CN117106683A - 一株好氧降解bde-47的基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents
一株好氧降解bde-47的基因工程菌及其构建方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117106683A CN117106683A CN202310479239.0A CN202310479239A CN117106683A CN 117106683 A CN117106683 A CN 117106683A CN 202310479239 A CN202310479239 A CN 202310479239A CN 117106683 A CN117106683 A CN 117106683A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bde
- genetically engineered
- bacteria
- degrading
- degradation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- XYBSIYMGXVUVGY-UHFFFAOYSA-N 2,2',4,4'-Tetrabromodiphenyl ether Chemical compound BrC1=CC(Br)=CC=C1OC1=CC=C(Br)C=C1Br XYBSIYMGXVUVGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 88
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 79
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 title claims abstract description 32
- 238000010276 construction Methods 0.000 title abstract description 9
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims abstract description 50
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims abstract description 50
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims abstract description 39
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims abstract description 12
- 241000490596 Shewanella sp. Species 0.000 claims abstract description 9
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 28
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 23
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 claims description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 13
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 claims description 10
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims description 9
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 9
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 6
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 claims description 5
- 241000589291 Acinetobacter Species 0.000 claims description 4
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 claims description 4
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 claims description 4
- 239000010793 electronic waste Substances 0.000 claims description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 abstract description 8
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 17
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 6
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000229113 Acinetobacter pittii Species 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 4
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000863430 Shewanella Species 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 241001223867 Shewanella oneidensis Species 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 238000007256 debromination reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 2
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- RNFJDJUURJAICM-UHFFFAOYSA-N 2,2,4,4,6,6-hexaphenoxy-1,3,5-triaza-2$l^{5},4$l^{5},6$l^{5}-triphosphacyclohexa-1,3,5-triene Chemical compound N=1P(OC=2C=CC=CC=2)(OC=2C=CC=CC=2)=NP(OC=2C=CC=CC=2)(OC=2C=CC=CC=2)=NP=1(OC=1C=CC=CC=1)OC1=CC=CC=C1 RNFJDJUURJAICM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100216163 Acinetobacter baylyi (strain ATCC 33305 / BD413 / ADP1) antB gene Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 description 1
- 206010029350 Neurotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 206010074268 Reproductive toxicity Diseases 0.000 description 1
- 206010044221 Toxic encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010876 biochemical test Methods 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000003063 flame retardant Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000007135 neurotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000228 neurotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 238000001782 photodegradation Methods 0.000 description 1
- -1 polybrominated diphenyl ether (Polybrominated diphenyl ethers Chemical class 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000007696 reproductive toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000372 reproductive toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 1
- 231100000967 thyroidotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000759 toxicological effect Toxicity 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B09—DISPOSAL OF SOLID WASTE; RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
- B09C—RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
- B09C1/00—Reclamation of contaminated soil
- B09C1/10—Reclamation of contaminated soil microbiologically, biologically or by using enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Soil Sciences (AREA)
- Environmental & Geological Engineering (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Processing Of Solid Wastes (AREA)
Abstract
一株好氧降解BDE‑47的基因工程菌及其构建方法和应用，本发明涉及一株好氧降解BDE‑47的基因工程菌及其构建方法和应用。本发明的目的是为了解决现有BDE‑47好氧降解菌普遍存在降解率低，降解效能不稳定以及在污染土壤中的环境适应性差的问题，本发明一株好氧降解BDE‑47的基因工程菌希瓦氏菌Shewanellasp.G‑Ant，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期是2022年12月29日，保藏编号为CCTCCNO:M20222098。本发明构建BDE‑47降解基因工程菌提高BDE‑47降解菌的降解稳定性和环境适应性，从而提高降解率。本发明应用于基因工程技术领域。
Description
技术领域
本发明涉及一株好氧降解BDE-47的基因工程菌及其构建方法和应用。
背景技术
2,2’,4,4’-四溴联苯醚(BDE-47)常添加于电子产品、纺织品中作为阻燃剂使用。因其化学键间的相互作用力不强，并且具有较高的亲脂性和疏水性，易迁移至大气、水体、土壤等环境，具有一定的生态风险。BDE-47是环境样品及生物组织中毒性最强的多溴联苯醚(Polybrominated diphenyl ethers，PBDEs)同系物，可通过食物链在人体内蓄积，产生甲状腺毒性、神经毒性、生殖毒性等，危害人类健康。
目前常用的BDE-47降解方式为光降解、零价铁降解和生物降解法。其中，微生物降解成本较低、操作方便且环境友好，具有较强的可操作性和研究价值。
微生物降解包括好氧降解和厌氧降解。通常沉积物中的污染物降解方式为厌氧降解，一般通过还原脱溴的方式降解BDE-47。目前，已有部分的BDE-47好氧降解菌被发掘，但普遍存在降解率低，降解效能不稳定的问题。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有BDE-47好氧降解菌普遍存在降解率低，降解效能不稳定以及在污染土壤中的环境适应性差的问题，提供了一株好氧降解BDE-47的基因工程菌及其构建方法和应用。
本发明一株好氧降解BDE-47的基因工程菌为希瓦氏菌Shewanella sp.G-Ant，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉市武汉大学，保藏日期是2022年12月29日，保藏编号为CCTCC NO:M 20222098。
本发明一株好氧降解BDE-47的基因工程菌的构建方法为：
一、从受BDE-47污染的电子垃圾拆解地土壤中筛选土著优势菌作为基因工程菌的受体菌；
二、提取BDE-47降解菌Acinetobacter pittii sp.GB-2的基因组DNA，然后以基因组DNA为模板，以1,2-双加氧酶基因AntABC基因簇为目的基因，设计引物进行PCR扩增，得到目的基因；
三、将目的基因与克隆载体pMD-18T连接，构建重组克隆载体pMD-AntABC；
四、使用限制性内切酶NotⅠ分别酶切重组克隆载体质粒pMD-AntABC和表达载体pUT-mini-Tn5，对酶切后的表达载体质粒pUT-mini-Tn5进行去磷酸化处理，得到线性表达载体；然后将线性表达载体与酶切后的重组克隆载体质粒pMD-AntABC连接，得到重组表达载体质粒；
五、通过三亲接合法将重组表达载体质粒转入步骤一的基因工程菌的受体菌中，得到基因工程菌希瓦氏菌Shewanella sp.G-Ant。
本发明一株好氧降解BDE-47的基因工程菌在降解环境污染物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明所制备的一种能降解BDE-47的基因工程菌，较供体菌GB-2相比，提高了降解率，并且具有一定的遗传稳定性和降解稳定性，对基因工程菌进行人工传代培养，并对传代菌株进行目的基因PCR扩增验证，表明基因工程菌可稳定遗传；传代菌株在浓度为100μg/L的BDE-47降解率可达72～76％之间，最高降解率为76.78％。
(2)多数BDE-47降解菌为外源菌，无法持续在BDE-47污染环境下生存和降解BDE-47，而本发明所制备的基因工程菌能够在BDE-47污染土壤中完成对BDE-47的降解，并具有一定的土壤环境适应性，对未来修复BDE-47污染土壤提供了一种可能的选择。
本发明研究表明，基因工程菌可稳定遗传，相比供体菌GB-2，对BDE-47的降解率有所提高，在污染土壤中的环境适应性较供体菌GB-2更佳。
附图说明
图1为WT-G菌株系统发育树；
图2为采集的BDE-47污染土壤的高通量测序技术解析的土壤微生物群落结构中的菌属结果图；
图3为目的基因AntABC基因簇片段；
图4为克隆载体pMD-AntABC菌落PCR鉴定；
图5为表达载体酶切鉴定；
图6为基因工程菌G-Ant的PCR验证；
图7为基因工程菌G-Ant的遗传稳定性PCR验证；
图8为基因工程菌的目的基因相对丰度；
图9为物种分布柱状图；
图10为BDE-47的降解效果。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式一株好氧降解BDE-47的基因工程菌为希瓦氏菌Shewanella sp.G-Ant，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉市武汉大学，保藏日期是2022年12月29日，保藏编号为CCTCC NO:M 20222098。
具体实施方式二：本实施方式一株好氧降解BDE-47的基因工程菌的构建方法为：
一、从受BDE-47污染的电子垃圾拆解地土壤中筛选土著优势菌作为基因工程菌的受体菌；
二、提取BDE-47降解菌Acinetobacterpittii sp.GB-2的基因组DNA，然后以基因组DNA为模板，以1,2-双加氧酶基因AntABC基因簇为目的基因，设计引物进行PCR扩增，得到目的基因；
三、将目的基因与克隆载体pMD-18T连接，构建重组克隆载体pMD-AntABC；
四、使用限制性内切酶NotⅠ分别酶切重组克隆载体质粒pMD-AntABC和表达载体pUT-mini-Tn5，对酶切后的表达载体质粒pUT-mini-Tn5进行去磷酸化处理，得到线性表达载体；然后将线性表达载体与酶切后的重组克隆载体质粒pMD-AntABC连接，得到重组表达载体质粒；
五、通过三亲接合法将重组表达载体质粒转入步骤一的基因工程菌的受体菌中，得到基因工程菌希瓦氏菌Shewanella sp.G-Ant。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：1,2-双加氧酶的AntABC基因簇序列如SEQ ID NO.1所示。其他与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：BDE-47降解菌Acinetobacterpittii GB-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo.M2021107。其他与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：所述的引物如下：
AntABCF1:5'-ATTTGCGGCCGCCAATGGAATGATTTTGTAGATGG-3'
AntABCR1:5'-ATTTGCGGCCGCGGTATTGCTTTGTAAAAACTTCTC-3'。其他与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式一株好氧降解BDE-47的基因工程菌在降解环境污染物中的应用。
具体实施方式七：本实施方式土著优势菌的筛选与鉴定。
筛选方法为：
一、采用浙江省台州市路桥区峰江镇电子拆解工业园区被BDE-47污染的土壤(0～20cm)，筛选土著优势菌。取5g新鲜土壤和玻璃珠于锥形瓶中，在LB液体培养基中加入50μg/L的BDE-47，于35℃，150rpm下震荡培养，将土壤中的优势细菌富集出来；
二、取出培养瓶于超净工作台中静置30min，取1ml菌悬液稀释涂布于LB固体培养基中，选取生长较大，数目较多的菌落进行分离纯化，得到单菌株；
LB液体/固体培养基：酵母膏5g、蛋白胨10g、NaCL 10g、蒸馏水1000mL。pH值调至7.0～7.2，121℃高温蒸汽下灭菌20min，固体培养基在液体培养基的基础上加入15～20g琼脂，培养基倒入锥形瓶中，121℃高温蒸汽下灭菌20min。
对分离得到的纯菌进行形态学观察见表1、生理生化特性试验见表2和分子生物学鉴定，结果如图1所示。
将测序结果用BLAST软件与Genbank中已登录的16S rDNA序列进行同源性比较，发现本实施方式筛选得到的菌株WT-G与奥奈达希瓦氏菌属(Shewanella oneidensis)同源性达100％，将序列提交GenBank数据库。根据16S rDNA测序结果，16S rDNA序列如SEQ ID NO：2所示，利用NCBI提供的Blast工具和MEGA7.0等相关软件在GenBank数据库中找到了同源序列，并建立了系统发育树，菌株与奥奈达希瓦氏菌的同源性最高，达100％，最终命名为奥奈达希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)WT-G。
将细菌的分类菌属，与采集的BDE-47污染土壤的高通量测序技术解析的土壤微生物群落结构中的菌属结果(图2)进行比对，BDE-47污染土壤中希瓦氏菌属(Shewanella)平均丰度最高，在F2土样中出现为74.22％。确定土著优势菌WT-G，以其作为基因工程菌的受体菌Shewanella sp.WT-G；
表1菌株WT-G形态学观察结果
表2菌株WT-G生理生化实验结果
具体实施方式八：本实施方式一株BDE-47降解基因工程菌的构建。
根据对GB-2菌株在降解BDE-47过程中的转录组测序分析解析得到BDE-47好氧降解基因，其中，AntA、AntB和AntC是编码1,2-双加氧酶的协同作用基因，并且GB-2菌株中的AntABC基因簇在BDE-47降解第一步发生羟基化反应时起作用。利用PCR技术扩增AntABC基因簇得到基因簇片段，结果如图3所示；使用限制性内切酶XbaⅠ和BamhⅠ分别将目的基因与克隆载体pMD-18T酶切，使用同样的内切酶将二者连接起来，构建重组克隆载体pMD-AntABC；使用热激转化法将重组克隆载体质粒转移至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在含有氨苄青霉素的LB平板上培养12h后，取长势较好的单菌落进行菌落PCR验证并测序，筛选阳性菌株，结果如图4所示；使用限制性内切酶NotⅠ酶切分别重组克隆载体质粒pMD-AntABC和表达载体pUT-mini-Tn5，对酶切后的表达载体质粒进行去磷酸化处理，使其成为线性载体。将线性表达载体与含有目的基因的克隆载体质粒连接得到重组表达载体质粒，使用NotⅠ酶切验证，结果如图5所示；将重组表达载体质粒转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，取长势较好的菌株进行菌落PCR鉴定阳性菌株，结果如图6所示；通过三亲接合法将重组表达载体质粒转入土著优势受体菌中，得到基因工程菌G-Ant。
目的基因的引物为：
AntABCF1:5'-ATTTGCGGCCGCCAATGGAATGATTTTGTAGATGG-3'
AntABCR1:5'-ATTTGCGGCCGCGGTATTGCTTTGTAAAAACTTCTC-3'
PCR扩增体系为：dNTP Mixture 0.8μl、10×PCRbuffer 1.0μl、DNATemplate 1.0μl、Primer F 0.2μl、Primer R 0.2μl、ddH2O 6.7μl，共10.0μl。
PCR扩增程序为：
克隆载体连接体系为：纯化后的PCR产物4.0μl、pMD-18T 1.0μl、SolutionⅠ5.0μl，总体积10.0μl。16℃连接。
表达载体酶切体系为：质粒DNA 10.0μl、BSA2.0μl、Trition X-1002.0μl、NotⅠ0.8μl、10×H缓冲液2.0μl、ddH2O 3.2μl，总体积20.0μl。37℃酶切。
去磷酸化反应体系为：质粒DNA20.0μl、CIAP 1.0μl、10×Alkaline PhosphataseBuffer5.0μl、ddH2O 24.0μl，总体积为50.0μl。
表达载体连接体系为：AntABC基因簇4.0μl、表达载体1.0μl、Ligation Mix 5.0μl，总体积为10.0μl。16℃连接。
对基因工程菌进行人工传代培养30代，通过PCR扩增和荧光定量PCR验证基因工程菌的遗传稳定性，通过摇瓶实验验证基因工程菌的遗传稳定性，结果如图7和图8所示，由图7可知，基因工程菌与本身含有的AntABC基因的GB-2菌株相比，目的基因在传代过程中可稳定遗传。由图8可知，随着传代代数的增加，基因工程菌的BDE-47污染物的适应性增强，在传代的基因工程菌降解BDE-47时，目的基因基因的表达量随着传代次数的增加，其与供体菌Acinetobacterpittii GB-2相比的相对基因表达量逐渐提高。
对本实施方式的基因工程菌在降解BDE-47上的功能性验证：
试验1：基因工程菌G-Ant对BDE-47降解能力的测定
在50mL锥形瓶中加入20mg/L的BDE-47正己烷储备液100μL，待正己烷挥发后，添加无机盐培养基20mL，使反应体系中BDE-47的最终浓度为100μg/L。将菌株G-Ant接种于降解体系中，接种量为1％，于pH为7.0，35℃，150rpm的恒温振荡培养箱中培养7d后，上HPLC分析，测定培养液中BDE-47的剩余量，计算基因工程菌G-Ant对BDE-47的降解率。
本试验在100μg/LBDE-47浓度以下，培养7d，BDE-47降解率达到76.78％。同时经过传代的基因工程菌对该浓度的BDE-47降解率在72～74％之间，具有一定的降解稳定性。试验证明BDE-47降解基因工程菌G-Ant具有修复BDE-47污染土壤的功能，而且无需添加其它化学制剂，可为BDE-47污染土壤的原位生物修复提供微生物菌剂资源，具有广阔的应用前景。
其中主要实验试剂包括：BDE-47标样(>99％)、正己烷(色谱纯)、甲醇(色谱纯)、牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、酵母膏、Na2HPO4·2H2O、Ca(NO3)2·4H2O、(NH4)2SO4、MgCl2·6H2O、K2HPO4等。
无机盐液体培养基：Na2HPO4·2H2O 3.5g、K2HPO41 g、(NH4)2SO40.5 g、MgCl2·6H2O0.1g、Ca(NO3)2·4H2O 0.05g。121℃高温蒸汽下灭菌30min。
各组分模拟修复土壤样品柱状图见图9，S1表示模拟修复第0天的无BDE-47污染土壤、S2表示模拟修复第0天的浓度为1500ng/g的BDE-47污染土壤、S3表示模拟修复第0天的加入固定化GB-2修复的浓度为1500ng/g的BDE-47污染土壤、S4表示模拟修复第0天的加入固定化G-Ant修复的浓度为1500ng/g的BDE-47污染土壤、S5表示模拟修复第30天的无BDE-47污染土壤、S6表示模拟修复第30天的浓度为1500ng/g的BDE-47污染土壤、S7表示模拟修复第30天的加入固定化GB-2修复的浓度为1500ng/g的BDE-47污染土壤、S8表示模拟修复第30天的加入固定化G-Ant修复的浓度为1500ng/g的BDE-47污染土壤。从S7和S8可以看出，模拟修复30天后，S8中基因工程菌希瓦氏菌属的物种相对丰度高于S7中供体菌皮特不动杆菌的物种相对丰度。经过一段时间的模拟修复，BDE-47污染土壤中基因工程菌Shewanellasp.G-Ant比供体菌Acinetobacterpittii GB-2具有更高的物种相对丰度，占据了一定的生长优势，说明以土著优势菌为受体菌构建的BDE-47降解菌具有更好的环境适应性，较高的相对丰度也表明了该基因工程菌G-Ant在一定程度上是稳定的。
取模拟修复体系土壤修复第0天和第30天土壤，均匀混合多点取样土壤，测定降解菌修复BDE-47污染土壤30天，土壤中BDE-47残余量，计算得出降解率见图10。在土壤中，基因工程菌G-Ant(T2)30天降解1500ng/g的BDE-47的效率为47.15％，稍高于GB-2菌株(T1)30天降解BDE-47的效率41.98％。在100μg/L的BDE-47降解体系中，基因工程菌G-Ant(Y2)的降解率也比GB-2菌株(Y1)略高一些，表明以土著优势菌为受体菌构建的基因工程菌G-Ant具有更好的降解效果，也验证了GB-2菌株降解BDE-47第一步发生的反应即羟基化反应编码的AntABC基因在BDE-47降解中起到了一定的作用。结合模拟修复30天时土壤微生物群落结构分析(图9中S8)，基因工程菌G-Ant在土壤中保持了一定的丰度，表明其在土壤中的适应性也较好。目的基因AntABC基因在BDE-47降解第一步发生羟基化反应时起作用，而后可能需要在其他还原酶的作用下发生脱溴，然而，这需要对其降解的产物、路径、代谢物的毒理作用等进行深入的研究。综上所述，基因工程菌G-Ant提高了BDE-47的降解率，并具有较好的环境适应性和降解稳定性。
Claims (6)
1.一株好氧降解BDE-47的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌为希瓦氏菌Shewanellasp.G-Ant，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉市武汉大学，保藏日期是2022年12月29日，保藏编号为CCTCCNO:M20222098。
2.如权利要求1所述的一株好氧降解BDE-47的基因工程菌的构建方法，其特征在于，构建方法为：
一、从受BDE-47污染的电子垃圾拆解地土壤中筛选土著优势菌作为基因工程菌的受体菌；
二、提取BDE-47降解菌Acinetobacterpittiisp.GB-2的基因组DNA，然后以基因组DNA为模板，以1,2-双加氧酶基因AntABC基因簇为目的基因，设计引物进行PCR扩增，得到目的基因；
三、将目的基因与克隆载体pMD-18T连接，构建重组克隆载体pMD-AntABC；
四、使用限制性内切酶NotⅠ分别酶切重组克隆载体质粒pMD-AntABC和表达载体pUT-mini-Tn5，对酶切后的表达载体质粒pUT-mini-Tn5进行去磷酸化处理，得到线性表达载体；然后将线性表达载体与酶切后的重组克隆载体质粒pMD-AntABC连接，得到重组表达载体质粒；
五、通过三亲接合法将重组表达载体质粒转入步骤一的基因工程菌的受体菌中，得到基因工程菌希瓦氏菌Shewanellasp.G-Ant。
3.根据权利要求2所述的一株好氧降解BDE-47的基因工程菌的构建方法，其特征在于1,2-双加氧酶的AntABC基因簇序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求2所述的一株好氧降解BDE-47的基因工程菌的构建方法，其特征在于BDE-47降解菌AcinetobacterpittiiGB-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo.M2021107。
5.根据权利要求2所述的一株好氧降解BDE-47的基因工程菌的构建方法，其特征在于所述的引物如下：
AntABCF1:5'-ATTTGCGGCCGCCAATGGAATGATTTTGTAGATGG-3'
AntABCR1:5'-ATTTGCGGCCGCGGTATTGCTTTGTAAAAACTTCTC-3'。
6.如权利要求1所述的一株好氧降解BDE-47的基因工程菌在降解环境污染物中的应用，其特征在于所述的环境污染物为2,2’,4,4’-四溴联苯醚。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310479239.0A CN117106683A (zh) | 2023-04-28 | 2023-04-28 | 一株好氧降解bde-47的基因工程菌及其构建方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310479239.0A CN117106683A (zh) | 2023-04-28 | 2023-04-28 | 一株好氧降解bde-47的基因工程菌及其构建方法和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117106683A true CN117106683A (zh) | 2023-11-24 |
Family
ID=88793566
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310479239.0A Pending CN117106683A (zh) | 2023-04-28 | 2023-04-28 | 一株好氧降解bde-47的基因工程菌及其构建方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117106683A (zh) |
-
2023
- 2023-04-28 CN CN202310479239.0A patent/CN117106683A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Sheng et al. | Isolation and characterization of silicate mineral-solubilizing Bacillus globisporus Q12 from the surfaces of weathered feldspar | |
| Li et al. | Oxidation of elemental sulfur by Fusarium solani strain THIF01 harboring endobacterium Bradyrhizobium sp. | |
| Kato et al. | Functional gene analysis of freshwater iron-rich flocs at circumneutral pH and isolation of a stalk-forming microaerophilic iron-oxidizing bacterium | |
| Maya et al. | Degradation kinetics of chlorpyrifos and 3, 5, 6-trichloro-2-pyridinol (TCP) by fungal communities | |
| Mukhtar et al. | Comparison of Microbial Communities Associated with Halophyte (Salsola stocksii) and Non-Halophyte (Triticum aestivum) Using Culture-Independent Approache | |
| Franchi et al. | Exploiting Hydrocarbon‐Degrading Indigenous Bacteria for Bioremediation and Phytoremediation of a Multicontaminated Soil | |
| CN112725240B (zh) | 一株活不动杆菌及其菌剂和应用 | |
| CN110283741B (zh) | 一株具有高效降解多环芳烃功能的玫瑰变色菌及其应用 | |
| Ismaeil et al. | Bacteroides sedimenti sp. nov., isolated from a chloroethenes-dechlorinating consortium enriched from river sediment | |
| Alessa et al. | Comprehensive comparative genomics and phenotyping of Methylobacterium species | |
| Liu et al. | Optimization of Cr 6+ removal by Bacillus subtilis strain SZMC 6179J from chromium-containing soil | |
| Panosyan et al. | Geothermal springs in Armenia and Nagorno-Karabakh: potential sources of hydrolase-producing thermophilic bacilli | |
| CN111733100B (zh) | 一株降解聚乙烯地膜的申氏不动杆菌及其应用 | |
| CN106947719B (zh) | 一种伯克霍尔德菌gyp1及其在降解溴代阻燃剂中的应用 | |
| Lin et al. | Lysobacter lycopersici sp. nov., isolated from tomato plant Solanum lycopersicum | |
| Sikora et al. | Selection of bacteria capable of dissimilatory reduction of Fe (III) from a long-term continous culture on molasses and their use in a microbial fuel cell. | |
| CN117106683A (zh) | 一株好氧降解bde-47的基因工程菌及其构建方法和应用 | |
| Khalil et al. | Novel Anoxybacillus flavithermus AK1: A thermophile isolated from a hot spring in Saudi Arabia | |
| Mahapatra et al. | Genome assessment: functional gene identification involved in heavy metal tolerance and detoxification | |
| CN109423459B (zh) | 一种假单胞菌及其鉴定方法和应用 | |
| CN113265347B (zh) | 一株黄色杆菌t21及其应用 | |
| Acer et al. | Bioaccumulation, resistance, removal of U (VI) and Th (IV) and their effects on antioxidant enzymes on thermophilic Anoxybacillus flavithermus ST15 | |
| Jiang et al. | The diversity and metabolism of culturable nitrate-reducing bacteria from the photic zone of the Western North Pacific Ocean | |
| Amin et al. | Characterization of mercury-resistant rhizobacteria for plant growth promotion: An in vitro and in silico approach | |
| CN104805098A (zh) | 源于红树林沉积物的可降解孔雀石绿的过氧化物酶及制备 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |