CN117110596A - 一种用于富集cfDNA的修饰玻片、方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术和体外诊断领域，公开了一种用于富集cfDNA的修饰玻片、方法及其应用。其中，富集cfDNA的修饰玻片的制备方法是将清洗后的玻片经过表面修饰及玻片表面PEI反应，然后将2‑氯甲基吡啶盐、无水碳酸钾、三乙胺加入乙醇溶液中，搅拌溶解，将完成玻片表面PEI反应的玻片置于溶液中反应，乙醇清洗后置于20 mg/mL硫酸锌溶液中孵育，即可得到Zn‑DPA修饰玻片，该修饰玻片对cfDNA有特异性富集作用，可实现cfDNA的可视化检测，并利用定量检测系统可实现cfDNA的定量检测。本发明提供的富集cfDNA的修饰玻片对DNA具有很高的结合亲和力，采用修饰玻片及相应的检测装置进行cfDNA富集及可视化检测，其成本低，检测时间短，携带方便，并且无需任何预处理，更利于在普通人群中的推广和应用。

Description

一种用于富集cfDNA的修饰玻片、方法及其应用
技术领域
本发明涉及属于生物技术和体外诊断领域，具体地涉及一种用于富集cfDNA的修饰玻片、方法及其应用。
背景技术
泌尿系统疾病是现阶段临床中较为常见的一种疾病类型，泌尿系统由两个肾脏、两个输尿管、一个膀胱和一个尿道组成，共同致力于消除血液中存在的废物。泌尿系统疾病在缺乏及时诊断和有效干预的情况下，泌尿系统发生病灶并进一步恶化可能会导致肾脏健康状况不佳，进一步引发慢性肾脏病。慢性肾脏病会削弱免疫系统，使患者面临尿路感染等风险，如果不及时治疗，泌尿系统功能会进一步恶化。随着病情的发展影响患者整个泌尿系统，给患者带来膀胱癌等泌尿系统恶性肿瘤的风险。同时泌尿系统疾病的发生发展过程中伴随着不同程度的炎症，这对泌尿系统的健康功能构成威胁，加速了泌尿系统疾病的进一步恶化，对患者的身体健康与生命安全有着极大的负面影响。据统计，每年影响全球100多万人，而中国平均100个成年人中就有7个人出现排尿异常的症状，其发病率较高，严重危害我国人民的生命健康。
准确、有效的检测结果对患者后续的治疗方案选择有着重要意义。传统检查泌尿系统疾病的方法有很多，常见的有尿常规检测，B超检查，尿路X线平片，磁共振检查和静脉输尿管造影等，但这些检查存在局限性，检测时间较长，容易延误患者的病情。尿常规检测是对泌尿系统疾病进行判断的金标准，在临床上通常以检测尿液中的生物标志物来判断泌尿系统疾病进展情况。主要是通过尿液干化学法检测尿液的酸碱度、蛋白质、葡萄糖、酮体、胆红素、尿胆原、红细胞、血红蛋白、亚硝酸盐、白细胞等指标来判断泌尿系统的炎症情况，但是尿液干化学的检测受很多因素影响，例如尿液在膀胱中时间过长会改变尿液酸碱度和比重，导致细胞的变形和溶胀影响最后仪器的读数结果。由于尿液样本的易获得性，开发出针对尿液样本的快速、准确、有效、易操作的检测泌尿系统疾病的方法十分重要。
发明内容
针对目前所存在的技术问题，本发明提供了一种用于富集cfDNA的修饰玻片、方法及其应用，本发明的方案可高效富集样本中cfDNA，成本低，并且可视化检测便于携带，操作简单，可应用于家庭疾病检测。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明一方面提供了一种用于富集cfDNA的修饰玻片，所述修饰玻片的表面经过玻片Si-OH暴露、PEI修饰、DPA修饰以及Zn-DPA修饰的一系列功能化修饰，所述修饰玻片通过Zn-DPA与cfDNA的特异配位，对cfDNA进行富集。
在一些具体实施方案中，所述修饰玻片的表面功能化修饰方法包括如下步骤：
（1）玻片表面Si-OH暴露：盖玻片超声清洗干净，浸泡于80℃的由30%过氧化氢、30%氨水和蒸馏水以1：1：5的体积比混合的溶液中，用过氧化氢洗涤；再浸泡于80℃的30%过氧化氢、1M盐酸溶液和蒸馏水以1：1：5的体积比混合的溶液中，乙醇溶液洗涤；再置于真空干燥烘箱中烘干，保存于无水乙醇中。一些具体实施方案中，盖玻片超声清洗是将2.0cm*2.0cm的盖玻片置于肥皂水中超声30min，然后置于蒸馏水中超声30min。一些具体实施方案中，修饰玻片合成步骤（1）中，玻片在混合溶液中浸泡20min。
（2）玻片表面PEI修饰：将步骤（1）得到的玻片在去除氧气的环氧硅烷溶液中，80℃条件下进行反应，反应结束后用乙醇和水反复冲洗，冲洗后的玻片与PEI溶液中，在30℃条件下进行反应，并加入NaOH调节PH至10，反应结束后使用乙醇和水洗涤。一些具体实施例中，玻片在环氧硅烷溶液中反应12h，在PEI溶液中反应24h。
（3）玻片表面DPA-Zn修饰：将2-氯甲基吡啶盐、无水碳酸钾、三乙胺加入乙醇溶液中，搅拌溶解，将完成步骤（2）的玻片置于溶液中，在80℃条件下反应，反应结束后用乙醇清洗，置于20mg/mL硫酸锌溶液中孵育，得到锌(II)-二甲基吡啶胺修饰玻片，简称Zn-DPA修饰玻片。在一些具体实施方案中，玻片在80℃条件下反应24h，玻片在20mg/mL硫酸锌溶液中孵育30min。
在一些具体实施方案中，步骤（2）中，去除氧气的环氧硅烷溶液为200mL甲苯溶液中加入10mL环氧硅烷，并通入氮气去除溶液中的氧气；PEI溶液的浓度为0.025g/mL，分子量为25000。
在一些具体实施方案中，步骤（3）中，2-氯甲基吡啶盐的浓度为0.01g/mL，无水碳酸钾的浓度为0.0025g/mL，三乙胺的浓度为0.025g/mL。
本发明的第二方面提供了一种基于修饰玻片的cfDNA的富集方法，采用本发明第一方面所述的修饰玻片，将其置于待测样本溶液中共同孵育，即可完成富集。
本发明的第三方面提供了一种基于修饰玻片的cfDNA的可视化检测方法，包括如下步骤：
（1）将本发明第一方面所述的修饰玻片置于样品皿中，向样品皿中加入待测样本溶液，共同孵育；
（2）加入PicoGreen溶液，等待几分钟后将待测样本溶液吸弃；
（3）再加入ABTS溶液和缓冲溶液；
（4）光照催化，光照结束后将溶液转移至样本管中观察颜色变化。
在一些具体实施方案中，所述PicoGreen溶液浓度为3-4μM，所述ABTS溶液浓度为3-4mM，所述缓冲溶液的PH为3.8-4.5，所述光照催化时间为15-25min。需要注意的是，PicoGreen溶液需要避光，使用PicoGreen溶液时，现配现用，同时要注意避光。
在一些具体实施方案中，所述步骤（4）中光照催化采用蓝光照射，光照时间20min。
在一些具体实施方案中，第一方面所述的修饰玻片提前浸泡在20mg/mL的七合硫酸锌溶液中。
用于cfDNA的可视化检测装置，包括样品池和光照催化箱，所述样品池为透明容器，样品池上端开口，样品池的池身位于光照催化箱内，光照催化箱为黑色不透明容器；所述光照催化箱内设有蓝光光源，蓝光光源通过电线与供电单元连接，所述电线上设有控制开关，控制开关固定在光照催化箱箱体上，第一方面所述的修饰玻片与检测试剂在所述样品池内反应。
用于cfDNA的定量检测系统，包括前文所述的可视化检测装置，还包括图像采集单元以及图像数据处理单元，前文所述的可视化检测装置和本发明第三方面所述的可视化检测方法，将待测样本中的cfDNA转化成可视化检测产物，利用图像采集单元采集可视化检测产物的图像，然后用图像数据处理单元对待测样本中cfDNA含量的准确定量分析。
本发明的第四方面提供了一种cfDNA的可视化检测试剂盒，包括本发明第一方面的修饰玻片以及显色辅助试剂。在一些具体实施方案中，显色辅助试剂包括PicoGreen试剂，ABTS试剂和酸性缓冲试剂。在一些较佳实施方案中，PicoGreen试剂浓度为3-4μM，ABTS试剂浓度为3-4mM，酸性缓冲试剂的PH为3.8-4.5，使用试剂盒检测过程，光照催化时间为15-25min。
本发明的第五方面提供了一种本发明第一方面所述的修饰玻片在制备泌尿系统疾病的早期检测或诊断产品中的应用。
在一些具体实施方案中，可用于尿液、血液等生物样本中cfDNA含量检测，比如检测尿液样本中cfDNA含量，可实现对泌尿系统疾病的预防和控制。
本发明的有益效果
本发明具有以下有益效果为：本发明提供富集cfDNA的修饰玻片，修饰有吸附磷酸根功能的Zn-DPA，可用于吸附cfDNA的磷酸根离子，对DNA具有很高的结合亲和力，在3000ng/mL浓度内吸附效率达90%以上，表现出极好的DNA吸附能力，具有良好的DNA富集效果。并且采用修饰玻片及相应的检测装置进行cfDNA富集及可视化检测，其成本低，检测时间短，携带方便，并且无需任何预处理；通过在低廉易得的玻片表面进行具有DNA高亲和性的DPA基团涂层，构筑出可捕获并富集生物样本中cfDNA的基底材料，随后利用DNA结合染料PicoGreen对基底上的cfDNA进行选择性标记，并创新性地通过PicoGreen的光敏特性介导的光催化氧化作用，释放出大量的活性单线态氧，将无色还原底物（ABTS）氧化为有色产物（ABTS+），从而实现cfDNA的可视化定量检测，利用其颜色的色值判断尿液中的cfDNA的含量，显色反应结果直观；可视化检测结果在配合图像采集单元以及图像数据处理单元ColorGrab的条件下，可准确获得样本中cfDNA的准确浓度，实现定量检测。
富集cfDNA的修饰玻片，可视化检测装置以及定量检测系统，轻便便携，直观、低成本、简单、快速、无创无痛苦的检测优势，更利于在普通人群中实现居家健康状态检测的推广和应用，可显著提高人民健康自测意识，有利于患者的早期诊断，从而提高患者的治愈率，提升全民健康水平。
附图说明
图1为实施例1中玻片表面表征在扫描电子显微镜以及傅里叶红外光谱与紫外吸收光谱的检测结果图；其中，（a）表面形貌；（b）元素分析；（c）紫外谱；（d）红外光谱；
图2为实施例2中玻片的荧光显微镜观察及荧光定量分析的检测结果图；其中，（a）荧光显微镜图像；（b）ImageJ荧光定量计算以及（c）修饰玻片对DNA的吸附效率；
图3为实施例3中用蓝光分光光度计的检测结果图；其中，（a）PicoGreen特异性标记DNA的能力检测；（b）PicoGreen光催化产生活性氧的能力；（c）ABTS在活性氧与光照下氧化变色的能力；
图4为实施例4的显色条件优化用蓝光分光光度计检测结果图；其中，（a）ABTS变色的pH值；（b）ABTS浓度；（c）PicoGreen浓度；（d）光催化活性时间；
图5为实施例5中Zn-DPA修饰玻片对cfDNA的选择性结果图；
图6为实施例6中不用浓度DNA下标准曲线图及显色结果；
图7为实施例7中检测过程的示意图；
图8为实施例7中临床尿液样本cfDNA含量检测结果图；其中，（a）为本方法与商业标准方法拟合曲线结果对比图；（b）为健康与患者样本中cfDNA水平差异比较；（c）为cfDNA对泌尿系统疾病的相应ROC曲线。
具体实施方式
除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。在适用的情况下，本申请中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考，特别这些文献所披露的关于本领域中的合成技术、产物和加工设计、聚合物、共聚单体、引发剂或催化剂等的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。
本申请中的数字范围是近似值，因此除非另有说明，否则其可包括范围以外的数值。数值范围包括以1个单位增加的从下限值到上限值的所有数值，条件是在任意较低值与任意较高值之间存在至少2个单位的间隔。例如，如果记载组分、物理或其它性质（如分子量，熔体指数等）是100至1000，意味着明确列举了所有的单个数值，例如100，101，102等，以及所有的子范围，例如100到166，155到170，198到200等。对于包含小于1的数值或者包含大于1的分数（例如1.1，1.5等）的范围，则适当地将1个单位看作0.0001，0.001，0.01或者0.1。对于包含小于10（例如1到5）的个位数的范围，通常将1个单位看作0.1。这些仅仅是想要表达的内容的具体示例，并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合都被认为清楚记载在本申请中。
关于化学化合物使用时，除非明确地说明，否则单数包括所有的异构形式，反之亦然（例如，“己烷”单独地或共同地包括己烷的全部异构体）。另外，除非明确地说明，否则用“一个”，“一种”或“该”形容的名词也包括其复数形式。
术语“包含”，“包括”，“具有”以及它们的派生词不排除任何其它的组分、步骤或过程的存在，且与这些其它的组分、步骤或过程是否在本申请中披露无关。为消除任何疑问，除非明确说明，否则本申请中所有使用术语“包含”，“包括”，或“具有”的组合物可以包含任何附加的添加剂、辅料或化合物。相反，出来对操作性能所必要的那些，术语“基本上由……组成”将任何其他组分、步骤或过程排除在任何该术语下文叙述的范围之外。术语“由……组成”不包括未具体描述或列出的任何组分、步骤或过程。除非明确说明，否则术语“或”指列出的单独成员或其任何组合。
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
实施例1具有吸附cfDNA功能的玻片合成过程及表征
（1）玻片清洗及表面修饰
将盖玻片（2.0cm*2.0cm）置于肥皂水中超声30min，然后置于蒸馏水中超声30min。将玻片于80℃下浸泡于30%过氧化氢、30%氨水和蒸馏水以1：1：5的体积比的混合溶液20min，用过氧化氢洗涤后，浸泡于80℃的30%过氧化氢、1M盐酸溶液和蒸馏水体积比为1：1：5的混合溶液20min使硅羟基充分暴露出来。玻片用乙醇溶液洗涤后，置于真空干燥烘箱中烘干，保存于无水乙醇溶液中。
（2）玻片表面PEI的反应
暴露出硅羟基的玻片与5%的环氧硅烷进一步反应，于200mL的甲苯溶液中加入10mL的环氧硅烷。为了排除氧气的影响，加入N2除去O2后，在80℃下反应12h。反应结束后，用乙醇和水反复冲洗3次以除去未结合的环氧硅烷。冲洗后的玻片与5g PEI（MW:25000）于200mL的水溶液在30℃下反应24h，并加入NaOH调pH至10。经过24小时的反应后，使用乙醇和水洗涤三次以获得表面有氨基的玻片。硅烷化试剂主要是使表面具有功能化，环氧硅烷未经水解的步骤，直接与玻片上的羟基进行反应，交联到玻片表面，形成表面为环氧基团的玻片。此时将玻片通过PEI结构中的氨基与环氧键反应，将PEI以共价键的方式固定到盖玻片上。
（3）Zn-DPA在玻片表面的修饰
在200mL的乙醇溶液中，加入2g 2-氯甲基吡啶盐，0.5g无水碳酸钾，5g三乙胺搅拌溶解后，将修饰好PEI的玻片置于溶液中，在80℃中反应24h。最后将反应结束的玻片收集并用乙醇清洗后，与20mg/mL硫酸锌溶液中孵育30min，得到Zn-DPA修饰的玻片。
（4）修饰玻片的表征
为了验证Zn-DPA在玻片表面的成功修饰，采用扫描电子显微镜对Zn-DPA修饰玻片以及未修饰玻片进行表征，并利用傅里叶红外光谱与紫外吸收光谱对玻片表面修饰的官能团进行表征。
上述（1）（2）（3）（4）的检测结果如图1所示。
结果说明：图中（a）为扫描电子显微镜显示的玻片表面形貌，与未修饰玻片相比，Zn-DPA修饰玻片表面变得非常粗糙，有利于捕捉DNA，说明玻片表面Zn-DPA的成功修饰。（b）为修饰玻片的元素分析，测定Zn-DPA修饰玻片表面中的Zn含量为3.5%。（c）为玻片的紫外谱分析，紫外吸收光谱中，Zn-DPA修饰玻片在260nm处表现出Zn-DPA配合物的吡啶特征吸收峰，对应π→π*跃迁，而未修饰的玻片没有此特征。（d）为玻片的红外光谱分析，傅里叶变换红外光谱表征了玻片表面的官能团，与未修饰的玻片相比，Zn-DPA修饰玻片分别在3500-3100cm-1处显示-NH-拉伸振动吸收，在1675-1640 cm-1处显示-C=C-拉伸振动吸收，在1350-1000 cm-1处显示-C-N-拉伸振动吸收。
这些结果共同证实了Zn-DPA在玻片表面上的成功修饰，Zn-DPA复合物对带有负电荷磷酸基团的DNA具有高亲和力，体现出Zn-DPA修饰玻片具有cfDNA富集的特性。
实施例2 Zn-DPA玻片吸附cfDNA的能力以及特异性
（1）DNA标准样品的配置和定量
DNA标准样品使用小牛胸腺DNA（Invitrogen），原始浓度为100μg/mL。每次配制使用Tris buffer（10mM Tris-HCl，pH7.5）稀释。
PicoGreen（QuantiTTMPicoGreenTM，Invitrogen）是一种极为灵敏的荧光核酸染料，其仅在与双链DNA结合后才发出荧光，所产生的荧光与DNA浓度呈正比。进行检测前，先将浓缩于DMSO的PicoGreen取出后回温至室温，用1×Tris buffer（10mM Tris-HCl，pH7.5）按1:200的比例稀释PicoGreen浓缩液，作为PicoGreen工作液。因为QuantiTTMPicoGreenTM试剂容易被光降解，为了达到最佳效果，该工作溶液应用锡箔纸包裹避免光照，并在制备后的几个小时内使用，PicoGreen反应的优选剂量为3.5μM。
待检测时，等体积加入等梯度DNA标准品与待测的DNA溶液，即于96孔板（黑色）中加入25μL DNA溶液与25μL PicoGreen工作液，室温下避光于摇床低速孵育10min（保持样品的荧光测量时间恒定，减少光淬灭效应），通过荧光酶标仪（Ex=480nm，Em=520nm）检测荧光强度对DNA进行定量。从每个样品的荧光值中减去试剂空白对照，使用校正后的数据生成DNA浓度-荧光吸收的标准曲线。
（2）Zn-DPA修饰玻片富集DNA的能力
将Zn-DPA修饰玻片置于6孔板中，将提前配置好的0.5μg/mL标准DNA样品共同孵育10分钟。孵育结束后，吸走上清DNA用蒸馏水洗涤三次。使用500nM碘化丙啶（PI）染液染色10分钟后，洗涤未与DNA结合的PI染料。使用荧光显微镜观察荧光信号，并利用ImageJ软件进行荧光定量分析。
（3）Zn-DPA修饰玻片富集DNA的吸附效率
取DNA标准样品，用Tris buffer分别配制3000、2000、1600、1400、1200、1000、800、600、400、300、100、40ng/mL的DNA标准品工作液。分别取1mL的DNA溶液与玻片孵育10min，孵育结束后收集上清吸附后的DNA溶液于EP管中，并进行DNA浓度定量检测，计算Zn-DPA修饰玻片的吸附效率。玻片吸附效率=（加入DNA浓度-上清DNA浓度）/加入DNA浓度×100%。
（4）Zn-DPA修饰玻片富集DNA的特异性
用20mM EDTA溶液洗涤Zn-DPA修饰玻片，以去除Zn离子，得到经EDTA洗脱后玻片，同时采用未修饰玻片作为对比。使用荧光显微镜观察荧光信号，并利用ImageJ软件进行荧光定量分析。
上述（1）（2）（3）（4）的检测结果如图2所示。
结果说明：如图中（a）（b）所示，Zn-DPA修饰玻片上的荧光强度强于未修饰的玻片；用20mM EDTA溶液洗涤以去除Zn离子后，发现在Zn-DPA修饰玻片上荧光信号的显著损失，表明Zn-DPA的修饰对DNA的高效富集起着至关重要的作用。（c）根据建立的标准曲线计算玻片吸附后的上清液DNA含量，发现修饰玻片对DNA具有很高的结合亲和力，在3000ng/mL浓度内吸附效率达90%以上。结果表明，Zn-DPA修饰后的玻片具有较好的吸附DNA能力。
实施例3 Zn-DPA修饰玻片富集cfDNA的策略探究
（1）PicoGreen 特异性标记DNA的能力
QuantiTTMPicoGreenTM试剂结合dsDNA和ssDNA后的荧光增强。
过程如下：分别向三个试管中加入QuantiTTMPicoGreenTM试剂，然后向其中一个试管中加入含有500ng/mL小牛胸腺DNA；向另外一个试管中加入M13 ssDNA的样品。三个试管的样品在480nm处激发，并使用荧光分光光度计收集含有染料和核酸样品的发射光谱。
（2）PicoGreen光催化产生活性氧的能力
PicoGreen与DNA结合被激发时，容易参与光敏氧化，通过染料向溶解氧的能量转移而产生活性单线态氧。为检测其单线态氧产生的情况，利用1,3-二苯基异苯并呋喃（DPBF）单线态氧指示荧光探针对单线态氧具有高特异性，去检测活性氧的生成。
过程如下：分别于两个EP管加入50μL PicoGreen工作液与50μL 200ng/mL的DNA，混合孵育20min后，其中一管于蓝光灯片下打光20min后再加入900μL 1.184×10-6mol/L的DPBF，另一管直接加入DPBF溶液，分别标记为PG+DNA+L与PG+DNA。
另取两管EP管分别加入50μL PicoGreen工作液和50μL Tris buffer溶液，其中一管于蓝光灯片下打光20min后再加入900μL 1.184×10-6mol/L的DPBF；另一管直接加入DPBF溶液，分别标记为PG+L与PG。配制好的四管样品检测前注意避光，于Ex=403nm，Em=447nm测定体系相对荧光强度，其荧光强度越弱说明生成的活性氧越多。
（3）ABTS在活性氧与光照下氧化变色的能力
PicoGreen与DNA结合被激发时，容易参与光敏氧化，通过染料向溶解氧的能量转移而产生活性单线态氧。2,2'-联氨基双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）在活性氧下会氧化变色。ABTS溶液的准备：称量54.8mg的ABTS于1mL纯水中，超声溶解，为100mM的ABTS工作液，ABTS反应的优选剂量为3mM。缓冲溶液配置：ABTS的氧化过程需要在酸性条件下进行，采用0.2M十二水合磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）与0.1M柠檬酸溶液配置，缓冲溶液优选pH为4.2。
过程如下：分别于两个EP管中加入50μL PicoGreen工作液与50μL 200ng/mL的DNA，混合孵育20min后，其中一管于蓝光灯片下打光20min后再加入900μL 3mM的ABTS溶液，另一管直接加入900μL 3mM的ABTS溶液，分别标记为ABTS+PG+DNA+L与ABTS+PG+DNA。
另外取两个EP管，其中一管中加入50μL PicoGreen工作液、50μL Tris buffer溶液和900μL 3mM的ABTS溶液，向另外一管中加入1000μL 3mM的ABTS溶液，分别标记为ABTS+PG与ABTS。使用蓝光分光光度计于420nm检测其吸收值。
上述（1）（2）（3）的检测结果如图3所示。
结果显示：如图3中（a）所示，与游离的PicoGreen和单链DNA相比，PicoGren与双链DNA结合后产生的荧光更强，是由于PicoGreen是一种荧光探针，结合在双链DNA（dsDNA）主干的沟槽上，形成高度发光的复合物。图3中（b）所示，DPBF被ROS氧化导致DPBF荧光的降低，在实验中，游离PicoGreen组和PicoGreen-DNA组的DPBF荧光没有下降，是因为PicoGreen和PicoGreen-DNA没有产生ROS；PicoGreen在打光后，DPBF荧光的轻微下降表明，说明PicoGreen在光照射下可以诱导ROS的少量产生，因此要注意避光使用；PicoGreen-DNA在蓝光照射下，DPBF荧光的显著降低表明，说明PicoGreen-DNA在光照射下的释放了大量的ROS，而所产生的大量单线态氧促进ABTS的光催化氧化，产生了在420nm处具有特征吸收峰带的ABTS+（c）。基于上述特性，本发明的检测方法具有可行性。
实施例4 Zn-DPA修饰玻片对cfDNA可视化检测的显色条件优化
实验采用200ng/mL的DNA作为核酸样本，每组实验中核酸样本3mL、ABTS溶液300μL、PicoGreen溶液10μL、缓冲溶液3mL，针对DNA的光催化活性的显色条件：pH值、ABTS溶液的浓度、PicoGreen溶液的浓度以及光照显色时间设计不同的数值，其中，pH值范围在3.0~5.8、ABTS浓度范围在1-5.5mM、PicoGreen浓度范围在0.5-6μM、光照显色时间范围在2-40min，以寻找最有佳的显色条件。每组实验使用蓝光分光光度计于420nm检测其吸收值。
结果如图4所示。
通过实验发现最佳pH值为4.2，光催化活性最佳ABTS浓度为3.5mM，最佳光催化所需PicoGreen浓度为3μM，光照时间为20min。
后续实验均于最佳实验条件下进行。
实施例5 Zn-DPA修饰玻片对cfDNA的选择性
分别准备高浓度人工尿液及低浓度人工尿液，以尿液中的主要成分作为干扰物，包括无机盐、尿素、葡萄糖、蛋白质和RNA，并向其中添加DNA作为对比。
向高浓度人工尿液中分别添加干扰物：NaCl 170.9mmol/L，尿素166.5mmol/L，葡萄糖83.2mmol/L，RNA 200ng/mL，蛋白质10.5g/L，dsDNA 200ng/mL；向低浓度人工尿液中分别添加干扰物：NaCl 85.5mmol/L，尿素83.3mmol/L，葡萄糖16.6mmol/L，RNA 50ng/mL，蛋白质1.5g/L，dsDNA 50ng/mL；反应后观察Zn-DPA修饰玻片对cfDNA的选择性。
记录观察到的各实验显色反应的颜色，将显色结果与显色卡比较，实验结果如图5所示。
结果表明，干扰物获得的颜色强度较低，由于PicoGreen的单线态氧生成不足而没有形成DNA-PicoGreen复合物。相反，无论低浓度还是高浓度，加入DNA溶液后都观察到显著的颜色变化。这些结果表明，本发明的可视化检测方法具有较高的DNA检测特异性，能够排除尿液中干扰物的干扰。
实施例6 Zn-DPA修饰玻片对cfDNA可视化检测的灵敏性
分别配制100、200、400、800、1000ng/mL不同浓度的DNA，取DNA样本3mL，分别与Zn-DPA修饰玻片共同孵育10min后，在最优选的条件的基础上进行，即于吸附玻片中加入10μL3uM PicoGreen孵育10min，3mL pH=4.2的缓冲溶液、300μL 3.5mM的ABTS，在蓝光下照射20min后，利用手机拍照读取色值，并以DNA浓度为横坐标绘制标准曲线。结果如图6和表1所示。
表1 不同浓度DNA情况下手机读取色值与显色结果
结果显示，随着DNA的增加，颜色变化更深。
实施例7 临床样本检测
从临床收集了60份人尿液样品，其中包含40例泌尿系统疾病患者和20例健康人的尿液。待测尿液样本溶液的采集方法：
取清洁干燥一次性尿杯一个，留取新鲜中段尿约6-12mL（连续排尿不中断，此时截取中段排的尿作为送检样品）倒入一次性尿管内，样本均以清晨第一次尿为宜。样本留取前最好清洁尿道口及外阴，同时避免经血、白带、精液、粪便等混入污染，并做好标记，粘贴条形码时应注意将条形码竖向、严密粘贴于尿管壁上，避免横向或斜贴引起样本信息丢失。样本收集后检测最佳时间为半小时以内，最长不要超过2小时，以免尿样本成分变质或被破坏影响检验结果，或保存于-80℃中。
采用本发明的可视化检测装置以及定量检测系统测定临床尿液样本中的cfDNA含量，并采用目前常用的DNA检测方法QIAamp DNA Blood Mini Kit DNA提取试剂盒进行对比实验。
可视化检测装置包括样品池和光照催化箱，样品池为透明容器，样品池上端开口，样品池的池身位于光照催化箱内，光照催化箱为黑色不透明容器；光照催化箱内设有蓝光光源，蓝光光源通过电线与供电单元连接，电线上设有控制开关，控制开关固定在光照催化箱箱体上，Zn-DPA修饰玻片置于样品池中，向样品池中加入待测人尿液样品孵化20min，在加入PicoGreen溶液，等待10分钟后将尿液吸弃，再加入ABTS溶液，和pH为4.2的缓冲溶液，打开控制开关，蓝光光照20min，光照结束后将溶液转移至离心管中观察颜色变化；打开手机Color Grab的APP，对检测结果进行拍照获取颜色变化的图片数据，在经过初步的切割剪裁、各像素点的CKMB值提取并采用算法计算得到数据处理结果给予相应的建议，即ColorGrab自动给出显色结果对应的cfDNA含量。
检测示意图如图7所示，60份人尿液样品cfDNA含量检测结果如图8所示。
结果显示：采用本发明方法测定的尿液样品中的cfDNA含量拟合曲线与商业标准方法高达95.16%，见图8（a）；但是，在尿液中DNA水平超过600ng/mL的情况下，ABTS的颜色变化不明显。在这些样本中，收集的色卡值和cfDNA含量不遵循线性关系，这归因于尿液中存在大量血细胞。高DNA含量（>600ng/mL）的检测结果为泌尿系统疾病的严重程度提供了重要指示。根据检测结果我们发现健康个体的平均尿cfDNA量为85.16ng/mL。然而，被诊断患有泌尿系统疾病的患者尿液中cfDNA水平升高，平均为313.62ng/mL，见图8（b）。为了便于泌尿系统疾病的诊断，利用检测结果绘制了cfDNA对泌尿系统疾病的相应ROC曲线，见图8（c），当DNA临界浓度为116.5ng/mL时，诊断灵敏度为97.56%，特异性为84.21%，AUC为0.9833（95%CI：0.9583–1.000），表明生物传感器平台对准确预测泌尿系统疾病的有效性。
以上数据证实本发明的方案可以准确、可重复地检测临床尿液样本中的cfDNA，并能够进一步有效地应用在根据cfDNA含量评估泌尿系统疾病。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种用于富集cfDNA的修饰玻片，其特征在于：所述修饰玻片的表面经过玻片Si-OH暴露、PEI修饰、DPA修饰以及Zn-DPA修饰的一系列功能化修饰，所述修饰玻片通过Zn-DPA与cfDNA的特异配位，对cfDNA进行富集。
2.根据权利要求1所述的修饰玻片，其特征在于，所述修饰玻片的表面功能化修饰方法包括如下步骤：
（1）玻片表面Si-OH暴露：盖玻片超声清洗干净，浸泡于80℃的由30%过氧化氢、30%氨水和蒸馏水以1：1：5的体积比混合的溶液中，后用过氧化氢洗涤；再浸泡于80℃的30%过氧化氢、1M盐酸溶液和蒸馏水以1：1：5的体积比混合的溶液中，后用乙醇溶液洗涤；最后置于真空干燥烘箱中烘干，保存于无水乙醇中；
（2）玻片表面PEI修饰：将步骤（1）得到的玻片在去除氧气的环氧硅烷溶液中，80℃条件下进行反应，反应结束后用乙醇和水反复冲洗，冲洗后的玻片于PEI溶液中，在30℃条件下进行反应，并加入NaOH调节PH至10，反应结束后使用乙醇和水洗涤；
（3）玻片表面DPA-Zn修饰：将2-氯甲基吡啶盐、无水碳酸钾、三乙胺加入乙醇溶液中，搅拌溶解，将完成步骤（2）的玻片置于溶液中，在80℃条件下反应，反应结束后用乙醇清洗，置于20mg/mL硫酸锌溶液中孵育，得到Zn-DPA修饰玻片。
3.根据权利要求1所述的修饰玻片，其特征在于：步骤（2）中，去除氧气的环氧硅烷溶液为200mL甲苯溶液中加入10mL环氧硅烷，并通入氮气去除溶液中的氧气；PEI溶液的浓度为0.025g/mL，分子量为25000。
4.根据权利要求1所述的修饰玻片，其特征在于：步骤（3）中，2-氯甲基吡啶盐的浓度为0.01g/mL，无水碳酸钾的浓度为0.0025g/mL，三乙胺的浓度为0.025g/mL。
5.一种基于修饰玻片的cfDNA的富集方法，其特征在于：采用权利要求1-4任一项所述的修饰玻片，将其置于待测样本溶液中共同孵育，即可完成富集。
6.一种基于修饰玻片的cfDNA可视化检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将权利要求1-4任一项所述的修饰玻片置于样品皿中，向样品皿中加入待测样本溶液，共同孵育；
（2）加入PicoGreen溶液，等待几分钟后将待测样本溶液吸弃；
（3）再加入ABTS溶液和缓冲溶液；
（4）光照催化，光照结束后将溶液转移至样本管中观察颜色变化。
7.根据权利要求6所述的一种基于修饰玻片的cfDNA可视化检测方法，其特征在于：所述PicoGreen溶液浓度为3-4μM，所述ABTS溶液浓度为3-4mM，所述缓冲溶液的PH为3.8-4.5，所述光照催化时间为15-25min。
8.根据权利要求6所述的一种基于修饰玻片的cfDNA可视化检测方法，其特征在于：所述步骤（4）中光照催化采用蓝光照射。
9.一种cfDNA的可视化检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1-4任一项所述的修饰玻片以及显色辅助试剂。
10.一种如权利要求1-4任一项所述的修饰玻片在制备泌尿系统疾病早期检测或诊断产品中的应用。
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