧核糖糖的类似形式，包括例如2′-O-甲基-、2′-O-烯丙基、2′-氟-或2′-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α-或β-异头糖、差向异构糖(如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖)、无环类似物和无碱基核苷类似物如甲基核糖苷。
“同源性”或“同一性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如 果两个DNA分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100％的函数。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60％同源。一般而言，当比对两个序列而得到最大的同源性百分率时进行比较。
“核酸分子”与“多核苷酸”可互换使用，其是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，优选是双链DNA。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。
“载体”意指能够在宿主细胞中递送并且在一些实施例中表达一种或多种目的基因或序列的构建体。载体的例子包括但不限于病毒载体、裸露DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂结合的DNA或RNA表达载体、包封在脂质体中的DNA或RNA表达载体、以及某些真核细胞如生产细胞。
“宿主细胞”包括各个细胞或细胞培养物，其可为或已是用于掺入多核苷酸插入片段的载体的接受者。宿主细胞包括单个宿主细胞的子代，并且由于天然、偶然或有意的突变，子代可不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态学或基因组DNA互补体中)。宿主细胞包括用本公开的多核苷酸在体内转染和/或转化的细胞。“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这类名称都包括其后代；例如，包括与最初转化细胞中筛选的亲本细胞具有相同功能或生物学活性的突变后代。
“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述活性成分或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
“药学可接受的载体”或“药学可接受的赋形剂”包括当与活性成分组合时，允许该成分保留生物学活性并且不与受试者的免疫系统反应的任何材料。例子包括但不限于任何标准药物载体，例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳剂如油/水乳剂、和各种类型的润湿剂。在一些实施例中，用于气雾剂或肠胃外施用的稀释剂是磷酸盐缓冲盐水(PBS)或生理(0.9％)盐水。包含此类载体的组合物通过众所周知的常规方法配制(参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，A.Gennaro，编辑，Mack PublishingCo.，Easton，PA，1990；以及R Remington，The Science and Practice of Pharmacy第20版Mack Publishing，2000)。
“癌症”和“癌性”和“肿瘤”指向或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌，淋巴瘤，母细胞瘤，肉瘤和白血病或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更具体例子包括但不限于鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)，肺癌(包括小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺的腺癌，和肺的鳞癌)，腹膜癌，肝癌，肝细胞癌，胃癌(包括胃肠癌和胃肠基质癌)，胰腺癌，成胶质细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，膀胱癌，尿道癌，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺癌，肾癌，前列腺癌，外阴癌， 甲状腺癌，肛门癌，阴茎癌，黑素瘤(浅表扩散性黑素瘤，恶性雀斑样痣黑素瘤，肢端黑素瘤，结节性黑素瘤)，多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，急性成淋巴细胞性白血病(ALL)，毛细胞性白血病，慢性成髓细胞性白血病，和移植后淋巴增殖性病症(PTLD)，以及与瘢痣病(phakomatoses)，水肿(诸如与脑瘤有关的)和梅格斯氏(Meigs)综合征有关的异常血管增殖，脑瘤和脑癌，以及头颈癌，及相关转移。在某些实施方案中，适合于通过本公开的PD-1结合蛋白来治疗的癌症包括乳腺癌，结肠直肠癌，直肠癌，非小细胞肺癌，成胶质细胞瘤，非何杰金氏淋巴瘤(NHL)，肾细胞癌，前列腺癌，肝癌，胰腺癌，软组织肉瘤，卡波西(Kaposi)氏肉瘤，类癌癌(carcinoid carcinoma)，头颈癌，卵巢癌，间皮瘤，和多发性骨髓瘤。一些实施方案中，癌症选自：非小细胞肺癌，成胶质细胞瘤，成神经细胞瘤，黑素瘤，乳腺癌(例如三重阴性乳腺癌)，胃癌，结肠直肠癌(CRC)，和肝细胞癌。一些实施方案中，癌症选自：非小细胞肺癌，结肠直肠癌，成胶质细胞瘤和乳腺癌(例如三重阴性乳腺癌)，包括那些癌症的转移性形式。
“增殖性病症”指与一定程度的异常细胞增殖有关的病症。在一个实施方案中，增殖性病症指癌症。
“肿瘤”指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。“癌症”、“癌性”、“增殖性病症”和“肿瘤”在本公开中提到时并不互相排斥。
“预防癌症”是指在受试者中延迟、抑制或防止癌症发作，所述受试者中癌症发生或肿瘤发生的起始尚未得到证实，但是通过例如遗传筛查或其它方法确定，已鉴定了癌症易感性。该还包括治疗具有癌变前病症的受试者以终止所述癌变前病症向恶性肿瘤的进展或导致其消退。
“给予”、“施用”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触，例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“给予”、“施用”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。
“治疗”意指给予受试者内用或外用治疗剂，诸如包含本公开的任一种抗体或其药物组合物作为治疗剂，所述受试者已经患有、疑似患有、倾向于患有一种或多种增殖性疾病或其症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗受试者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，无论是通过诱导这类症状退化还是抑制这类症状发展到任何临床能测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如受试者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在受试者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。尽管本公开的实施方案(例如 治疗方法或制品)在缓解某个受试者中目标疾病症状方面可能无效，但是根据本领域已知的任何统计学检验方法如Student t检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定，其在统计学显著数目的受试者中应当减轻目标疾病症状。
“有效量”包含足以改善或预防医学病症的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于受试者的有效量可依据以下因素而变化：如待治疗的病症、受试者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。本公开的受试者可以是动物或人类受试者。
“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生的场合。
如本公开所用的“受试者”、“患者”意指哺乳动物，尤其灵长类动物，尤其是人。
除非另有指明，本公开中所用的单数形式也涵盖其复数形式。
具体实施方案
以下结合实施例用于进一步描述本公开，但这些实施例并非限制着本公开的范围。本公开实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如冷泉港的抗体技术实验手册，分子克隆手册；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
实施例1：PD-1抗原及检测用蛋白的制备
PD-1抗原设计：
以人PD-1作为PD-1模板，设计PD-1抗原及检测用蛋白的氨基酸序列(以下PD-1抗原未特殊说明的均指人PD-1)。
人PD-1全长蛋白：
(注释：双横线部分为信号肽(Signal peptid)；划横线部分为PD-1胞外区(Extracellular domain)，其中35-144位为Ig-like V-type 1Domain，70-77位为Interaction with CD274；点划线部分为跨膜区部分(Transmembrane domain)；斜体部分为胞内区(Cytoplasmic domain)。)
SEQ ID NO：1；
猴PD-1全长氨基酸序列：
(注释：双横线部分为信号肽；划横线部分为PD-1胞外区，其中38-127位为V-Set Domain，39-125位为Ig-like；点划线部分为跨膜区部分(Transmembrane domain)；斜体部分为胞内区(Cytoplasmic domain)。)
SEQ ID NO：2；
筛选及检测用人PD-1抗原(为商业化产品(Sino Biological Cat.10377-H08H))：
(注释：划横线部分为PD-1胞外区；斜体部分为His-tag标记。)
SEQ ID NO：3；
筛选及检测用人PD-1-Fc抗原(为商业化产品(百英生物：B3789))：
(注释：划横线部分为胞外区；斜体部分为human Fc标记。)
SEQ ID NO：4；
检测用人PD-L1抗原(为商业化产品(Sino Biological cat ：10084-H08H-B))：
(注释：划横线部分为PD-L1胞外区；斜体部分为His-tag标记。)
SEQ ID NO：5；
检测用人PD-L2抗原(为商业化产品(Sino Biological cat：10292-H08H-B))：
(注释：划横线部分为PD-L2胞外区；斜体部分为His-tag标记。)
SEQ ID NO：6。
实施例2.特异性结合人PD-1的阳性抗体序列的筛选
人PD-1蛋白(ACRO，Cat#PD-1-H5259和ACRO，Cat#PD-1-H5221)分别免疫两头双峰驼(Camelus dromedarius)，取免疫前的骆驼血清5mL并分离血清。将弗氏完全佐剂与抗原体积1：1混合后，对骆驼进行皮下多点免疫(免疫剂量为100μg蛋白/只/每次，第一次为弗氏完全佐剂，剩下的为弗氏不完全佐剂)。每两周进行一次加强免疫，免疫四次后测定效价。用5μg/mL PD-1-his蛋白包被平板(100μL/孔)，4℃过夜。第二天洗涤之后加入4％的脱脂奶粉进行封闭，37℃，2h。洗涤后加入不同梯度稀释的骆驼的血清，37℃，1h进行孵育。阴性对照为免疫前血清(1：1000稀释)和PBS溶液。孵育结束后用PBST洗涤三遍，加入HRP-抗骆驼抗体(1：5000稀释)，37℃孵育1小时。最后洗涤加入碱性磷酸酶显色液，用2M硫酸进行终止，450nm波长读取吸收值。1：25600倍稀释后检测到效价。效价合格，采集骆驼外周血进行建库。
骆驼外周血分离淋巴细胞，细胞计数为1.2×10 8，加入Trizol试剂重悬(1×10 7个细胞/mL Trizol)，以裂解细胞，冰上放置5min；13000rpm离心3min，取上清，弃沉淀；加入1/5体积的氯仿，剧烈震荡30-60s，冰浴静置2min；13000rpm离心10min，吸取上层水相层至新的1.5mL管中；加入等体积的异丙醇，混匀，-20℃静置30min；13000rpm离心10min，去掉上清，保留沉淀；加入预冷的75％乙醇洗涤沉淀，室温放置5-10min；加入RNA酶去除的去离子水600μL，复溶，得到RNA，逆转录得到cDNA，进行噬菌体文库的构建。
通过噬菌体库的筛选来获得与PD-1抗原蛋白具有高亲和力的单域抗体，用20μg的PD-1-avi-生物素蛋白结合1mg Dynabeads MyOne链霉亲和素T1，37℃放置一小时后用2％脱脂奶室温封闭2小时，加入骆驼重链单域抗体噬菌展示文库，在室温下作用1小时。用PBST(0.05％Tween-20)溶液洗9遍，去除不结合的噬菌体。用1mg/mL的胰蛋白酶将与PD-1特异性结合的噬菌体洗脱，并感染处于对数期生长的大肠杆菌TG1，产生并纯化噬菌体用于下一轮筛选。相同筛选过程重复2-3轮后。阳性的克隆被富集。
从筛选富集的阳性克隆中挑取96个单克隆菌落包装成噬菌体单链抗体，用于噬菌体ELISA测试。ELISA板上分别包被2μg/mL的PD-1-his蛋白，加入封闭液稀释的噬菌体上清，用抗M13HRP检测。将ELISA结合测试到中OD450值大于0.5的克隆进行测序，得到51个特异性序列。
实施例3.完整单克隆抗体的构建
将实施例2通过噬菌体库筛选得到的51个特异性序列构建完整抗体，之后通过ELISA结合实验和ELISA竞争实验，确定其中25个抗体结合能力强，并能抑制PD-1与PD-L1的相互作用，结果如表1所示。
表1.PD-1抗体的ELISA检测结果
抗体编号 OD450 抗体编号 OD450 抗体编号 OD450
2# 1.71 56# 1.6633 109# 1.7868
4# 1.7036 59# 1.697 112# 1.6533
6# 1.8356 61# 1.7869 113# 1.4008
7# 1.7844 62# 1.7721 114# 1.5921
11# 1.5262 68# 1.6568 118# 1.5299
19# 1.6879 104# 1.765 122# 1.6316
32# 1.869 106# 1.7502 123# 1.5266
41# 1.4095 107# 1.659 Opdivo(阳性对照) 1.7387
54# 1.5173 108# 1.7068 PBS(阴性对照) 0.161
其完整的VHH序列如下：
以上序列SEQ ID NO：7-33中，顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜体为FR序列，下划线分别为CDR1、CDR2、CDR3序列。本公开提供的PD-1抗体的编号规则均为Kabat，将CDR序列总结如表2。
表2.PD-1单域抗体的CDR序列
将抗体序列融合一个人IgG1-Fc(CH2-CH3)段序列，并构建到PTT5表达载体中，所连接的人IgG1-Fc的序列可以如下所示：
以下是抗体序列融合人Fc(CH2-CH3)段的全蛋白序列，单下划线是人IgG1-Fc(CH2-CH3)段序列(SEQ ID NO：103所示)，双下划线为连接子序列。蛋白序列如下(以32#、7#、106#、107#号为例，其他PD-1抗体也一样)：
实施例4.PD-1抗体的人源化改造
通过对选定的特异性PD-1单域抗体分子进行三维结构同源建模，结合与V-base人种系序列序列数据库，IMGT人类抗体重链可变区种系基因数据库进行比对的结果，挑选与筛选出来的抗体同源性高的重链可变区种系基因作为模板，将骆驼来源单域抗体的CDR移植到相应的人源模板中，形成次序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可变区序列。对移植后的单域抗体再次进行三维结构模拟并分析，将FR区中影响CDR区结构形态的特定位点进行回复突变。获得的人源化具体序列如下：
如上序列所示，在人源化和回复突变的过程中，部分抗体的CDR发生变化，如7#_Hu_5有T35S的突变，获的YNFMS(SEQ ID NO：113)所示的CDR1序列；7#_Hu_6有F33Y和T35S的突变，获的YNYMS(SEQ ID NO：114)所示的CDR1序列；106_hu_1至6有A61D的突变，获的VVDRFGGTIYADSVKG(SEQ ID NO：71)所示的CDR2序列；112_hu_1有Y54F和A61D的突变，获的VVDRFGGIIYADSVKG(SEQ ID NO：93)所示的CDR2序列。
使用实施例4中的方法构建人源化PD-1单域抗体与hIgG1的Fc(CH2-CH3)段融合的全蛋白序列，单下划线是hIgG1-Fc(CH2-CH3)段序列(SEQ ID NO：103所示)，双下划线为连接子序列。蛋白序列如下(以32_hu_3-IgG1为例，其他人源化PD-1单域抗体也一样)：
使用实施例4中的方法构建人源化PD-1单域抗体与hIgG4的Fc(CH2-CH3)段融合的全蛋白序列，单下划线是hIgG4-Fc(CH2-CH3)段序列(SEQ ID NO：108所示)。
所连接的人IgG4-Fc的序列如下所示：
获得的抗体序列如下：
将质粒转染HEK293细胞，6天后收集表达上清，高速离心去除杂质，用Protein A柱进行纯化。用PBS平衡至A280读数降至基线。用pH 3.0-3.5的酸性洗脱液洗脱目的蛋白，用1M Tris-HCl，pH8.0-9.0中和。洗脱样品适当浓缩后，利用PBS平衡好的凝胶层析Superdex200(GE)进一步纯化，以去除聚体，收集单体峰，分装备用。经检测，获得本公开的PD-1单域抗体。
实施例5.PD-1抗体的糖基化改造及表达纯化
106#_hu_1_hIgG4序列中的CDR1( NKCMG)和CDR3(GSYTSA NSCQPDAL)中含有两个N-糖糖基化位点(NXC)，分别是N 31KC和N 104SC，通过mapping(如下实施例6的具体方法)分析得到CDR1中的NKC发生糖基化的比例是11％，CDR3中的NSC发生糖基化的比例是30％，因此将N 31进行如下氨基酸的突变：N 31-D/E/F/G/H/I/K/L/M/P/Q/R/S；N 104进行如下氨基酸的突变：N 104-A/E/F/G/H/K/P/Q/R/S；通过SPR(Biacore T200)的方法(如下实施例7的具体方法)筛选出亲和力变化不大的序列，分别是N 31-D/G和N 104-G/H。
其中106#_hu_1_hIgG4(N 31-D，N 104-G)命名为0076#_hIgG4；106#_hu_1_hIgG4(N 31-G，N 104-G)命名为0077#_hIgG4；106#_hu_1_hIgG4(N 31-D，N 104-H)命名为0078#_hIgG4；106#_hu_1_hIgG4(N 31-G，N 104-H)命名为0079#_hIgG4。CDR1和CDR2的序列总结如表3。
表3.糖基化改造PD-1抗体的CDR1、CDR2序列(CDR2的序列均为VVDRFGGTIYADSVKG(SEQ ID NO：71))
因此，本公开提供PD-1抗体，其CDR1为X 22KCMG(SEQ ID NO：152)，其中，X 22选自N、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R或S；CDR2为VVDRFGGTIYADSVKG(SEQ ID NO：71)；CDR3为GSYTSAX 23SCQPDAL(SEQ ID NO：153)，其中，X 23选自N、A、E、F、G、H、K、P、Q、R或S。
106#_hu_1糖基化改造后获得的抗体序列示例如下：
构建质粒转染Expi-CHO细胞，培养9天后收集表达上清，高速离心去除杂质，用Protein A柱进行纯化。用PBS平衡至A280读数降至基线。用pH3.0-3.5的酸 性洗脱液洗脱目的蛋白，用1M Tris-HCl，pH8.0-9.0中和。洗脱样品适当浓缩后，利用PBS平衡好的凝胶层析Superdex200(GE)进一步纯化，以去除聚体，收集单体峰，分装备用。经检测，制备获得本公开的PD-1抗体。
实施例6.PD-1抗体的质谱分析与糖基化分析
仪器设备：美国Agilent Q TOF 6530质谱仪，配有Dual AJS ESI离子源及数据分析软件Agilent MassHunter BioConfirm Software B.08.00，美国Agilent公司Agilent 1290Infinity高效液相色谱系统。
色谱条件：色谱柱为Agilent AdvanceBio C18(2.1x150mm，2.7um)肽谱分析色谱柱；流动相：A相为100％H2O-0.1％FA，B相为100％ACN-0.1％FA；色谱洗脱梯度为0-65min 3％-35％B；65-68min 35％-95％B；68-70min 95％B；70-72min 95％-3％B；72-75min 3％B；流速为0.4mL/min；柱温60℃；进样量20ul。
质谱参数：质谱离子源为Dual AJS ESI电喷雾离子源；离子喷射电压:3.5KV；Gas temperature:250℃；Sheath Gas temperature:350℃；Sheath Gas Flow:12l/min；Drying Gas:10l/min；Nebulizer:35psi；正离子方式检测；质量数范围为m/z 200-3000；采集速率为每秒钟5张质谱图；分离峰宽：中等(约4m/z)。
样品处理：每份样品中加入一定量的盐酸胍，加入还原剂DTT使得终浓度为20mmol/L，60℃孵育1h；加入烷化剂IAM使得终浓度为40mmol/L，避光反应1h；然后分别稀释样品至盐酸胍浓度在2mol/L以下，按照蛋白：胰蛋白酶质量比25:1加入胰蛋白酶，37℃过夜。
数据处理：使用数据分析软件Agilent MassHunter BioConfirm Software B.08.00处理LC/MS/MS中采集的原始数据。在mAb序列中搜索结果，序列中包括烷基化(C)、氧化(M)、脱酰氨基化(NQ)、焦谷氨酸化(E)和糖基化(N)各种常见的修饰；质谱匹配的允许误差为±20ppm，MS/MS匹配的允许误差为±50ppm。允许两处胰蛋白酶漏切位点。结果如表4所示。
结果显示，106#_hu_1_hIgG4有三个糖基化修饰，而且VHH段的糖基化比例分别是11％和30％，导致了抗体蛋白的不均一性。改造后的0076#_hIgG4抗体只有一个糖基化修饰位点，蛋白均一性好。
表4.PD-1抗体的糖基化修饰比例
实施例7.PD-1抗体与PD-1蛋白结合的亲和力测定
为检测筛选到的PD-1单域抗体对于人PD-1蛋白和猴PD-1的体外结合能力，人PD-1(Sino Biological Cat.10377-H08H)和猴PD-1(Sino Biological Cat.90311-C08H)被用于通过ELISA结合实验进行体外结合检测。
本实施例的阴性对照为PBS，阳性对照使用Opdivo(购自上海睿智化学 (chempartner)lot：180612001)，以及，部分实验使用了WO2017054646中的IgG4型PD-1Ab646(以下简称PD-1Ab646)作为阳性对照，序列如下：
PD-1抗体重链：
PD-1抗体轻链：
用pH7.4的PBS缓冲液将带PD-1抗体蛋白稀释至2μg/mL，以100μL/孔的体积加入96孔酶标板(corning，9018 25/box 96well clear flat bottom plate)中，于4℃放置过夜16-20小时。弃去液体后，用PBST(PH7.4，0.05％Tween-20)缓冲液洗板三次后，加入用PBS缓冲液稀释的2％BSA封闭液(300μL/孔)，37℃孵育箱孵育2小时进行封闭。封闭结束后，弃去封闭液，并用PBST缓冲液洗板3次后，加入初始浓度为30μg/mL的PD-1抗原(Sino Biological Cat.10377-H08H)蛋白，用PBS缓冲液三倍比稀释8个梯度，置于37℃孵育箱孵育1小时。孵育结束后，弃去酶标板中的反应液，用PBST洗板6次，每孔加入100μL/HRP标记的抗his的二抗(Abcam ab1187)(1:5000稀释)，37℃孵育1小时。用PBST洗板6次后，加入100μLTMB显色底物，室温孵育3-5min，加入100μL1M硫酸终止反应，用SpectraMax M5酶标仪在450nm处读取吸收值，计算抗体对抗原的结合EC 50值。部分抗体的EC 50结果如表3所示。结果显示，其均能与人、猴PD-1抗原有较好的结合力。
表5.PD-1抗体与人、猴PD-1抗原的结合力EC 50(nM)
抗体编号 结合人PD-1的EC 50 结合猴PD-1的EC 50
7# 1.86 2.2
32# 1.99 4.8
32#_hu_1 4.08 6.2
32#_hu_2 3.43 2.3
32#_hu_3 2.98 1.2
61# 1.85 /
106# 2.56 0.67
107# 3.14 2.9
112# 2.51 1.5
阳性对照(Opdivo) 1.69 2.88
阴性对照(PBS) 0 0
(注：“/”表示未检测到)
此外，还通过Biacore 8K(GE Healthcare)仪器测定PD-1抗体与PD-1蛋白的解离常数。首先将抗人IgG Fc抗体(GE Healthcare，Cat.#BR-1008-39)共价偶联到CM5S系列芯片上，待检测PD-1抗体通过亲和捕获至芯片表面，然后于芯片表面流过不同浓度的PD-1蛋白(SEQ ID NO：3)，利用Biacore仪器实时检测反应信号从而获得结合解离曲线，通过拟合获得结合力常数。实验使用溶液为HBS-P溶液(10mM HEPES，150mM NaCl，0.005％P20，pH 7.4)。每个实验循环结束时，用3M MgCl 2溶液将芯片洗净再生。部分抗体的亲和力结果如表6所示。结果显示，本公开筛选获得的抗体与PD-1的亲和力与阳性对照相当。
表6.PD-1抗体与PD-1的亲和力
抗体编号 抗原 k a(1/Ms) k d(1/s) K D(M)
7# PD-1 1.36E+05 2.81E-04 2.06E-09
32# PD-1 3.25E+05 2.07E-03 6.35E-09
32#_hu_1 PD-1 1.79E+05 2.91E-03 1.63E-08
32#_hu_2 PD-1 1.67E+05 1.56E-03 9.36E-09
32#_hu_3 PD-1 2.20E+05 2.01E-03 9.11E-09
32#_hu_4 PD-1 1.75E+05 3.53E-03 2.02E-08
32#_hu_5 PD-1 1.62E+05 3.19E-03 1.96E-08
61# PD-1 1.54E+05 8.19E-04 5.33E-09
61#_hu_1 PD-1 2.26E+05 4.61E-03 2.04E-08
106# PD-1 7.94E+04 4.77E-04 6.01E-09
107# PD-1 9.65E+04 7.82E-04 8.10E-09
Opdivo PD-1 5.91E+05 1.45E-03 2.45E-09
此外，还使用Biacore T200(GE Healthcare)仪器测定PD-1抗体与PD-1蛋白的解离常数。将proteinA(雅心RSPA05)共价偶联到CM5S series芯片上，待检测抗体通过亲和捕获至芯片表面，然后于芯片表面流过不同浓度的PD-1蛋白(Sino Biological Cat.10377-H08H)，实时检测反应信号从而获得结合解离曲线，通过拟合获得结合力常数。实验使用溶液为HBS-EP溶液(10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.005％P20，pH 7.4)。每个实验循环结束时，用10mM甘氨酸，PH＝1.5(GE，BR-1003-54)溶液将芯片洗净再生。结果参见表7和表8。
表7.PD-1抗体与人PD-1的亲和力K D
抗体编号 k a(1/Ms) k d(1/s) K D(M)
32#_hu_3_hIgG4 1.05E+05 2.01E-03 1.92E-08
7#_hu_4_hIgG4 4.72E+04 5.84E-03 1.24E-07
106#_hu_1_hIgG4 8.17E+03 7.05E-04 8.63E-08
107#_hu_4_hIgG4 9.40E+03 1.20E-03 1.28E-07
PD-1Ab646 6.18E+04 4.79E-04 7.75E-09
表8.PD-1抗体与PD-1的亲和力K D
抗体编号 亲和力等级
106#_hu_1_hIgG4 ++
106#_hu_1_hIgG4(N 31-D) ++
106#_hu_1_hIgG4(N 31-E) ++
106#_hu_1_hIgG4(N 31-F) +
106#_hu_1_hIgG4(N 31-G) ++
106#_hu_1_hIgG4(N 31-H) +
106#_hu_1_hIgG4(N 31-I) +
106#_hu_1_hIgG4(N 31-K) +
106#_hu_1_hIgG4(N 31-L) +
106#_hu_1_hIgG4(N 31-M) +
106#_hu_1_hIgG4(N 31-P) +
106#_hu_1_hIgG4(N 31-Q) +
106#_hu_1_hIgG4(N 31-R) +
106#_hu_1_hIgG4(N 31-S) +
106#_hu_1_hIgG4(N 104-A) +
106#_hu_1_hIgG4(N 104-E) +
106#_hu_1_hIgG4(N 104-F) +
106#_hu_1_hIgG4(N 104-G) ++
106#_hu_1_hIgG4(N 104-H) ++
106#_hu_1_hIgG4(N 104-K) +
106#_hu_1_hIgG4(N 104-P) +
106#_hu_1_hIgG4(N 104-Q) +
106#_hu_1_hIgG4(N 104-R) +
106#_hu_1_hIgG4(N 104-S) +
0076#_hIgG4 ++
0077#_hIgG4 ++
0078#_hIgG4 ++
0079#_hIgG4 ++
(注：“/”为检测具体数值未示出；亲和力等级“++”是指<3.00E-07，“+”是指≥3.00E-07)
实施例8.PD-1抗体阻断PD-1和PD-L1、PD-L2的结合
PD-1抗体的功能实验是通过阻断PD-1与PD-L1以及PD-L2之间结合的ELISA竞争实验来检测。
用PH7.4的PBS缓冲液稀释带Fc标签的PD-1融合蛋白至浓度为2μg/mL，以100μL/孔的体积加入96孔酶标板中，于4℃放置过夜16-20小时。弃去液体后，用PBST(PH7.4，0.05％Tween-20)缓冲液洗板三次后，加入用PBS缓冲液稀释的2％BSA封闭液300μL/孔，37℃孵育2小时进行封闭。封闭结束后，弃去封闭液，并用PBST缓冲液洗板3次后，加入带有生物素化的PD-L1和PD-L2蛋白，蛋白浓度为6μg/mL，每孔加入50μL，随后加入初始浓度为30μg/mL的PD-1抗体蛋白，用PBS缓冲液三倍比稀释6个梯度，置于37℃孵育箱孵育1小时。孵育结束后，弃去酶标板中的反应液，用PBST洗板6次，加入100μL/孔用PBS(0.5％BSA)稀释(1:500)的HRP标记的抗SA的二抗(Peroxidase-conjugated Streptavidin，Jackson 136861)，37℃孵育1小时。用PBST洗板6次后，加入100μL/孔TMB显色底物，于室温孵育3-5min，加入1M硫酸终止反应，用SpectraMax M5酶标仪在450nm处读取吸收值，计算抗体对抗原的结合IC 50值。部分抗体的IC 50结果如表4所示。结果显示，所述抗体均能与PD-L1和PD-L2竞争结合PD-1，阴性对照为PBS，阳性对照使用Opdivo(本公开使用的Opdivo均购自上海睿智化学(chempartner)lot：180612001)。部分抗体阻断PD-1与PD-L1结合的结果如表9、表10所示。
表9.不同PD-1抗体竞争PD-1抗原与PD-L1和PD-L2的IC 50(nM)
表10.不同PD-1抗体竞争PD-1抗原与PD-L1的IC 50(nM)
抗体编号 阻断PD-1与PD-L1结合的IC 50
32#_hu_3_hIgG4 2.42
7#_hu_4_hIgG4 1.22
106#_hu_1_hIgG4 3.14
PD-1Ab646 2.79
阴性对照(PBS) 9999
实施例9.PD-1抗体的体外细胞结合实验
将人PD-1全长基因PCR克隆到哺乳动物细胞表达载体pTargeT上，取线性化质粒电转染CHO-S细胞(电转仪自带的预设CHO细胞参数)，经1mg/ml G418筛选2周，再进行2次有限稀释，通过流式细胞分析仪检测细胞表面的PD-1基因， 选出单克隆细胞株高表达人PD-1。命名为CHO-PD-1。
收集稳定高表达PD-1的细胞系CHO-PD-1，每孔5×10 5细胞。梯度稀释PD-1抗体为16.67μg/mL、5.55μg/mL、1.85μg/mL、0.617μg/mL、0.205μg/mL、0.069μg/mL、0.023μg/mL，与CHO-PD-1冰上避光孵育1个小时。用PBS漂洗一次后，每孔加入FITC抗人IgG(1:100)冰上避光孵育1个小时。再用PBS漂洗一次后，以每管100μL PBS重悬，在BD C6Plus流式细胞分析仪上进行荧光检测。使用Graphpad Prism9软件进行对抗体各剂量处理所得的平均荧光强度进行曲线拟合并作图，以定量分析PD-1抗体与CHO-PD-1细胞的结合。结果显示，PD-1抗体与CHO-PD-1细胞的结合强度呈抗体剂量依赖性。
部分抗体的结合力EC 50结果如表11、表12和图1所示。结果显示，本公开筛选获得的抗体(如2#、32#、32#_hu_1、32#_hu_2、32#_hu_3、61#、32#_hu_3_hIgG4、7#_hu_4_hIgG4、106#_hu_1_hIgG4、107#_hu_4_hIgG4)与PD-1的结合力均显著优于阳性对照Opdivo。突变后的0076#_hIgG4和0078#_hIgG4等分子与PD-1的结合力相比106#_hu_1_hIgG4也没有降低。
本公开的阴性对照为NC时，其是与本公开PD-1抗体具有相同的恒定区IgG4，但可变区不识别抗原PD-1的抗体。阳性对照使用Opdivo。
表11.PD-1抗体与细胞表面抗原PD-1的结合EC 50
抗体 EC 50(nM)
阴性对照(NC) 637030
阳性对照(Opdivo) 66.3
2# 18.5
32# 2.9
32_hu_1# 7.3
32_hu_2# 4.8
32_hu_3# 6.1
61# 16.7
32#_hu_3_hIgG4 3.912
7#_hu_4_hIgG4 3.614
106#_hu_1_hIgG4 8.926
107#_hu_4_hIgG4 11.95
表12.PD-1抗体与细胞表面抗原PD-1的结合EC 50
抗体编号 EC 50(nM)
106#_hu_1_hIgG4 9.29
106#_hu_1_hIgG4(N 31-G) 4.76
106#_hu_1_hIgG4(N 31-D) 5.07
106#_hu_1_hIgG4(N 104-G) 5.21
106#_hu_1_hIgG4(N 104-H) 4.95
0076#_hIgG4 5.04
0078#_hIgG4 5.00
实施例10.PD-1抗体阻断细胞上的PD-1与PD-L1结合
收集稳定高表达PD-1的细胞系CHO-PD-1，调整至每孔5×10 5细胞。梯度稀释PD-1抗体为50μg/mL、16.67μg/mL、5.55μg/mL、1.85μg/mL、0.617μg/mL、0.205μg/mL、0.069μg/mL、0.023μg/mL，与CHO-PD-1细胞冰上共孵育1个小时。用PBS漂洗一次后，每管加入PD-L1-mIgG2a蛋白1μg/mL冰上孵育1小时，PBS再次清洗。清洗后每管加入PE抗小鼠IgG2a(1:300)冰上孵育1小时，用PBS漂洗一次后，以每管100uL PBS重悬，在BD C6Plus流式细胞分析仪上进行荧光检测。使用Graphpad Prism9软件进行对抗体各剂量处理所得的平均荧光强度进行曲线拟合并作图，以定量分析PD-1抗体阻断细胞上的PD-1与PD-L1结合。
结果显示，PD-1抗体能阻断PD-L1蛋白与CHO-PD-1细胞结合，呈现抗体剂量依赖性，部分抗体的阻断IC 50结果如表13、表14和图2所示。以及，本公开的抗体(如7、32、32_hu_1、32_hu_2、32_hu_3、106、107、112)，较之对照Opdivo有更强的阻断PD-L1与PD-1结合的能力。以及，突变后的0076#_hIgG4和0078#_hIgG4等分子阻断PD-L1与PD-1结合的能力相比106#_hu_1_hIgG4也没有降低。
表13.PD-1抗体阻断PD-L1蛋白与细胞表面抗原PD-1的IC 50(nM)
抗体编号 IC 50(nM)
7# 3.8
32# 2.3
32#_hu_1 6.2
32#_hu_2 4.3
32#_hu_3 4.3
61# 5.0
61#_hu_1 197.20
61#_hu_2 334.80
106# 4.8
107# 5.0
112 6.1
Opdivo 43.9
阴性对照(NC) 9999
表14.PD-1抗体阻断PD-L1蛋白与细胞表面抗原PD-1的IC 50(nM)
抗体编号 IC 50(nM)
106#_hu_1_hIgG4 9.38
106#_hu_1_hIgG4(N 31-G) 5.9
106#_hu_1_hIgG4(N 31-D) 6.1
106#_hu_1_hIgG4(N 104-G) 6.45
106#_hu_1_hIgG4(N 104-H) 6.47
0076#_hIgG4 4.5
0078#_hIgG4 5.5
阴性对照(NC) 9999
实施例11.PD-1抗体在体外解除PD-1/PD-L1阻断的免疫激活实验
收集内源稳定高表达PD-L1和TCR激活分子的CHO-PD-L1aAPC细胞系(购买自Promega，PD-1/PD-L1Blockade Bioassay，J1252)，用PD-L1阴性的CHO细胞作为对照，用完全培养基调整细胞密度为4×10 5/mL，每孔加入100uL，置于37℃5％CO 2的培养箱培养20-24小时。
测试当天使用分析培养基将PD-1抗体梯度稀释为1000、250、62.5、15.6、3.91、0.98、0.24、0.06nM，每个浓度设置2个复孔。
收集内源稳定高表达PD-1的效应细胞Jurkat-PD-1(购买自Promega，PD-1/PD-L1Blockade Bioassay，J1252)，该细胞同时内源稳定表达NFAT启动的荧光素酶报告基因，用分析培养基调整细胞密度为1.25×10 6/mL。
取出前一天接种CHO-PD-L1aAPC细胞的培养板，弃上清，将稀释好的抗体和调整好密度的效应细胞Jurkat-PD-1一次加入细胞培养板中，每孔各加入40uL，轻轻混匀，置于37℃5％CO 2的培养箱培养6小时。
在抗体孵育期间，将Bio-Glo TM Reagent(Promega)取出使其温度恢复至室温。混合培养完成后取出细胞培养板，室温静置5-10分钟，然后每孔加入80uL Bio-Glo TM Reagent，轻轻混匀，使用Molecular Device SpectraMax多功能酶标仪读取化学发光数值，得到的数据用Graphpad Prism9软件进行曲线拟合分析并作图。部分抗体结果如表15和图3所示。
结果显示，0076#_hIgG4与106#_hu_1_hIgG4均能很好的解除PD-1/PD-L1阻断的免疫激活，0076#_hIgG4的效果优于106#_hu_1_hIgG4。
表15.PD-1抗体解除PD-1/PD-L1阻断的免疫激活的IC 50
抗体编号 IC 50(nM)
106#_hu_1_hIgG4 29.18
0076#_hIgG4 14.25
实施例12.PD-1抗体在体外促进混合淋巴细胞分泌细胞因子
将人新鲜或复苏的PBMCs通过EasySep人CD14阳性筛选试剂盒(STEMCELL technologies，17858)分离CD14 +单核细胞。所分离的CD14 +细胞按照单核细胞衍生的树突细胞分化试剂盒(R&D system，CDK004)的方法，通过加入IL-4和GM-CSF因子诱导6天后，再加入TNF-α进一步诱导3天，成为成熟DC。
人PBMC通过EasySep人CD3阳性筛选试剂盒(STEMCELL technologies，18051)分离CD3 +T细胞(与DC不同供体来源)。将分离所得的T与DC细胞以10：1的比例混合培养，同时加入低内毒素控制的PD-1抗体，培养5天后，用人IFNγquantikine ELISA试剂盒(R&D system，DIF50)检测激活T细胞的IFNγ分泌。
混合培养后，IFNγ分泌量如表16、表17和图4、图5所示。结果显示，筛 选获得的多个PD-1抗体均能够有效增强T细胞激活并分泌IFNγ。
表16.PD-1抗体促IFNγ分泌量
抗体编号 IFNγ分泌量(pg/mL)
7# 963.5
32# 555.3
32#_hu_3 1031.5
106# 1164.2
107# 1776.6
阴性对照(NC) 49
阳性对照(Opdivo) 1181.5
表17.PD-1抗体促IFNγ分泌量
抗体编号 IFNγ分泌量(pg/mL)
32#_hu_3_hIgG4 877.3
7#_hu_4_hIgG4 759.9
106#_hu_1_hIgG4 736.94
PD-1Ab646 549.8
阴性对照(NC) 163
实施例13.PD-1抗体抑制小鼠结肠癌模型中肿瘤生长
动物实验由上海艾费医药科技有限公司完成，使用HuPD-1人源化转基因小鼠，雌性，6-8周龄，购买于南京银河生物医药有限公司。
将PBS重悬的小鼠结肠癌细胞系MC38细胞以5×10 5个/0.1mL浓度，0.1mL/只体积接种于HuPD-1人源化小鼠的右侧胁肋部皮下。当平均肿瘤体积达到100mm 3(70-120mm 3)时，挑选个体肿瘤体积适中的小鼠入组，以右侧肿瘤体积为分组依据。分组当天开始给药，给药剂量均为0.3mg/kg；给药频率是每三天注射一次，一共注射三周；给药方式是静脉注射。
PD-1抗体抑制小鼠结肠癌肿瘤生长结果如表18和图6A、图6B所示。结果显示，第24天，阳性对照的抑瘤比率为47.3％；32#_hu_3_hIgG4的抑瘤比率为50.8％；7#_hu_4_hIgG4的抑瘤比率为68.4％；106#_hu_3_hIgG4的抑瘤比率为64.4％，均能够有效抑制小鼠体内肿瘤的生长。
表18.PD-1抗体抑制小鼠结肠癌肿瘤生长结果
实施例14.PD-1/LAG-3双特异性抗体的构建、表达与纯化
将本公开的PD-1抗体与LAG-3抗体构建靶向PD-1/LAG-3的双特异性抗体。
人LAG-3全长蛋白如NCBI Reference Sequence:NP_002277.4所示。筛选及检测用人LAG-3抗原、人LAG-3-Fc抗原、猴LAG-3抗原均为商业化产品(百英生物B2062；Sino Biological Cat.16498-H02H；Sino Biological Cat:90841-C08H)。此处全文引入WO2017219995A中的LAG-3抗体的序列、制备方法。本公开所使用的LAG-3抗体的CDR序列如表19所示，编号规则为Kabat。
表19.LAG-3抗体的CDR序列
LAG-3抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)如下所示：
示例性LAG-3抗体LAG-3Ab303的重链序列：
LAG-3Ab303的轻链序列：
PD-1/LAG-3双特异性抗体的构建方式包括：将本公开的PD-1抗体的可变区序列(即VHH)与LAG-3抗体重链的N端相连接，与LAG-3抗体重链的C端相连接，与LAG-3抗体轻链的N端相连接，与LAG-3抗体轻链的C端相连接，或其组合方式。连接PD-1抗体与LAG-3抗体的连接子可以为(G4S) 2、(G4S) 3、(G4S) 4。
106#_hu_1及其糖基化变体0076#、0077#、0078#、0079#与LAG-3抗体构建 的双特异性抗体2140#、2170#、2171#、2172#、2173#的序列如下：
2140#的第一多肽链：
2170#的第一多肽链：
2171#的重链序列：
2172#的第一多肽链：
2173#的第一多肽链：
2140#、2170#、2171#、2172#、2173#的第二多肽链序列均如SEQ ID NO：188所示。
另有7#_hu_4、32#_hu_4与LAG-3的示例性双抗2138#、2136#序列如下：
2138#的第一多肽链：
2136#的第一多肽链：
2138#、2136#的第二多肽链序列也如SEQ ID NO：188所示。
将双特异性抗体构建质粒转染Expi-CHO细胞，培养9天后收集表达上清，高速离心去除杂质，用Protein A柱进行纯化。用PBS平衡至A280读数降至基线。用pH 3.0-3.5的酸性洗脱液洗脱目的蛋白，用1M Tris-HCl，pH8.0-9.0中和。洗脱样品用25mM MES,pH6.0稀释，用CIEX SP-HP柱进行离子交换层析纯化，纯化出的蛋白浓缩换液到PBS溶液，分装保存。经检测，获得了本公开的PD-1/LAG-3双特异性抗体。
实施例15.PD-1/LAG-3双抗与PD-1和LAG-3蛋白结合的亲和力测定
使用Biacore T200的方法检测双特异性抗体与PD-1和LAG-3蛋白的亲和力。结果如表20至表23所示，与单独使用抗PD-1的抗体0076#_hIgG4和单独的抗LAG-3的抗体mAb303-IgG4相比，双抗2170#的亲和力没有明显降低。方法为：使用Biacore T200(GE Healthcare)仪器测定双抗分子与PD-1蛋白和LAG-3蛋白的解离常数。将proteinA(雅心RSPA05)共价偶联到CM5S series芯片上，待检测抗体通过亲和捕获至芯片表面，然后于芯片表面流过不同浓度的PD-1蛋白(Sino Biological Cat.10377-H08H)和LAG-3蛋白，实时检测反应信号从而获得结合解离曲线，通过拟合获得结合力常数。实验使用溶液为HBS-EP溶液(10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.005％P20，pH 7.4)。每个实验循环结束时，用10mM甘氨酸，PH＝1.5(GE，BR-1003-54)溶液将芯片洗净再生。
表20.PD-1/LAG-3双抗与人PD-1的亲和力
抗体编号 k a(1/Ms) k d(1/s) K D(M)
106#_hu_1_hIgG4 3.79E+03 8.49E-04 2.24E-07
0076#_hIgG4 4.84E+03 1.11E-03 2.29E-07
2140# 6.19E+03 7.77E-04 1.53E-07
2170# 6.99E+03 9.17E-04 1.31E-07
2171# 5.66E+03 8.62E-04 1.52E-07
2172# 7.20E+03 1.13E-03 1.57E-07
2173# 5.73E+03 8.72E-04 1.52E-07
表21.PD-1/LAG-3双抗与猴PD-1的亲和力
抗体编号 k a(1/Ms) k d(1/s) K D(M)
0076#_hIgG4 6.04E+03 6.65E-04 1.10E-07
2170# 7.80E+03 5.33E-04 6.83E-08
表22.PD-1/LAG-3双抗与人LAG-3的亲和力
抗体编号 k a(1/Ms) k d(1/s) K D(M)
mAb303-IgG4 5.36E+06 9.94E-05 1.85E-11
2170# 5.28E+06 6.77E-05 1.28E-11
表23.PD-1/LAG-3双抗与猴LAG-3的亲和力
抗体编号 k a(1/Ms) k d(1/s) K D(M)
mAb303-IgG4 1.33E+05 5.45E-03 4.09E-08
2170# 1.35E+05 4.73E-03 3.50E-08
实施例16.PD-1/LAG-3双抗的体外细胞结合实验
本实施例的阴性对照为PBS，阳性对照使用Opdivo。部分实验使用了WO2017054646A1中的IgG4型PD-1Ab646作为阳性对照(如前SEQ ID NO：121和122所示)。部分实验使用了WO2018185043A1中的IgG1型PD-1和LAG-3双特异性抗体(RO7247669)作为阳性对照，序列如下：
RO7247669的抗体重链1：
RO7247669的抗体重链2：
RO7247669的抗体轻链1：
RO7247669的抗体轻链2：
使用实施例9的方法进行检测，所使用的阴性对照为NC。部分抗体的结合EC 50结果如表24、表25、图7和图8所示。其中，本实施例是检测双抗，但是对于PD-1结合来说是一致的，所以浓度是与实施例9中一致的。
结果显示，双特异分子与细胞表面的PD-1的结合强度呈抗体剂量依赖性，且与单独使用抗PD-1抗体0076#_hIgG4或106#_hu_1_hIgG4相比，双抗(例如2140#、2170#)的结合力没有明显降低。
表24.PD-1/LAG-3双抗与细胞表面抗原PD-1的结合EC 50
抗体编号 EC 50(ug/mL)
2136# 0.8367
2138# 0.7390
2140# 1.873
PD-1Ab646 0.2613
表25.PD-1/LAG-3双抗与细胞表面抗原PD-1的结合EC 50
用反转录病毒侵染的方式构建CHO-LAG3过表达细胞系。用HEK293T(ATCC，CRL-3216)进行病毒包装，将装有LAG-3全长基因的pBABE表达载体和辅助载体pVSV-G,pGag-pol共同转染HEK293T后，收集病毒上清，并用其侵染CHO-K1(ATCC，CCL-61)细胞，用有限稀释的方法获得单克隆细胞株，并用流式方法检测细胞膜表面LAG-3的表达，挑选高表达LAG-3的细胞株，命名为CHO-LAG-3。
收集稳定高表达LAG-3的细胞系CHO-LAG-3，用PBS调整细胞密度为6×10 6/mL，每孔加入50uL。梯度稀释LAG-3抗体或双抗为111.1nM、37.04nM、12.3nM、4.12nM、1.37nM、0.46nM，每孔加入50uL。与CHO-LAG-3细胞冰上孵育1个小时。用PBS漂洗一次后，每管加入FITC anti-human IgG(1:100)冰上避光孵育1个小时。再用PBS漂洗一次后，以每管100uL PBS重悬，在BD C6Plus流式细胞分析仪上进行荧光检测。使用Graphpad Prism9软件进行对抗体各剂量处理所得的平均荧光强度进行曲线拟合并作图，以定量分析双特异分子或抗LAG-3抗体与CHO-LAG-3细胞的结合。所应用的阴性对照为NC。
部分抗体的结合力EC 50结果如表26、图9所示。结果显示，双特异分子或抗LAG-3抗体与CHO-LAG-3细胞的结合强度呈抗体剂量依赖性。且与单独使用抗LAG-3抗体LAG-3Ab303相比，双特异分子2140#和2170#等分子的结合力没有明显降低。
表26.PD-1/LAG-3双抗与细胞表面抗原LAG-3的结合EC 50
抗体编号 EC 50(nM)
2140# 1.888
2170# 2.322
2172# 2.064
2171# 2.085
2173# 1.665
LAG-3Ab303 0.4786
实施例17.PD-1/LAG-3双抗阻断细胞上的PD-1与PD-L1结合，阻断LAG-3与MHCII高表达的A735结合
使用实施例10中的方法进行检测。部分抗体的阻断IC 50结果如表27、表28和图10、图11所示。结果显示，双抗能阻断PD-L1蛋白与CHO-PD-1细胞结合，呈现抗体剂量依赖性。且与单独使用抗PD-1抗体0076#_hIgG4或106#_hu_1_hIgG4相比，双抗2140#和2170#等阻断PD-L1蛋白与CHO-PD-1细胞结合的能力没有明显降低。
表27.PD-1/LAG-3双抗阻断PD-L1蛋白与细胞表面抗原PD-1的IC 50
抗体编号 IC 50(ug/mL)
2136# 0.7607
2138# 0.8715
2140# 1.839
PD-1Ab646 0.2722
表28.PD-1/LAG-3双抗阻断PD-L1蛋白与细胞表面抗原PD-1的IC 50
收集内源稳定高表达MHCII的细胞系A375，用PBS调整细胞密度为10×10 6/mL，每孔加入30uL。梯度稀释LAG-3抗体或双特异抗体为1000,333.3,111.1,37.04,12.3,4.12,1.37,0.46nM，每孔加入50uL。同时加入100ug/mL LAG-3-hIgG蛋白每孔20uL，混合均匀，冰上孵育1小时，PBS漂洗一次。清洗后每管加入FITC抗人IgG(1:100)冰上避光孵育1个小时，再用PBS漂洗一次后，以每管100uL PBS重悬，在BD C6Plus流式细胞分析仪上进行荧光检测。使用Graphpad Prism9软件进行对抗体各剂量处理所得的平均荧光强度进行曲线拟合并作图，以定量分析双特异分子或抗LAG-3抗体阻断LAG-3蛋白与细胞表面的MHCII的结合。
部分抗体的阻断IC 50结果如表29和图12所示。结果显示，双特异分子2140#、2170#、2171#、2172#、2173#均能阻断LAG-3蛋白与细胞表面的MHCII的结合，且与单独使用抗LAG-3抗体LAG-3Ab303相比，双抗功能无显著降低。
表29.PD-1/LAG-3双抗阻断LAG-3蛋白与细胞表面MHCII结合的IC 50
抗体编号 IC 50(nM)
2140# 109.6
2170# 72.04
2172# 86.46
2171# 99.53
2173# 106.4
LAG-3Ab303 66.10
实施例18.PD-1/LAG-3双抗在体外解除PD-1/PD-L1阻断的免疫激活实验
收集内源稳定高表达PD-L1和TCR激活分子的CHO-PD-L1aAPC细胞系，用PD-L1阴性的CHO细胞作为对照，用完全培养基调整细胞密度为4×10 5/mL，每孔加入100uL，置于37℃5％CO 2的培养箱培养20-24小时。
测试当天使用分析培养基将PD-1/LAG-3双抗梯度稀释为1000、250、62.5、15.6、3.91、0.98、0.24、0.06nM，每个浓度设置2个复孔。
收集内源稳定高表达PD-1的效应细胞Jurkat-PD-1，该细胞同时内源稳定表达NFAT启动的荧光素酶报告基因，用分析培养基调整细胞密度为1.25×10 6/mL。
取出前一天接种CHO-PD-L1aAPC细胞的培养板，用多道移液器取出上清 95uL/孔并弃去，将稀释好的抗体和调整好密度的效应细胞一次加入细胞培养板中，每孔各加入40uL，轻轻混匀，置于37℃5％CO2的培养箱培养6小时。
在抗体孵育期间，将Bio-Glo TM Reagent(Promega)取出使其温度恢复至室温。混合培养完成后取出细胞培养板，室温静置5-10分钟，然后每孔加入80uL Bio-Glo TM Reagent，轻轻混匀，使用Molecular Device SpectraMax多功能酶标仪读取化学发光数值，得到的数据用Graphpad Prism9软件进行曲线拟合分析并作图。
部分抗体的IC50结果如表30、表31和图13、图14所示。结果显示，双特异分子2136#、2138#和2140#均能阻断细胞表面的PD-1和PD-L1的结合，并解除二者结合造成的免疫抑制。
表30.PD-1/LAG-3双抗解除PD-1/PD-L1阻断的免疫激活的IC 50
抗体编号 IC 50(nM)
2136# 5.481
2138# 59.83
2140# 16.26
PD-1Ab646 4.249
RO7247669 20.13
表31.PD-1/LAG-3双抗解除PD-1/PD-L1阻断的免疫激活的IC50
候选抗体 IC 50(nM)
106#_hu_1_hIgG4 29.18
0076#_hIgG4 14.25
2140# 27.20
2170# 17.39
RO7247669 20.18
实施例19.PD-1/LAG-3双抗在体外促进混合淋巴细胞分泌细胞因子
将新鲜或复苏的人PBMC通过EasySep TM Human Monocyte Isolation Kit(STEMCELL technologies,19359)分离单核细胞，分离的单核细胞按照ImmunoCult TM Dendritic Cell Culture Kit(STEMCELL technologies,19085)的方法，通过加入Differentiation Supplement诱导分化5天后，再加入Maturation Supplement进一步诱导成熟2天，分化成为成熟DC细胞。用培养基调整细胞密度为1.25×10 5/mL。
新鲜或复苏的人PBMC(与DC细胞不同供体来源)通过EasySep TM Human CD4+T Cell Isolation Kit(STEMCELL technologies,17952)分离CD4 +T细胞。将分离所得的T细胞使用20uM CFSE(Invitrogen 65-0850)标记染色后，用培养基调整细胞密度为1×10 6/mL，每孔加入100uL。然后每孔加入80uL分化成熟的DC细胞，二者以10:1比例混合培养。同时每孔加入低内毒素控制的PD-1或双特异抗体20uL，处理好的细胞置于37℃5％CO2的培养箱培养。
在混合培养第3天和第5天，分别取上清用HTRF检测激活T细胞的IL-2和IFNg分泌水平(Cisbio 62HIL02PEG,62HIFNGPEG)，按照检测说明书进行测试， 并用Tecan Magellan Pro多功能酶标仪读取620nM和665nM处的荧光值。并在培养第5天，用BD C6Plus流式细胞分析仪检测CFSE标记的T细胞增殖情况。得到的数据用Graphpad Prism9软件进行标准品曲线拟合分析并作图。
IL-2和IFNγ分泌水平别分如图15A和图15B所示，与阴性对照(NC)或单独使用抗LAG-3抗体LAG-3Ab303或单独使用抗PD-1抗体0076#_hIgG4相比，双抗2170#和RO7247669均更加显著激活PBMC分泌IFNγ，略优于抗LAG-3抗体和抗PD-1抗体联合使用效果。
表32.混合淋巴细胞反应刺激细胞因子分泌水平
实施例20.金黄色葡萄球菌超抗原刺激实验
将新鲜或复苏的人PBMC使用含0.5ng/mL超抗原金黄色葡萄球菌素(SEB)的培养基体外培养刺激48小时，收集预刺激的PBMC，用1×PBS漂洗两次。用含有0.5ng/mL SEB培养基调整细胞密度为5×10 5个/mL，每孔加入100μL。
用培养基将抗体梯度稀释为1000nM、200nM、40nM、8nM、1.6nM、0.32nM及0.064nM，每个浓度设置2个复孔。将抗体加入到SEB预刺激的PBMC细胞中，每孔加入100μL，轻轻混匀。置于37℃5％CO 2的培养箱培养。混合培养48小时后，取上清用HTRF检测激活T细胞的IFNγ分泌水平(Cisbio 62HIFNGPEG)，按照检测说明书进行测试，并用Tecan Magellan Pro多功能酶标仪读取620nM和665nM处的荧光值。得到的数据用Graphpad Prism9软件进行标准品曲线拟合分析并作图。
结果如图16所示，与阴性对照(NC)或单独使用抗LAG-3抗体LAG-3Ab303或单独使用抗PD-1抗体0076#_hIgG4相比，双抗2170#和RO7247669均更加显著激活PBMC分泌IFNγ。
实施例21.PBMC的肿瘤杀伤实验
将新鲜或复苏的人PBMC使用含20IU/mL IL-2(STEMCELL technologies,78036)和Human CD3/CD28T Cell Activator(STEMCELL technologies,10971)的培养基培养过夜。第二天收集活化的PBMC，用培养基调整细胞密度为1×10 6/mL，每孔加入100uL。
在混合培养当天，收集靶细胞，用培养基调整细胞密度为1.25×10 5/mL，每孔加入80uL，PBMC与靶细胞二者以10:1比例混合培养。同时每孔加入低内毒素控制的PD-1或双特异抗体20uL，处理好的细胞置于37℃5％CO 2的培养箱培养。混合培养48小时后，轻轻取上清用HTRF检测激活T细胞的IFNγ分泌水平(Cisbio 62HIFNGPEG)，按照检测说明书进行测试，并用Tecan Magellan Pro多功能酶标仪读取620nM和665nM处的荧光值，进行标准品曲线拟合分析并作图。
结果如图17和下表33所示，与阴性对照(NC)或单独使用抗LAG-3抗体LAG-3Ab303或单独使用抗PD-1抗体0076#_hIgG4相比，或与双特异分子RO7247669相比，双特异分子2170#更加显著激活PBMC分泌IFNγ。
表33.PBMC的肿瘤杀伤实验刺激T细胞的IFNγ分泌水平
实施例22.PD-1/LAG-3双抗在人源化动物模型中抑制肿瘤生长
将NOG小鼠(雌性，6-8周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司) 适应性饲养一周。实验当天编号称重，收集处于对数生长期的人黑色素瘤细胞系A375，按照每只动物接种6×10 6/个细胞(200uL)的剂量接种于小鼠右肋部皮下。同一天复苏人PBMC，置于37℃5％CO 2的培养箱培养1小时后，用PBS漂洗并调整细胞密度为1×10 7/mL，按照每只动物接种5×10 6/个细胞(500uL)的剂量进行尾静脉注射。接种后5-7天，待肿瘤生长至50-90mm 3后，去除体重、肿瘤过大或过小的，按照下表34-36所示随机分组，并腹腔注射相应抗体，一周两次，共给药6次。每周测量2次小鼠体重以及肿瘤体积。肿瘤体积计算公式为TV＝L 长×L 短 2/2。各组肿瘤体积用平均值±标准差表示，使用双因素ANOVA进行统计分析，并计算肿瘤抑制率(％TGI)，计算公式为％TGI＝[1-(T-T0)/(C-C0)]×100％。实验终点时取血，裂解红细胞(BD 555899)，与靶向人和鼠的CD45的单克隆抗体(eBioscience TM 11-0451-82,12-9459-42)混合孵育40分钟后，用BD C6Plus流式细胞分析仪检测小鼠血液中人CD45阳性细胞占所有淋巴细胞的百分比，作为该小鼠模型中人PBMC的重建水平。结果如图18A、图18B、图18C，图19A、图19B，图20A、图20B、图20C所示。
表34.PD-1/LAG-3双抗给药方案和小鼠模型抑瘤效果
分组 给药剂量(mg/kg) 动物数量(只) 第31天％TGI
2136# 12 12 80％****
2138# 12 12 65％****
2140# 12 12 86％****
阴性对照(PBS) - 12 -
(注：在双因素ANOVA统计分析中，与PBS组相比，第31天肿瘤大小有显著性差异，P<0.0001时，标记为****。)
表35.PD-1/LAG-3双抗给药方案和小鼠模型抑瘤效果
分组 给药剂量(mg/kg) 动物数量(只) 第24天％TGI
2136# 12 6 55％**
2138# 12 6 34％
2140# 12 6 93％****
PD-1Ab646 10 6 34％
LAG-3Ab303 10 6 8％
阴性对照(PBS) - 6 -
(注：在双因素ANOVA统计分析中，与PBS组相比，第24天肿瘤大小有显著性差异，P<0.005时，标记为**；P<0.0001时，标记为****。)
表36.PD-1/LAG-3双抗给药方案和小鼠模型抑瘤效果
(注：在双因素ANOVA统计分析中，与阴性对照组相比，第30天肿瘤大小有显著性差 异，P<0.005时，标记为**；P<0.0005时，标记为***。)
结果显示，在相同摩尔量时，与阴性对照(PBS)相比，双抗2136#、2138#和2140#均能抑制A375肿瘤在人源化模型中的生长，其中2140#的抑制肿瘤效果优于前两者，在两次实验终点的肿瘤抑制率分别为86％(表34)和93％(表35)。
表36中的结果显示，在相同物质的量给药时，与阴性对照(NC)或单独使用抗LAG-3抗体LAG-3Ab303或单独使用抗PD-1抗体0076#_hIgG4相比，双特异分子2170#和联合给药均更加显著抑制A375肿瘤在人源化模型中的生长。
虽然以上描述了本公开的具体实施方案，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，在不背离本公开的原理和实质的前提下，可以对这些实施方案做出多种变更或修改。因此，本公开的保护范围由所附权利要求书限定。

Claims (26)

  1. PD-1结合蛋白，其包含至少一个免疫球蛋白单一可变结构域，所述免疫球蛋白单一可变结构域包含三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中：
    CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：152、204、153所示的氨基酸序列。
  2. 如权利要求1所述的PD-1结合蛋白，其中：
    1)CDR1包含如SEQ ID NO：129所示的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO：71或82所示的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO：145所示的氨基酸序列；或
    2)CDR1包含如SEQ ID NO：129-141任一所示的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO：71或82所示的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列；或
    3)CDR1包含如SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO：71或82所示的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO：142-151任一所示的氨基酸序列；或
    4)CDR1包含如SEQ ID NO：132所示的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO：71或82所示的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO：145所示的氨基酸序列；或
    5)CDR1包含如SEQ ID NO：129所示的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO：71或82所示的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO：146所示的氨基酸序列；或
    6)CDR1包含如SEQ ID NO：132所示的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO：71或82所示的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO：146所示的氨基酸序列；或
    7)CDR1包含SEQ ID NO：81所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：71或82所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：83所示氨基酸序列。
  3. 如权利要求1或2所述的PD-1结合蛋白，其中所述的免疫球蛋白单一可变结构域是VHH；
    优选地，所述VHH为人源化的和/或经亲和力成熟的VHH；
    更优选地，所述VHH为SEQ ID NO：154-157任一所示或与SEQ ID NO：154-157任一具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。
  4. 如权利要求1-3任一项所述的PD-1结合蛋白，其为特异性结合PD-1或其片段的抗体；
    优选地，所述抗体为骆驼抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体。
  5. 如前述权利要求任一项所述的PD-1结合蛋白，其还包含人免疫球蛋白Fc区；
    优选地，所述Fc区是人IgG1或IgG4的Fc区；
    更优选地，所述人IgG4的Fc区具有228P、234A、235A和/或447A突变。
  6. 如前述权利要求任一项所述的PD-1结合蛋白，其包含：
    SEQ ID NO：200-203任一所示或与之具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。
  7. PD-1/LAG-3结合蛋白，其包含：
    特异性结合PD-1的第一抗原结合结构域、和
    特异性结合LAG-3的第二抗原结合结构域，
    所述特异性结合PD-1的第一抗原结合结构域包含至少一个免疫球蛋白单一可变结构域，所述免疫球蛋白单一可变结构域包含三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中：
    1)CDR1、CDR2和CDR3为如权利要求1所限定的CDR1、CDR2和CDR3；或
    2)CDR1、CDR2和CDR3分别包含如SEQ ID NO：62、115、64所示氨基酸序列；或
    3)CDR1、CDR2和CDR3分别包含如SEQ ID NO：81、116、117所示氨基酸序列；或
    4)CDR1、CDR2和CDR3分别包含如SEQ ID NO：118、66、67所示氨基酸序列；或
    5)CDR1、CDR2和CDR3分别包含如SEQ ID NO：84、119、86所示氨基酸序列；或
    6)CDR1、CDR2和CDR3分别包含如SEQ ID NO：78、120、80所示氨基酸序列；或
    7)CDR1、CDR2和CDR3分别包含如SEQ ID NO：59、60、61所示氨基酸序列；或
    8)CDR1、CDR2和CDR3分别包含如SEQ ID NO：74、75、76所示氨基酸序列；或
    9)CDR1、CDR2和CDR3分别包含如SEQ ID NO：88、89、90所示氨基酸序列；或
    10)CDR1、CDR2和CDR3分别包含如SEQ ID NO：96、97、98所示氨基酸序列。
  8. 如权利要求7所述的PD-1/LAG-3结合蛋白，所述免疫球蛋白单一可变结 构域包含如下的CDR1、CDR2和CDR3：
    1)CDR1包含如SEQ ID NO：129所示的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO：71或82所示的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO：145所示的氨基酸序列；或
    2)CDR1包含如SEQ ID NO：129-141任一所示的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO：71或82所示的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列；或
    3)CDR1包含如SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO：71或82所示的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO：142-151任一所示的氨基酸序列；或
    4)CDR1包含如SEQ ID NO：132所示的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO：71或82所示的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO：145所示的氨基酸序列；或
    5)CDR1包含如SEQ ID NO：129所示的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO：71或82所示的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO：146所示的氨基酸序列；或
    6)CDR1包含如SEQ ID NO：132所示的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO：71或82所示的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO：146所示的氨基酸序列；或
    7)CDR1包含SEQ ID NO：62所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：63、68、69、70、72、77任一所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：64所示氨基酸序列；或
    8)CDR1包含SEQ ID NO：62所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：63所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：73所示氨基酸序列；或
    9)CDR1包含SEQ ID NO：81所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：71或82所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：83所示氨基酸序列；或
    10)CDR1包含SEQ ID NO：81所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：91、93任一所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：92所示氨基酸序列；或
    11)CDR1包含SEQ ID NO：81所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：94所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：95所示氨基酸序列；或
    12)CDR1包含SEQ ID NO：65、113、114任一所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：66所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：67所示氨基酸序列；或
    13)CDR1包含SEQ ID NO：84所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：85、102任一所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：86所示氨基酸序列；或
    14)CDR1包含SEQ ID NO：78所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：79、87、99、100、101任一所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：80所示氨基酸序列。
  9. 如权利要求7或8所述的PD-1/LAG-3结合蛋白，所述免疫球蛋白单一可变结构域包含如SEQ ID NO：154-157、7-33、35-58、123-128任一所示或与之具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。
  10. 如权利要求7至9任一项所述的PD-1/LAG-3结合蛋白，所述特异性结合LAG-3的第二抗原结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：
    VH包含分别如SEQ ID NO：164-166所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，VL包含分别如SEQ ID NO：167-169所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3；或
    VH包含分别如SEQ ID NO：158-160所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，VL包含分别如SEQ ID NO：161-163所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3。
  11. 如权利要求10所述的PD-1/LAG-3结合蛋白，其中：
    所述VH包含如SEQ ID NO：178-181任一所示或与之具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列，VL包含如SEQ ID NO：182-186任一所示或与之具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列；或
    VH包含如SEQ ID NO：170-173任一所示或与之具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列，VL包含如SEQ ID NO：174-177任一所示或与之具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列；
    优选地，VH包含如SEQ ID NO：178所示氨基酸序列或与之具有至少95％同一性，VL包含如SEQ ID NO：183所示氨基酸序列与之具有至少95％同一性。
  12. 如权利要求10或11所述的PD-1/LAG-3结合蛋白，其中，所述特异性结合LAG-3的第二抗原结合结构域包含全长重链(HC)和全长轻链(LC)；
    优选地，全长重链为IgG1或IgG4同种型，全长轻链为Kappa同种型；
    更优选地，全长重链为SEQ ID NO：187所示或与之具有至少90％序列同一性，全长轻链为SEQ ID NO：188所示或与之具有至少90％序列同一性。
  13. 如权利要求7至12任一项所述的PD-1/LAG-3结合蛋白，其中：
    所述特异性结合PD-1的第一抗原结合结构域的免疫球蛋白单一可变结构域位于特异性结合LAG-3的第二抗原结合结构域的重链可变区的N端；
    所述特异性结合PD-1的第一抗原结合结构域的免疫球蛋白单一可变结构域位于特异性结合LAG-3的第二抗原结合结构域的重链可变区的C端；
    所述特异性结合PD-1的第一抗原结合结构域的免疫球蛋白单一可变结构域位于特异性结合LAG-3的第二抗原结合结构域的轻链可变区的N端；和/或
    所述特异性结合PD-1的第一抗原结合结构域的免疫球蛋白单一可变结构域位于特异性结合LAG-3的第二抗原结合结构域的轻链可变区的C端。
  14. 如权利要求13所述的PD-1/LAG-3结合蛋白，其中，特异性结合PD-1的第一抗原结合结构域的免疫球蛋白单一可变结构域与特异性结合LAG-3的第二抗原结合结构域直接或通过连接子相连接；
    优选地，所述连接子为具有如(G 4S) x所示的氨基酸序列，其中，x独立地选自1-20的整数；
    更优选地，所述连接子为(G 4S) 2、(G 4S) 3所示的氨基酸序列。
  15. 如权利要求7至14任一项所述的PD-1/LAG-3结合蛋白，其包含第一多肽链和第二多肽链，其中：
    第一多肽链包含如SEQ ID NO：189-195任一所示的氨基酸序列或与之具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列，
    第二多肽链包含如SEQ ID NO：188所示的氨基酸序列或与之具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。
  16. 抗PD-1/LAG-3双特异性抗体，其含有：
    权利要求7至9任一项中所限定的免疫球蛋白单一可变结构域，和
    权利要求10或11中所限定的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)；
    优选地，所述抗PD-1/LAG-3双特异性抗体还含有人IgG1或IgG4的Fc区。
  17. 多核苷酸，其编码选自以下的任一项：
    权利要求1至6任一项所述的PD-1结合蛋白，
    权利要求7至15任一项所述的PD-1/LAG-3结合蛋白，
    权利要求16所述的抗PD-1/LAG-3双特异性抗体。
  18. 宿主细胞，其包含权利要求17所述的多核苷酸。
  19. 制备PD-1结合蛋白、PD-1/LAG-3结合蛋白、抗PD-1/LAG-3双特异性抗体的方法，包括步骤：
    培养权利要求18所述的宿主细胞；
    回收权利要求1至6任一项所述的PD-1结合蛋白，或权利要求7至15任一项所述的PD-1/LAG-3结合蛋白，或权利要求16所述的抗PD-1/LAG-3双特异性抗体，以及
    任选地，纯化和/或修饰所述PD-1结合蛋白、PD-1/LAG-3结合蛋白、抗PD-1/LAG-3双特异性抗体。
  20. 组合物或药盒，其包含PD-1结合蛋白和LAG-3结合蛋白，所述PD-1结合蛋白是权利要求1至6任一项所述的PD-1结合蛋白；
    优选地，所述LAG-3结合蛋白包含权利要求10或11中所限定的重链可变区 (VH)和轻链可变区(VL)，或权利要求12中所限定的全长重链(HC)和全长轻链(LC)；
    PD-1结合蛋白和LAG-3结合蛋白在相同或不同的容器中。
  21. 药物组合物，其包含：
    一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂、缓冲剂或赋形剂、以及
    选自以下的任一项：
    治疗有效量或预防有效量的权利要求1至6任一项所述的PD-1结合蛋白、权利要求7至15任一项所述的PD-1/LAG-3结合蛋白、权利要求16所述的抗PD-1/LAG-3双特异性抗体、权利要求20所述的组合物或药盒、或其组合。
  22. 一种治疗癌症的方法，包括：
    向受试者施用治疗有效量的选自以下的任一项：
    权利要求1至6任一项所述的PD-1结合蛋白、权利要求7至15任一项所述的PD-1/LAG-3结合蛋白、权利要求16所述的抗PD-1/LAG-3双特异性抗体、权利要求20所述的组合物或药盒、权利要求21所述的药物组合物、或其组合；
    优选地，所述癌症选自肺癌、前列腺癌、乳腺癌、头颈部癌、食管癌、胃癌、结肠癌、结直肠癌、膀胱癌、宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、肝癌、黑色素瘤、肾癌、鳞状细胞癌、血液系统癌症、或者特征在于不受控细胞生长的疾病或病症。
  23. 一种促进T细胞增殖或使受试者从免疫反应上调获益的方法，包括向受试者施用有效量的选自以下的任一项：
    权利要求1至6任一项所述的PD-1结合蛋白、权利要求7至15任一项所述的PD-1/LAG-3结合蛋白、权利要求16所述的抗PD-1/LAG-3双特异性抗体、权利要求20所述的组合物或药盒、权利要求21所述的药物组合物、或其组合；
    优选地，所述受试者已经患有、疑似患有、易感于癌症；
    更优选地，所述癌症选自肺癌、前列腺癌、乳腺癌、头颈部癌、食管癌、胃癌、结肠癌、结直肠癌、膀胱癌、宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、肝癌、黑色素瘤、肾癌、鳞状细胞癌、血液系统癌症、或者特征在于不受控细胞生长的疾病或病症。
  24. PD-1结合蛋白联合LAG-3结合蛋白用于制备治疗癌症的药物的用途，所述PD-1结合蛋白为权利要求1至6任一项所述的PD-1结合蛋白，所述LAG-3结合蛋白包含权利要求10至12任一项中所限定的第二抗原结合结构域；
    优选地，所述癌症选自肺癌、前列腺癌、乳腺癌、头颈部癌、食管癌、胃癌、结肠癌、结直肠癌、膀胱癌、宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、肝癌、黑色素瘤、肾癌、鳞状细胞癌、血液系统癌症、或者特征在于不受控细胞生长的疾病或病症。
  25. PD-1结合蛋白，其与LAG-3结合蛋白联合用于治疗癌症，PD-1结合蛋白和LAG-3结合蛋白同时或顺序施用，所述PD-1结合蛋白为权利要求1至6任一项所述的PD-1结合蛋白，所述LAG-3结合蛋白含有权利要求10至12任一项中 所限定的第二抗原结合结构域；
    优选地，所述癌症选自肺癌、前列腺癌、乳腺癌、头颈部癌、食管癌、胃癌、结肠癌、结直肠癌、膀胱癌、宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、肝癌、黑色素瘤、肾癌、鳞状细胞癌、血液系统癌症、或者特征在于不受控细胞生长的疾病或病症。
  26. LAG-3结合蛋白，其与PD-1结合蛋白联合用于治疗癌症，LAG-3结合蛋白和PD-1结合蛋白同时或顺序施用，所述PD-1结合蛋白为权利要求1至6任一项所述的PD-1结合蛋白，所述LAG-3结合蛋白含有权利要求10至12任一项中所限定的第二抗原结合结构域；
    优选地，所述癌症选自肺癌、前列腺癌、乳腺癌、头颈部癌、食管癌、胃癌、结肠癌、结直肠癌、膀胱癌、宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、肝癌、黑色素瘤、肾癌、鳞状细胞癌、血液系统癌症、或者特征在于不受控细胞生长的疾病或病症。
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